專利名稱：酚類化合物等高分子化的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用酶使酚類化合物或芳香胺化合物高分子化的方法及該法制得的高分子化合物的使用方法。
更詳細地說，本發(fā)明提供在堿性pH范圍內，通過使具有多酚氧化作用的酶作用于酚類化合物或芳香胺化合物，制備分子量增大的酚類化合物或芳香胺化合物的方法，以及提供利用酶在上述堿性范圍內的催化作用而得到酚類化合物或芳香胺化合物分子量迅速增大的反應，利用該反應生產增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、混凝土混和劑、染料、脫臭劑、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、種子噴播表土穩(wěn)定劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染抑制劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料以及木材處理劑等劑類的方法、廢水處理方法、脫氧方法、木材處理方法、混凝土處理方法以及土壤處理方法。
背景技術：
原先，人們已知利用酶，例如擔子菌類及半知菌類生產的蟲漆酶以及利用多酚氧化酶使酚類化合物高分子化(Journal ofBiotechnology,13,229～241,1990)。然而，菌類生產的蟲漆酶及多酚氧化酶，由于其最佳反應pH處于酸性范圍，在用這些酶催化、加速高分子化反應時，反應要在酸性至中性的pH范圍內實施，因此，該高分子化反應的速度不可能很高。另外，可以與這些酶反應的多種天然有機化合物是多酚化合物，雖然這些多酚化合物的溶解度，在酸性至中性的pH范圍內降低，然而，由于酶的最佳反應pH處于酸性范圍內，所以，反應要在酸性至中性的pH范圍內實施，故高濃度的多酚化合物不能高效率地高分子化，這是其缺點。另外，盡管多種多酚化合物在堿性pH范圍內自動氧化加速，但由于原先要在酸性至中性的pH范圍內進行酶的氧化聚合，所以，就不可能有效利用其自動氧化，這是其缺點。
另外，早先人們已知用膽紅素氧化酶可以使酚類化合物等高分子化，并在木質素的高分子化和棉制品的染色方面利用它(WO95-01426號、特開平6-316874號)。然而，如在采用膽紅素氧化酶的將來技術中，酚類化合物等的酶催化聚合是在酸性至中性pH范圍內實施，其高分子化的反應速度不能很高，而用膽紅素氧化酶在堿性pH范圍內加速酚類化合物的高分子化反應未見報道。
發(fā)明的目的本發(fā)明的任務是提供，用酶催化的方法，在堿性pH范圍內使酚類化合物或芳香胺化合物高分子化。
本發(fā)明的又一任務是提供，包括采用具有多酚作用的酶，在堿性pH范圍內，使酚類化合物或芳香胺化合物高效率地高分子化的工序在內的下列物質制備方法增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混和劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、脫臭劑、消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染阻止劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、墨水基料以及木材處理劑等。
本發(fā)明又一任務是提供，含有上述酚類化合物或芳香胺化合物高效地生成的高分子化合物的下列物質增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混和劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、防種子吹出表土穩(wěn)定劑、脫臭劑、消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染阻止劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料以及木材處理劑。
另外，本發(fā)明的另一任務是，利用上述本發(fā)明所用的高分子化反應，從含酚類化合物及芳香胺化合物的廢水中去除該類化合物的處理方法。
另外，本發(fā)明的任務是提供，利用上述本發(fā)明所用的高分子化反應去除溶解氧的脫氧方法。
另外，本發(fā)明的任務是提供，利用上述本發(fā)明所用的高分子化反應的木材處理方法。
另外本發(fā)明的任務是提供，利用上述本發(fā)明所用的高分子化反應的混凝土處理方法。
再，本發(fā)明的任務是提供，利用上述本發(fā)明所用的高分子化反應的土壤改良方法。
發(fā)明的公開本發(fā)明人為了開發(fā)酚類化合物或芳香胺化合物高效率地高分子化的方法，銳意進行研究。而且，出人意料的是，在堿性范圍，特別是在pH8以上的堿性pH范圍內，發(fā)現通過使用具有多酚氧化作用的適當的酶，可以高效地完成酚類化合物或芳香胺化合物的高分子化，實現本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供下列各項。
1)在堿性pH范圍內，使具有多酚氧化作用的酶作用于酚類化合物或芳香胺化合物，使其高分子化，以此為特征的、分子量增大的酚類化合物或芳香胺化合物制備方法。
