專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌多糖抗原疫苗、其生產(chǎn)方法以及此類多糖在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
特別地，本發(fā)明涉及相互關(guān)聯(lián)的三個方面A-疫苗，含有一種肺炎球菌多糖抗原，特別是肺炎球菌多糖結(jié)合物抗原，該疫苗添加有一種來自肺炎鏈球菌的蛋白抗原和一種可選的Th1誘導(dǎo)佐劑；B-添加有Th1佐劑的特定的有利肺炎球菌多糖結(jié)合物；以及C-細(xì)菌多糖結(jié)合物，通常與來自流感嗜血菌的蛋白D結(jié)合。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌屬革蘭氏陽性菌，它可導(dǎo)致非常高地發(fā)病率甚至死亡(尤其對幼齡和高齡人)，并可引起諸如肺炎、菌血癥和腦膜炎等侵襲性疾病以及與集群相關(guān)的疾病，如急性中耳炎。在美國，年齡大于60歲的人患有肺炎球菌性肺炎的比例估計為十萬分之3-8。其中有20％會引發(fā)菌血癥，其他則表現(xiàn)為腦膜炎，其死亡率接近30％，甚至用抗生素治療也是如此。
肺炎球菌包裹著化學(xué)交聯(lián)的多糖莢膜，這可賦予其血清型特異性。目前已知的肺炎球菌血清型有90種，肺炎球菌的莢膜是其毒力的主要決定因素，因為這些細(xì)菌的莢膜不但可保護(hù)其內(nèi)表面免受補(bǔ)體作用，而且莢膜本身的免疫原性很弱。多糖是非T細(xì)胞依賴性抗原，不能被加工或呈遞到MHC分子上以與T細(xì)胞相互作用。但它們可通過替代機(jī)制來刺激免疫系統(tǒng)，該機(jī)制涉及與B細(xì)胞表面受體的交聯(lián)。
一些實驗表明，對侵襲性肺炎球菌疾病的防護(hù)作用與莢膜特異性抗體強(qiáng)烈相關(guān)，并且這種防護(hù)作用具有血清型特異性。
基于多糖抗原的疫苗已為該領(lǐng)域所熟知。已被準(zhǔn)許用于人類的有四種，包括傷寒沙門菌的Vi多糖、來自流感嗜血菌的PRP多糖、含有血清型A、C、W135和Y的四價腦膜炎球菌疫苗，以及含有相當(dāng)于血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33的多糖的23價肺炎球菌疫苗(至少占肺炎球菌血分離物的90％)。
后三種疫苗可用來防護(hù)致呼吸道感染的細(xì)菌，此類感染能夠在嬰兒中導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡，但這些疫苗未被準(zhǔn)許用于年齡小于2歲的兒童，原因是它們在該年齡組中不具有足夠的免疫原性〔Peltolaet al.(1984)，N.Engl.J.Med.3101561-1566〕。肺炎鏈球菌是嬰兒和幼齡兒童的侵襲性細(xì)菌疾病與中耳炎的最常見病因。同樣，高齡人對肺炎球菌疫苗的反應(yīng)很弱〔Roghmann et al.，(1987)，J.Gerontol.42265-270〕，使得該群體的細(xì)菌性肺炎發(fā)病率上升〔Verghese and Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62271-285〕。
用來克服嬰兒中的這種免疫原性缺陷的策略包括，將這種多糖與免疫原性大蛋白相連接，該蛋白能夠協(xié)助旁T細(xì)胞，并可誘導(dǎo)出針對其結(jié)合的多糖抗原的免疫記憶。通過評定，目前認(rèn)為肺炎球菌糖蛋白結(jié)合物疫苗在不同年齡組中均安全有效，并且具有免疫原性。A)肺炎球菌多糖疫苗
23價非結(jié)合肺炎球菌疫苗的臨床效果在0％-81％之間變化很大(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med.1542531-2535)。其效果似乎與被免疫的風(fēng)險人群有關(guān)，如高齡人、何杰金氏病、脾臟切除、鐮狀細(xì)胞病和無丙種球蛋白血癥(Fine et al.(1994)Arch InternMed.1542666-2677)，并且與疾病的臨床表現(xiàn)有關(guān)。這種23價疫苗并未顯示出可防護(hù)肺炎球菌性肺炎(在諸如高齡人等某些高危人群中)以及中耳炎病。
因此，我們需要改進(jìn)的肺炎球菌疫苗組合物，特別是在預(yù)防或改善高齡人及幼齡兒童的肺炎球菌性疾病(尤其是肺炎)方面更有效的疫苗組合物。
本發(fā)明將提供這種改進(jìn)疫苗。B)選定的肺炎球菌多糖結(jié)合物+3D-MPL組合物
一般認(rèn)為商品化非結(jié)合肺炎球菌疫苗的防護(hù)效率與接種時誘導(dǎo)出的抗體濃度有或多或少的關(guān)系；實際上，這23種多糖只是在每種多糖組分的免疫原性方面獲得了認(rèn)證(Ed.Williams et al.New YorkAcademy of Sciences 1995 pp.241-249)。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)對肺炎球菌多糖的抗體反應(yīng)可提高嬰兒與高齡人利用保護(hù)性水平的抗體對首次注射的多糖或多糖結(jié)合物產(chǎn)生應(yīng)答的比例，并且可減少誘導(dǎo)對肺炎鏈球菌感染的保護(hù)性免疫所必需的劑量和注射次數(shù)。
研究人員從20世紀(jì)初就開始對大量能夠添加到抗原中以提高其在疫苗組合物中的免疫原性的復(fù)合物進(jìn)行試驗〔綜述見M.F.Powell&M.J.Newman，Plenum Press，NY，“疫苗設(shè)計——亞基及佐劑方法”(1995)第7章“疫苗佐劑與賦形劑一覽表”〕。其中有許多非常有效，但是會引起明顯的局部或全身性副作用，從而阻礙其應(yīng)用于人類疫苗組合物。1926年首次描述的鋁型佐劑(如明礬、氫氧化鋁或磷酸鋁)仍然是經(jīng)美國準(zhǔn)許而用于人類疫苗的唯一免疫佐劑。
鋁型佐劑屬于載體類佐劑，可通過其攻擊的“貯積效應(yīng)”來發(fā)揮作用?？乖皆谄浔砻妫?dāng)注射該組合物時，佐劑和抗原不會立即分散在血流中——而是保留在注射的局部環(huán)境中，從而可獲得更明顯的免疫應(yīng)答。這些載體類佐劑還具有其它優(yōu)勢，即適于使易分解抗原，如某些多糖抗原，保持穩(wěn)定。
3D-MPL屬于非載體類佐劑。其全稱為3-O-脫?；鶈瘟柞Ｖ珹(或3脫-O-酰基單磷酰脂A或3-O-脫?；?4’單磷酰脂A)，表示為3D-MPL，以說明其還原端葡糖胺的第3位為脫-O-?；问?。其制備方法可參考GB2220211A。從化學(xué)上分析，它是3-脫?；鶈瘟柞Ｖ珹與4、5或6種酰化鏈的混合物。它最早制備于20世紀(jì)90年代初期，當(dāng)時的方法是將脂A的4’-單磷酰衍生物(MPL)進(jìn)行3-O-脫?；@種方法可產(chǎn)生一種毒性更弱但免疫刺激活性不變的分子。
目前已將3D-MPL本身作為一種獨(dú)立佐劑，或是優(yōu)選地與一種積累型載體佐劑結(jié)合使用，如氫氧化鋁、磷酸鋁或水包油型乳劑。這些組合物中包含的抗原和3D-MPL呈相同的顆粒結(jié)構(gòu)，從而可更有效地呈遞抗原信號和免疫刺激信號。研究表明，3D-MPL可進(jìn)一步增強(qiáng)被明磯吸附的抗原的免疫原性〔Thoelen et al.Vaccine(1998)16708-14；EP689454-B1〕。此類組合還被該領(lǐng)域作為優(yōu)選方法用于易吸附抗原(如細(xì)菌多糖結(jié)合物)，這些抗原被吸附到明礬上后有助于使其保持穩(wěn)定。最常用的是沉淀的鋁型佐劑，因為它們是目前被許可的人類疫苗中使用的唯一佐劑。因此，同時含有3D-MPL和鋁型佐劑的疫苗因其易于研制且能夠快速引入市場而備受該領(lǐng)域喜愛。
MPL(非3-脫?；?已被用作幾種一價多糖-結(jié)合物疫苗抗原的佐劑，并由此來對其進(jìn)行評定。將MPL與生理鹽水同時注射可加強(qiáng)血清抗體對四種一價多糖結(jié)合物的應(yīng)答肺炎球菌PS 6B-破傷風(fēng)類毒素、肺炎球菌PS 12-白喉毒素以及與綠膿假單胞菌外毒素A結(jié)合的金黃色葡萄球菌5型和金黃色葡萄球菌8型〔Schneerson et al.J.Immunology(1991)1472136-2140〕。增強(qiáng)的應(yīng)答被認(rèn)為具有抗原特異性。處于水包油型乳劑(載體型佐劑)中的MPL因其和抗原以相同的顆粒結(jié)構(gòu)存在而始終強(qiáng)于生理鹽水中MPL的作用，并且被認(rèn)為是遞送其它多糖結(jié)合物疫苗的優(yōu)選佐劑系統(tǒng)。
Devi等人〔Infect.Immun.(1991)593700-7〕評定了處于生理鹽水中的MPL(非3-脫?；?在鼠對新生隱球菌莢膜多糖TT結(jié)合物的抗體應(yīng)答方面的輔助效果。當(dāng)同時使用MPL和該結(jié)合物時，對PS的IgM-和IgG-特異性應(yīng)答都只有輕微的提高；但是在結(jié)合物給藥2天后將MPL給藥時，MPL的作用要大得多。需要將MPL相對于抗原進(jìn)行延遲給藥的免疫方案的實用性值得懷疑，尤其是對嬰兒。MPL對多糖和多糖-蛋白結(jié)合物的輔助效果似乎依賴于組合物。此外，將MPL加到適當(dāng)緩釋遞送系統(tǒng)中(如使用載體佐劑)可獲得更持久的輔助效應(yīng)，并且可避免時間調(diào)配以及延遲給藥的問題。
總之，以目前的技術(shù)發(fā)展水平而言，當(dāng)用MPL或3D-MPL為佐劑時，最好是將其與一種載體佐劑(如鋁型佐劑)協(xié)同使用，以便最大程度地實現(xiàn)其免疫刺激效應(yīng)。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，對某些肺炎球菌多糖結(jié)合物而言，其疫苗組合物在抗原與3D-MPL單獨(dú)配制時的免疫原性要明顯高于抗原與3D-MPL和載體佐劑(如一種鋁型佐劑)協(xié)同配制時的免疫原性。觀測到的這種改進(jìn)不依賴于所用3D-MPL的濃度，也與將特定結(jié)合物以單價組合物形式使用或是將其結(jié)合使用以形成多價組合物無關(guān)。C)細(xì)菌多糖-蛋白D結(jié)合物
如上所述，基于多糖抗原的疫苗已為該領(lǐng)域所熟知。上述被許可的多糖疫苗具有不同的實際臨床效果。據(jù)估計，Vi多糖疫苗在預(yù)防由培養(yǎng)確認(rèn)的傷寒方面的效力為55％-77％(Plotkin and Cam.(1995)Arch Intern Med 1552293-99)。腦膜炎球菌C多糖疫苗在流行情況下則顯示出79％的效力(De Wals P，et al.(1996)Bull WorldHealth Organ.74407-411)。23價肺炎球菌疫苗的臨床效果在0％-81％之間具有很大的差異(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med.1542531-2535)。如上所述，一般認(rèn)為肺炎球菌疫苗的防護(hù)效率與接種時誘導(dǎo)出的抗體濃度有或多或少的關(guān)系。
用多糖進(jìn)行接種的方法存在一個問題，即多糖本身為弱免疫原。用來克服這種免疫原性缺陷的策略包括，將多糖與能夠協(xié)助旁T細(xì)胞的高免疫原性大蛋白載體相連接。
目前用來產(chǎn)生多糖免疫原的這些常用高免疫原性載體包括，例如，白喉毒素(DT或CRM197突變體)、破傷風(fēng)類毒素(TT)、鑰孔血蘭素(KLH)以及結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)。常用載體的問題
這些常用載體各自都具有許多問題，其中包括產(chǎn)生GMP結(jié)合物方面的，也包括這些結(jié)合物的免疫學(xué)特性方面的。
盡管這些載體被經(jīng)常使用，并且也成功誘導(dǎo)出抗多糖的抗體應(yīng)答，但是它們具有一些缺點(diǎn)。舉例來說，當(dāng)預(yù)先存在針對該載體，此處為破傷風(fēng)毒素，的抗體時，抗原特異性免疫應(yīng)答會被抑制(表位抑制)(Di John et al；(1989)Lancet，21415-8)。而作為慣例，這些疫苗都用于人類的接種，所以在整個群體中，對DT和TT均預(yù)先存在免疫力的人占有非常高的比例。例如，在英國有95％的兒童接受DTP疫苗，其中就含有DT和TT。其它作者還描述了動物模型中對肽類疫苗的表位抑制問題(Sad et al，Immunology，1991；74223-227；Schutze et al，J.Immunol.1354，1985；2319-2322)。
此外，對需要定期促升的疫苗而言，使用諸如TT和DT等高免疫原性載體可能會在注射數(shù)次后即抑制多糖抗原的應(yīng)答。多次接種還會伴有不良反應(yīng)，如遲發(fā)型超反應(yīng)(DTH)。
KLH作為強(qiáng)免疫原已作為IgE肽的載體用于人類的臨床試驗。但也觀測到一些副反應(yīng)(DTH樣反應(yīng)或IgE致敏)和針對抗體的抗體應(yīng)答。
因此，在選擇載體蛋白用于以多糖為基礎(chǔ)的疫苗時，需要在使用可適用于所有患者的載體(廣泛MHC識別)的必要性、誘導(dǎo)高水平的抗多糖抗體應(yīng)答和低水平的抗載體抗體應(yīng)答之間尋求一種平衡。
因此，以前用于以多糖為基礎(chǔ)的疫苗的載體有很多缺點(diǎn)。用在組合疫苗中則尤其明顯，此時若將同一種載體用于不同的多糖抗原，則表位抑制問題會特別嚴(yán)重。為了盡量克服這種影響，WO98/51339是在組合疫苗中使用了多種載體。
本發(fā)明提供一種新載體，用于制備不具有上述缺點(diǎn)的多糖/基于多糖的免疫原性結(jié)合物。
本發(fā)明提供一種來源于流感嗜血菌的蛋白D(EP 059461B1)或其片段，作為基于多糖的免疫原性組合物，其中包括疫苗，的載體。該載體特別利于在組合疫苗中使用。發(fā)明概述A)肺炎鏈球菌多糖疫苗
本發(fā)明提供一種疫苗組合物，該組合物至少含有一種肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖抗原(優(yōu)選的為結(jié)合的多糖抗原)和一種肺炎鏈球菌蛋白抗原或其免疫學(xué)功能等價物，并選擇性地含有一種Th1佐劑(誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答的佐劑)。優(yōu)選的是肺炎球菌蛋白和Th1佐劑均包括。本發(fā)明的該組合物特別適用于高齡人的肺炎治療。
肺炎球菌多糖疫苗(結(jié)合的或未結(jié)合的)可能無法保護(hù)高齡人群不得肺炎，該群體患此疾病的幾率非常高。抵抗肺炎球菌的主要防御機(jī)制是調(diào)理素吞噬作用(通過產(chǎn)生抗肺炎球菌多糖抗體而引發(fā)的由體液性B細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的事件，最后將細(xì)菌吞噬)，但高齡人體內(nèi)涉及調(diào)理素機(jī)制的某些部分出現(xiàn)障礙，即PMN(多形核細(xì)胞)產(chǎn)生過氧化物、其它類型活性氧的產(chǎn)生、PMN動員、PMN凋亡、PMN的變形性。高齡人體內(nèi)的抗體應(yīng)答也會出現(xiàn)障礙。
