專利名稱：茶多酚在制備抑制β－淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶多酚在制備抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用。
β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β-protein,Aβ)是老年斑(Senile Plaques,SP)中的主要成份，它來自于一種跨膜糖蛋白，即β-淀粉樣前體蛋白(Amyloid-β Precursor Protein,APP),Aβ的不溶性纖維狀沉積被認(rèn)為是導(dǎo)致老年性癡呆(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)病的主要原因。AD的發(fā)病率隨著年齡的增大而逐漸增加，并隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展，其發(fā)病人數(shù)急劇上升?，F(xiàn)已成為導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。另外，Aβ聚集和纖維形成還能導(dǎo)致血管性淀粉樣病變。
至今仍未能找到對(duì)AD有效的治療方法?，F(xiàn)有治療的目的主要是控制行為學(xué)方面的異常癥狀，改善語言、記憶等認(rèn)知功能，減緩疾病的發(fā)展速度以及延緩病癥的發(fā)生。藥物的運(yùn)用主要包括如下幾方面①乙酰膽堿酯酶抑制劑，針對(duì)AD患者腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元大量丟失，乙酰膽堿遞質(zhì)嚴(yán)重缺乏，運(yùn)用乙酰膽堿酯酶抑制劑，可增加腦內(nèi)乙酰膽堿的含量，促進(jìn)神經(jīng)元功能的恢復(fù)。②興奮性氨基酸受體拮抗劑，保護(hù)細(xì)胞免受興奮性遞質(zhì)細(xì)胞毒性作用的攻擊。③抗炎藥物，由于在老年斑淀粉樣變核心的周圍存在著反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞，有人因此提出了AD的慢性炎癥學(xué)說，并利用合適的抗炎藥來達(dá)到預(yù)防和治療的目的。④神經(jīng)營養(yǎng)因子，它能特異性的作用于神經(jīng)元，刺激神經(jīng)元的可塑性，促進(jìn)神經(jīng)元的生長、存活，維護(hù)細(xì)胞的功能。⑤其它，如雌激素的替代治療，腦細(xì)胞代謝激活劑，鈣離子拮抗劑的運(yùn)用等。雖然上述藥物在臨床應(yīng)用中已顯示出一定的療效，但在長期使用過程中，由于存在著嚴(yán)重的不可避免的副作用，或者來源有限且不易通過血腦屏障，更缺乏可以肯定的有效性和特異性，因此，這類藥物的運(yùn)用有待于進(jìn)一步的研究。
目前，化學(xué)合成藥物的毒副作用嚴(yán)重地困擾著醫(yī)學(xué)界，回歸自然，返樸歸真成為人們對(duì)涉及自身生存條件的新的渴求，人們比以往更注目于天然藥物，近年來，人們把這些藥物應(yīng)用于AD的防治已積累了大量行之有效的經(jīng)驗(yàn)，如中藥復(fù)方黃連解毒湯，當(dāng)歸芍藥散，鉤藤散等，既可治療AD的精神癥狀，對(duì)抗健忘，又能改善患者體質(zhì)。運(yùn)用天然藥物治療AD至少有兩點(diǎn)優(yōu)勢(1)作用的多靶點(diǎn)并對(duì)人體機(jī)能進(jìn)行整體性的調(diào)節(jié)；(2)副作用小。因此，對(duì)于AD這種神經(jīng)系統(tǒng)的慢性退行性疾病而言，天然藥物的開發(fā)和運(yùn)用具有更大的優(yōu)勢和更廣闊的發(fā)展前景。目前，雖然天然制劑對(duì)AD的治療取得了一定的效果，然而由于每個(gè)患者有不同的辨證特征，藥物的療效差異較大，且現(xiàn)有藥物重在改善患者的臨床癥狀，但不能阻遏病情的發(fā)展。
Aβ聚集和纖維形成還能導(dǎo)致血管性淀粉樣病變，進(jìn)而誘發(fā)中風(fēng)等疾患。迄今為止，沒有根治血管性淀粉樣病變的藥物。