2)上述1)中記載的制備方法，其特征是在pH8以上的堿性范圍進行高分子化。
3)上述1)或2)中記載的制備方法，其特征是，作為有多酚氧化作用的酶-兒茶酚氧化酶、蟲漆酶、多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶，或膽紅素氧化酶，單獨或幾種組合使用。
4)上述1)～3)的任何一項記載的制備方法，采用培養(yǎng)屬于芽孢桿菌(Bacillus)屬的細菌得到的、具有多酚氧化作用的酶。
5)上述4)中記載的制備方法，其中有多酚氧化作用的酶是培養(yǎng)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)或納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)得到的酶。
6)上述5)中記載的制備方法，其中有多酚氧化作用的酶是培養(yǎng)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)SD 3003(保藏號FERM BP-5801)得到的酶。
7)上述1)～3)任何一項中記載的制備方法，其中具有多酚氧化作用的酶是培養(yǎng)漆斑菌(Myrothecium)屬菌類得到的酶。
8)上述7)中記載的制備方法，其中具有多酚氧化作用的酶是培養(yǎng)疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)或露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)得到的酶。
9)上述8)中記載的制備方法，其中具有多酚氧化作用的酶是培養(yǎng)疣孢漆斑菌SD 3001(Myrothecium verrucaria SD 3001)(保藏號FERM BP-5520)或露濕漆斑菌SD 3002(Myrothecium roridum SD3002)(保藏號FERM BP-5523)得到的酶。
10)上述1)～9)中任何一項記載的制備方法，其中具有多酚氧化作用的酶，是用丁香醛連氮測定活性，在pH 7.5以上的堿性范圍顯示非常合適的pH的酶。
11)上述1)～10)任何一項記載的制備方法，其中酚類化合物是木質素或木質素衍生物。
12)上述11)記載的制備方法，其中木質素衍生物是木質磺酸。
13)上述1)～10)中任何一項記載的制備方法，其中酚類化合物是類黃酮。
14)上述1)～13)任何一項記載的制備方法，其特征是，把苯醌化合物、不飽和脂肪酸、不飽和醇或不飽和烷基化合物，單獨或幾種混合起來加至酚類化合物或芳香胺化合物。
15)上述1)～14)任何一項記載的制備方法，其中抗菌性化合物、抗病毒性化合物、生物驅蟲化合物、殺蟲性化合物或金屬離子共存。
16)上述1)～15)任何一項記載的制備方法，是在0～100℃的溫度進行高分子化。
17)含有上述1)～16)任何一項記載的方法制備的高分子化合物的增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混合劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、種子吹出表土穩(wěn)定劑、脫臭劑、消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染阻止劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料或木材處理劑。
18)包括上述1)～16)任何一項記載的酚類化合物或芳香胺化合物進行高分子化的工序在內的下列物質制備方法增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混和劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、種子噴播表土穩(wěn)定劑、脫臭劑、消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染阻止劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料或木材處理劑。
19)按照上述1)～16)任何一項記載的方法，其特征是，把廢水中的酚類化合物或芳香胺化合物高分子化而將其去除的廢水處理方法。
20)一種脫氧劑，其特征是含有在堿性pH范圍內使用的酚類化合物或芳香胺化合物以及上述1)～16)中具多酚氧化作用的酶。
21)一種木材處理方法，其特征是，用具有多酚氧化作用的酶，與酚類化合物或芳香胺化合物一起浸漬木材，酚類化合物或芳香胺化合物在木材中高分子化。
22)把具有多酚氧化作用的酶，與酚類化合物或芳香胺化合物一起，添加至混凝土中，酚類化合物或芳香胺化合物在混凝土中高分子化，以此為特征的混凝土處理方法。
23．把具有多酚氧化作用的酶，與酚類化合物或芳香胺化合物一起添加至土壤中，酚類化合物或芳香胺化合物在土壤中高分子化，以此為特征的土壤處理方法。
