專利名稱：利用胰高血糖素樣肽－1或其生物活性類似物代謝介入以改善缺血性及再灌注大腦的功能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明有關(guān)一種改善缺血性及再灌注大腦功能的有效治療法。
背景技術(shù)：
中風(fēng)，或腦血管意外，是由于流向腦部某一區(qū)域的腦血流急性受阻而引起的。在美國(guó)每年大約有五十萬(wàn)個(gè)病例，其中30％是致死性的，因此中風(fēng)在美國(guó)位于主要致死原因的第三位。其中80％的中風(fēng)是“缺血性”的，這是某一腦動(dòng)脈急性栓塞(通常是血液凝塊或血栓)及血流量的減少所造成的。余下部分是“大出血性”的，這是由于腦動(dòng)脈的破裂而使大量血液流入腦器官，接著就可發(fā)生因局部組織的收縮而使血流受阻，導(dǎo)致缺血。
中風(fēng)通常發(fā)生在65歲以上的個(gè)體，而高血壓是最主要的風(fēng)險(xiǎn)因素。但是還有一些重要的風(fēng)險(xiǎn)因素，糖尿病就是其中最主要的因素，它能增加2-3倍的患病風(fēng)險(xiǎn)并與中風(fēng)后死亡率及患病率增加有關(guān)。雖然其因果關(guān)系和潛在機(jī)理仍有爭(zhēng)論，然而已有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，高血糖本身不論其與糖尿病有關(guān)與否，均能增加與中風(fēng)相關(guān)的死亡率和發(fā)病率。
至今，對(duì)急性中風(fēng)仍無(wú)經(jīng)證實(shí)的治療方法，只是運(yùn)用通常的醫(yī)學(xué)支持療法，接著對(duì)明顯的損傷進(jìn)行康復(fù)。1996年，基于一定數(shù)量的對(duì)照試驗(yàn)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了運(yùn)用組織纖維酶原激活劑(tPA)治療急性中風(fēng)。試驗(yàn)病例的一部分，但不是全部，顯示出對(duì)臨床效果有30-55％的改善，總體上而言能減小死亡率和患病率。盡管顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)有明顯增加(tPA治療組為6.4％，安慰劑治療組為0.64％)，其中半數(shù)是致死的，但還是獲得了總體益處。因?yàn)閷?duì)于安全性和不確定的有效性有擔(dān)憂，用tPA進(jìn)行溶栓療法治療急性缺血性中風(fēng)并未被臨床醫(yī)生廣泛接受。目前，溶栓療法實(shí)際上限于主要的醫(yī)學(xué)中心并由專業(yè)化的醫(yī)學(xué)專家對(duì)急性中風(fēng)進(jìn)行治療，限于經(jīng)CT掃描無(wú)嚴(yán)重梗死跡象并且無(wú)包括糖尿病在內(nèi)的嚴(yán)重醫(yī)學(xué)癥狀的70歲以下患者。因此大約只有1.5％可以作為tPA溶栓療法候選者的病人接受了實(shí)際的治療。這種狀況可能隨著臨床運(yùn)用經(jīng)驗(yàn)的積累和適用病人類型更加明確的確定而有所改善。然而有證據(jù)表明中風(fēng)后同時(shí)再灌注能改善狀況，這支持了運(yùn)用再灌注療法的思路。
從這些考慮出發(fā)，很明顯對(duì)于急性中風(fēng)極迫切需要新型有效的療法。這也激發(fā)了深入研究來(lái)尋找那些在缺血期(不論是缺血性還是出血性中風(fēng))能提供神經(jīng)保護(hù)的鑒別策略，以及能阻斷缺血性中風(fēng)再通后的再灌注損傷的治療方法。其目標(biāo)是拯救阻塞中心周圍所謂缺血半影區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元。待選的藥劑可分為三大組興奮毒性抑制劑；白細(xì)胞粘附抑制劑；和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。在第一組中，最主要的注意力集中在阻斷神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酰氨的興奮毒性作用，主要是通過阻斷NMDA類的谷氨酰氨受體。其他的策略包括阻斷鈉離子和鈣離子通道和清除一氧化氮。
第二種策略是阻斷白細(xì)胞粘附，它基于這樣一個(gè)前提，嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在再灌注損傷和梗死擴(kuò)散方面起主要作用，使用相關(guān)粘附分子和炎性細(xì)胞因子的抑制劑可以防止其進(jìn)入缺血區(qū)域(Jean等，1998)。
第三種策略涉及使用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，這些因子對(duì)處于缺血期和再灌注期的神經(jīng)元提供綜合的營(yíng)養(yǎng)支持，從而保護(hù)神經(jīng)元。在這組藥劑中包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素。大量的研究表明，胰島素在多種類型的中風(fēng)模型中均有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，胰島素的使用又因高血糖的神經(jīng)毒性、適度血糖的潛在益處和嚴(yán)重低血糖的致死可能性等不確定性而變得復(fù)雜化。