正常水平的抗莢膜多糖抗體不能有效地完全清除細(xì)菌，這與公認(rèn)的法則正相反，其原因是肺炎球菌能夠侵入宿主細(xì)胞以躲避免疫系統(tǒng)這一分支途徑。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，除體液免疫系統(tǒng)這一分支途徑(如B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)之外再同時刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)這一分支途徑(如T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)可獲得一種增效作用(或協(xié)同作用)，這種作用能夠促進(jìn)宿主清除肺炎球菌。這一發(fā)現(xiàn)有助于預(yù)防一般人的肺炎球菌性感染，而對高齡人的肺炎預(yù)防而言卻至關(guān)重要，因為基于多糖的疫苗對他們不具有療效。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，若將肺炎球菌多糖(優(yōu)選的為結(jié)合的肺炎球菌多糖)與一種肺炎球菌蛋白(優(yōu)選的為肺炎球菌表面表達(dá)的或由其分泌或釋放的一種能夠在II類和MHC I類環(huán)境中加工并呈遞到被感染哺乳動物細(xì)胞表面的蛋白)一同給藥，則兩種免疫系統(tǒng)可由此產(chǎn)生協(xié)同作用。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，盡管肺炎球菌蛋白本身可觸發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，但疫苗制劑中Th1誘導(dǎo)佐劑的存在可協(xié)助這種免疫系統(tǒng)，并且能夠令人驚奇地進(jìn)一步加強(qiáng)這兩種免疫系統(tǒng)之間的協(xié)同作用。B)選定的肺炎球菌多糖結(jié)合物+3D-MPL組合物
因此，本發(fā)明還提供一種抗原組合物，該組合物含有一種或多種肺炎球菌多糖結(jié)合物，并且添加有3D-MPL佐劑而基本不含鋁型佐劑，其中至少有一種肺炎球菌多糖結(jié)合物是在含有3D-MPL的組合物中的免疫原性明顯高于在同時含有3D-MPL和鋁型佐劑的組合物中的免疫原性。
本發(fā)明提供的優(yōu)選實施方案是含有以下一種或多種肺炎球菌莢膜多糖的結(jié)合物的抗原組合物血清型4、6B、18C、19F和23F。這些組合物中的每種多糖都是在只含有3D-MPL的組合物中的免疫原性明顯高于在同時含有3D-MPL和一種鋁型佐劑的組合物中的免疫原性。
因此，本發(fā)明的一項實施方案提供一種抗原組合物，該組合物含有與一種免疫原性蛋白以及3D-MPL佐劑結(jié)合的血清型4、6B、18C、19F或23F肺炎鏈球菌莢膜多糖，其中該組合物基本不含鋁型佐劑。
本發(fā)明的另一實施方案提供一種基本不含鋁型佐劑的組合型抗原組合物，該組合物含有3D-MPL佐劑以及選自血清型4、血清型6B、血清型18C、血清型19F和血清型23F的兩種或多種肺炎球菌多糖結(jié)合物。C)細(xì)菌多糖-蛋白D結(jié)合物
因此，本發(fā)明提供一種多糖結(jié)合物抗原，該抗原含有一種與來自流感嗜血菌(H.influenzae)的蛋白D或其蛋白D片段結(jié)合的來源于一種致病菌的多糖抗原。此外，本發(fā)明還提供多價疫苗組合物，其中有一種或多種多糖抗原與蛋白D結(jié)合。發(fā)明詳述A)肺炎球菌多糖疫苗
本發(fā)明提供一種改進(jìn)疫苗，特別用來預(yù)防或改善高齡人(和/或嬰兒與幼兒)的肺炎球菌性感染。
在本發(fā)明中，年齡等于或大于55歲的患者被認(rèn)為是高齡人，典型的則大于60歲，更一般的則大于65歲。
因此，本發(fā)明的一項實施方案提供一種適用于高齡人(和/或嬰兒與幼兒)的疫苗組合物，該組合物含有至少一種肺炎鏈球菌多糖抗原和至少一種肺炎鏈球菌蛋白抗原。
本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案提供一種疫苗(適用于高齡人的肺炎預(yù)防)，該疫苗含有至少一種肺炎鏈球菌多糖抗原和至少一種肺炎鏈球菌蛋白抗原以及一種Th1佐劑。
可以認(rèn)為該疫苗也適用于其它高危人群，如嬰兒或幼兒，的肺炎球菌性感染(如中耳炎)的治療。
本發(fā)明的第三實施方案提供一種疫苗組合物，該組合物含有一種肺炎球菌多糖抗原和一種Th1佐劑。本發(fā)明的肺炎鏈球菌多糖抗原
本發(fā)明的肺炎鏈球菌疫苗通常都含有多糖抗原(優(yōu)選的為結(jié)合的多糖抗原)，其中的多糖抗原至少來源于四種血清型的肺炎球菌。優(yōu)選而言，這四種血清型包括6B、14、19F和23F。更優(yōu)選的是該組合物中至少含有7種血清型，如來源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F。更加優(yōu)選的是該組合物中至少含有11種血清型，例如一項實施方案中的組合物含有來源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜多糖(優(yōu)選的為結(jié)合的多糖)。盡管本發(fā)明也考慮采用，例如，23價的方案(如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)，但本發(fā)明的一項優(yōu)選實施方案含有的是至少13種多糖抗原(優(yōu)選的為結(jié)合的多糖抗原)。
對高齡人接種(如用來預(yù)防肺炎)而言，在上述11價抗原組合物中另加上血清型8和12F(最優(yōu)選的是再加上15和22)以形成15價疫苗的方案更具優(yōu)勢，而加上6A和19A以形成13價疫苗的方案更利于嬰兒或幼兒使用(此時更關(guān)注的是中耳炎)。
在預(yù)防/改善高齡人群(+55歲)的肺炎和嬰兒(18個月以前)與幼兒(通常為18個月-5歲)的中耳炎時，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是將文中所述的多價肺炎鏈球菌多糖與一種肺炎鏈球菌蛋白或其免疫學(xué)功能等價物相結(jié)合。本發(fā)明的肺炎球菌蛋白
對本發(fā)明而言，“免疫學(xué)功能等價物”的定義是一種蛋白的肽，該蛋白至少含有一種來源于本發(fā)明所述蛋白的保護(hù)性表位。這些表位的特性是暴露在表面，高度保守，并且能夠在宿主內(nèi)引發(fā)殺菌性抗體應(yīng)答或能夠避免毒性作用。優(yōu)選而言，該功能等價物至少具有15個來源于本發(fā)明所述蛋白的連續(xù)氨基酸，優(yōu)選的則至少為30個或更多。最優(yōu)選的是使用該蛋白的片段、諸如跨膜區(qū)缺失變異體(即使用蛋白的細(xì)胞外區(qū)域)等缺失體、融合體、經(jīng)化學(xué)或遺傳方法去毒的衍生物等，前提是它們能夠引起與天然蛋白基本相同的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的優(yōu)選蛋白是那些暴露在肺炎球菌外表面(至少在肺炎球菌生活周期的部分時間里能夠被宿主的免疫系統(tǒng)識別)的肺炎球菌蛋白，或由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。最優(yōu)選的蛋白則是肺炎鏈球菌的毒素、粘附素、雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或脂蛋白，或其免疫學(xué)功能等價物。
可包含在所述組合疫苗中的特別優(yōu)選的蛋白包括，但不局限于肺炎球菌溶血素(pneumolysin)(優(yōu)選的是通過化學(xué)處理或突變進(jìn)行去毒)〔Mitchell et al.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)4010“來源于1型和2型肺炎鏈球菌的肺炎球菌溶血素基因及蛋白的比較”，Mitchell et al.Biochim Biophys Acta 1989 Jan23；1007(1)67-72“大腸桿菌中的肺炎球菌溶血素基因表達(dá)快速純化及生物學(xué)特性”，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO90/06951(Paton et al)，WO99/03884(NAVA)〕；PspA及其跨膜區(qū)缺失突變體(US 5804193-Briles et al.)；PspC及其跨膜區(qū)缺失突變體(WO97/09994-Briles et al.)；PsaA及其跨膜區(qū)缺失突變體(Berry&Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)5255-62“PsaA，對肺炎鏈球菌的毒力至關(guān)重要的一種37kD假定粘附素，的序列異質(zhì)性”)；肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白及其跨膜區(qū)缺失突變體；CbpA及其跨膜區(qū)缺失突變體(WO97/41151；WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(Infect.Immun.1996 643544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMS Microbiol Lett 1998，164207-14)；M樣蛋白，SB專利申請?zhí)朎P0837130；以及粘附素18627，SB專利申請?zhí)朎P0834568。
優(yōu)選而言，本發(fā)明使用的蛋白選自肺炎球菌溶血素、PsaA、PspA、PspC、CbpA或這些蛋白中的兩種或多種的組合。本發(fā)明還包括這些蛋白(如上文所定)的免疫學(xué)功能等價物。
組合物內(nèi)的該蛋白可協(xié)助誘導(dǎo)抗肺炎球菌疾病的T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答——這是防護(hù)肺炎所特別需要的——這種應(yīng)答與體液免疫系統(tǒng)相配合可抑制肺炎球菌的侵襲，并且可刺激調(diào)理素吞噬作用。
包含有這種蛋白抗原的另一優(yōu)勢在于可向調(diào)理素吞噬過程遞送更多的抗原，并且可抑制細(xì)菌粘附素(若使用粘附素)或使毒素中和(若使用毒素)。
本發(fā)明在一項實施方案中提供一種肺炎鏈球菌疫苗，該肺炎鏈球菌疫苗含有一種肺炎球菌多糖結(jié)合物疫苗，該肺炎球菌多糖結(jié)合物疫苗含有來源于至少4種血清型的多糖抗原，優(yōu)選的為至少7種，更優(yōu)選的為至少11種，并含有至少一種肺炎鏈球菌蛋白，而優(yōu)選的為兩種。優(yōu)選而言，其中有一種蛋白為肺炎球菌溶血素或PsaA或PspA或CbpA(最優(yōu)選的為去毒的肺炎球菌溶血素)。優(yōu)選的組合為至少含有肺炎球菌溶血素或其衍生物，以及PspA。
如上文所述，用多糖進(jìn)行接種的方法存在一個問題，即多糖本身為弱免疫原。為了克服這一點(diǎn)，可將多糖與能夠協(xié)助旁T細(xì)胞(bystander T-cell help)的蛋白載體相連接。因此，優(yōu)選的是將本發(fā)明使用的多糖與這樣一種蛋白載體相連接。目前常用來產(chǎn)生多糖免疫原的此類載體包括，例如，白喉類和破傷風(fēng)類毒素(分別為DT、DTCRM197和TT)、鑰孔血蘭素(KLH)、來自腦膜炎奈瑟菌的OMPC以及結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)
但這些常用載體各自都存在許多問題(見上文“常用載體的問題”一節(jié))。
本發(fā)明在一項優(yōu)選實施方案中提供一種新載體，用于制備不具有這些缺點(diǎn)的基于多糖的免疫原構(gòu)建體。用于以肺炎球菌多糖為基礎(chǔ)的免疫原組合物(或疫苗)的優(yōu)選載體為流感嗜血菌蛋白D或其片段(EP594610-B)。適于使用的片段包括含有輔助T細(xì)胞表位的片段。特別地，蛋白D的片段優(yōu)選地應(yīng)含有該蛋白N端1/3的部分。
用于肺炎球菌多糖的另一優(yōu)選載體為肺炎球菌蛋白本身(如上文“本發(fā)明的肺炎球菌蛋白”一節(jié)所定)。
本發(fā)明的疫苗優(yōu)選地應(yīng)被佐劑化。適當(dāng)?shù)淖魟┌ㄒ环N鋁鹽，如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁，但也可以是一種鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽，或是?；野彼?，或酰化糖的不溶懸浮物、多糖的陽離子或陰離子衍生物、或聚磷腈。
優(yōu)選而言，所選佐劑應(yīng)該是TH1型應(yīng)答的一種優(yōu)選誘導(dǎo)劑，以協(xié)助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的TH1佐劑
高水平的Th1型細(xì)胞因子利于誘導(dǎo)出對給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的Th2型細(xì)胞因子利于誘導(dǎo)出對抗原的體液免疫應(yīng)答。
重要的是應(yīng)記住，Th1型與Th2型免疫應(yīng)答的差異并不是絕對的。實際上我們把個體所維持的免疫應(yīng)答描述成Th1占優(yōu)勢或Th2占優(yōu)勢。但通?？梢罁?jù)Mosmann和Coffman對鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆的描述來方便地對細(xì)胞因子家族進(jìn)行研究(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1與TH2細(xì)胞不同的淋巴因子分泌方式導(dǎo)致不同的功能特性。Annual Review of Immunology，7，p145-173)。通常Th1型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的INF-γ和IL-2有關(guān)。常與誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答直接相關(guān)的其它細(xì)胞因子，如IL-12，則不由T細(xì)胞產(chǎn)生。相比之下，Th2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有關(guān)?？纱龠M(jìn)Th1占優(yōu)勢的應(yīng)答的適當(dāng)佐劑包括單磷酰脂A或其衍生物，特別是3-脫-O-?；鶈瘟柞Ｖ珹，以及單磷酰脂A，優(yōu)選的是3-脫-O-?；鶈瘟柞Ｖ珹(3D-MPL)與一種鋁鹽的組合物。
一種改進(jìn)系統(tǒng)涉及單磷酰脂A與一種皂甙衍生物的組合，特別是WO94/00153中公開的QS21與3D-MPL的組合，或是按WO96/33739的公開方法用膽固醇將QS21淬滅從而反應(yīng)原性較弱的一種組合物。