發(fā)明的詳細說明〔多酚氧化酶〕本發(fā)明目的中使用的酶，最好是在堿性pH具有多酚氧化作用的酶。作為這種酶的例子，可以舉出微生物，例如由真菌或細菌產生的，或由植物產生的兒茶酚氧化酶、蟲漆酶、多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、或膽紅素氧化酶等多酚氧化酶。另外，除這些酶外，在堿性pH具有多酚氧化作用的任何蛋白質也可在本發(fā)明中使用。
本發(fā)明使用的在堿性pH范圍具有多酚氧化作用的酶、為實施良好效率的高分子化反應，希望多酚氧化反應最合適的反應pH處于pH 7.5以上的堿性區(qū)內。具體的是希望這些酶用下列丁香醛連氮測定活性，在pH7.5以上的堿性區(qū)具有最適pH值的酶。
本發(fā)明的目的中使用的產生酶的微生物，其實例可舉出如下作為真菌，屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)的有曲霉屬(Aspergillus)、葡萄孢屬(Botrytis)、漆斑菌屬(Myrothecium)、青霉菌屬(Penicillium)、多毛孢菌屬(Pestalotia)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、Tricoderma，理想的是屬于構巢曲菌(Aspergillusnidulaus)、灰質葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、露濕漆斑菌(Myrothecium roridum)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、Myrothecium prestonii、Myrothecium leucotrichum、菌核青霉(Penicillium sclerotiorum)、微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)、掌狀盤多孔孢(Pestalotiu palmarum)、Rhizoctoniapraticola、Tricoderma reesei、Tricoderma viride的菌株。其中，特別理想的是疣孢漆斑菌SD 3001(Myrothecim verrucaria SD3001)(1995年5月29日，以FERM P-14955，保藏在日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號的通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所，1996年4月24日作為FERM BP-5520移至國際保藏)或露濕漆斑菌SD 3002(Myrothecium roridum SD 3002)(1995年5月29日以FERM P-15255，保藏在日本國茨城縣的筑波市東1丁目1番3號的通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所，1996年4月24日作為FERM P-5523移至國際寄存)。
其他的理想真菌，屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)、灰側耳菌屬(Pleurotus)、香茹屬(Lentinus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、假蜜環(huán)菌屬(Amrillariella)、火茹屬(Flamulina)、蘑茹屬(Agaricus)、鬼傘屬(Coprinus)、Phanerochaete、射脈菌屬(Phlebia)、革裥菌屬(Lenzites)、鈣囊蘑屬(Melanoleuea)、鱗耳屬(Pholiota)、韌革菌屬(Stereumu)、多孔菌屬(Polyporus)、擬多孔菌屬(Polyporellus)、微孔菌屬(Microporus)、擬蟲孔菌屬(Fomitopsis)、堅盤(吸蟲)屬(Pycnoporus)、桂菌屬(Trametes)、革蓋菌屬(Coriolus)、迷孔菌屬(Daedaleopsis)、硬孔菌屬(Rigidoporus)、層孔菌屬(Fomes)、靈芝屬(Ganoderma)、Trachyderma、銹革屬(Hymenochaece)、纖孔菌屬(Inonotus)，理想的是屬于白黃側耳(Pleurotus cornucopiae)、糙皮側耳(Pleurotusosteratus)、香茹(Lentinus edodes)、裂褶菌(Schizophyiiumcommune)、假蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)、Flammulinavelutipes、二孢蘑茹(Agaricus bisporus)、毛頭鬼傘(Coprinuscomatus)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、Coprinus congregatus、Phanerochaete chrysosporium、射脈菌(Phlebia radiata)、樺革裥菌(Lenzites betulina)、Melanoleuca verrucipos、光帽鱗傘(Pholita nameko)、毛韌革菌(Stereumu hirsutum)、鱗多孔菌(Polyporus