依據(jù)本發(fā)明，可以看出確實(shí)有真切和持續(xù)的需要，以便改善缺血性和再灌注大腦的功能。本發(fā)明也將滿足這一需要作為主要的目標(biāo)。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是在急性中風(fēng)和出血后利用GLP-1或其生物活性類似物來(lái)優(yōu)化胰島素分泌、通過抑制胰高血糖素的拮抗作用來(lái)強(qiáng)化胰島素的效用和維持正常血糖濃度或保持適度低血糖而避免嚴(yán)重低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，從而治療缺血性和再灌注大腦。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是運(yùn)用一種組合物來(lái)達(dá)到上述目的，該組合物無(wú)嚴(yán)重低血糖的風(fēng)險(xiǎn)并能糾正高血糖。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是使用一種生物活性化合物進(jìn)行治療的方法，該化合物而不管怎樣都沒有任何副作用的風(fēng)險(xiǎn)。
達(dá)到上述目標(biāo)的方式的方法和手段會(huì)在下列的發(fā)明詳細(xì)描述中闡明。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在急性中風(fēng)或出血后運(yùn)用GLP-1進(jìn)行治療，最好是靜脈給藥，是一種理想的治療方法。因?yàn)樗峁┮环N優(yōu)化胰島素的分泌的方法，它可增加大腦的合成代謝，通過抑制胰高血糖素來(lái)強(qiáng)化胰島素的效用，和維持正常的血糖或適度的低血糖且無(wú)嚴(yán)重低血糖的風(fēng)險(xiǎn)或其他不良反應(yīng)。
發(fā)明詳述大量的動(dòng)物及人的研究已經(jīng)揭示了，高血糖與中風(fēng)相關(guān)死亡率和患病率的嚴(yán)重程度是密切關(guān)聯(lián)的。然而，對(duì)于血液中高葡萄糖濃度是否確實(shí)造成缺血時(shí)的神經(jīng)元損傷，或高血糖只是對(duì)神經(jīng)元損傷的繼發(fā)性應(yīng)激反應(yīng)等還有相當(dāng)?shù)臓?zhēng)論。一項(xiàng)在英國(guó)進(jìn)行的811例急性中風(fēng)的回顧性研究結(jié)論表明，高血糖預(yù)示著更高的死亡率和患病率并與其他不良預(yù)后癥狀相獨(dú)立，因此它是神經(jīng)損傷的原因。然而，這一結(jié)論受到了某些人根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果而提出的挑戰(zhàn)，在一些地區(qū)的研究結(jié)論表明，中風(fēng)病人中的高血糖是腦損傷應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果而不是原因。不論怎樣，很明顯有20-43％的中風(fēng)病人表現(xiàn)出高血糖。這可部分歸因于先前已有的糖尿病(占高血糖病人的25-50％)，但是就大多數(shù)而言這似乎反映因急性中風(fēng)應(yīng)激反應(yīng)而使得皮質(zhì)激素，胰高血糖素和兒茶酚胺生成的增加。目前還不能明確地回答形成的高血糖是否和中風(fēng)病人的神經(jīng)元損傷是前因后果關(guān)系。
有關(guān)澄清高血糖在造成神經(jīng)元損傷中作用的努力集中在合適的急性中風(fēng)的動(dòng)物模型上。這些研究揭示了，在暫時(shí)性病灶性腦缺血后伴有再灌注的大鼠模型上(一個(gè)與用tPA血管化治療缺血性中風(fēng)的臨床狀況有關(guān)的模型)中，高血糖看上去與神經(jīng)元損傷的加劇有因果關(guān)系。與病灶性缺血相比，不論是由在大鼠身上的暫時(shí)性心臟停搏還是由雙側(cè)血管阻塞造成的廣泛性缺血的模型，高血糖都表現(xiàn)出較不明顯的神經(jīng)毒性。在這些廣泛性缺血模型中的試驗(yàn)表現(xiàn)出胰島素誘導(dǎo)的正?；蚱偷难怯猩窠?jīng)保護(hù)作用，但這種效應(yīng)看似由胰島素直接介導(dǎo)的，與它的降血糖作用無(wú)關(guān)。這樣，在動(dòng)物身上的試驗(yàn)提示，在急性中風(fēng)期之中和之后血糖的神經(jīng)效應(yīng)是復(fù)雜多樣的，與缺血區(qū)域的范圍大小和血液葡萄糖的作用時(shí)間密切有關(guān)。
不論是病灶性還是廣泛性，缺血-再灌注的后果是可逆或不可逆的腦細(xì)胞損傷，細(xì)胞死亡和器官功能性效用的下降。