WO95/17210描述了一種特別有效的佐劑配方，該配方涉及將QS21、3D-MPL和生育酚加到一種水包油型乳劑中，該配方是優(yōu)選的配方。
優(yōu)選而言，疫苗中可另含有一種皂甙，更優(yōu)選的則為QS21。該配方還可包含一種水包油型乳劑和生育酚(WO95/17210)。
本發(fā)明還提供一種方法，用于產(chǎn)生一種疫苗制劑，該方法包括將本發(fā)明的一種蛋白與一種藥學(xué)容許的賦形劑，如3D-MPL，相混合。
含有寡核苷酸的非甲基化CpG(WO96/02555)也是適用于本發(fā)明的優(yōu)選TH1應(yīng)答誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明的特別優(yōu)選組合物含有一種或多種結(jié)合的肺炎球菌多糖、一種或多種肺炎球菌蛋白和一種Th 1佐劑。使用該Th1佐劑有助于通過肺炎球菌蛋白(如上文所述)來誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，并有助于兩種免疫系統(tǒng)之間的協(xié)同，從而可獲得一種特別有效的疫苗，來對抗一般人的肺炎球菌性疾病，更重要的是可對抗高齡人的肺炎球菌性肺炎。
另一方面，本發(fā)明提供如文中所述的一種免疫原或疫苗，用來在醫(yī)學(xué)中使用。
再一方面，本發(fā)明提供一種含有肺炎球菌多糖結(jié)合物和Th1佐劑(優(yōu)選的為3D-MPL)的組合物，該組合物可在無應(yīng)答群體中引發(fā)血清轉(zhuǎn)化或誘導(dǎo)出抗多糖抗原的體液抗體應(yīng)答。
已知有10-30％的人對多糖免疫法不產(chǎn)生應(yīng)答(對疫苗中50％以上的血清型不產(chǎn)生應(yīng)答)(Konradsen et al.，Scand.J.Immun 40251(1994)；Rodriguez et al.，JID，1731347(1996))。使用結(jié)合物疫苗也是如此(Musher et al.Clin.Inf.Dis.271487(1998))。對高危人群(嬰兒、幼兒和高齡人)則特別嚴(yán)重。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將結(jié)合的肺炎球菌多糖(易于在特定群體中產(chǎn)生低應(yīng)答)與一種Th1佐劑(見上文“本發(fā)明的Th1佐劑”)結(jié)合使用可克服這種無應(yīng)答性。優(yōu)選的是使用3D-MPL，最優(yōu)選的是使用不含鋁型佐劑的3D-MPL(這樣可獲得更好的應(yīng)答)。因此，本發(fā)明提供這些組合物，并進(jìn)一步提供一種方法，用于治療對肺炎球菌多糖不產(chǎn)生應(yīng)答的個體，方法是將這些組合物給藥，同時還提供Th1佐劑在含有結(jié)合的肺炎球菌多糖抗原的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，以及在針對(或防護(hù))多糖抗原無應(yīng)答性個體的肺炎球菌性疾病的治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明在一項實施方案中提供一種方法，用來預(yù)防或改善高齡人的肺炎，該方法包括將安全并且有效劑量的文中所述疫苗向所述高齡患者給藥，該疫苗含有一種肺炎鏈球菌多糖抗原，并含有一種Th1佐劑或一種肺炎球菌蛋白(優(yōu)選的是兩者都包含)。
本發(fā)明在另一項實施方案中提供一種方法，用來預(yù)防或改善嬰兒或幼兒的中耳炎，該方法包括將安全并且有效劑量的一種疫苗向所述嬰兒或幼兒給藥，該疫苗含有一種肺炎鏈球菌多糖抗原，并含有一種肺炎鏈球菌蛋白抗原或一種Th1佐劑(優(yōu)選的是兩者都包含)。
在本發(fā)明的上述方法中，優(yōu)選的是以多糖蛋白結(jié)合物形式提供所述多糖抗原。本發(fā)明的疫苗制劑
本發(fā)明的疫苗制劑可用來保護(hù)或治療易感染哺乳動物，方法是將所述疫苗經(jīng)全身或粘膜途徑給藥。這些給藥方法包括肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射；或經(jīng)粘膜向口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道給藥。用于治療肺炎或中耳炎的優(yōu)選方法是將疫苗進(jìn)行鼻內(nèi)給藥(因為可更有效地預(yù)防肺炎球菌經(jīng)鼻咽運(yùn)輸，從而在其最早階段使感染減弱)。
每劑疫苗中的結(jié)合抗原量可選擇在典型疫苗中能夠引發(fā)免疫保護(hù)性應(yīng)答但不造成明顯副作用的量。其數(shù)值將根據(jù)所用特定免疫原及其呈遞方法的不同而有所不同。一般認(rèn)為每劑應(yīng)含有0.1-100μg多糖，優(yōu)選的為0.1-50μg，更優(yōu)選的為0.1-10μg，最優(yōu)選的為1-5μg。
疫苗中的蛋白抗原含量通常為1-100μg，優(yōu)選的為5-50μg，最優(yōu)選的通常為5-25μg。
特定疫苗的最佳組分含量可通過標(biāo)準(zhǔn)研究方法來加以確定，該方法涉及對主體的適當(dāng)免疫應(yīng)答進(jìn)行觀測。在初次接種后，主體可接受一次或數(shù)次間隔時間適當(dāng)?shù)拇偕庖摺?br> 在《疫苗設(shè)計》中對疫苗的制備方法進(jìn)行了綜合論述(“亞基及佐劑方法”(eds Powell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum PressNew York)。Fullerton的美國專利4,235,877則描述了封裝在脂質(zhì)體中的方法。B)選定的肺炎球菌多糖結(jié)合物+3D-MPL組合物
對本發(fā)明而言，術(shù)語“本發(fā)明的肺炎球菌多糖結(jié)合物”是指那些在只含有3D-MPL的組合物中的免疫原性高于在同時含有3D-MPL和一種鋁型佐劑的組合物中的免疫原性的肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物(如血清型4的結(jié)合物、血清型6B的結(jié)合物、血清型18C的結(jié)合物、血清型19F的結(jié)合物或血清型23F的結(jié)合物)。
對本發(fā)明而言，術(shù)語“基本不含鋁型佐劑”是指組合物中不含有足以使本發(fā)明的肺炎球菌多糖結(jié)合物在免疫原性方面低于只含有3D-MPL而不加鋁型佐劑的相同組合物的鋁型佐劑(如氫氧化鋁，特別是磷酸鋁)。優(yōu)選的抗原組合物所包含的佐劑應(yīng)基本上為3D-MPL。優(yōu)選而言，每劑量中添加的鋁型佐劑的量應(yīng)少于50μg，更優(yōu)選的是少于30μg，更加優(yōu)選的是少于10μg，而最優(yōu)選的是本發(fā)明的抗原組合物中不添加任何鋁型佐劑。
對本發(fā)明而言，應(yīng)按實施例2所述來確定是否肺炎球菌多糖結(jié)合物在只含有3D-MPL的組合物中的免疫原性明顯高于在同時含有3D-MPL和一種鋁型佐劑的組合物中的免疫原性。作為只含有3D-MPL的組合物的免疫原性是否明顯更高的指征，只含有3D-MPL的組合物與同時含有3D-MPL和一種鋁型佐劑的組合物的GMC IgG濃度比應(yīng)大于2，優(yōu)選的為大于5，更優(yōu)選的為大于7，更加優(yōu)選的為大于9，而最優(yōu)選的是大于14。
在與多糖接種方法有關(guān)的問題中，有一個問題是多糖本身為弱免疫原。用來克服這種免疫原性缺陷的策略包括，將多糖與能夠協(xié)助旁T細(xì)胞的大蛋白載體相連接(結(jié)合)。優(yōu)選的是將本發(fā)明的肺炎球菌多糖與一種可協(xié)助旁T細(xì)胞的蛋白載體相連接。可使用的此類載體包括，例如，白喉毒素、白喉毒素突變體及破傷風(fēng)類毒素(分別為DT、CRM197和TT)、鑰孔血蘭素(KLH)、結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)以及腦膜炎奈瑟菌的OMPC。
最優(yōu)選的是將流感嗜血菌的蛋白D(EP0594610-B)或其片段(見C小節(jié))作為該免疫原性蛋白載體用于本發(fā)明的肺炎球菌多糖。
在一項實施方案中，本發(fā)明的抗原組合物含有與一種免疫原性蛋白相結(jié)合的肺炎球菌多糖血清型(PS)4，并且用3D-MPL佐劑配制，其中該組合物基本不含鋁型佐劑。其它實施方案中的抗原組合物則分別含有與一種免疫原性蛋白相結(jié)合的PS 6B、18C、19F或23F，并且用3D-MPL佐劑配制，其中該組合物基本不含鋁型佐劑。
本發(fā)明在另一項實施方案中提供一種組合型抗原組合物，該組合物含有兩種或多種肺炎球菌多糖結(jié)合物，并且用3D-MPL佐劑配制，這些結(jié)合物選自PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F，其中該組合物基本不含鋁型佐劑。
加入其它肺炎球菌多糖結(jié)合物不會明顯影響本發(fā)明所述肺炎球菌多糖結(jié)合物的免疫原性(實施例3)。因此，作為優(yōu)選方式，本發(fā)明提供一種組合型抗原組合物，該組合物同時含有一種或多種本發(fā)明的肺炎球菌多糖結(jié)合物和一種或多種其它肺炎球菌多糖結(jié)合物，其中該組合物用3D-MPL佐劑配制，并且基本不含鋁型佐劑。
本發(fā)明在另一優(yōu)選實施方案中提供組合型抗原組合物，這些組合物至少含有PS 4、6B、18C、19F或23F肺炎球菌多糖結(jié)合物中的一種，優(yōu)選的則含有其中的2種、3種、4種或所有5種，此外還含有任意組合的其它肺炎球菌多糖結(jié)合物，這些組合物均用3D-MPL佐劑配制，但基本不含鋁型佐劑。
本發(fā)明的組合型肺炎鏈球菌抗原組合物通常都含有多糖結(jié)合物抗原，其中的多糖至少來源于4種、7種、11種、13種、15種或23種血清型(見上文“本發(fā)明的肺炎鏈球菌多糖抗原”，其優(yōu)選的血清型組合方式取決于要治療的疾病)。
優(yōu)選地，可將本發(fā)明的抗原組合物作為疫苗組合物用于肺炎球菌性感染的預(yù)防(或治療)，特別是用于高齡人以及嬰兒和幼兒。
本發(fā)明的其它實施方案包括提供上述抗原組合物用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；一種方法，用來誘導(dǎo)對肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物的免疫應(yīng)答，該方法包括將安全并且有效劑量的上述抗原組合物之一向患者給藥的步驟；以及上述抗原組合物之一在用于預(yù)防(或治療)肺炎球菌性疾病的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
在預(yù)防/改善高齡人群(+55歲)的肺炎和嬰兒(18個月以前)與幼兒(通常為18個月-5歲)的中耳炎時，本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案是將按文中所述方法制備的多價肺炎鏈球菌多糖結(jié)合物與一種肺炎鏈球菌蛋白或其免疫學(xué)功能等價物相結(jié)合。優(yōu)選的蛋白/蛋白組合可參考上文“本發(fā)明的肺炎球菌蛋白”一節(jié)。
若不立即使用，優(yōu)選的是將上文所述抗原組合物(和疫苗)凍干，并可在使用前以稀釋劑將其即時重構(gòu)。更優(yōu)選的是在3D-MPL存在的情況下將其凍干，并用鹽溶液即時重構(gòu)。
將組合物凍干可使其更加穩(wěn)定(例如可避免多糖抗原分解)。令人驚奇的是，該方法還可以使抗體對肺炎球菌多糖的效價更高。對PS6B結(jié)合物而言，這種現(xiàn)象特別明顯。因此，本發(fā)明的另一形式是一種凍干的抗原組合物，該組合物含有PS 6B結(jié)合物，并用3D-MPL佐劑配制且基本不含鋁型佐劑。
疫苗的制備可參考上文“本發(fā)明的疫苗制劑”一節(jié)。C)細(xì)菌多糖-蛋白D結(jié)合物
傾向于使用組合疫苗的優(yōu)勢有，減少對賦形劑的不適、便于安排進(jìn)度，以及確保嚴(yán)格管理的完成；但也會伴隨有疫苗效率降低的危險(見上文有關(guān)過度使用載體蛋白導(dǎo)致表位抑制的論述)。因此，有益的是應(yīng)該制定能夠滿足某個群體的需要并且其組分間不表現(xiàn)出免疫原性干擾的疫苗組合方式。這些優(yōu)勢可通過本發(fā)明的免疫原性組合物(或疫苗)來實現(xiàn)，它們特別有利于將組合型疫苗向嬰兒、幼兒或高齡人等高危人群給藥。
本發(fā)明提供一種流感嗜血菌蛋白D或其片段，以作為載體用于以多糖為基礎(chǔ)的免疫原性組合物，其中包括疫苗。適于使用的片段包括含有輔助T細(xì)胞表位的片段。特別地，蛋白D的片段優(yōu)選地應(yīng)含有該蛋白N端1/3的部分。
蛋白D是來源于流感嗜血菌的一種IgD結(jié)合蛋白(EP 0594610B1)，它是一種潛在的免疫原。
本發(fā)明考慮的與蛋白D結(jié)合的多糖包括，但不局限于，抗傷寒沙門菌的Vi多糖抗原、腦膜炎球菌多糖(包括A型、C型、W135型和Y型，以及B類腦膜炎球菌多糖和修飾多糖)、來自金黃色葡萄球菌的多糖、來自無乳鏈球菌的多糖、來自肺炎鏈球菌的多糖、來自諸如結(jié)核分支桿菌等分支桿菌的多糖(如甘露糖磷酸肌醇海藻糖、分支菌酸、帶甘露糖帽的阿拉伯甘露聚糖、其莢膜以及阿拉伯半乳聚糖)、來自新生隱球菌的多糖、未分類流感嗜血菌的脂多糖、來自流感嗜血菌b的莢膜多糖、粘膜炎莫拉菌的脂多糖、宋內(nèi)志賀菌的脂多糖、克氏錐蟲的脂肽磷酸聚糖(LPPG)、與癌癥相關(guān)的神經(jīng)節(jié)苷脂GD3、GD2、與腫瘤相關(guān)的粘蛋白，特別是T-F抗原和唾液酸T-F抗原，以及結(jié)構(gòu)上與T-F抗原有關(guān)的HIV相關(guān)多糖。
多糖與載體蛋白的連接可采用任何已知的方法(如Likhite的美國專利4,372,945以及Armor等人的美國專利4,474,757的方法)。優(yōu)選的是采用CDAP結(jié)合法(WO95/08348)。
在CDAP方法中，優(yōu)選的是使用氰化劑1-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)來合成多糖-蛋白結(jié)合物。這種氰化劑可在相對溫和的條件下發(fā)揮作用，從而可避免堿敏感性多糖的水解。該合成方法可用于與載體蛋白的直接結(jié)合。
將多糖增溶于水或鹽溶液。將CDAP溶于乙腈，并立即加到多糖溶液中。CDAP能夠與多糖的羥基反應(yīng)，從而形成一種氰基酯。在該活化步驟之后加入載體蛋白。賴氨酸的氨基能夠與活化的多糖反應(yīng)，從而形成一種異脲共價連接。
在該結(jié)合反應(yīng)之后，再加入大大過量的甘氨酸以淬滅剩余的活化官能團(tuán)。然后將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠滲透層析以去除未反應(yīng)的載體蛋白及殘留試劑。因此，本發(fā)明提供一種方法，用來產(chǎn)生多糖蛋白D結(jié)合物，該方法包括將多糖活化并將多糖與蛋白D連接的步驟。