squamosus)、Polyporullus badius、扇狀小孔菌(Microporus flabelliformis)、松生擬層孔菌(Fomitopsispinicola)、Pycnoporus coccineus、東方栓菌(Trametesorientalis)、采絨革蓋菌(Coriolus versicolor)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、三色擬迷孔菌(Daedaleopsis tricolor)、環(huán)紋硬孔菌(Rigidoporus zonalis)、木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)、靈芝(Ganoderma lucidum)、Trachyderma tsunodae、褐赤刺革菌(Hymenochaete rubiginasa)、Inonotus mikadoi的菌株。
其他的真菌是屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)的柄孢殼菌屬(Podospora)、脈孢菌屬(Neurospora)、Monocillum，理想的是屬于Podospora anserina、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、Monocillium的菌株。
作為理想的細菌有嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、納豆芽孢桿菌(Baciuusnatto)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，理想的是含有屬于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)的菌株。其中，特別理想的是地衣芽孢桿菌SD 3003(Bacillus licheniformis SD 3003)(1995年12月28日作為FERMP-15383保藏在日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號的通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命土學工業(yè)技術研究所，1997年1月28日作為FERM P-5801移至國際寄存)。
還包括屬于其他理想細菌的菌株，固氮羅菌屬(Azospiriuum)，理想的是生脂固氮羅菌(Azospirillum lipoferum)，或者放線菌目(Actinomycetales)，例如鏈霉菌屬(Streptomyces)，理想的是抗生鏈霉菌(Streptomyces antibioticus)，或者氣桿菌屬(Aerobacter)，理想的是產氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)。
本發(fā)明使用的含酶的幾種理想的植物包括，歐亞槭屬(Acerpseudoplatanum)、薯蕷屬(Dioscorea)，秋葵屬(Abelmoschus)、番石榴屬(Psidium)、向日葵屬(Helianthus)、馳鈴薯、蘋果、南瓜、黃瓜、小麥、紫苜蓿等?！裁傅闹苽洹潮景l(fā)明使用的酶，除用上述微生物，例如屬于真菌或細菌的菌株及其變異株培養(yǎng)得到的以外，也可用基因工程菌來制備。即，將編碼上述酶蛋白的DNA序列與在宿主生物中有表達機能的適當的啟動子，操縱子和終止子DNA序列放在一起，以及為了在宿主生物中復制載體而將其插入到有復制起點的DNA載體中，從而得到表達載體和轉化的宿主細胞，還有將編碼上述酶蛋白的DNA序列與在宿主生物中有表達機能的適當的啟動子，操縱子和終止子DNA序列放在一起，以及為了在宿主生物中復制載而將其插入到有復制起點的DNA載體中，從而得到表達載體和轉化的宿主細胞，將該轉化細胞在能表達酶蛋白的條件下進行培養(yǎng)，進一步可以從培養(yǎng)基中回收該酶蛋白的生產方法。
為了取得編碼本發(fā)明涉及的酶蛋白的DNA片段，用上述微生物，例如，把屬于真菌或細菌菌株cDNA或基因組庫作為分離源，按照本發(fā)明涉及的酶蛋白的氨基酸序列所合成的寡核苷酸作探針的釣出目的DNA片斷，或者選擇表達氧化酶活性的克隆，或者選擇克隆，生產對上述酶蛋白有抗體反應的蛋白質等經常用的方法來生產。
本發(fā)明有關的酶蛋白，也可從來自上述植物的種子，或者果實、葉片等提取制備。
另外，為了得到本發(fā)明有關的酶蛋白，對屬于真菌或細菌的菌株及其變異株進行的培養(yǎng)，可以使用通常用的合成培養(yǎng)基以及含有機碳源及有機氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)時，添加作為金屬鹽的Cu2+離子濃度為0.001mM～10mM，理想的為0.01mM～1mM。