與一段缺血厭氧期及繼發(fā)再灌注相關(guān)聯(lián)的一種似是而非的細(xì)胞損傷理論是，細(xì)胞損傷和死亡看起來(lái)不僅僅只是直接由于缺氧階段的結(jié)果，而且是在缺血階段對(duì)氧化破壞高度敏感的組織再通氧所造成的。再灌注損傷從血流再通時(shí)即刻開始氧化性破壞，并作為在同一缺血性組織中發(fā)展的一個(gè)炎性過程，這種損傷持續(xù)及惡化達(dá)很多個(gè)數(shù)小時(shí)之久。旨在降低缺氧后細(xì)胞對(duì)氧化破壞的敏感性的努力和旨在減弱同一組織中炎性反應(yīng)的努力都已顯示出，可減輕缺氧后的再灌注器官的可逆性或不可逆性的損傷。一種組合了減輕最初的氧化破壞損傷和繼發(fā)的炎性相關(guān)的損傷的方法，能提供協(xié)同保護(hù)以防止再灌注損傷。GLP-1和其生物活性類似物可以通過在腦細(xì)胞上產(chǎn)生強(qiáng)勁的組成代謝作用而達(dá)此目的。
不僅僅是GLP-1及其生物活性類似物，這種療法還包括使用自由基清除劑，諸如谷胱甘肽(glutadione)，褪黑激素，維生素E和過氧化物歧化酶(SOD)。在這些組合中，使再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)降到更低的程度。
對(duì)于治療這樣的病人，現(xiàn)行通用的方法是用諸如葡激酶或tPA等溶栓藥物進(jìn)行治療。美國(guó)專利第4,976,959號(hào)揭示了一種使用tPA和SOD以抑制再灌注時(shí)組織損傷的療法。這樣，有越來(lái)越多的病人會(huì)受到再灌注損傷的危險(xiǎn)和溶栓療法所造成的影響。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用人GLP-1，或其生物活性類似物，可增強(qiáng)或恢復(fù)胰島素的分泌應(yīng)答，產(chǎn)生了起神經(jīng)保護(hù)作用的胰島素，這可能由于直接的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的效應(yīng)，同樣也可能是由于控制了中風(fēng)相關(guān)的高血糖。
術(shù)語(yǔ)“GLP-1”，或胰高血糖素樣肽，包括在本專利文本中使用的GLP-1模擬物和其生物活性類似物，它們可以包括胰高血糖素樣肽及其相關(guān)肽、和胰高血糖素樣肽-1類似物，它們與諸如酰胺化GLP-1(7-36)受體蛋白之類的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體蛋白相結(jié)合，并象酰胺化GLP-1(7-36)那樣對(duì)胰島素分泌有相應(yīng)的天然效應(yīng)。GLP-1(7-36)酰胺是LGP-1的天然生物活性形式。見Gke，B和Byrne，M，糖尿病醫(yī)學(xué)(Diabetic Medicine).1996，13854-860。GLP-1受體是在例如產(chǎn)生胰島素的胰β-細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面蛋白。胰高血糖素樣肽和其類似物包括那些具有胰島素營(yíng)養(yǎng)活性的物質(zhì)，這些物質(zhì)是在產(chǎn)生胰島素的胰β-細(xì)胞等上的GLP-1受體分子及第二信使活性的促效劑(即起激活作用)。通過該受體顯示活性的胰高血糖素樣肽促效劑，在下列文獻(xiàn)中描述歐洲專利EP0708179A2；Hjorth，S.A.等J.Biol.Chem.269(48)30121-30124(1994)；Siegel，E.G.等美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)第57屆學(xué)術(shù)研討會(huì)，波士頓，1997年；Hareter，A.等，美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)第57屆學(xué)術(shù)研討會(huì)，波士頓，1997年；Adelhoest，K等，J.Biol.Chem.269(9)6275-6278(1994)；Deacon，C.F.等，第16屆國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)大會(huì)摘要，糖尿病學(xué)增補(bǔ)本(1997)；Irwin，D.M.等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 947915-7920(1997)；Mosjov，S.Int.J.Peptide Protein Res.40333-343(1992)。胰高血糖素樣分子包括表達(dá)GLP-1促效劑的多聚核苷酸，此促效劑就是在產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的GLP-1受體分子及其第二信使系統(tǒng)的激活物。GLP-1模擬物也是β-細(xì)胞的促效劑，這包括例如專門設(shè)計(jì)用于激活GLP-1受體的化學(xué)化合物。最近的出版物闡明了黑寡婦型GLP-1和Ser2GLP-1，參見G.G.Holz，J.F.Hakner/比較生物化學(xué)和物理學(xué)，B部分121(1998)177-184和Ritzel，等，一種合成的血漿穩(wěn)定性提高的胰高血糖素樣肽-1類似物，內(nèi)分泌雜志，1998年10月；159(1)93-102。