本發(fā)明在一項優(yōu)選實施方案中提供一種免疫原性組合物(或疫苗)制劑，用來預(yù)防肺炎鏈球菌感染。
肺炎球菌向肺、腦脊液和血液擴(kuò)散的機(jī)制還不是很清楚。細(xì)菌生長向正常肺泡的延伸可被其相對干燥的環(huán)境以及肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬活性所抑制。這些相互協(xié)調(diào)的防御若出現(xiàn)任何組織上或生理上的變化，都會導(dǎo)致肺對感染的易感性增加。肺炎鏈球菌的細(xì)胞壁在肺泡炎性反應(yīng)的產(chǎn)生過程中具有重要作用(Gillespie et al.(1997)I&I653936)。
本發(fā)明的肺炎鏈球菌疫苗一般都含有蛋白D多糖結(jié)合物，其中的多糖至少來源于4種、7種、11種、13種、15種或23種血清型。優(yōu)選的血清型組合可參考上文“本發(fā)明的肺炎鏈球菌多糖抗原”，這些組合方式取決于要治療的疾病。
本發(fā)明在另一實施方案中提供一種腦膜炎奈瑟菌疫苗；特別是來源于血清型A、B、C、W-135和Y的疫苗。腦膜炎奈瑟菌是細(xì)菌性腦膜炎的最重要病因之一。這些細(xì)菌的糖類莢膜可作為其毒力的決定因素，并且可充當(dāng)保護(hù)性抗體的作用對象。但眾所周知的是，糖類在幼齡兒童體內(nèi)是一種弱免疫原。本發(fā)明提供一種特別適用于這些多糖的蛋白載體，蛋白D，它可提供能夠激活T細(xì)胞應(yīng)答的T細(xì)胞表位，從而有助于多糖抗原特異性B細(xì)胞的增殖和成熟，并有助于誘導(dǎo)免疫記憶。
本發(fā)明在一項可選實施方案中提供一種流感嗜血菌b莢膜多糖(PRP)-蛋白D結(jié)合物。
本發(fā)明還考慮了能夠防護(hù)一系列不同病原體的組合型疫苗。令人驚奇的是，蛋白D載體可以作為結(jié)合有多種多糖抗原的組合型疫苗的有效載體。如上所述，若各種多糖都使用相同的載體，則可能引發(fā)表位抑制。WO98/51339提供了一些組合物，試圖將這種干擾減至最小，方法是將組合物中一定比例的多糖結(jié)合在DT上，其余的則結(jié)合在TT上。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，蛋白D特別適于在組合型疫苗中將此類表位抑制效應(yīng)減至最小。將組合物中的一種或多種多糖結(jié)合在蛋白D上是有益的，優(yōu)選的則是將此類組合型疫苗中的所有抗原均結(jié)合在蛋白D上。
優(yōu)選的組合物包括可防護(hù)腦膜炎奈瑟菌C和Y(優(yōu)選的則還有A)感染的一種疫苗，其中來源于血清型Y和C(最優(yōu)選的則還有A)之一種或多種的多糖抗原均連接于蛋白D。
基于流感嗜血菌多糖的疫苗(優(yōu)選的是與TT、DT或CRM197結(jié)合的PRP，或最優(yōu)選的是與蛋白D結(jié)合的PRP)可用上述組合型疫苗來配制。
目前，有許多小兒用疫苗是以組合型疫苗形式提供的，這樣可減少兒童必須接受的注射次數(shù)。因此，當(dāng)作為小兒用疫苗時，可用本發(fā)明的疫苗來配制其它抗原。舉例來說，可使用眾所周知的含有白喉類毒素(DT)、破傷風(fēng)類毒素(TT)以及百日咳組分〔通常為去毒的百日咳類毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)以及可選的pertactin(PRN)和/或凝集素1+2〕的“三價”組合疫苗，如含有DT、TT、PT、FHA和PRN抗原的商品化疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeechamBiologicals)，或全細(xì)胞百日咳組分，如SmithKlineBeechamBiologicals s.a.的商品化TritanrixTM，來配制本發(fā)明的疫苗，或是同時獨(dú)立給藥。組合的疫苗還可含有其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原(如滅活的三價脊髓灰質(zhì)炎病毒——IPV)、粘膜炎莫拉菌外膜蛋白、未分類流感嗜血菌蛋白、腦膜炎奈瑟菌B外膜蛋白。
可包含在組合型疫苗(特別是用來預(yù)防中耳炎的)中的粘膜炎莫拉菌蛋白抗原的實例有OMP106〔WO97/41731(Antex)&WO96/34960(PMC)〕；OMP21；LbpA&LbpB〔WO98/55606(PMC)〕；TbpA&TbpB〔WO97/13785&WO97/32980(PMC)〕；CopB〔Helminen ME.et al.(1993)Infect.Immun.612003-2010〕；UspA1/2〔WO93/03761(University of Texas)〕；和OmpCD?？砂诮M合型疫苗(特別是用來預(yù)防中耳炎的)中的未分類流感嗜血菌抗原的實例有絲束蛋白〔(US 5766608-Ohio State Research Foundation)〕及含有來自絲束蛋白肽的融合體〔如LB1(f)肽融合體；US 5843464(OSU)或WO99/64067〕；OMP26〔WO97/01638(Cortecs)〕；P6〔EP 281673(State University of New York)〕；TbpA和TbpB；Hia；Hmw1，2；Hap；以及D15。
本發(fā)明考慮的優(yōu)選小兒用疫苗有a)腦膜炎奈瑟菌C多糖結(jié)合物和流感嗜血菌b多糖結(jié)合物，以及 可選的腦膜炎奈瑟菌A和/或Y多糖結(jié)合物，條件是至少有一種多 糖抗原，優(yōu)選的是所有多糖抗原，與蛋白D相結(jié)合。b)含有DT、TT、百日咳組分(優(yōu)選的含有PT、FHA和PRN)、乙 型肝炎表面抗原以及IPV(滅活的三價脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗)的疫 苗a)。c)與蛋白D結(jié)合的肺炎鏈球菌多糖抗原。d)含有來源于粘膜炎莫拉菌和/或未分類流感嗜血菌的一種或多 種抗原的疫苗c)。
加入蛋白D作為載體對以上所有組合型疫苗均有利。很明顯，組合型疫苗中包含的載體種類越多(例如為了克服表位抑制)，最終疫苗就越昂貴并且越復(fù)雜。因此，將組合型疫苗的所有或大多數(shù)多糖抗原結(jié)合在蛋白D上可帶來相當(dāng)大的利益。
在預(yù)防高齡人群(+55歲)的肺炎和嬰兒或幼兒的中耳炎時，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是將文中所述的多價肺炎鏈球菌多糖-蛋白D抗原與一種肺炎鏈球菌蛋白或其免疫學(xué)功能等價物相結(jié)合。關(guān)于這種組合物可包含的優(yōu)選蛋白/蛋白組合物，可參考上文“本發(fā)明的肺炎球菌蛋白”一節(jié)。
因此，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，該組合物含有一種肺炎鏈球菌多糖-蛋白D結(jié)合物以及一種肺炎鏈球菌蛋白抗原。
優(yōu)選的是在本發(fā)明的疫苗制劑中將本發(fā)明的多糖-蛋白D結(jié)合物抗原佐劑化。適當(dāng)?shù)淖魟┌ㄤX鹽，如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁，但也可以是鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽，或是?；野彼岬牟蝗軕腋∥?，或?；?、多糖的陽離子或陰離子衍生物，或聚磷腈。
對用于高齡人的疫苗而言，優(yōu)選的是所選佐劑可作為TH1型應(yīng)答的優(yōu)選誘導(dǎo)劑。
關(guān)于特定的Th1佐劑可參考上文“本發(fā)明的Th1佐劑”。
另一方面，本發(fā)明提供如文中所述的一種免疫原或疫苗，用來在醫(yī)學(xué)中使用。
關(guān)于結(jié)合物疫苗的制備/給藥方法，可參考上文“本發(fā)明的疫苗制劑”。
在抗中耳炎的疫苗中使用蛋白D也同樣有利，因為蛋白D本身是一種免疫原，可產(chǎn)生B細(xì)胞介導(dǎo)的抗未分類流感嗜血菌(ntHi)防護(hù)作用。ntHi可侵入宿主細(xì)胞，并躲避由蛋白抗原誘導(dǎo)的B細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，有一種方法可提高蛋白D作為抗原(無論是單獨(dú)使用還是作為多糖的載體)用于中耳炎疫苗的有效性。方法是將蛋白D佐劑化，使其能夠在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)一種強(qiáng)Th1應(yīng)答，這樣就可以優(yōu)化針對蛋白D的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)。令人驚奇的是，使用含有蛋白D和一種Th1佐劑(優(yōu)選的為3D-MPL)的凍干組合物即可實現(xiàn)這一點(diǎn)，該組合物可在給藥前即時重構(gòu)。因此，本發(fā)明還提供此類組合物、一種制備此類組合物的方法(方法是將含有蛋白D和一種Th1佐劑的混合物凍干)以及該組合物在中耳炎種類中的應(yīng)用。
從更廣泛的意義上來看，本發(fā)明人認(rèn)為，在Th1佐劑(見“本發(fā)明的Th1佐劑”)，優(yōu)選的為3D-MPL，存在的情況下將免疫原凍干通常都會提高對該免疫原的Th1免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明適用于任何需要針對其產(chǎn)生強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答的免疫原。這些免疫原包括細(xì)菌性、病毒性和腫瘤性蛋白抗原，也包括這些蛋白本身及其肽。實施例
這些實施例可對本發(fā)明進(jìn)行說明，但并不限制本發(fā)明。實施例1肺炎鏈球菌莢膜多糖
候選的11價疫苗含有血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F莢膜多糖，其制備基本如EP 72513所述。利用CDAP化學(xué)物(WO95/08348)將每種多糖活化和派生，并與蛋白載體相結(jié)合。除血清型3(減小尺寸以降低其粘度)之外，所有多糖都以其天然形式結(jié)合。蛋白載體
所選蛋白載體為來源于未分類流感嗜血菌但在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白D。蛋白D的表達(dá)流感嗜血菌用于蛋白D表達(dá)的基因構(gòu)建原材料蛋白D編碼DNA
蛋白D在所有血清型以及未分類的流感嗜血菌中都高度保守。含有整個蛋白D基因編碼DNA序列的載體pHIC348由A.Forsgren博士，Department of Medical Microbiology，University of Lund，Malm General Hospital，Malm，Sweden提供。蛋白D的DNA序列由Janson et al.(1991)Infect.Immun.59119-125發(fā)表。表達(dá)載體pMG1
表達(dá)載體pMG1派生于pBR322(Gross et al.，1985)，其中引入了衍生于噬菌體λ的調(diào)控因子，該調(diào)控因子用于調(diào)控插入的外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯(Shatzman et al.，1983)。此外，氨芐青霉素抗性基因被替換成了卡那霉素抗性基因。大腸桿菌菌株AR58
用預(yù)先在SA500派生菌(galE∷TN10，LambdaKil cI857 ΔH1)中生長的P1噬菌體原種轉(zhuǎn)導(dǎo)N99即獲得大腸桿菌菌株AR58。N99和SA500屬于大腸桿菌K12菌株，由National Institute of Health的Martin Rosenberg博士的實驗室提供。表達(dá)載體pMG1
產(chǎn)生蛋白D時，將編碼該蛋白的DNA克隆到表達(dá)載體pMG1中。該質(zhì)粒使用λ噬菌體DNA的信號來推動外源插入基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。該載體含有啟動子PL、操縱子OL和2種可用位點(diǎn)(NutL和NutR)，從而當(dāng)N蛋白存在時可緩解轉(zhuǎn)錄極性效應(yīng)(Gross et al.，1985)。將含有PL啟動子的載體引入一種大腸桿菌溶原性宿主，以保持質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定。溶原性宿主菌株含有整合到基因組中的復(fù)制缺陷型λ噬菌體DNA(Shatzman et al.，1983)。染色體中的λ噬菌體DNA可指導(dǎo)cI阻抑物蛋白的合成，該蛋白能夠與載體的OL阻抑物結(jié)合，從而避免插入基因通過RNA聚合酶與PL啟動子結(jié)合而轉(zhuǎn)錄。表達(dá)菌株AR58的cI基因含有一種溫度敏感性突變，因而可通過溫度變化來調(diào)控PL指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，即提高培養(yǎng)溫度可使阻抑物失活，從而開始合成外源蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)可實現(xiàn)外源蛋白，特別是對細(xì)胞有毒性的外源蛋白，的受控合成(Shimataka&Rosenberg)。大腸桿菌菌株AR58
用來產(chǎn)生蛋白D載體的AR58溶原性大腸桿菌菌株派生于標(biāo)準(zhǔn)的NIH大腸桿菌K12菌株N99(F-su-galK2，lacZ-thr-)。它含有缺陷型溶原性λ噬菌體(galE∷TN10，LambdaKil-cI857ΔH1)。Kil表型可防止宿主停止合成大分子。cI857突變可使cI阻抑物具有一種對溫度敏感的損傷。ΔH1缺失可去除λ噬菌體的右側(cè)操縱子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因位點(diǎn)。用預(yù)先在SA500派生菌(galE∷TN10，LambdaKil-cI857ΔH1)中生長的P1噬菌體原種轉(zhuǎn)導(dǎo)N99即獲得大腸桿菌菌株AR58。由于galE基因附近存在編碼四環(huán)素抗性的TN10轉(zhuǎn)座子，因而可利用四環(huán)素對缺陷型溶菌原向N99的轉(zhuǎn)導(dǎo)情況進(jìn)行篩選。載體pMGMDPPrD的構(gòu)建
pMGMDPPrD的構(gòu)建使用的是含有流感病毒S1非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的pMG1載體(pMGNSI)。利用在5’和3’端分別含有NcoI與XbaI限制位點(diǎn)的PCR引物經(jīng)PCR由pHI C348載體(Janson et al.1991)擴(kuò)增出蛋白D基因。然后將NcoI/XbaI片段引入到pMGNSI的NcoI與XbaI之間，這樣就創(chuàng)建了一種在PD蛋白前含有NS1蛋白N端81個氨基酸的融合蛋白。該載體記為pMGNS1PrD。