本發(fā)明有關的多酚氧化酶在分泌到真菌或細菌的菌體外的場合，可以用已知的方法從培養(yǎng)基中加以回收。其回收次序是，采用離心分離或過濾、膜分離，從培養(yǎng)基分離細胞，例如包括用離子交換層析法進行層析分離的一系列程序。另外，用超濾膜的膜濃縮也有效。在酶蛋白蓄積在真菌或細菌菌株內的場合以及存在于植物組織內的場合，用已知方法，可以從菌體組織及植物組織回收它。其回收次序是，用勻漿法對組織加以機械破壞，用離心分離或過濾、膜分離、分離、萃取出酶蛋白質溶液，例如，包括用離子交換層析法等進行層析分離法一系列程序。另外，用超濾膜的膜濃縮也有效。〔活性測定法〕在本發(fā)明中，具有多酚氧化作用的酶蛋白質其多酚氧化活性的測定是于20℃，在含有20ppm的丁香醛連氮和100mM的Tris-HCl緩沖劑或磷酸鉀緩沖劑的水溶液中，用合適的反應pH進行反應，測定525nm的吸光度。而且，把在1分鐘內氧化1μmol的丁香醛連氮的活性量定義為1單位(下面簡寫為U)?！哺叻肿踊磻椒捌鋺谩吃谟帽痉椒ㄟM行分子量增大的酚類化合物或芳香胺化合物制備時，酚類化合物或芳香胺化合物的濃度為0.01～90％，理想的為1～80％。另外，反應溫度為0～150℃，理想的為0～100℃。并且，反應的pH為7.0～12，理想的為7.5～10。另外，所用酶的活性濃度為1～10000U/L，理想的為10～2000U/L。酶的活性濃度，希望根據目的加以調整。即，在想要達到快速高分子化及凝膠化或固化的場合，最好在高活性濃度下進行反應。另外，如在低活性濃度進行反應，則高分子化反應進行平穩(wěn)，可以得到作為液狀物質的比較均勻的高分子物溶液，當再繼續(xù)進行反應時，則整個反應液進行平穩(wěn)地凝膠化反應。在達到適當的聚合度時，添加NaOH、NH3、Na2CO3、CaCO3等堿以及堿鹽，添加鹽酸、硫酸、硝酸等酸、添加已知的酶抑制劑，或于100℃加熱處理15分鐘，使反應停止。
另外，凝膠化了的酚類化合物或芳香胺化合物，如果需要，通過于50℃～230℃加熱，可以再使其溶解。在用作分散劑、粘合劑、涂料等時，這樣的熱溶解性是有用的性質。另外，在熱熔化后，添加熱水等，使其分散，溶解，分子量非常高的酚類化合物或芳香胺化合物可作為溶液得到。
另外，在加熱的目的是促進硬化時，也可添加糠醇和糖等多元醇。另外，為了得到生理活性物質的固定物質或能緩慢釋放生理活性物質的材料時，可將生理活性物質包含在高分子化合物中，或在抗菌化合物、抗病毒性化合物、生物驅蟲化合物、殺蟲化合物或金屬離子共存時進行高分子化反應，或在高分子化反應后，添加抗菌化合物、抗病毒化合物、生物驅蟲化合物、殺蟲性化合物或金屬離子。用作此目的的抗菌化合物、抗病毒化合物、生物驅蟲化合物、殺蟲性化合物或金屬離子，可以使用早先已知的多種物質。
本發(fā)明所用的高分子化反應，是用具有多酚氧化作用的酶作為氧化催化劑，用空氣中的氧氣作為氧化劑，這就使本發(fā)明在廣泛的領域內使用成為可能。另外，在大量生產高分子化物的場合，反應液用機械攪拌，以及把空氣或氧氣通入反應體系的操作是有效的。另外，向反應液添加過氧化酶和過氧化氫，或添加代替過氧化氫的、可以生成過氧化氫的氧化酶及其基質，則以氧氣作氧化劑的本發(fā)明反應，和以過氧化氫作氧化劑的反應也可同時進行?！卜宇惢衔锘蚍枷惆坊衔铩潮景l(fā)明中作為高分子化對象的酚類化合物或芳香胺化合物，是本發(fā)明所用酶可以氧化的任何一種化合物均可使用。
這樣的酚類化合物或芳香胺化合物的具體例子有木質素、木質磺酸、腐殖酸、硝基腐殖酸、丹寧酸、兒茶酸、浸食子酸、漆酚、橙皮苷、綠原酸、日扁柏醇、焦兒茶酚、氫醌、叔丁基氫醌、苯基氫醌、三甲基氫醌、乙基-3,4-二羥基桂皮酸、焦棒酚、棒酸月桂酯、棒酸辛酯、丁香苷酸、阿魏酸、香草醛、鄰香草醛、香草酸、香草醇、抗壞血酸、1,2-二羥基萘、2,3-二羥基萘、6,7-二羥基-2-萘磺酸、1,2,10-蒽三酚、茜素、醌茜、鄰亞苯基二胺、對亞苯基二胺、3,4-二氨基苯并苯酮、鄰茴香胺、對茴香胺、鄰氨基苯酚、對氨基苯酚、1,2-二氨基蒽醌，鄰氨基苯酚、對氨基苯酚、1,2-二氨基蒽醌、1,4-二氨基蒽醌。
除上述化合物外，本發(fā)明所用的酶因其可以氧化物質，故可作為高分子化物原料或作為高分子化反應的催化劑。這樣的化合物的例子有ABTS(2,2′-偶氮二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、膽紅素、抗壞血酸、槲皮黃素、蕓香苷、愈皰木酚、4-甲氧基苯酚、聯苯酚、4,4′-乙烯基聯苯胺、甲基氫醌、1-羥基苯并三唑、6-羥基-2,4,5-三氨基嘧啶、4,5,6-三氨基嘧啶、2,3-二羥基噠嗪、3,6-二羥基噠嗪、2,3-二羥基吡啶、4-羥基-3-甲氧基安息香酸、4,5-二氨基-6-羥基-2-巰基嘧啶、2,3-二氨基吡啶、2,5-二羥基-1,4-苯醌、2,5-二羥基安息香酸、3,4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1,2-二酮、3-(3,4-二羥基苯)-L-丙氨酸、2-氨基-3-羥基吡啶、3-氨基-2-甲氧基二苯并呋喃、2,4-二甲氧基苯胺、2,5-二甲氧基苯胺、3,4-二甲氧基苯胺、2′,5′-二甲氧基乙酰苯、3′,4′-二甲氧基乙酰苯、1,4-二甲氧基苯、鄰二甲氧基苯、2,3-二甲氧基安息香酸、2,5-二甲氧基安息香酸、藜蘆酸、3,4-二甲氧基芐醇、3,4-二甲氧基苯乙胺、(3,4-二甲氧基苯基)乙酸，(3,4-二甲氧基苯基)乙腈、4-芳基-2-甲氧基苯酚、2-甲氧基-4-(N-乙基-3,3-′二苯二丙基胺)苯酚、2-甲氧基-5-甲基苯胺、2-甲氧基-5-硝基苯胺、4-甲氧基-2-硝基苯胺、3-甲基水楊酸、3-甲基兒茶酚、4-甲基兒茶酚、棒酸甲酯、棒酸丙酯、3,4,5-三甲氧基苯胺、3,4,5-三甲氧基苯酚、酚酮、紅紫棒精、水楊醛肟、3-氨基-5,6,7,8-四氫-2-茶酚、1,5-二羥基萘、3,5-二羥基-2-萘(甲)酸、4-羥基-1-萘磺酸、呋喃、2,3-二氫-9,10-二羥基-1,4-蒽二酮、各種偶氮系列染料。