胰高血糖素樣肽-1的拮抗劑也是已知的(例如，可參見Watanbe，Y.等，內(nèi)分泌雜志，140(1)45-52，1994)，包括氨基化exendin(9-39)(一種exendin類似物)，它是GLP-1受體的強(qiáng)效拮抗劑(例如見WO97/46584)。進(jìn)一步的例子包括化學(xué)合成的胰高血糖素樣肽和任何與之基本同源的多肽或片段?！盎就础奔瓤舍槍?duì)氨基酸序列也可針對(duì)核苷酸序列，也就是說(shuō)，一個(gè)特定的序列(例如是突變子的序列)，對(duì)于參照序列而言有一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的置換、缺失或增加，但這些變化的凈效應(yīng)并不導(dǎo)致在特定序列和參照序列之間產(chǎn)生功能上有害的差別。就本發(fā)明的目的而言，有50％以上的同源性，更好的是有90％以上的同源性，并且有相同的增強(qiáng)β-細(xì)胞對(duì)血漿中葡萄糖產(chǎn)生應(yīng)答的生物活性和相同的表達(dá)特性的序列，均視為基本同源。為測(cè)定同源性，應(yīng)忽視突變序列切斷的截?cái)?。同源性較低，但有可比的生物活性和相同的表達(dá)特性的那些序列，將視為等價(jià)的。
哺乳動(dòng)物的GLP肽和胰高血糖素是由同一基因編碼的。在回腸中，原形分子被加工為兩類GLP肽激素，就是GLP-1和GLP-2?，F(xiàn)已知有四種GLP-1相關(guān)的肽來(lái)源于原形肽。GLP-1(1-37)有如下序列HisAspGluPheGluArgHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly(SEQ ID NO1)。GLP-1(1-37)經(jīng)翻譯后加工時(shí)酰胺化而形成GLP-1(1-36)NH2，其序列為HisAspGluPheGluArgHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg(NH2)(SEQ ID NO2)，或經(jīng)酶解產(chǎn)生GLP-1(7-37)，其序列為HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly(SEQ ID NO3)。GLP-1(7-37)也可被酰胺化為氨基化的GLP-1(7-36)，其序列為HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg(NH2)(SEQ ID NO4)，這是天然形態(tài)的GLP-1分子。
小腸L細(xì)胞分別分泌GLP-1(7-37)(SEQ ID NO3)和GLP-1(7-36)NH2(SEQ IDNO4)，兩者的比例是1∶5。這些截?cái)嗟腉LP-1形式在原位處的半衰期是短的，也就是小于10分鐘，并可被氨基二肽酶滅活而分別產(chǎn)生GluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly(SEQ ID NO5)，和GluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg(NH2)(SEQ ID NO6)。GluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly(SEQ ID NO5)，和GluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg(NH2)(SEQ ID NO6)這兩個(gè)片段被懷疑影響肝糖的形成，但并不刺激胰臟合成和釋放胰島素。
在美洲大毒蜥的毒液中有六種多肽與GLP-1同源。表1中將它們的序列與GLP-1作了比較。
表1aHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNH2bHSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2cDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2dHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSNH2eHSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPSSfHSDATFTAEYSKLLAKLALQKYLESILGSSTSPRPPSgHSDAIFTEEYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2hHSDAIFTQQYSKLLAKLALQKYLASILGSRTSPPPNH2
a＝GLP-1(序列識(shí)別號(hào)4)b＝Exendin3(SEQ ID NO7)c＝Exendin4(9-39)(NH2(SEQ ID NO8)d＝Exendin4(SEQ ID NO9)e＝毒蜥素I(SEQ ID NO10)f＝毒蜥素II(SEQ ID NO11)g＝毒蟲析素(SEQ ID NO12)h＝Q8，Q9毒蟲析素(SEQ ID NO13)。