在上述構(gòu)建體的基礎(chǔ)上產(chǎn)生用于蛋白D表達(dá)的最終構(gòu)建體。從pMGNS1PrD中去除BamHI/BamHI片段。該DNA水解反應(yīng)可去除NS1編碼區(qū)而只保留其N端的前3個殘基。將載體重新連接，即產(chǎn)生了一種可編碼具有以下N端氨基酸序列的融合蛋白的基因-----MDP SSHSSNMANT-----NS1 蛋白D
蛋白D不含有導(dǎo)肽或通常連接有脂鏈的N端半胱氨酸。因此，該蛋白不會被分泌到周質(zhì)中，也不會被脂化，而是以可溶形式保留在細(xì)胞質(zhì)中。
通過37℃熱休克將最終構(gòu)建體pMG-MDPPrD引入到AR58宿主菌中。在卡那霉素存在的情況下篩選含有質(zhì)粒的細(xì)菌。用選定的核酸內(nèi)切酶消化分離的質(zhì)粒DNA，因此來證明蛋白D編碼DNA插入序列的存在。重組的大腸桿菌菌株稱為ECD4。
在λPL啟動子/OL操縱子的調(diào)控下表達(dá)蛋白D。宿主菌AR58的基因組中含有溫度敏感性cI基因，它在低溫下可通過與OL結(jié)合來阻礙由λPL起始的表達(dá)。一旦溫度提高，OL即釋放cI，從而使蛋白D能夠表達(dá)。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，可將細(xì)胞濃縮并冷凍。
如下所述由收集的細(xì)胞抽提并純化蛋白D。將冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀融解，并重懸于細(xì)胞裂解液(檸檬酸緩沖液pH6.0)，使最終OD650＝60。使該懸浮液兩次流經(jīng)P＝1000bar的高壓勻漿儀。通過離心澄清細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿，并過濾去除細(xì)胞碎片。第一次純化步驟是將過濾的溶菌產(chǎn)物上樣于陽離子交換層析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD可通過離子交換與凝膠基質(zhì)結(jié)合，并可通過增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度而將其洗脫。
第二次純化步驟可使雜質(zhì)保留在陰離子交換基質(zhì)上(Q SepharoseFast Flow)。PD不與該凝膠結(jié)合，從而可收集在流出物中。
兩次柱層析步驟均利用OD來監(jiān)測分部收集物。將陰離子交換層析柱的流出物超濾濃縮，其中含有純化的蛋白D。
最后，使含有蛋白D的超濾滯留物流經(jīng)0.2μm濾膜?；瘜W(xué)反應(yīng)活化及偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)
每種多糖有特定的活化及偶聯(lián)條件。這些條件列于表1。將天然多糖(PS3除外)溶于2M NaCl或水以用于注射。評定所有血清型的最佳多糖濃度。
將溶于乙腈的100mg/ml CDAP儲液加到多糖溶液中(CDAP/PS比率為0.75mg/mg PS)。1.5分鐘后加入0.2M三乙胺以獲得特定的活化pH值。在該pH及25℃條件下將多糖活化2分鐘。將蛋白D(數(shù)量取決于最初的PS/PD比率)加到活化的多糖中，并使偶聯(lián)反應(yīng)在特定pH下持續(xù)1小時。然后在25℃下用甘氨酸將反應(yīng)淬滅30分鐘，再4℃過夜。
通過凝膠過濾將結(jié)合物純化，過濾使用的是0.2M NaCl平衡的Sephacryl 500HR凝膠過濾柱。
測定洗脫組分的糖類及蛋白含量。將結(jié)合物合并，再用0.22μm除菌膜過濾除菌。測定該結(jié)合物制劑的PS/蛋白比率。性質(zhì)鑒定
鑒定各結(jié)合物的性質(zhì)，其結(jié)果符合表2所述的詳細(xì)說明。多糖含量(μg/ml)的測定采用間苯二酚測定法，蛋白含量(μg/ml)的測定采用Lowry測定法。由濃度的比值確定最終的PS/PD比率(w/w)。殘留DMAP含量(ng/μg PS)
用CDAP活化多糖可將氰基引入多糖，并且釋放出DMAP(4-二甲氨基-吡啶)。利用SB開發(fā)的特定測試法確定殘留的DMAP含量。游離多糖含量(％)
將4℃保存或37℃儲存7天的結(jié)合物與α-PD抗體保溫，再用硫酸銨飽和，然后離心，最后測量上清液中的游離多糖含量。
利用α-PS/α-PS ELISA方法測定上清液中游離多糖的含量。另外還利用α-PD/α-PS ELISA方法測量結(jié)合物空白對照。降低游離多糖的量可獲得改進(jìn)的結(jié)合物疫苗?？乖?br> 利用夾心式ELISA方法分析上述結(jié)合物的抗原性，其中捕獲抗體和檢測抗體分別為α-PS和α-PD。游離蛋白含量(％)
通過用SDS處理樣品的方法測定“游離的”殘留蛋白D的水平。在100℃及存在0.1％SDS的條件下將結(jié)合物加熱10分鐘，然后上樣于SEC-HPLC凝膠過濾柱(TSK 3000-PWXL)。由于蛋白D為二聚體，所以用SDS將該結(jié)構(gòu)解離的方法可能會使“游離”蛋白D的水平被過高估計。分子大小(Kav)
在SEC-HPLC凝膠過濾柱(TSK 5000-PWXL)上測定分子大小。穩(wěn)定性
在HPLC-SEC凝膠過濾柱(TSK 6000-PWXL)上測量4℃保存或37℃儲存7天的結(jié)合物的穩(wěn)定性。
表2給出11價疫苗的特性。
可將蛋白結(jié)合物吸附在磷酸鋁上，然后合并，成為最終的疫苗。結(jié)論
由此即產(chǎn)生了免疫原性結(jié)合物，后來發(fā)現(xiàn)，該結(jié)合物可作為一種頗有前途的疫苗的成分。針對每種11價疫苗都找到了獲得高品質(zhì)的最終肺炎球菌多糖結(jié)合物的優(yōu)化CDAP條件。因此，由上述改進(jìn)(優(yōu)化)的CDAP方法獲得的這些肺炎球菌多糖結(jié)合物(與所用載體蛋白無關(guān)，但優(yōu)選的為蛋白D)可作為本發(fā)明的另一方面。實施例2-改進(jìn)的佐劑對11價肺炎球菌PS-PD結(jié)合物疫苗在未成年大鼠中的免疫原性影響的研究
用11價肺炎球菌PS-PD結(jié)合物疫苗免疫未成年大鼠，劑量為每種多糖(按實施例1的方法制備)0.1μg，并且使用以下佐劑配方無佐劑、AlPO4、3D-MPL、吸附在AlPO4上的3D-MPL。
在11種抗原中，只含有3D-MPL的劑型比其它劑型在統(tǒng)計學(xué)上更具免疫原性(最高的GMC IgG)的有5種。使用高濃度和低濃度3D-MPL時均是如此。
調(diào)理素吞噬作用也支持該GMC結(jié)果。材料與方法免疫方案
將不同母鼠隨機(jī)繁殖的7天齡未成年OFA大鼠進(jìn)行首次免疫。并在14和28天后再進(jìn)行2次免疫。第56天(III級免疫后第28天)時取血。所有疫苗均為皮下注射，每組疫苗免疫10只大鼠。
用含有結(jié)合在蛋白D上的下列血清型多糖的11價肺炎球菌結(jié)合物疫苗免疫大鼠1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F。配制方法
為檢測不同改進(jìn)佐劑的效果，將每種多糖結(jié)合物的劑量保持在0.1μg不變，并用AlPO4和3D-MPL佐劑以不同劑量和組合形式進(jìn)行配制，其中包括不加任何佐劑。其結(jié)果以數(shù)值形式列于表3，以供參考。吸附在AlPO4上
被吸附的濃縮單價疫苗的制備方法如下。將50μg AlPO4(pH5.1)與5μg結(jié)合物多糖混合。2小時后將其pH調(diào)至pH5.1，然后再放置16小時。添加1500mM NaCl，使鹽濃度最終為150mM。5分鐘后，添加5mg/ml的2-苯氧乙醇。放置30分鐘，再將pH調(diào)至6.1，然后于4℃放置3天以上。稀釋劑的制備
在NaCl 150mM/5mg/ml苯氧乙醇中制備3種稀釋劑
A1mg/ml AlPO4
B濃度分別為250和1000μg/ml的吸附在AlPO4上的3D-MPL，3D-MPL/AlPO4的重量比＝5/20。
C濃度分別為561和1000μg/ml的吸附在AlPO4上的3D-MPL，3D-MPL/AlPO4的重量比＝50/89。被吸附的11價疫苗的制備
將11種被吸附的濃縮PS-PD單價疫苗以適當(dāng)比例混合。按稀釋劑A補(bǔ)加AlPO4。當(dāng)需要加3D-MPL時，則以水溶液形式(未吸附形式，見下文的方法1)或按稀釋劑B或C(2倍劑量的吸附在AlPO4上的3D-MPL，見下文的方法2)添加。方法1
將3D-MPL以水性懸浮液形式添加到被吸附的組合型結(jié)合物中。室溫下將其與11價疫苗混合10分鐘，并在給藥前保存于4℃。方法2
將3D-MPL預(yù)先吸附在AlPO4上，然后添加到被吸附的組合型結(jié)合物中(稀釋劑B和C)。室溫下將3D-MPL的水性懸浮液(250或561μg)與1mg溶于150mM NaCl pH6.3的AlPO4混合5分鐘，制成1ml稀釋劑。用NaCl pH6.1/苯氧乙醇稀釋該溶液，再4℃保溫過夜。未被吸附的11價疫苗的制備
將11種PS-PD結(jié)合物混合，并以適當(dāng)比例稀釋于150mM NaClpH6.1，苯氧乙醇。當(dāng)需要加3D-MPL時，則以溶液形式(未吸附形式)添加。
用于注射的所有制劑都是在首次給藥前第18天時制備。ELISA
測量大鼠IgG的ELISA方法采用的是WHO Workshop的方案，該ELISA方法可用來測定人類血清中的抗肺炎鏈球菌莢膜多糖IgG抗體含量。從本質(zhì)上說，是用純化的莢膜多糖直接包被微量滴定板。將血清樣品與所有肺炎球菌共有的細(xì)胞壁多糖(C物質(zhì))預(yù)保溫，該細(xì)胞壁多糖在按照公開內(nèi)容(EP 72513 B1)純化的肺炎球菌多糖中約占0.5％。然后利用Jackson ImmunoLaboratories Inc.試劑檢測結(jié)合的鼠IgG。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物(單克隆抗體)的邏輯對數(shù)方程模型繪制效價曲線。再利用SoftMax Pro軟件加以計算?？烧J(rèn)為這些結(jié)果的最大絕對誤差系數(shù)小于2。相對誤差則低于30％。調(diào)理素吞噬作用
通過CDC方法(用分化的HL60細(xì)胞檢測肺炎鏈球菌的調(diào)理素吞噬作用，1.1方案)用純化的人PMN和幼兔補(bǔ)體測定血清型3、6B、7F、14、19F及23F的調(diào)理素效價。所做修改包括使用自身(in house)肺炎球菌菌株并用純化的人嗜中性粒細(xì)胞PMN代替HL60吞噬細(xì)胞(這些吞噬細(xì)胞之間具有高度的相關(guān)性)。此外還在微量滴定板中加入3mm玻璃珠以加強(qiáng)混合，這樣能夠使吞噬細(xì)胞細(xì)菌的比例降低至400這一推薦值。結(jié)果IgG濃度
表4-10顯示每種血清型與PD的IgG濃度幾何平均數(shù)。為便于比較，還提供了此前由4價疫苗制劑獲得的血清型6B、14、19F及23F的結(jié)果。
表4-10突出顯示了最高的IgG濃度。表11為3D-MPL相對于3D-MPL/AlPO4組合物的統(tǒng)計學(xué)p值。在11種血清型中，有9種血清型的最高GMC’s是由第4號佐劑配方(含有高劑量3D-MPL的未吸附結(jié)合物)獲得。另一種最具免疫原性是低劑量MPL配方，占5/11。此外，與改變劑量的方法相比，佐劑化方法能夠使所有血清型都獲得更高的GMC’s(數(shù)據(jù)未顯示)，血清型4、6B、7F、18C和23F在這一方面具有統(tǒng)計顯著性(由95％CI得出的p＜0.05)。調(diào)理素吞噬作用
表4-8顯示血清型3、6B、7F、14、19F和23F的合并血清的調(diào)理素吞噬作用結(jié)果。這些調(diào)理素效價在很大程度上可進(jìn)一步證實GMCIgG。事實上，血清型6B、19F、23F的IgG濃度相關(guān)性大于85％(數(shù)據(jù)未顯示)。重要的是應(yīng)注意到，對血清型3而言，只有3D-MPL組誘導(dǎo)出了高于閾值的調(diào)理素活性。結(jié)論
在該實驗中，出乎意料的是單獨(dú)使用3D-MPL誘導(dǎo)出的IgG濃度最高。
將通過改變佐劑獲得的最大GMC IgG與通過改變PS劑量獲得的最大GMC進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)在11種血清型中，有5種是3D-MPL誘導(dǎo)出明顯更高的應(yīng)答。
表11顯示，通過3D-MPL與3D-MPL/AlPO4組合物的比較(比較配制方法和3D-MPL劑量)可發(fā)現(xiàn)，只用3D-MPL配制時的免疫原性明顯高于用3D-MPL+AlPO4配制時的免疫原性的多糖結(jié)合物有5種PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F。實施例3-組合方法對PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F在成年大鼠中的免疫原性影響的研究
用肺炎球菌多糖-蛋白D結(jié)合物疫苗單獨(dú)免疫成年大鼠，或用合并的多價組合物(4價、5價、7價或10價)免疫成年大鼠。10只大鼠為1組，每組免疫兩次，間隔28天，并在第28天和第42天(第二次給藥后第14天)取血測試。
通過ELISA測定血清中的抗肺炎球菌多糖IgG抗體。ELISA的測定結(jié)果表明，所有結(jié)合物都誘導(dǎo)出特定的IgG抗體。表12顯示單價PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F蛋白D結(jié)合物的組合方法對其在成年大鼠中的免疫原性的影響，該結(jié)果是通過測量第二次給藥后第14天的IgG濃度而獲得。
對所有樣品進(jìn)行統(tǒng)計分析，以確定組合后的抗體濃度是否有明顯差異。用血清型PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F蛋白D結(jié)合物任意組合的多價疫苗均不會明顯改變其免疫原性。表1PS肺炎鏈球菌-蛋白D結(jié)合物的特定活化/偶聯(lián)/淬滅條件表211價肺炎球菌PS-PD疫苗的詳細(xì)說明(批號代碼的第一個數(shù)表明血清型)表3.在未成年大鼠中測試的11價肺炎球菌PS-PD所使用的佐劑配方一覽表表4.用含有不同佐劑的11價PS-PD對未成年大鼠進(jìn)行III級免疫后第28天的血清型6B的IgG濃度幾何平均數(shù)、血清轉(zhuǎn)化和調(diào)理素平均效價(與4價疫苗免疫相比)表5.用含有不同佐劑的11價PS-PD對未成年大鼠進(jìn)行III級免疫后第28天的血清型14的IgG濃度幾何平均數(shù)、血清轉(zhuǎn)化和調(diào)理素平均效價(與4價疫苗免疫相比)表6.用含有不同佐劑的11價PS-PD對未成年大鼠進(jìn)行III級免疫后第28天的血清型19F的IgG濃度幾何平均數(shù)、血清轉(zhuǎn)化和調(diào)理素平均效價(與4價疫苗免疫相比)表7.用含有不同佐劑的11價PS-PD對未成年大鼠進(jìn)行III級免疫后第28天的血清型23F的IgG濃度幾何平均數(shù)、血清轉(zhuǎn)化和調(diào)理素平均效價(與4價疫苗免疫相比)表8.用含有不同佐劑的11價PS-PD對未成年大鼠進(jìn)行III級免疫后第28天的血清型3和7F的IgG濃度幾何平均數(shù)、血清轉(zhuǎn)化和調(diào)理素平均效價表9.用含有不同佐劑的11價PS-PD對未成年大鼠進(jìn)行III級免疫后第28天的血清型1、4和5的IgG濃度幾何平均數(shù)及血清轉(zhuǎn)化表10.用含有不同佐劑的11價PS-PD對未成年大鼠進(jìn)行III級免疫后第28天的血清型9V、18C以及PD的IgG濃度幾何平均數(shù)和血清轉(zhuǎn)化表11某些肺炎球菌多糖結(jié)合物只用3D-MPL配制時的免疫原性相對于用3D-MPL/AlPO4配制時的免疫原性的改進(jìn)情況的統(tǒng)計顯著性(p值)。p值小于0.01則被認(rèn)為顯著性很高。方法1和方法2表明配制方法。表12單獨(dú)使用1.0μg多糖蛋白D結(jié)合物或使用4價、5價、7價或10價組合疫苗對成年大鼠進(jìn)行第二次給藥后第14天的IgG濃度幾何平均數(shù)(μg/ml)。這些數(shù)據(jù)綜合了5次單獨(dú)實驗的結(jié)果。實施例4-添加肺炎球菌溶血素及3D-MPL對11價多糖PD結(jié)合物疫苗在抗小鼠肺炎球菌性肺集群方面的保護(hù)效果的有益影響免疫顯示肺炎球菌溶血素特異性血清IgG的ELISA用量