另外，為了調節(jié)高分子化物的物性，這些酚類化合物或芳香胺化合物也可以幾種組合起來使用。
另外，在本發(fā)明制備高分子酚類化合物或芳香胺化合物時，按照同樣的反應路線得到的高分子化的苯醌也可以共存。這樣的苯醌類化合物的實例有蒽醌-2-磺酸、蒽醌-1,5-二磺酸、蒽醌-2,6-二磺酸、蒽醌-2-羧酸、1-氨基蒽醌、2-氨基蒽醌、蒽縫酚、氨基萘、1,8-二羥基蒽醌、莰烷酮、脫氫抗壞血酸、2-羥基-1,4-萘醌、靛紅、5-硝基靛紅、各種蒽醌系列染料。另外，油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，或者油醇等不飽和醇，并且，角鯊烯等不飽和烷基等能自動氧化的物質也可共存，可在酶反應的同時用空氣氧化進行聚合。
按照本發(fā)明制備的高分子酚類化合物或芳香胺化合物中，尤其是木質素、木質磺酸、腐殖酸、硝基腐殖酸、丹寧、兒茶酸、漆酚、橙皮苷、日扁柏醇等天然產物或天然產物的衍生物高分子化物，因其對環(huán)境及人體的安全性高，所以，用途大，利用該高分子化合物的特性，在增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混和劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、種子噴播表土穩(wěn)定劑、脫臭劑消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染阻止劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料或木材處理劑等各種領域的利用成為可能。還有，在這些用途中，也可與各種領域通常所用的各種添加劑成分并用。
并且，在這些用途范圍內，用本發(fā)明公開的方法，天然的或非天然的酚類化合物或芳香胺化合物，以平穩(wěn)的反應條件進行高分子化，通過調節(jié)粘性、粘接性、保水性、水溶性、耐水性、彈性、強度等物性及生理作用，使高分子化合物的優(yōu)良性能廣泛應用成為可能。
另外，本發(fā)明使用的具有多酚氧化作用的酶，在堿性范圍內，通過與含有酚類化合物或芳香胺化合物的廢水作用，使廢水中的酚類化合物或芳香胺化合物高分子化，從而易于濃縮，從廢水中分離、去除高分子化了的酚類化合物或芳香胺化合物的廢水處理方法成為可能。這樣的利用法特別是在工業(yè)部門和作為反應基質，在紙漿工業(yè)部門有木質素或木質素衍生物，在印染部門有偶氮系列，蒽醌系列等染料。在這樣的高分子化反應后，通過添加絮凝劑進行的絮凝沉淀處理以及活性炭處理、過濾處理，有效地把廢水中的酚類化合物或芳香胺化合物從廢水中濃縮、分離、去除。
另外，本發(fā)明所用的具有多酚氧化作用的酶，在堿性pH范圍內與酚類化合物或芳香胺化合物作用而消耗溶解氧，利用它來脫氧或可用來制備脫氧劑。在這樣的脫氧法及脫氧劑中，天然的或非天然的多種酚類化合物或芳香胺化合物可能使用，使溶解氧濃度快速降低，它們是極有用的。
另外，本發(fā)明所用的具有多酚氧化作用的酶，與酚類化合物或芳香胺化合物一起，浸漬木材，酚類化合物或芳香胺化合物以及木材中早先含有的木質素等多酚化合物，在木材中通過高分子化，使木材浸漬處理后的干燥工序作業(yè)性能提高，通過木材蒸煮處理或用高溫蒸汽處理，降低木質素分解，木材強度增大，由于木材中的原氣環(huán)境得到保持。完善，使微生物繁殖得到抑制。
另外，按照本發(fā)明，用多酚氧化酶作用于染料或染料前驅體，以及用多酚氧化酶作用于木材，在木材中生成著色物質，或者，著色物質和木材中早先含有的木質素等多酚化合物使在木材中進行復合高分子化成為可能，由此，可將木材進行比較牢固地染色。著色處理。還有，在上述木材染色。著色處理中，人們已知多種多酚氧化酶可使木材中的著色物質木質素發(fā)生漂白，本發(fā)明的木材染色。著色處理，由于是酶的漂白和染色。著色處理可以同時進行，所以，在謀求工序的縮短、色調的提高是極有用的。
另外，把本發(fā)明的具有多酚氧化作用的酶，添加至與酚類化合物或芳香胺化合物共存的混凝土中，通過酚類化合物或芳香胺化合物在混凝土中的高分子化，改善其坍落損耗，提高混凝土強度，降低混凝土中的氧濃度，由此使鋼筋生銹得到抑制。
實施本發(fā)明的最佳方式下面給出本發(fā)明的代表性實施例，更具體地加以說明。但是，這些是簡單地舉例，本發(fā)明不受此局限。