表1的強(qiáng)調(diào)部分所示的主要同源性是肽c和f分別是從b和g衍生而來(lái)。所有天然存在的六種肽(a，b，c，d，e，f)在第1、7、11和18位點(diǎn)是同源的。GLP-1和exendin3和4(a，b和d)更在位點(diǎn)4，5，6，8，9，15，22，23，25，26和29同源。在位點(diǎn)2上，A，S和G是結(jié)構(gòu)相似的。在位點(diǎn)3上，殘基D和E(Asp和Glu)是結(jié)構(gòu)相似的。在位點(diǎn)22、23上，F(xiàn)(苯丙氨酸)和I(異亮氨酸)分別與Y(酪氨酸)和L(亮氨酸)結(jié)構(gòu)相類似。同樣的，在位點(diǎn)26上，L與I也是結(jié)構(gòu)相類似的，這樣，在GLP-1、exendin3和4的30個(gè)氨基酸殘基中有15個(gè)是相同的，還有另5個(gè)是等價(jià)的。只是在位點(diǎn)16、17、19、21、24、27、28和30上的殘基結(jié)構(gòu)有明顯不同。Exendins在羧基端多9個(gè)氨基酸殘基。
GLP-1樣肽可用固相合成法進(jìn)行化學(xué)合成。GLP-1也可用傳統(tǒng)的重組技術(shù)，通過如Sambrook和Maniatis所著的文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法制造。這里所講的“重組”是指一種蛋白質(zhì)來(lái)自重組的表達(dá)系統(tǒng)(例如，微生物或哺乳動(dòng)物)，這種系統(tǒng)是通過遺傳的方法加以改變使之含有表達(dá)GLP-1或其生物活性類似物的基因。
GLP-1樣的多肽可用下列的方法從重組細(xì)胞的培養(yǎng)物中加以收集與純化，這些方法包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陽(yáng)離子或陰離子交換色譜，磷酸纖維素色譜，疏水相互作用色譜，親和色譜，羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。高效液相色譜(HPLC)可用于最后的純化步驟。
本發(fā)明中多肽可以是天然提取的純品，或是化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或是利用重組技術(shù)從原核生物或真核生物宿主(例如細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲或哺乳動(dòng)物，培養(yǎng)或體內(nèi)培養(yǎng))進(jìn)行制備。依據(jù)重組過程中所用的宿主情況，本發(fā)明中的多肽通常是非糖基化的，但也可以是糖基化的。
GLP-1的生物活性可用標(biāo)準(zhǔn)的方法加以測(cè)定，總體而言，就是受體結(jié)合活性篩選法，該方法利用其表面有GLP-1受體的合適細(xì)胞，諸如RINmSF細(xì)胞或INS-1細(xì)胞之類的胰島素瘤細(xì)胞系。也可參見Mosjov，S.(1992)和歐洲專利EP0708170A2。除了利用放射免疫法測(cè)量特異性結(jié)合于細(xì)胞膜上的示蹤物之外，還可測(cè)量cAMP的活性或葡萄糖依賴的胰島素的合成。在一種方法中，將編碼本發(fā)明受體的多聚核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)表達(dá)GLP-1受體蛋白。這樣，舉例而言，這些方法可以用來(lái)篩選受體的促效劑，只要將待篩選的化合物與這些細(xì)胞相混合，再篩選和測(cè)定這些化合物是否能產(chǎn)生信號(hào)(例如，可激活受體)。
多克隆及單克隆抗體也可用以測(cè)定純度和鑒別在這里所描述方法中運(yùn)用的GLP-1樣肽。諸如ABGA1178之類的抗體可檢測(cè)完整的未經(jīng)剪切的GLP-1(1-37)或氨基端切除的GLP-1(7-37)或氨基化的GLP-1(7-36)。其他抗體檢測(cè)前體分子的C端最末端，這一方法可運(yùn)用減量法計(jì)算已截短的肽(例如GLP-1(7-37)或氨基化GLP-1(7-36))的生物活性。(Orskov等Diabetes，1993，42658-661；Orskov等J.Clin.Invest.1991，87415-423)其他篩選方法包括使用那些表達(dá)GLP-1受體的細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，并在系統(tǒng)中檢測(cè)因受體激活而導(dǎo)致的胞外的pH或離子濃度的變化。舉例來(lái)講將待選的促效劑與表達(dá)GLP-1受體蛋白和第二信使應(yīng)答(如信號(hào)傳導(dǎo)或離子或pH變化)的細(xì)胞接觸，可檢測(cè)以確定這些待選的促效劑是否有效應(yīng)。