用稀釋于PBS的2μg/ml重組天然肺炎球菌溶血素(PLY)以100μl/孔的量將Maxisorp Nunc免疫板37℃包被2小時。用NaCl 0.9％Tween-20 0.05％緩沖液將板清洗3次。然后加入作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(從670ng/ml IgG開始)的依次2倍稀釋(于PBS/Tween-20 0.05％，l00μl/孔)的抗PLY參照血清以及血清樣品(由1/10稀釋度開始)，20℃振蕩保溫30分鐘。如前所述清洗，加入5000×稀釋于PBS/Tween-20 0.05％的過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗鼠IgG(Jackson)，20℃振蕩保溫30分鐘。如上清洗，然后室溫下與100μl/孔的顯象緩沖液(溶于100mM檸檬酸緩沖液pH4.5的OPDA 0.4mg/ml和H2O20.05％)保溫15分鐘。通過加入50μl/孔HCl 1N終止顯象。利用Emax免疫讀出儀(Molecular Devices)在490和620nm下測量光密度。用SoftMaxPro軟件以4參數(shù)數(shù)學(xué)法計算抗體效價。溶血抑制
該測定方法可測量血清抗體對肺炎球菌溶血素(PLY)溶血活性的抑制能力。為了去除膽固醇(易與PLY相互作用)，將血清樣品進(jìn)行如下的2×處理與等體積的氯仿混合后振蕩保溫45分鐘。1000rpm離心10分鐘，然后收集上清液。在96孔板(Nunc.)中將去除膽固醇的血清稀釋(用1mM二硫蘇糖醇，0.01％BSA，15mM TRIS，150mMNaCl，pH7.5)依次2倍稀釋。每孔加入50μl含有4HU(溶血單位)PLY的溶液，37℃保溫15分鐘。然后加入100μl羊血紅細(xì)胞(1％的溶液)，37℃保溫30分鐘。l000rpm離心10分鐘，然后收集上清液(150μl)至另一96孔板，在405nm下測量光密度。給出的結(jié)果為中點(diǎn)稀釋度的效價。肺炎球菌溶血素的化學(xué)去毒
將重組的天然肺炎球菌溶血素(PLY)對磷酸鹽50mM、NaCl 500mM pH7.6的緩沖液透析。以下所有步驟都在39.5℃及偶爾振蕩的條件下進(jìn)行。第1天，在PLY溶液中加入含有Tween-80 10％(1/250v/v)、N-乙酰色氨酸57.4mM pH7.6(3/100v/v)、甘氨酸2.2M的磷酸緩沖液(1/100v/v)和含有10％甲醛的磷酸緩沖液(3/100v/v)。第2和第3天再分別加入3/100及2/100v/v比的10％甲醛。在偶爾振蕩的條件下39.5℃保溫至第7天。最后將PLY對磷酸鹽50mM、NaCl 500mM pH7.6的緩沖液透析。溶血測定表明PLY完全失活。OFl小鼠的肺炎球菌鼻內(nèi)攻擊
將7周齡OF1雌性小鼠麻醉，用5.105CFU的鼠適應(yīng)性肺炎鏈球菌血清型6B進(jìn)行鼻內(nèi)接種。攻擊6小時后將肺取出，并勻漿(Ultramax，24000rpm，4℃)于Todd Hewith Broth(THB，Gibco)培養(yǎng)基。用依次l0倍稀釋的肺勻漿物將含有THB瓊脂并補(bǔ)加酵母抽提物的培養(yǎng)皿37℃包被過夜。測定肺炎球菌性肺感染的CFU/鼠的數(shù)量，表示為對數(shù)的加權(quán)平均數(shù)。檢測極限為2.14log CFU/鼠。實施例4A
3D-MPL佐劑在抗肺炎球菌溶血素免疫應(yīng)答方面的影響
本發(fā)明評定了3D-MPL佐劑在抗天然重組肺炎球菌溶血素(PLY，由J.Paton，Children’s Hospital，North Adelaide，Australia提供)及其化學(xué)去毒的對應(yīng)物(DPLY)的免疫應(yīng)答方面的影響?；瘜W(xué)去毒的實施如下文所述。
每10只6周齡Balb/c小鼠為一組，在第0、14和21天用包含在AAlPO4 100μg；或BAlPO4 100μg+5μg 3D-MPL(3脫-O-?；鶈瘟柞Ｖ珹，由Ribi Immunochem提供)中的1μg PLY或DPLY對多組小鼠進(jìn)行肌內(nèi)免疫。

圖1A和1B顯示由III級免疫后血清測量的ELISA IgG和溶血抑制效價(HLI)。
無論何種抗原，誘導(dǎo)出最佳免疫應(yīng)答的都是用補(bǔ)加3D-MPL的制劑接種的動物。有趣的是，當(dāng)與AlPO4+3D-MPL一同給藥時，DPLY的免疫原性與PLY相同，而在AlPO4制劑中卻是一種較弱的免疫原。這表明3D-MPL具有提高抗體對去毒肺炎球菌溶血素的應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)。
在含有肺炎球菌溶血素的組合物中，優(yōu)選的是使用以化學(xué)方法去毒的肺炎球菌溶血素而不使用以突變方法去毒的肺炎球菌溶血素。這是因為，迄今為止獲得的去毒突變體仍殘留有毒素化學(xué)——而化學(xué)去毒的肺炎球菌溶血素不會。因此，作為本發(fā)明的另一方面，一般應(yīng)使用一種Th1佐劑，優(yōu)選的為3D-MPL，來輔佐含有經(jīng)化學(xué)去毒以用于疫苗的肺炎球菌溶血素(或肺炎球菌溶血素突變體)的組合物。本發(fā)明即提供這些組合物。另外還提供一種方法，用來提高免疫原性組合物中經(jīng)化學(xué)去毒的肺炎球菌溶血素的免疫應(yīng)答，該方法包括在組合物中添加一種Th1佐劑(優(yōu)選的為3D-MPL)的步驟。實施例4B
添加肺炎球菌溶血素減毒突變體和3D-MPL佐劑對11價多糖PD結(jié)合物疫苗在抵抗經(jīng)血清型6B鼻內(nèi)攻擊的OF1小鼠的肺炎球菌性肺集群方面的保護(hù)效果的有益影響
本發(fā)明評定了含有11價多糖-蛋白D結(jié)合物、肺炎球菌溶血素減毒突變體抗原(PdB，WO90/06951)和AlPO4+3D-MPL佐劑的疫苗的預(yù)防效果，并與吸附在AlPO4上的11價多糖-蛋白D結(jié)合物傳統(tǒng)制劑進(jìn)行了比較。
每12只4周齡雌性O(shè)F1小鼠為一組，在第0和14天用含有A50μg AlPO4；B0.1μg PS/血清型的11價多糖-PD結(jié)合物疫苗+50μg AlPO4；或C0.1μg PS/血清型的11價多糖-PD結(jié)合物疫苗+10μg PdB(由J.Paton，Children’s Hospital，North Adelaide，Australia提供)+50μg AlPO4+5μg 3D-MPL(由Ribi Immunochem提供)的制劑對多組小鼠進(jìn)行皮下免疫。并如上所述在第21天進(jìn)行攻擊。
如圖1C所示，補(bǔ)加有PdB和AlPO4+MPL佐劑的11價多糖結(jié)合物疫苗產(chǎn)生了非常明顯的防護(hù)作用(p＜0.007)(黑色條帶表示算術(shù)平均數(shù))。相反，在用11價多糖結(jié)合物/AlPO4制劑免疫的動物體內(nèi)未觀測到明顯的防護(hù)作用。該結(jié)果證明，添加肺炎球菌溶血素抗原(甚至是減毒的)和3D-MPL佐劑可增強(qiáng)11價多糖結(jié)合物疫苗的抗肺炎效率。實施例4C實施例4B所示防護(hù)作用的免疫相關(guān)性
為了確立實施例4B中產(chǎn)生的防護(hù)作用的免疫相關(guān)性，在11價多糖結(jié)合物疫苗中補(bǔ)加減毒的肺炎球菌溶血素突變體(PdB)和3D-MPL，并如上文所述測定攻擊前對多糖6B及PdB的血清抗體應(yīng)答。
然后將抗體效價與攻擊6小時后相應(yīng)動物的肺部細(xì)菌菌落測量值相比較。在Log/Log線性回歸圖上計算R2。
通過計算，抗PdB和抗6B抗體應(yīng)答的R2分別為0.18和0.02。這表明體液免疫應(yīng)答與這兩種抗原的防護(hù)作用之間沒有相關(guān)性。抗6B抗體的效價在用11價結(jié)合物疫苗(GMY＝0.318ng/ml)免疫或用補(bǔ)加有PdD和3D-MPL的相同疫苗(GMY＝0.458ng/ml)免疫的不同組之間沒有明顯的差異。因此，由制劑C觀測到的防護(hù)作用加強(qiáng)不只是因為對多糖6B的抗體應(yīng)答較強(qiáng)。
綜上所述，這些結(jié)果表明防護(hù)作用并非只由體液免疫應(yīng)答介導(dǎo)，而是還有PdB抗原在3D-MPL存在的情況下誘導(dǎo)出的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的參與。這就更加支持了在肺炎球菌多糖結(jié)合物疫苗中添加蛋白抗原和潛在佐劑以協(xié)調(diào)兩種免疫系統(tǒng)來獲得最佳防護(hù)作用的觀點(diǎn)。實施例5-用肺炎球菌溶血素主動免疫以及用抗肺炎球菌PS抗體被動免疫的小鼠體內(nèi)的兩種免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用實施例5A-確定經(jīng)被動給藥后可預(yù)防肺炎的抗6B多糖(抗PS)抗體的濃度方法
疫苗組按下表所述分組方法在第1天用100μl未稀釋的大鼠抗多糖抗血清對4組小鼠進(jìn)行被動免疫(i.p.)，每組16只小鼠(共64只小鼠)。
動物來自Charles River，Canada的64只雄性CD-1小鼠。重量約35g(約10周齡)
麻醉用異氟烷(3％)加O2(1L/min)將小鼠麻醉。
生物體從補(bǔ)加有5％馬血的胰胨豆胨瓊脂平板(TSA)收集肺炎鏈球菌N1387(血清型6)并懸浮在6ml PBS中。在進(jìn)行感染前，將1ml細(xì)菌懸浮液稀釋于9ml冷卻的溶融營養(yǎng)瓊脂，并保持于41℃。每只小鼠約接受6.0log10cfu，體積50μl。
感染第0天，如上文所述將小鼠麻醉，并用肺炎鏈球菌N1387(50μ1冷卻的細(xì)菌懸浮液)感染小鼠，方法是通過非手術(shù)氣管內(nèi)插管進(jìn)行支氣管內(nèi)滴注。Woodnut and Berry(Antimicrob.Ag.Chemotherap.4329(1999))對該方法有所描述。
取樣感染后第3天，利用過量CO2將每組中的8只小鼠處死，取出肺并勻漿在1ml PBS中。用PBS依次10倍稀釋，以計算存活菌的數(shù)量。將樣品(20μμl)接種在補(bǔ)加有5％馬血的TSA平板上，一式三份，37℃保溫過夜，然后進(jìn)行評定。其它的小鼠則在第7天處死并如上所述取樣。結(jié)果
括號中的數(shù)字為取樣時間前死亡的動物數(shù)量。結(jié)論
總的來說，從所有處理組分離出的細(xì)菌數(shù)之間沒有明顯的差異。這表明，直至并包括5μg/ml濃度的抗多糖抗血清也不能產(chǎn)生可測量的防護(hù)作用。
這與某些人類臨床試驗的觀測結(jié)果相類似，即抗多糖抗體不足以防護(hù)某些群體的肺炎球菌性肺炎。實施例5B-測定由含有或不含有佐劑的Ply(肺炎球菌溶血素)的主動給藥產(chǎn)生的防肺炎作用以及與亞-最佳(sub-optimal)抗PS抗體的協(xié)同作用。方法
動物來自Charles River，St.Constant，Quebec，Canada的128只雄性CD-1小鼠(免疫時為6周齡，感染時為10周齡)。動物在6周時約重20gm，10周時約重38g。
免疫在第22天和第14天用100μl下述疫苗對6組小鼠進(jìn)行皮下免疫，每組16只小鼠(共128只小鼠)。PdB(WO90/06951)由澳大利亞的James Paton博士慷慨捐贈。3D-MPL來自Ribi/Corixa。
第1天，用4.26μg/ml濃度(5μg/ml濃度取4ml+2μg/ml濃度取1.3ml)的鼠抗多糖抗體對特定的組(見下表)進(jìn)行被動免疫(i.p.100μl)。感染第0天，將小鼠麻醉(3％異氟烷加1L/min O2)。細(xì)菌接種物的制備方法是從補(bǔ)加有5％馬血的胰胨豆胨瓊脂平板(TSA)收集生長的肺炎鏈球菌N1387(血清型6)并懸浮在6ml PBS中。在感染前用冷卻的溶融營養(yǎng)瓊脂制備成10倍稀釋液(1ml+9ml)(保持于41℃)。通過非手術(shù)氣管內(nèi)插管進(jìn)行支氣管內(nèi)滴注，以感染小鼠。每只小鼠約接受6.0log10cfu，體積50μl。Woodnut and Berry(Antimicrob.Ag.Chemotherap.4329(1999))對該方法有所描述。
取樣感染后第72，利用過量CO2將每組中的8只小鼠處死，取出肺并勻漿在1m1 PBS中。用PBS依次10倍稀釋，以計算存活菌的數(shù)量。將樣品(20μl)接種在補(bǔ)加有5％馬血的TSA平板上，一式三份，37℃保溫過夜，然后進(jìn)行評定。其它的小鼠則在感染后第8天處死并如上所述取樣。數(shù)據(jù)分析
測量感染后第3天和第7天的肺中細(xì)菌數(shù)，并將不同處理方法的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表示為組平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過Studentst-test進(jìn)行統(tǒng)計分析，p值＜0.05的被認(rèn)為具有顯著性。結(jié)果感染后第72小時
1-4組的細(xì)菌計數(shù)明顯低于1-3組(p＜0.05)。
1-4組的細(xì)菌計數(shù)明顯低于1-5組(p＜0.05)。感染后第168小時
各組的第8天細(xì)菌數(shù)均比第3天細(xì)菌數(shù)低約2個數(shù)量級，這表明感染正在消退。
1-2組的細(xì)菌計數(shù)明顯低于1-5組(p＜0.05)。
如上所示，單獨(dú)使用抗多糖抗體(組1-5)不會產(chǎn)生抗肺部肺炎球菌生長的防護(hù)作用。用AlPO4為佐劑的PdB也是如此，但PdB與3D-MPL結(jié)合使用時，在第8天傾向于產(chǎn)生一種防護(hù)作用(組1-2)。