茶多酚(Green tea polyphenols)是從茶科植物茶(Cameliasinensis)中提取的物質(zhì)，約占綠茶干重的15％～25％，其結(jié)構(gòu)中含多個(gè)鄰位酚羥基結(jié)構(gòu)，供質(zhì)子氫的能力很強(qiáng)，其主要含有幾個(gè)主要兒茶素化合物表沒食子兒茶素沒食子酸脂(epigallocatechin gallate,EGCG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表沒食子沒食子酸脂(epicatechin gallate,EGCG)、表兒茶素(epicatechin EC)和沒食子兒茶素(gallocatechin,GC)。茶多酚作為一種天然食品抗氧化劑，1991年已列入我國國家標(biāo)準(zhǔn)。中國專利88108154已報(bào)導(dǎo)其提取方法。李楠等有關(guān)于茶多酚的研究進(jìn)展的綜述[《江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》，1999,11(3),140-141]，報(bào)導(dǎo)了其提供方法及其具抗氧化等生物活性，迄今為止，未見有關(guān)于茶多酚抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成、用于治療血管性淀粉樣病變、老年性癡呆疾病的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的就是為了克服目前治療老年性癡呆、血管性淀粉樣病變無療效好的藥物的缺點(diǎn)，提供療效好、無毒副作用的茶多酚在制備抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物上的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。
茶多酚是從綠茶中提取的上述幾種兒茶素化合物為主的混合物?？梢酝ㄟ^下述幾種方法提取(1)茶葉→熱水浸提→減壓濃縮→氯仿(或二氯甲烷)萃取→有機(jī)層提取咖啡堿(水層→乙酸乙酯萃取精制茶多酚)。(2)茶葉→冷提→減壓濃縮→萃取脂溶性物質(zhì)→乙酸乙酯萃取精制茶多酚。(3)茶葉→80％乙醇(或熱水浸提)→吸附劑吸附式有機(jī)高分子柱吸附→醇洗脫→濃縮干燥精制茶多酚。(4)茶葉→粉碎→熱水浸提→沉淀分離→分離純化→噴霧干燥。還可以通過88108154專利的提取方法提取。
經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn)及加速老化鼠(SAM)的行為學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)表明，茶多酚對(duì)Aβ的作用包括以下方面①清除體內(nèi)的自由基，清除引起Aβ聚集的誘發(fā)因素；②與Aβ結(jié)合阻止其聚集和纖維化；③與Aβ肽自由基結(jié)合抑制Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性作用；④降解已成熟的Aβ纖維，發(fā)揮清除淀粉的效應(yīng)。體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)也顯示，茶多酚對(duì)Aβ樣沉積的抑制作用及其改善加速老化鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，進(jìn)一步提示茶多酚可以干預(yù)Aβ纖維聚集、拮抗其神經(jīng)毒性，達(dá)到治療AD的效果。據(jù)李楠等關(guān)于茶多酚的研究進(jìn)展文獻(xiàn)資料表明，茶多酚屬實(shí)際無毒級(jí)，且無蓄積毒性，因此茶多酚是實(shí)施以Aβ為靶治療AD的理想藥物。當(dāng)然，由于茶多酚能抑制Aβ聚集和纖維形成，茶多酚便具有治療血管性淀粉樣病變的功效。
本發(fā)明的茶多酚制備成抑制Aβ聚集和纖維形成的藥物，由于茶多酚能通過血腦屏障達(dá)到有效濃度，且能通過胃腸道吸收，可以采用口服劑型、包括片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液等，也可加入食物中食用，或添加至食品中作為保健食品食用。
本發(fā)明的茶多酚也可以與目前治療AD的西藥如膽堿酯酶抑制劑如他克林(Tacrine)復(fù)方，制成復(fù)方制劑，使得在治療AD時(shí)達(dá)到標(biāo)本兼治的目的，也可以與其它中藥如當(dāng)歸藥散復(fù)方。
下列實(shí)施例只用于說明本發(fā)明，而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍無任何限制作用。
實(shí)施例1，茶多酚的提取，同中國專利88108154的實(shí)施例的方法，以熱水浸提綠茶，在浸提液中加入石灰水，分離、洗滌沉淀后，用稀酸進(jìn)行轉(zhuǎn)溶沉淀，轉(zhuǎn)溶液即為茶多酚溶液。濃縮干燥為粉狀茶多酚粗品，轉(zhuǎn)溶液經(jīng)有機(jī)溶制萃取后，濃縮干燥即為粗晶態(tài)茶多酚。進(jìn)一步萃取精制，得精制茶多酚。
實(shí)施例2茶多酚膠囊劑。
取精制茶多酚，加滑石粉，混合，在裝膠囊機(jī)中分裝，即得膠囊劑。