本發(fā)明中的胰高血糖素樣肽-1受體結(jié)合蛋白可以和合適的藥物載體相組合使用。這種組合物包括治療有效量的多肽和藥物學(xué)上合適載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡聚糖，水，甘油，乙醇，乳糖，磷酸鹽，甘露醇，精氨酸，海藻糖，和它們的組合。制劑需要與給藥方式相適應(yīng)并容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員所確定。GLP-1肽可以與本領(lǐng)域已知的那些能提高肽藥物體內(nèi)半衰期的藥劑相組合，從而加強(qiáng)或延長(zhǎng)肽的生物活性。例如在用藥以前，可以將本發(fā)明物質(zhì)與分子或化學(xué)部分進(jìn)行共價(jià)連接。另外，增強(qiáng)劑也可與組合物同時(shí)給藥。再進(jìn)一步，這些藥劑可以含有被認(rèn)為是GLP-1樣肽的酶解反應(yīng)抑制劑的分子，它們可以與GLP-1肽組合物同時(shí)給藥或在GLP-1肽組合物給藥后使用。這樣的分子可用諸如口服或注射的方法給藥。
有效的劑量濃度范圍實(shí)際上多少與給藥方式有關(guān)，即緩釋給藥或持續(xù)給藥如靜脈輸注或皮下輸注。既然GLP-1無(wú)副作用，因而可有相當(dāng)大靈活度。通過靜脈注射皮下給藥，也可以丸藥形式施用。
雖然下列的范圍沒有限制而且列出只是作為說(shuō)明，不同給藥方式的推薦劑量范圍是靜脈連續(xù)輸注(I.V.)0.1pmol/kg/min到10pmol/kg/min；皮下給藥(s.c.)0.1pmol/kg/min到75pmol/kg/min，單劑注射(丸藥)靜脈0.1nmol/kg到2.0nmol/kg，皮下0.1nmol/kg到100nmol/kg。
較優(yōu)的GLP-1肽給藥方式是通過連續(xù)給藥，劑量范圍是從約1pmol/kg/min到約10pmol/kg/min GLP-1，途徑是緩釋皮下給藥，肌內(nèi)給藥，腹腔內(nèi)給藥，緩釋注射藥庫(kù)，深部肺吸入，同樣也可用靜脈給藥，口腔給藥，藥貼給藥或其他緩釋給藥方法。
葡萄糖神經(jīng)毒性的可能機(jī)制仍是不明確的，而申請(qǐng)人不希望被理論所束縛。然而，在腦部缺血期，和其他組織相同，厭氧糖酵解增強(qiáng)了并產(chǎn)生了乳酸，這又可因高血糖而更嚴(yán)重。乳酸可能尤其對(duì)缺血的神經(jīng)元細(xì)胞有毒性。第二種可能是高血糖加劇了紅血球細(xì)胞滲漏穿過缺血的毛細(xì)血管內(nèi)皮，從而產(chǎn)生微小的出血行梗死。第三種提出的機(jī)制是神經(jīng)元的興奮性毒性(如由谷氨酰氨所誘導(dǎo))是葡萄糖敏感性的，因此高血糖又強(qiáng)化了這種嚴(yán)重的神經(jīng)損害之源。雖然還不了解它的精確的機(jī)制，事實(shí)是使用GLP-1治療帶來(lái)了明顯的好處。
GLP-1能在而且應(yīng)當(dāng)在感到這事情已經(jīng)或正在發(fā)生時(shí)馬上使用，這一點(diǎn)是重要的并且可防止損傷和風(fēng)險(xiǎn)的加劇。也就是說(shuō)，GLP-1可以在家里或救護(hù)車上使用以發(fā)揮其即刻的合成代謝作用從而改善腦代謝。
從這些理由出發(fā)，在治療急性中風(fēng)和控制梗死范圍時(shí)極其重要的策略是控制高血糖，將血液中葡萄糖水平降至正?；蜻m度的低血糖范圍。然而至今唯一實(shí)用的控制高血糖的手段是使用胰島素。
至今，非隨機(jī)分組的對(duì)照人體試驗(yàn)已經(jīng)完成，用來(lái)檢驗(yàn)胰島素治療對(duì)急性中風(fēng)的益處，雖然這樣的試驗(yàn)是值得提倡的，但胰島素的副作用風(fēng)險(xiǎn)太大了。與人體試驗(yàn)的數(shù)據(jù)匱乏相對(duì)照，大量的試驗(yàn)已評(píng)估了在動(dòng)物中風(fēng)模型中胰島素的效用。幾乎無(wú)例外，這些研究記錄了很大的益處，提示了胰島素有保護(hù)功能的能力，可控制梗死范圍大小，并降低廣泛性和病灶性缺血并再灌注后的死亡率。在廣泛性缺血的模型中(模型的兩側(cè)頸動(dòng)脈都阻塞，并且某些模型有的誘發(fā)有高血壓，或者在模型中誘導(dǎo)了心臟窒息性停搏)，胰島素有明顯的保護(hù)作用，可限制梗死范圍，減少神經(jīng)功能缺失和促進(jìn)代謝恢復(fù)。而且胰島素的作用與其降血糖的功能在很大程度上無(wú)關(guān)；實(shí)際上，嚴(yán)重的低血糖對(duì)大腦的功能及結(jié)果都是有害的。