第3天時，使用所有3種成分，PdB、3D-MPL和被動給藥的抗多糖抗體，的組1-4產(chǎn)生了最明顯的防護(hù)作用。死亡率也支持這一結(jié)果。組1-4只有2/8死亡，相比之下，組1-5和1-3有5/10死亡。結(jié)論
因為該實驗使用被動免疫的動物，所以，另由肺炎球菌溶血素和MPL的主動免疫產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)不是由抗多糖抗原的抗體水平增加引起的。
由于動物只接受一次抗肺炎球菌多糖的被動免疫，因而在第8天時，這種抗體的大部分已被宿主消耗。
盡管如此，在用肺炎球菌溶血素加3D-MPL免疫的組中，尤其在用肺炎球菌溶血素加3D-MPL加被動給藥的抗多糖抗體免疫的組中，仍觀測到了明顯的抗肺炎球菌性肺炎的防護(hù)作用，這表明該組合方式具有協(xié)同效應(yīng)。
如果以主動方式(優(yōu)選的是使用結(jié)合的多糖)進(jìn)行抗多糖免疫，則效果會因B細(xì)胞的記憶效應(yīng)而更加明顯，另外恒定水平的抗PS抗體也會促進(jìn)免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用(可參考，例如，圖1C，其中顯示的多種以多糖和蛋白進(jìn)行主動免疫的動物在攻擊后肺部無細(xì)菌存在)。實施例6-3D-MPL輔佐的11價肺炎球菌-多糖蛋白D結(jié)合物疫苗在1歲Balb/C小鼠中的免疫原性前言及目標(biāo)
抗肺炎球菌性感染的防護(hù)作用是由血清型特異性抗體通過調(diào)理素吞噬作用來介導(dǎo)的?？梢酝茰y，增加該抗體的濃度會使防護(hù)作用更強(qiáng)，因而所做的許多努力都是為了尋求加強(qiáng)體液應(yīng)答的方法。有一種使用免疫刺激性佐劑的策略已成功應(yīng)用于臨床前結(jié)合物疫苗的研究(見綜述Poolman et al.1998，基于糖類的細(xì)菌疫苗。InHandbookof Experimental Pharmacology eds.P.Perlmann and H.Wigsell.Springer-Verlag，Heidelberg，D)。
本節(jié)提供的數(shù)據(jù)為最新實驗的結(jié)果，該實驗采用經(jīng)設(shè)計可模擬臨床試驗的方案，并使用臨床批藥。方案
用肺炎球菌-多糖蛋白D結(jié)合物疫苗或23價普通多糖疫苗免疫1歲balb/c小鼠，劑量為人類劑量的1/10。所用疫苗為臨床批藥DSP009、DSP013或DSP014，分別相當(dāng)于1mcg劑量血清型6B與23F及5mcg其余血清型的11價結(jié)合疫苗、0.1mcg劑量的11價結(jié)合疫苗，或用5mcg 3D-MPL佐劑配制的0.1mcg劑量的11價結(jié)合疫苗。所有11價結(jié)合疫苗都另加有50μg AlPO4佐劑。
對20只為一組的小鼠進(jìn)行肌內(nèi)免疫。在第0天和第21天對下表所列的各組小鼠進(jìn)行注射。在第35天(第二次給藥后第14天)取血測試。表用肺炎球菌-多糖蛋白D結(jié)合物疫苗的臨床批藥免疫1歲Balb/c小鼠的免疫時間表
按照CDC/WHO統(tǒng)一方案，即用細(xì)胞壁多糖將血清中和后，利用ELISA方法測試血清的抗肺炎球菌多糖IgG抗體。以血清型特異性IgG1單克隆抗體為標(biāo)準(zhǔn)對ELISA的結(jié)果進(jìn)行校正，以獲得單位為mcg/ml的抗體濃度。
比較結(jié)果的統(tǒng)計分析用UNISTAT 5.0beta版進(jìn)行計算。IgG濃度log值的方差分析采用Tukey-HSD方法。血清轉(zhuǎn)化率的成對比較使用Fisher的精確測試方法。結(jié)果
下表顯示第二次免疫(第二次給藥)后第14天的抗11種血清型及蛋白D的GMC IgG以及95％的置信區(qū)間。其中無法計算出95％置信區(qū)間的則顯示為血清轉(zhuǎn)化率。
組1表明用普通多糖進(jìn)行免疫的結(jié)果一般是只在動物體內(nèi)誘導(dǎo)出IgM。大部分IgG水平低于檢測閾值；但balb/c小鼠能夠針對少量肺炎球菌多糖產(chǎn)生IgG，尤其是血清型3、19F和14。
用結(jié)合物疫苗進(jìn)行免疫可誘導(dǎo)出抗23F以外的所有血清型的IgG抗體，并且可獲得高血清轉(zhuǎn)化率。
通過觀測發(fā)現(xiàn)，只有血清型7F和19F產(chǎn)生了劑量依賴性應(yīng)答(組4與組2相比)，但這些觀測結(jié)果不具有統(tǒng)計顯著性。在兩次給藥后獲得較強(qiáng)應(yīng)答的(b組與a組相比)有血清型3、6B、7F和19F以及PD，這些觀測結(jié)果在所有3種制劑的多種情況下都具有統(tǒng)計顯著性。
最有趣的是3D-MPL的效應(yīng)。將3D-MPL配制的疫苗兩次給藥(組3b)可誘導(dǎo)出最高的特異性GMC IgG，這對23F以外的所有血清型都具有統(tǒng)計顯著性，而對23F則是獲得明顯更高的血清轉(zhuǎn)化率(p＝0.02組3b與組2b相比，F(xiàn)isher的精確測試)。表用11價PS-PD結(jié)合物疫苗進(jìn)行II級免疫后第14天的1歲Balb/c小鼠體內(nèi)特定肺炎球菌血清型及蛋白D的[IgG]幾何平均數(shù)和95％的置信區(qū)間*單位為EU/ml；#血清轉(zhuǎn)化率，解釋為比陰性對照的平均值超出2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。
請參照前表對組的定義。結(jié)論
提供的數(shù)據(jù)表明，在11價肺炎球菌-多糖蛋白D結(jié)合物疫苗中添加3D-MPL可加強(qiáng)高齡balb/c小鼠對所有已測試血清型的免疫應(yīng)答。
在大多數(shù)情況下，將疫苗兩次給藥可誘導(dǎo)出比單次給藥更高的IgG濃度幾何平均數(shù)。而使用普通多糖疫苗并未觀測到這種現(xiàn)象，甚至用于人類也是如此，因而可認(rèn)為該結(jié)果表明了一種T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答以及免疫記憶的產(chǎn)生。
這些數(shù)據(jù)對使用結(jié)合的肺炎球菌多糖并用一種Th1佐劑(優(yōu)選的為3D-MPL)輔佐的疫苗給藥方案給予了支持，該方案至少將2倍劑量的佐劑化疫苗給藥，其間隔優(yōu)選的為1-12周，最優(yōu)選的為3周。該給藥方案可作為本發(fā)明的另一方面。
該實驗使用的小鼠對PS 23(普通的或結(jié)合的)不產(chǎn)生應(yīng)答。有趣的是，當(dāng)以3D-MPL為佐劑時，盡管抗多糖抗體的水平仍然很低，并且無論使用何種疫苗組合物都是如此，但還是有更多的小鼠對PS23產(chǎn)生了應(yīng)答(血清轉(zhuǎn)化率則明顯提高)。Th1佐劑，特別是3D-MPL，為解除對疫苗中某種肺炎球菌多糖的無應(yīng)答性而在含有結(jié)合的肺炎球菌多糖的疫苗中的應(yīng)用可作為本發(fā)明的又一方面。利用二倍劑量給藥方案來解除對上述組合物的無應(yīng)答性的方法也可作為本發(fā)明的一個方面。實施例7-腦膜炎奈瑟菌C多糖-蛋白D結(jié)合物(PSC-PD)A蛋白D的表達(dá)
如實施例1B多糖C的產(chǎn)生
C型多糖來源于腦膜炎奈瑟菌C11菌株。利用傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)(EP72513)將其發(fā)酵。用于結(jié)合過程的多糖干粉與Mencevax(SBBiologicals s.a.)完全相同。
將一份C11菌株試樣融解，取0.1ml懸浮液在一個補(bǔ)加有酵母抽提物滲析液(10％，v/v)的Mueller Hinton培養(yǎng)基平皿上劃線培養(yǎng)，并在水蒸氣飽和的36℃空氣振蕩器中保溫23-25小時。
然后將表面生長的單菌落重懸在無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將該懸浮液接種在一個含有補(bǔ)加酵母抽提物滲析液(10％，v/v)的MuellerHinton培養(yǎng)基以及無菌玻璃珠的Roux瓶中。在水蒸氣飽和的36℃空氣振蕩器中保溫23-25小時，然后將表面生長的單菌落重懸在10ml無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將0.2-0.3ml該懸浮液接種在另外12個Mueller Hinton培養(yǎng)基Roux瓶中。
在水蒸氣飽和的36℃空氣振蕩器中保溫23-25小時，然后將表面生長的單菌落重懸在10ml無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中。將細(xì)菌懸浮液合并在一個錐形瓶中。
然后在無菌條件下用無菌注射器將該懸浮液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中。
在置于負(fù)壓超凈室的發(fā)酵罐中將腦膜炎球菌發(fā)酵。發(fā)酵一般在10-12小時后完成，相當(dāng)于約1010個細(xì)菌/ml(即穩(wěn)定期早期)，然后提高pH以進(jìn)行檢測。
在此期將整個肉湯培養(yǎng)基加熱滅活(56℃ 12分鐘)，然后離心。在滅活前及滅活后從肉湯培養(yǎng)基中取樣，并在Mueller Hinton培養(yǎng)基平皿上劃線培養(yǎng)。CPS純化
該純化方法需對整個發(fā)酵肉湯進(jìn)行多步操作。純化初期，將滅活培養(yǎng)物離心澄清，回收上清液。
多糖純化的依據(jù)是用季銨鹽(溴棕三甲銨/CTAB，CETAVLON R)進(jìn)行沉淀。CTAB可根據(jù)多糖、核酸及蛋白等多聚陰離子的pI值而與其形成不溶性復(fù)合物。在控制離子條件的情況下，該方法可用來沉淀雜質(zhì)(低電導(dǎo)率)或多糖(高電導(dǎo)率)。
以硅藻土(CELITER545)為基質(zhì)將澄清上清液中包含的多糖沉淀，這樣可避免在不同的沉淀/純化過程中形成不溶性惰性物質(zhì)。腦膜炎奈瑟菌多糖C的純化方案
步驟1將PBC-CTAB復(fù)合物固定在CELITER545上，并用0.05％CTAB清洗以去除細(xì)胞碎片、核酸及蛋白。
步驟2用50％EtOH洗脫P(yáng)S。丟棄最初的含有雜質(zhì)和LPS的混濁組分。利用絮凝測試法驗證隨后組分中的PS存在情況。
步驟3將PS-CTAB復(fù)合物再次固定在CELITE R 545上，并用0.05％CTAB清洗以去除微量的核酸和蛋白。
步驟4用50％EtOH洗脫P(yáng)S。丟棄最初的混濁組分。利用絮凝測試法驗證隨后組分中的PS存在情況。
將洗脫物過濾，并收集合有粗制多糖的濾出液。添加乙醇至終濃度80％，使濾出液中的多糖沉淀。然后回收白色的粉狀多糖，真空干燥并保存于-20℃。DCDAP的結(jié)合PSC與PD的結(jié)合
PSC與PD結(jié)合時，優(yōu)選的CDAP結(jié)合技術(shù)是CNBr活化并通過一種間隔物與載體蛋白結(jié)合的經(jīng)典方法。首先用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)通過氰化作用將多糖活化。CDAP是一種水溶性氰化劑，其氰基基團(tuán)的親電性要高于CNBr，從而能夠在相對溫和的條件下進(jìn)行氰化反應(yīng)?；罨蟮亩嗵强芍苯油ㄟ^其氨基與載體蛋白連接，而無需引入任何間隔分子。通過甘氨酸的過量反應(yīng)可淬滅未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)。這樣可減少結(jié)合物疫苗制備所需的總步驟數(shù)，最重要的是終產(chǎn)物中不存在可能有免疫原性的間隔分子。
用CDAP活化多糖會將氰基引入多糖，并且釋放出二甲氨基吡啶(DMAP)。氰基基團(tuán)能夠在隨后的結(jié)合步驟中與蛋白的NH2-基團(tuán)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成氨基甲酸酯。PSC活化及PSC-PD的結(jié)合
活化及結(jié)合在+25℃下進(jìn)行。
在WFI中將120mg PS溶解至少4小時。
加入CDAP溶液(以100mg/ml濃度新溶于乙腈)，使CDAP/PS(w/w)比率為0.75。
1分30秒后，加入三乙胺使pH升至活化pH值(pH10)，并保持穩(wěn)定直至添加PD。
3分30秒時，加NaCl至終濃度為2M。
4分鐘時，加入純化的PD，使PD/PS比率為1.5/1；立即將pH調(diào)至結(jié)合pH值(pH10)。在保持pH穩(wěn)定的情況下將溶液放置1小時。淬滅
將6m1 2M的甘氨酸溶液加到PS/PD/CDAP混合物中。將pH調(diào)至淬滅pH值(pH8.8)。在工作溫度下將溶液攪拌30分鐘，然后+2-8℃過夜并不斷緩慢攪拌。PS-PD的純化
在冷室內(nèi)用S400HR Sephacryl凝膠以凝膠滲透層析法將過濾(5μm)后的PS-PD結(jié)合物純化，以去除小分子(包括DMAP)和未結(jié)合的PD；洗脫——NaCl 150mM pH6.5；監(jiān)測——UV 280nm、pH和電導(dǎo)率。
根據(jù)反應(yīng)成分的不同分子大小，首先洗脫下來的是PS-PD結(jié)合物，然后是游離的PD，最后是DMAP。根據(jù)DMAB(PS)和μBCA(蛋白)的檢測結(jié)果將含有結(jié)合物的組分合并。將合并的組分過濾除菌(0.2μm)。E吸附于PSC-PD的結(jié)合物疫苗的配制清洗AlPO4
為了使PSC-PD結(jié)合物盡可能完善地吸附在AlPO4上，可將AlPO4清洗以降低PO43-的濃度
——用150mM NaCl清洗AlPO4，再離心(4×)；
——然后將沉淀重懸在150mM NaCl中，然后過濾(100μm)；以及
——將濾出液加熱除菌。
這種清洗過的AlPO4被稱為WAP(清洗并滅菌的磷酸鹽)。配制方法
將松散的PSC-PD結(jié)合物吸附在AlPO4WAP上，最后配制成終產(chǎn)物。室溫下將含有PSC-PD的AlPO4WAP攪拌5分鐘。將pH調(diào)至5.1，并在室溫下將混合物再攪拌18小時。加入NaCl溶液至濃度為150mM，并在室溫下將混合物攪拌5分鐘。加入2-苯氧乙醇至濃度為5mg/mL，室溫下攪拌15分鐘，然后將pH調(diào)至6.1。最終成分/用量
——PSC-PD10μg PS
——AlPO4WAP 0.25mg Al3+
——NaCl 150mM
——2-苯氧乙醇2.5mg
——注射用水 至0.5ml
——pH6.1F臨床使用前的信息多糖結(jié)合物在小鼠體內(nèi)的免疫原性
PSC-PD結(jié)合物的免疫原性已在6-8周齡Balb/C小鼠中進(jìn)行了評定。將普通(未吸附的)結(jié)合物或吸附在AlPO4上的結(jié)合物作為單價疫苗進(jìn)行注射。誘導(dǎo)出的抗PSC抗體的測定采用ELISA方法，而功能性抗體的分析采用殺菌測試法，這兩種方法均以CDC(疾病控制及預(yù)防中心，Atlanta，USA)方案為基礎(chǔ)。為評定應(yīng)答隨劑量的變化以及佐劑(AlPO4)的效果而實施的這兩種不同實驗的結(jié)果如下。劑量范圍實驗