實(shí)施例3茶多酚在體外抑制Aβ的聚集和纖維形成一、材料和方法Aβ1-40凍干粉用50mM PBS(pH7.4)稀釋成0.1％(230μM)Aβ，在室溫下(22℃)分別孵育30min和7天，運(yùn)用透射電鏡和硫黃素T(Th-T)熒光分析觀察Aβ纖維的形成，以及茶多酚和維生素E(VE)與Aβ在相同百分濃度下共同孵育時(shí)對(duì)Aβ纖維形成的影響；檢測茶多酚和VE在不同濃度(5×10-4％、5×10-3％、5×10-2％)和不同時(shí)間(孵育第1、2、3、4、5天)對(duì)Aβ纖維形成的抑制作用，同時(shí)觀察這兩種藥物對(duì)已成熟的Aβ纖維結(jié)構(gòu)的影響。二、結(jié)果(一)茶多酚抑制Aβ纖維的形成Aβ在PBS溶液中能自我聚集，產(chǎn)生無定形和纖維型兩種結(jié)構(gòu)，單獨(dú)孵育30min，主要以無定形Aβ存在，未見Aβ纖維形成。孵育7天，可見大量的直而無分枝的Aβ纖維呈晶狀聚集，纖維直徑約8～10nm，類似于AD腦SP中的Aβ纖維，茶多酚的存在，能顯著地阻止Aβ纖維形成，主要表現(xiàn)為無定形的Aβ結(jié)構(gòu)，VE與Aβ共同孵育也可出現(xiàn)Aβ纖維，直徑約3～10nm，呈網(wǎng)狀分布。茶多酚與VE的協(xié)同作用，產(chǎn)生大量直徑為3～5nm呈網(wǎng)狀分布的Aβ原纖維。Th-T分析顯示，茶多酚、VE和它們的協(xié)同作用均能顯著地降低Aβ的熒光強(qiáng)度，以茶多酚的效果最為顯著，在0.1％濃度下三者對(duì)Aβ纖維形成的抑制率分別為94.6％、62.3％和88.7％。(二)茶多酚抑制Aβ纖維形成的劑量和時(shí)間效應(yīng)茶多酚和VE對(duì)Aβ纖維形成的抑制均有濃度依賴性，它們在0.05％濃度附近出現(xiàn)最大抑制率，茶多酚在每一濃度點(diǎn)的抑制率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于VE，且具有較明顯的“平臺(tái)”。茶多酚在每一時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度也顯著小于各組，且能延遲在熒光強(qiáng)度曲線中半高峰出現(xiàn)的時(shí)間(T1/2)。(三)茶多酚對(duì)成熟Aβ纖維的作用茶多酚能使成熟的Aβ纖維降解，形成直徑約3～5nm，長度小于100nm，散在分布的纖維結(jié)構(gòu)。VE也能改變Aβ纖維的形態(tài)，形成直徑為3～5nm的Aβ原纖維，并呈絲網(wǎng)狀連接。Th-T熒光分析表明，茶多酚比VE更顯著地減弱了Aβ纖維的熒光強(qiáng)度。
2．空間探索試驗(yàn)(平臺(tái)象限游泳距離百分比)對(duì)照組在平臺(tái)象限的游泳距離百分比(11.33％)顯著小于TA2組(24.35％)和VE組(20.93％),TA1組在平臺(tái)象限的游泳距離百分比(15.09％)與TA2組間也存在顯著性差異。(二)MSG組化觀察MSG主要分布于海馬、皮質(zhì)深層、梨狀質(zhì)和小腦。海馬的MSG主要成群分布，分布于海馬各層。MSG形態(tài)為圓形和卵圓形，并表現(xiàn)出不同的密度。PAS染色的結(jié)果與MSG非常相似。(三)對(duì)海馬CA1區(qū)MSG數(shù)目、直徑和灰度的影響對(duì)海馬CA1區(qū)MSG數(shù)目、直徑、面積和灰度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，對(duì)照組的顆粒數(shù)(896.37±202.14)與TAI組(787.10±130.85)、TA2組(727.44±201.74)和VE組(767.70±146.23)的顆粒數(shù)相比均無顯著性差異(P＞0.05)。對(duì)照組的直徑和面積(2.04±0.22um,3.29±0.73um2)，顯著大于TA1組(1.85±0.14um,2.69±0.35um2)、TA2組(1.69±0.11um,2.26±0.31um2)和VE組(1.79±0.16um,2.53±0.48um2)(P＜0.05)。而這種差異在對(duì)照組和TA2或VE組之間更為顯著(P＜0.01)。同時(shí)TA1組和TA2組的直徑和面積也存在顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)照組MSG的平均灰度(92.04±13.24)比較TA1組(76.9±12.83)、TA2組(68.43±12.15)和VE組(69.03±15.71)有非常顯著性差異(P＜0.01)。在TA1組和TA2組或VE組之間差異也具有非常顯著性意義(P＜0.01)。TA2和VE組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。