在暫時(shí)性的病灶性腦缺血模型中，胰島素同樣有強(qiáng)大的保護(hù)作用，可減少梗死部分體積和腦壞死的程度，(Yip，PK，He，YY，Hsu，CY，Garg，N，Marangos，P和Hogan，EL(1991)“在病灶性大腦缺血-再灌注中血漿葡萄糖對(duì)梗死范圍的影響”，Neurology 41，899-905；Hamilton，MG，Tranner，BI，和Auer，RN(1995)“胰島素減少在暫時(shí)性病灶性缺血中大腦梗死”，J.Neurosurg.82，262-268)White及其同事已對(duì)胰島素強(qiáng)大的神經(jīng)效用從機(jī)理上進(jìn)行了考證(White，BC，Grossman，LI，和Krause，GS(1993)“廣泛性缺血和再灌注引起的腦損傷對(duì)于膜損傷和修復(fù)的理論性假定”，Neurology 43，1656-1665；White，BC，Grossman，LI，O’Neil，BJ，DeGracia，DJ，Neumar，RW，Rafols，JA，和Krause，GS(1996)“廣泛性缺血和再灌注”，Ann.Emerg.，Med.27，588-594)。這些作者提出胰島素作為強(qiáng)有力的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能激活一般的神經(jīng)元修復(fù)途徑，而這些途徑與其調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的功能相獨(dú)立。在中風(fēng)過程中大多數(shù)的損傷發(fā)生在再灌注時(shí)期。這被認(rèn)為起因于缺血所誘導(dǎo)的膜脂裂解，膜脂肪酸的局部累積，和繼發(fā)的在再灌注引起的脂肪酸氧化過程中導(dǎo)致的過氧化物生成。再灌注產(chǎn)生的氧自由基再通過脂質(zhì)過氧化來(lái)破壞神經(jīng)元細(xì)胞膜。這種損傷因再灌注引起的蛋白質(zhì)合成抑制而加劇，這使膜修復(fù)系統(tǒng)失去作用。在這背景下，胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)家族中其他成員有主要的神經(jīng)元拯救作用，這是通過刺激蛋白質(zhì)合成和上調(diào)新的膜脂質(zhì)合成機(jī)能而達(dá)到的。這依次起源于胰島素刺激真核細(xì)胞啟動(dòng)因子-2(elF-2α)的脫磷酸作用，然后是促進(jìn)了mRNA轉(zhuǎn)錄物的有效翻譯。
實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明，使用GLP-1(氨基化胰高血糖素樣肽-1(7-36))是用以治療急性中風(fēng)的胰島素的理想替代物。這是因?yàn)镚LP-1有葡萄糖依賴性的胰島素營(yíng)養(yǎng)作用。GLP-1可在正?；蚋哐堑那闆r下促進(jìn)內(nèi)源性胰島素的分泌，在低血糖的情況下則不會(huì)，這樣能免于造成嚴(yán)重的低血壓。這也意味著在II型糖尿病中，GLP-1能刺激胰島素持續(xù)分泌，并將血糖糾正在正常的范圍內(nèi)。這些作用將會(huì)給急性中風(fēng)病人帶來(lái)很大的益處。在那些非糖尿病并隨有應(yīng)激性高血糖的的中風(fēng)患者中也能得到相似的結(jié)果。在血糖正常的中風(fēng)患者中，GLP-1會(huì)導(dǎo)致胰島素的適度分泌，并在不補(bǔ)充葡萄糖時(shí)又回到基線水平。在這種情況中，最好同時(shí)靜脈輸注葡萄糖(低劑量，如5％)以便維持對(duì)胰島素分泌的刺激。與葡萄糖-胰島素輸注不同，不需要對(duì)滴定劑量的操心，因?yàn)镚LP-1對(duì)葡萄糖的依賴作用會(huì)通過升高循環(huán)中胰島素的水平來(lái)維持正常的血糖從而達(dá)到自動(dòng)滴注的結(jié)果。
目前認(rèn)為，循環(huán)中的游離脂肪酸(FFA)不能進(jìn)入腦部，不能成為大腦的能量來(lái)源。當(dāng)供氧充分時(shí)，大腦專一地代謝葡萄糖，只在長(zhǎng)期饑餓時(shí)才轉(zhuǎn)而利用肝臟產(chǎn)生的酮體。在缺血時(shí)，葡萄糖的有氧氧化受到損害，而糖酵解加強(qiáng)了，但這不能產(chǎn)生足夠的ATP。結(jié)果就是細(xì)胞膜的功能受損，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞膜磷脂的酶解過程加強(qiáng)，產(chǎn)生了腦內(nèi)的游離脂肪酸。這些脂肪酸并不是由于胰高血糖素的作用而產(chǎn)生的。而且，通過減弱由應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素拮抗?fàn)顟B(tài)，胰高血糖素的抑制通?？梢愿纳拼x環(huán)境。改善代謝環(huán)境對(duì)抑制炎癥反應(yīng)有益處。
從上述的例子中可見，這些例子只是說(shuō)明了已達(dá)到所有設(shè)定目標(biāo)的本發(fā)明的一個(gè)方面。重要的是，這些例子不能作為是本發(fā)明講授內(nèi)容或揭示內(nèi)容或范圍等的限制，因?yàn)樗鼈冎皇鞘痉缎缘摹?br> 權(quán)利要求