在該實驗中，用PSC-PD兩次(間隔2周)注射Balb/C小鼠。配制在AlPO4上的結(jié)合物的使用劑量有四種0.1；0.5；2.5；和9.6g/動物。在第14天(I級免疫后14天)、第28天(II級免疫后第14天)和第42天(II級免疫后第28天)將小鼠(10只/組)取血。通過ELISA測量多糖C特異性抗體的幾何平均濃度(GMCs)，并以純化的IgG為參照將結(jié)果表示為μgIgG/ml的形式。在加有幼兔補(bǔ)體的條件下用腦膜炎奈瑟菌C11菌株測量合并血清的殺菌性抗體，并將效價表示成可殺死50％細(xì)菌的稀釋度的倒數(shù)形式。
獲得的劑量-應(yīng)答曲線從2.5μg劑量處開始顯示為平臺區(qū)。結(jié)果表明，在I級免疫后14天與II級免疫后第14天之間有一次良好的促升應(yīng)答。II級免疫后第28天的抗體水平至少與II級免疫后第14天的相等。殺菌性抗體的效價與ELISA的濃度結(jié)果相符，從而證實了PSC-PD結(jié)合物的免疫原性。佐劑的作用
該實驗對配制在AlPO4上的一批PSC-PD結(jié)合物進(jìn)行評定，并以注射普通(未結(jié)合的)結(jié)合物為對照。用2μg結(jié)合物對10只為一組的小鼠進(jìn)行兩次皮下注射，間隔2周。在第14天(I級免疫后14天)、第28天(II級免疫后第14天)和第42天(II級免疫后第28天)將小鼠取血并進(jìn)行ELISA和功能性抗體效價的測量(只對II級免疫后第14天和II級免疫后第28天的血樣進(jìn)行殺菌測試)。與未加佐劑的制劑相比，加AlPO4的制劑可誘導(dǎo)出高達(dá)10倍的抗體效價。結(jié)論
由上述實驗結(jié)果可得出以下一般結(jié)論
——PSC-PD結(jié)合物可誘導(dǎo)出一種回憶應(yīng)答，表明PSC結(jié)合后可變成一種T細(xì)胞依賴性抗原。
——由ELISA測量的抗PSC抗體濃度與殺菌性抗體的效價具有良好的相關(guān)性，說明PSC-PD結(jié)合物誘導(dǎo)出的抗體具有抗腦膜炎奈瑟菌血清群C的功能。
——將大約2.5μg結(jié)合物吸附在AlPO4上似乎可在小鼠體內(nèi)獲得最佳的抗體應(yīng)答。
——CDAP化學(xué)物可作為一種適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ糜诿庖咴訮SC-PD結(jié)合物的制備。實施例8-來源于腦膜炎奈瑟菌血清群A的多糖-PD結(jié)合物的制備
在0.2M NaCl溶液中將多糖A(PSA)干粉溶解1小時，使其終濃度為8mg/ml。然后用HCl或NaOH使pH值穩(wěn)定于6，并將溶液的溫度控制在25℃。在PSA溶液中加入0.75mg CDAP/mg PSA(以100mg/ml濃度溶于乙腈的制劑)。1.5分鐘后加入0.2M NaOH，在不調(diào)節(jié)pH的情況下使pH值為10。2.5分鐘后加入蛋白D(濃縮至5mg/ml)，使PD/PSA的比率約為1。在1個小時的結(jié)合反應(yīng)期過程中保持pH值為10。然后加入10mg甘氨酸(2M pH9.0)/mg PSA，并將pH值調(diào)至9.0，25℃保持30分鐘。然后將混合物4℃保存過夜，再利用排阻柱層析法(購于Pharmacia的Sephacryl S400HR)進(jìn)行純化。首先洗脫下來的是結(jié)合物，然后是未反應(yīng)的PD和副產(chǎn)物(DMAP、甘氨酸、鹽類)。收集結(jié)合物并在購于Sartorius的Sartopore膜上進(jìn)行0.2μm過濾除菌。實施例9-實施例7和8的產(chǎn)物的體外特性鑒定
重要特性總結(jié)于下表體內(nèi)結(jié)果
以Balb/C小鼠為動物模型測試結(jié)合物的免疫原性。將結(jié)合物吸附在AlPO4或Al(OH)3上(500μg Al3+吸附10μg PS)或不進(jìn)行吸附。如下所述對小鼠進(jìn)行注射注射2次，間隔2周(2μg PS/次)。
由這些結(jié)果可首先斷定，游離PS對免疫應(yīng)答影響很大。而利用含游離PS少于10％的結(jié)合物獲得了更好的結(jié)果。因此，對CDAP方法的以上改進(jìn)可作為本發(fā)明的另一方面。
劑型也很重要。在該模型中，AlPO4似乎是最適當(dāng)?shù)淖魟?。結(jié)合物可產(chǎn)生促升效應(yīng)，當(dāng)只注射多糖時，這種效應(yīng)不會出現(xiàn)。結(jié)論
所得腦膜炎奈瑟菌A結(jié)合物及C結(jié)合物的最終PS/蛋白比率分別為1和0.6-0.7(w/w)。游離PS和游離載體蛋白分別低于10％和15％。多糖回收率高于70％。因此，可由上述的改進(jìn)(優(yōu)化)CDAP方法獲得的PSA結(jié)合物及PSC結(jié)合物(不考慮載體蛋白，但優(yōu)選的是蛋白D)可作為本發(fā)明的又一方面。實施例10-來源于流感嗜血菌b的多糖-PD結(jié)合物的制備
流感嗜血菌b是2歲以下兒童患有腦膜炎的主要病因之一。結(jié)合在破傷風(fēng)類毒素上的流感嗜血菌莢膜多糖(PRP)結(jié)合物已為人們所熟知(利用J.Robbins開發(fā)的化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合)。CDAP是一種改進(jìn)的化學(xué)方法。以下是摸索的將PRP與，優(yōu)選的為，PD結(jié)合的最佳CDAP條件。
可影響結(jié)合反應(yīng)的因素如下
·多糖的起始濃度(可對游離多糖的最終含量以及過濾除菌步驟
產(chǎn)生雙重影響)。
·載體蛋白的起始濃度。
·多糖與多糖的最初比率(可對游離多糖的最終含量以及過濾除
菌步驟產(chǎn)生雙重影響)。
·所用CDAP的量(通常為大大過量)。
·反應(yīng)溫度(可影響多糖分解、反應(yīng)動力學(xué)以及反應(yīng)基的分解)。
·活化及結(jié)合的pH值。
·淬滅的pH值(影響殘留DMAP的量)。
·活化、結(jié)合及淬滅的時間。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化終產(chǎn)物質(zhì)量的3個最關(guān)鍵因素是多糖/蛋白的最初比率；多糖的初始濃度；和結(jié)合的pH值。
因此，以上述3個條件為3個軸繪制立體反應(yīng)坐標(biāo)。這些軸的中點(diǎn)(和實驗值范圍)為PS/蛋白比率-1/1(±0.3/1)；[PS]＝5mg/ml(±2mg/ml)；和結(jié)合pH值＝8.0(±1pH單位)。
以下為重要性較低的因素的設(shè)定值所用多糖為30mg；溫度25℃；[CDAP]＝0.75mg/mg PS；pH調(diào)節(jié)使用0.2M NaOH；活化pH＝9.5；活化溫度＝1.5分鐘；結(jié)合溫度-1小時；[蛋白]＝10mg/ml；淬滅pH＝9.0；淬滅溫度＝1小時；將PS溶解在溶劑中的溫度＝在2M NaCl中溶解1小時；在Sephacryl S-400HR上的純化用150mM NaCl洗脫，流速12cm/小時；過濾除菌使用SAROLAB P20，速度5ml/分鐘。
為建立最佳產(chǎn)物制備條件而需在上述立體反應(yīng)坐標(biāo)中考察的數(shù)據(jù)有過濾后的最大產(chǎn)量、結(jié)合的最大蛋白量；以及產(chǎn)物質(zhì)量的數(shù)據(jù)——最終PS/蛋白比率、游離PS水平、游離蛋白水平、最低的殘留DMAP(CDAP的分解產(chǎn)物)水平。過濾后的產(chǎn)量
起始[PS]與結(jié)合pH值及最初PS/蛋白比率之間的相互作用是能夠影響過濾后產(chǎn)量的因素。在低[PS]的情況下，后兩種因素之間的相互作用很小，并且總是會獲得良好的濾過性(所有產(chǎn)物都達(dá)到約95％)。但在高濃度情況下，若提高pH和最初比率會使濾過性降低(高[PS]、最低比率、最低pH＝99％的濾過率；但高[PS]、最高比率及pH＝19％的濾過率)。蛋白結(jié)合的水平
PS/蛋白的最終比率與最初比率的比可作為結(jié)合效率的衡量標(biāo)準(zhǔn)。在高[PS]條件下，pH不影響兩種比率的比值。但最初比率會影響該比值(低最初比率時為1.75，高最初比率時為1.26)。在低[PS]條件下，兩種比率的比值多半會降低，但此時pH值的影響更大(低pH低比值時＝0.96；低pH高比值時＝0.8；高pH低比值時＝1.4；高pH高比值時＝0.92)。最終的PS/蛋白比率
最終比率取決于最初比率和[PS]。高最初比率與高[PS]相結(jié)合可獲得最高的最終比率。pH對最終比率的影響不象低[PS]那樣明顯。游離蛋白D的水平
在高pH及高[PS]條件下觀測到的游離蛋白D的量最少(水平接近0.0)。當(dāng)pH很低時，高[PS]的影響變得特別明顯。提高最初比率可導(dǎo)致游離蛋白D的少量增加。殘留DMAP
最初比率的影響不明顯。但DMAP的水平可隨[PS]的提高而提高，并隨pH的提高而降低。結(jié)論
因此，最優(yōu)選的結(jié)合條件如下結(jié)合pH＝9.0；[PS]＝3mg/m1；并且最初比率＝1/1。由這些條件獲得的終產(chǎn)物的特性如下
因此，可由上述的改進(jìn)(優(yōu)化)CDAP方法獲得的PRP結(jié)合物(不考慮載體蛋白，但優(yōu)選的為蛋白D)可作為本發(fā)明的又一方面。實施例11以蛋白D為抗原——將其與3D-MPL配制后如何提高其抗未分類流感嗜血菌的防護(hù)效率
用11價肺炎球菌多糖一蛋白D結(jié)合物疫苗對雌性Balb/c小鼠(每組10只)進(jìn)行免疫(肌內(nèi)方式)，20周齡(D0)時進(jìn)行第一次免疫，2周后(D14)進(jìn)行第二次免疫。第二次免疫后第7天取血。根據(jù)IgG1型、IgG2a型及IgG2b型抗體的量測定蛋白D抗體的效價。
制備凍干的11價疫苗(無AlPO4)，方法是在結(jié)合物中加入15.75％的乳糖，室溫下攪拌15分鐘，將pH調(diào)至6.14±0.1，然后凍干(凍干周期一般從-69℃開始，逐漸調(diào)至-24℃，耗時3小時，然后保持該溫度18小時，再逐漸調(diào)至-16℃，耗時1小時，然后保持該溫度6小時，再逐漸調(diào)至+34℃，耗時3小時，最后保持該溫度9小時)。
表13顯示制劑的成分以及凍干物的重構(gòu)劑。
目前已知道，測量Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答產(chǎn)生與否的最典型方法與IgG2a抗體的水平有關(guān)。由這些數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，若將蛋白D與一種Th1佐劑(此時為3D-MPL)一同凍干，則會使IgG2a出現(xiàn)驚人的大幅度提高。
表13制劑(每人類劑量)的成分以及抗體(1/10劑量)在小鼠體內(nèi)的抗蛋白D效價1注射前；2注射前±2小時；32-苯氧乙醇
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，該組合物含有至少一種肺炎鏈球菌多糖抗原和至少一種肺炎鏈球菌蛋白抗原或其免疫學(xué)功能等價物，以及一種佐劑。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中的蛋白抗原是肺炎鏈球菌的一種外表面蛋白或分泌蛋白或其免疫學(xué)功能等價物。
3.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其中的蛋白抗原是肺炎鏈球菌的一種毒素、粘附素或脂蛋白，或其免疫學(xué)功能等價物。
4.權(quán)利要求1-3的免疫原性組合物，其中的蛋白抗原或其免疫學(xué)功能等價物選自肺炎球菌溶血素、PspA或其跨膜區(qū)缺失變體、PspC或其跨膜區(qū)缺失突變體、PsaA或其跨膜區(qū)缺失變體、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶，以及CbpA或其跨膜區(qū)缺失變體。
5.權(quán)利要求1-4的免疫原性組合物，其中的多糖抗原以多糖-蛋白載體結(jié)合物形式提供。
6.權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中的載體蛋白選自白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、CRM197、鑰孔血蘭素(KLH)、結(jié)核菌素蛋白衍生物(PPD)，以及流感嗜血菌蛋白D。
7.權(quán)利要求1-6之一的一種免疫原性組合物，其中的疫苗至少含有四種不同血清型的肺炎球菌多糖抗原。
8.本權(quán)利要求書要求的一種免疫原性組合物，該組合物另含有一種佐劑。
9.權(quán)利要求8的一種免疫原性組合物，其中的佐劑含有一種鋁鹽。
10.權(quán)利要求8的一種免疫原性組合物，其中的佐劑是TH1應(yīng)答的一種優(yōu)選誘導(dǎo)劑。
11.權(quán)利要求10的一種免疫原性組合物，其中的佐劑至少含有下列中的一種3D-MPL、一種皂甙免疫刺激物或一種免疫刺激性CpG寡核苷酸。
12.權(quán)利要求11的一種免疫原性組合物，其中的佐劑含有一種載體，該載體選自水包油型乳劑、脂質(zhì)體以及鋁鹽。
13.權(quán)利要求書中要求的一種免疫原性組合物，該組合物可作為藥物使用。
14.一種疫苗，該疫苗含有權(quán)利要求1-12的免疫原性組合物。
15.一種方法，用來預(yù)防或改善55歲以上患者的肺炎鏈球菌性感染，該方法包括將有效劑量的一種疫苗給藥，該疫苗含有一種肺炎鏈球菌多糖和至少一種肺炎鏈球菌蛋白，并選擇性地含有一種Th1誘導(dǎo)佐劑。
16.與一種肺炎鏈球菌蛋白抗原和一種可選的Th1佐劑結(jié)合使用的肺炎球菌多糖抗原在預(yù)防55歲以上患者的肺炎的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
17.一種方法，用來制備權(quán)利要求書中要求的免疫原性組合物，該方法的步驟包括
選擇一種或多種肺炎球菌多糖抗原；
選擇一種或多種肺炎球菌蛋白抗原；以及
將所述多糖和蛋白抗原與一種適當(dāng)?shù)馁x形劑相混合。
18.一種方法，用來預(yù)防或改善嬰兒的中耳炎，該方法包括將安全并且有效劑量的一種疫苗向所述嬰兒給藥，該疫苗含有一種肺炎鏈球菌多糖抗原和一種肺炎鏈球菌蛋白抗原，并選擇性地含有一種Th1佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌多糖抗原疫苗的領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及添加有3D－MPL佐劑并且基本不含鋁型佐劑的特定的有利肺炎球菌多糖結(jié)合物。
文檔編號A61K39/005GK1391481SQ0080777
公開日2003年1月15日 申請日期2000年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月19日
發(fā)明者C·卡皮奧, M·德沙姆普斯, P·M·德斯蒙斯, C·A·J·拉菲里雷, J·波爾曼, J·-P·普里爾斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司