從MSG在不同灰度區(qū)的分布觀察，對(duì)照組、TA1組、TA2組和VE組在低密度顆粒區(qū)所占的百分比分別為12.05％、36.52％、47.91％和44.65％，即治療組在低密度區(qū)的顆粒數(shù)明顯增多，相關(guān)分析顯示，行為學(xué)參數(shù)的變化與MSG結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。小結(jié)一、透射電鏡和Th-T熒光分析發(fā)現(xiàn)，茶多酚在體外能強(qiáng)烈地抑制Aβ的聚集和纖維形成，并具有劑量的依賴性。同時(shí)，它還能明顯延遲Aβ老化的時(shí)間曲線中半高峰出現(xiàn)的時(shí)間(T1/2)，表明它不僅可以抑制Aβ的擴(kuò)布聚集，而且還能阻止或延遲Aβ的核化過程。此外，它還可促使成熟的Aβ纖維降解，具備清除淀粉的效應(yīng)。其抑制Aβ纖維形成的能力大大強(qiáng)于VE。
二、FT-IR定量研究表明，茶多酚抑制Aβ纖維形成的機(jī)制在于它可阻止Aβ老化時(shí)β-折疊結(jié)構(gòu)的形成，并促使β-折疊向自由卷曲和α-螺旋轉(zhuǎn)化。
三、EPR的分析結(jié)果顯示，Aβ在PBS中老化時(shí)可產(chǎn)生自由基，茶多酚具有強(qiáng)的清除Aβ肽自由基的能力，并將之轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的半醌自由基。對(duì)EPR譜的線型特征觀察表明，它有比VE更多的供氫位點(diǎn)，從而具有更強(qiáng)的抗氧化能力。
四、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚能有效地干預(yù)外源性Aβ在動(dòng)物腦內(nèi)的纖維形成。在以SAM-P8為AD模型的研究中，茶多酚有意義地減小了SAM-P8海馬中用六胺銀法所顯示的Aβ樣顆粒的聚集密度、直徑和面積，并能顯著改善SAM-P8的學(xué)習(xí)記憶能力。
五、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚對(duì)Aβ的作用包括以下方面①清除體內(nèi)的自由基，消除引起Aβ聚集的誘發(fā)因素；②與Aβ結(jié)合阻止其聚集和纖維化；③與Aβ肽自由基結(jié)合抑制Aβ的毒性作用；④降解已成熟的Aβ纖維，發(fā)揮清除淀粉的效應(yīng)。因此茶多酚是實(shí)施以Aβ為靶治療AD這一新的戰(zhàn)略思想的理想的候藥物。同時(shí)體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)也顯示，茶多酚對(duì)Aβ樣沉積的抑制作用及其改善SAM-P8學(xué)習(xí)記憶的能力，進(jìn)一步提示茶多酚可以通過干預(yù)Aβ纖維聚集、拮抗其神經(jīng)毒性，達(dá)到治療AD的效果。
權(quán)利要求
1.茶多酚在制備抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利1所述茶多酚在制備抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用，其特征在于茶多酚采用口服劑型。
3.根據(jù)權(quán)利1或2所述茶多酚在制備抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用，其特征在于茶多酚與治療老年性癡呆的西藥復(fù)方制成復(fù)方制劑。
4.根據(jù)權(quán)利1或2所述茶多酚在制備抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用，其特征在于茶多酚與治療老年性癡呆的中藥復(fù)方制成復(fù)方制劑。
5.根據(jù)權(quán)利1或2所述茶多酚在制備抑制β-淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用，其特征在于茶多酚添加至食品中制成保健食品。
全文摘要
茶多酚在制備抑制β－淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的藥物中的應(yīng)用，其療效好、無毒副作用，具有抑制β－淀粉樣蛋白聚集和纖維形成的較佳效果，可用來作為治療老年性癡呆、血管性淀粉樣病變的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/353GK1317313SQ0110766
公開日2001年10月17日 申請日期2001年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者姚志彬, 汪華僑, 庾照學(xué) 申請人:姚志彬