1.一種改善在缺血期后血流再灌注所引起的腦組織損傷的方法，其特征在于，它包括對(duì)需要治療的個(gè)體，給予有效量的組合物，該組合物含有在制藥用載體中的、可結(jié)合于胰高血糖素樣肽-1受體的化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，胰高血糖素樣肽-1是GLP-1和其生物活性類似物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，制藥用載體是選自下組；鹽水、緩沖鹽水、葡聚糖、水、甘油、乙醇、乳糖、磷酸鹽、甘露醇、精氨酸、海藻糖、和它們的組合。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)需要治療的個(gè)體的給藥是靜脈給藥0.1-10pmol/kg/min。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，同時(shí)給予葡萄糖。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，同時(shí)給予氧消除劑。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給藥在缺血事件發(fā)生4小時(shí)內(nèi)開始。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，給藥在缺血事件發(fā)生4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行并持續(xù)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給藥是以0.1-10pmol/kg/min靜脈連續(xù)給藥。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給藥是丸藥的皮下注射，劑量為0.1-75nmol/kg。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給藥方式是皮下或微壓注射、肺深部吸入、外置泵或埋置泵、注射藥庫(kù)，和其他緩釋給藥機(jī)制，和敷貼、口腔和其他透皮、透膜的給藥機(jī)制。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給藥是靜脈給藥，并且與葡萄糖聯(lián)用。
13.一種GLP-1代謝介入從而改善缺血和再灌注腦細(xì)胞功能的方法，其特征在于，所述的方法包括給予需要用治療的個(gè)體有效量的組合物，該組合物含有GLP-1和藥物載體。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，胰高血糖素樣肽-1是GLP-1或其生物活性類似物。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，藥物載體選自下組鹽水、緩沖鹽水、葡聚糖、水、甘油、乙醇、乳糖、磷酸鹽、甘露醇、精氨酸、海藻糖和它們的組合。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)需要治療的個(gè)體的給藥劑量為0.1-10pmol/kg/min。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，同時(shí)給予葡萄糖。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，給藥在缺血事件發(fā)生4小時(shí)內(nèi)開始。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，給藥在缺血事件發(fā)生4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行并持續(xù)。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，在人感到缺血事件要發(fā)生時(shí)立刻給藥。
21.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，需要運(yùn)用代謝介入法改善的組織損傷是醫(yī)學(xué)程序造成的，該醫(yī)學(xué)程序是造成腦組織缺血的外科事件。
22.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，醫(yī)學(xué)程序涉及再灌注事件。
23.一種用于GLP-1代謝介入以改善缺血和再灌注腦組織功能的組合物，其特征在于，包括有效量的GLP-1或其生物活性類似物，和藥學(xué)上有效的載體。
全文摘要
現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在急性中風(fēng)或腦出血后使用GLP－1治療(優(yōu)選靜脈給藥)是一種理想的治療方法,因?yàn)樗峁┝艘环N優(yōu)化胰島素分泌的方法,它可增強(qiáng)大腦的合成代謝,可通過抑制胰高血糖素而增強(qiáng)胰島素的效用,和維持正常的血糖水平或適度的低血糖,同時(shí)沒有嚴(yán)重低血糖的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1376072SQ00806935
公開日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2000年5月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日
發(fā)明者T·R·庫(kù)利奇, M·R·W·埃勒斯 申請(qǐng)人:拜爾內(nèi)布拉斯加股份有限公司