還有，在下面的實施例中，高分子化了的酚類化合物或芳香胺化合物的分子量分析，是用50mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)或0.1mM的硫酸鈉水溶液作洗提液，用Shodex RI(差示折射率檢測器，昭和電工制)作檢測器，并且用Shodex PROTEIN KW-802.5(雙聯，昭和電工制)，或把Shodex PROTEIN KW802.5(昭和電工制)和ShodexOHpak SB-804HQ(昭和電工制)連結一起作為柱子，用HPLC進行分析。實施例1培養(yǎng)及粗純化、濃縮在用500ml容積的燒瓶的培養(yǎng)裝置中，添加含0.134％Na2HPO4·12H2O、O.03％KH2PO4、1％麥芽糖、1％胨、0.1％酵母提取物、0.05％MgSO4·7H2O、0.1mM CuSO4、1mM MnCl2、2mM CaCl2的1000ml培養(yǎng)基，再加20％Na2CO3調至pH7.8，接種地衣芽孢桿菌SD3003(保藏號FERM BP-5801)，于50℃振蕩培養(yǎng)16小時后，把培養(yǎng)溫度降至35℃，再進行培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，于4℃離心分離，得到除菌的培養(yǎng)液。為將其再純化、濃縮、用硫酸銨分離是有效的，在20～60％的飽和硫酸銨濃度中，大部分多酚氧化酶活性可作為沉淀被回收。得到的硫酸銨沉淀，用1OmM Bis·Tris HCl緩沖溶液(pH7.0)進行透析，用超濾膜進一步純化、濃縮，得到分子量在10000～100000范圍的粗純化濃縮水溶液(0.8U/ml)。
然后，該培養(yǎng)液的一部分，用微型旋轉過濾料罐(CAT.NO:PTGCOMP04，三リポァ社制)的微型旋轉超濾系統(tǒng)(ミリポァ社制)濃縮，得到分子量大于10000的級分。將其再用2000ppm NH4HCO3透析后，加以冷凍干燥，得到粗純化物的冷凍干燥物。冷凍干燥物的多酚氧化酶活性是15U/mg。
還有，該冷凍干燥物的水溶液，在含銅蛋白質特有的600nm附近顯示吸收極大值。
然后，該培養(yǎng)液的一部分，用微型旋轉。過濾料罐(CAT.NO:PTGCOMP04，三リポァ社制)的微型旋轉超濾系統(tǒng)(ミリポァ社制)濃縮至分子量大于10000的級分。
再將其對200ppm NH4HCO3透析后，進行冷凍干燥，得到粗純化物的冷凍干燥物。冷凍干燥物的多酚氧化酶活性是10U/mg。
還有，該冷凍干燥物的水溶液，在含銅蛋白質特有的600nm附近顯示吸收極大值。實施例4高分子化反應用實施例1記載的粗精細濃縮水溶液進行下列〔4-1〕～〔4-3〕的高分子化反應，用市場得到的多酚氧化酶〔從TaKaRa得到〕進行〔4-4〕的高分子化反應。〔4-1〕配制反應液1ml，它含有木質磺酸鈉(從Aldrich ChemicalCompany,Inc.得到)20％，以及作為聚酚氧化酶的、活性濃度為300U/L的粗純化濃縮水溶液，在玻璃試管內，于反應溫度70℃，以100rpm進行振蕩，實施反應。用微量硫酸把反應液pH調至7.5。反應開始后，反應液的色調馬上加深，6小時后，可認為高分子化已顯著進行，20小時后，反應液大部分固化?！?-2〕另外，把多酚氧化酶的活性濃度變?yōu)?0U/L進行反應的場合，反應開始后20小時，反應液整體為粘性高的液體，在粘度上升的同時，分子量加大，再繼續(xù)反應20小時后，發(fā)現有部分固化。還有，用于分子量分析的樣品是選取部分反應液，在水浴中，于約100℃進行加熱處理15分鐘，使反應停止，配制完成?！?-3〕另外，用濃度20％(W/V)木質素(堿)(從nacalai tesque得到)代替木質磺酸，用300U/L的多酚氧化酶活性濃度，在pH7.5實施反應時，在反應開始24小時后，整個反應液為高粘性液體。〔4-4〕還有，配制反應液100ml，它含有20(W/V)％的木質磺酸鈉鹽，以及作為多酚氧化酶的、活性濃度為300U/L的、多酚氧化酶商品，在容積500ml的燒瓶內，于反應溫度25℃，以100rpm進行振蕩，實施反應。這里所用的多酚氧化酶商品，用丁香醛連氮測定活性，由于氧化酶在pH6～7顯示有合適的反應pH，所以，用少量硫酸調節(jié)反應液pH至6.5。反應開始后，反應液的色調立即變深，然而，為了使反應液的大部分固化，反應時間需約80小時。實施例5高分子化反應用實施例2記載的冷凍干燥物，進行〔5-1〕～〔5-3〕的高分子化反應?！?-1〕配制反應液100ml，其含有20％(W/V)的木質磺酸鈉鹽，以及作為多酚氧化酶的冷凍干燥物，其濃度為20ppm(300U/L)，在容積500ml的燒瓶內，于反應溫度25℃，以100rpm進行振蕩，實施反應。用NaOH把反應液pH調至9。反應開始后，反應液的色調立即加深，3小時后，認為已進行了顯著的高分子化，10小時后，反應液的大部分固化。另外，把多酚氧化酶的添加量變?yōu)?ppm進行反應的場合，反應開始后20小時，整個反應液為高粘性液體，再繼續(xù)反應20小時后，發(fā)現己部分固化。還有，用作分子量分析的樣品是選取部分反應液，在水浴中，于90℃進行加熱處理5分鐘，反應停止，配制完成?！?-2〕另外，用濃度20％(W/V)的木質素(堿)代替木質磺酸，用300U/L的多酚氧化酶活性濃度、pH9、反應溫度25℃實施反應。反應開始后，反應液的色調立即加深，進行高分子化反應，在24小時后，反應液的大部分固化。〔5-3〕
還有，在木質磺酸鈉鹽為20％(W/V)、多酚氧化酶的活性濃度為300U/L時，用少量硫酸調節(jié)反應液pH至7，于反應溫度25℃實施反應。反應開始后，反應液的色調立即變深，但未發(fā)現反應液固化。實施例6高分子化反應用實施例3記載的凍結干燥物進行下列〔6-1〕～〔6-2〕的高分子化反應。〔6-1〕配制反應液100ml，其含有20％(W/V)的木質磺酸鈉鹽，以及作為多酚氧化酶的、濃度為30ppm(300U/L)的冷凍干燥物，在容積500ml的燒瓶內，于反應溫度25℃，以100rpm進行振蕩，實施反應。用NaOH把反應液的pH調至9。反應開始后，反應液的色調立即變深，3小時后，認為已顯著進行了高分子化，10小時后，反應液的大部分固化?！?-2〕另外，用20％(W/V)濃度的木質素(堿)代替木質磺酸，在300U/L的多酚氧化酶活性濃度、pH9、反應溫度25℃實施反應。反應開始后，反應液的色調立即變深，24小時后，反應液的大部分固化。實施例7高分子化反應配制反應液100ml，其含有20％(W/V)的木質磺酸鈉鹽，以及300U/L濃度的作為多酚氧化酶的商品膽紅素氧化酶(冷凍干燥物)(從Sigma公司得到)。在容量500ml燒瓶內，于反應溫度25℃，以100rpm進行振蕩，實施反應。這里所用的商品膽紅素氧化酶，用丁香醛連氮測定活性，由于酶在pH8～9有合適的反應pH，故不用調節(jié)高分子化反應的反應液pH，就那樣在ph8.5實施反應。反應開始后，反應液的色調立即變深，8小時后，可認為已進行了顯著的高分子化，24小時后，反應液的大部分固化。
另外，用20％(W/V)濃度的木質素(堿)來代替木質磺酸的添加，在pH8.5實施反應時，在反應開始50小時后，反應液的大部分固化。
另外，添加5000ppm濃度的(+)-兒茶酸·H2O(從Sigma得到于20％(W/V)木質磺酸鈉鹽的水溶液中，再從300U/L的活性濃度添加作為多酚氧化酶的實施例2記載的冷凍干燥物，于反應溫度25℃,pH9進行高分子化反應，得到含有兒茶酸的固體(凝膠狀)木質磺酸。對該固體用上述實施例同樣的方法觀察其抗菌性，發(fā)現在木質磺酸小片上部及周圍約8mm的范圍內細菌的繁殖被阻止，表明其作為抗菌劑及抗菌物質保持劑是有的。
還有，用活性濃度30U/L的實施例1記載的粗純化濃縮水溶液代替2ppm的實施例2記載的冷凍干燥物作為多酚氧化酶，其他同上述實施例處理對亞苯基二胺。同樣，來自對亞苯基二胺的大部分高分子化合物可以從水溶液濾出。
還有，用活性濃度30U/L的實施例1記載的粗純化濃縮水溶液代替實施例2記載的4ppm冷凍干燥物，其他與上述實施例同樣，測定耗氧速度，反應開始后第1小時的溶解氧濃度減少至反應開始時的0.2％，同樣顯示有高的脫氧能力。
工業(yè)上利用的可能性按照本發(fā)明，酚類化合物或芳香胺化合物可效率高地完成高分子化反應，并且高效地提供含有該化合物的增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混合劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、種子噴播表土穩(wěn)定劑、脫臭劑、消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染阻止劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料或木材處理劑。
另外，通過利用本發(fā)明，提供含有酚類化合物或芳香胺化合物進行高分子化的工序在內的，高效地制備下列物質的方法增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混合劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、種子噴播表土穩(wěn)定劑、脫臭劑、消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染阻止劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料或木材處理劑。
并且，根據本發(fā)明，提供利用酚類化合物或芳香胺化合物的高分子化反應的廢水處理方法、脫氧方法、木材處理方法以及土壤處理方法。
另外，本發(fā)明用的地衣芽孢桿菌SD 3003(保藏號FERM BP-5801)、疣孢漆斑菌SD 3001(保藏號FERM BP-5520)以及露濕漆斑菌SD 3002(保藏號FERM BP-5523)在本發(fā)明高分子化物制備時特別有用。
權利要求
1．一種木材處理方法，其特征是把具有多酚氧化作用酶與酚類化合物或芳香胺化合物一起浸漬木材，酚類化合物或芳香胺化合物在木材中進行高分子化。
全文摘要
提供用具有多酚氧化活性的酶,在堿性環(huán)境中采用酶催化來制備酚類化合物或芳香胺化合物的高分子化物的方法,以及該法得到的高分子化物在增粘劑、穩(wěn)定劑、絮凝劑、乳化劑、分散劑、保水劑、抗氧化劑、粘合劑、混凝土混合劑、染料、涂料、石油回收劑、土壤改良劑、種子噴播表土穩(wěn)定劑、脫臭劑、消臭劑、農藥展開劑、飼料粘合劑、殺菌劑、抗菌劑、病毒感染抑制劑、生物附著防止劑、生物驅蟲劑、殺蟲劑、泥敷劑、油墨基料或木材處理劑中的應用,并且提供利用上述高分子化反應的廢水處理方法、脫氧方法、木材處理方法、混凝土處理方法以及土壤處理方法。
文檔編號A61P31/04GK1312150SQ0111096
公開日2001年9月12日 申請日期1997年5月20日 優(yōu)先權日1996年6月6日
發(fā)明者愛知后貴, 大野律子 申請人:昭和電工株式會社