專(zhuān)利名稱(chēng)：田旋花的高分子量提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)收集旋花材料的均相水溶液的高分子量成分獲得純化的旋花提取物。我們意外地發(fā)現(xiàn)這些高分子量提取物能抑制小鼠中兩種不同惡性腫瘤的生長(zhǎng)。被治療動(dòng)物腫瘤中白細(xì)胞的腫瘤侵潤(rùn)以及誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增生的證據(jù)證明了這些提取物具有免疫增強(qiáng)作用。在雛雞絨毛尿囊膜檢測(cè)中進(jìn)一步顯示它們具有抗血管生成性質(zhì)。提取方法能除去已知具有毒性的植物材料來(lái)源的小分子，包括生物堿。旋花提取物可被用作人和動(dòng)物的低毒性抗癌藥物。
背景技術(shù)：
最近應(yīng)用生物反應(yīng)變更因子(BRMs)的概念已被考慮用于治療癌癥。一些BRMs不直接對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，但是具有改變生物體環(huán)境的性能。免疫刺激和新血管生長(zhǎng)的抑制是潛在治療癌癥的兩種生物反應(yīng)變更策略。已知抗腫瘤活性的免疫刺激物的例子為多糖K，β-1，3-葡聚糖和Mamyame疫苗。所有這些都含有高分子量多糖和/或蛋白質(zhì)。血管生成抑制分子的例子包括TMP-470，和angiostatin，其已被證明具有抗腫瘤活性。在研究具有抗腫瘤活性的田旋花的提取物的過(guò)程中，我們開(kāi)始試圖分離低分子量生物堿，其已知具有毒性，并且我們猜想其具有常規(guī)的化學(xué)治療或腫瘤細(xì)胞毒性。
我們發(fā)現(xiàn)，含有毒性生物堿的低分子量提取物顯示出很小的抗腫瘤活性，而不包括該毒性生物堿的高分子量提取物通過(guò)用作生物反應(yīng)變更因子而具有明顯的抗腫瘤活性。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種組成為田旋花(Convolvulus arvensis)高分子量提取物的藥物組合物，其對(duì)正常細(xì)胞具有低的毒性，并能誘導(dǎo)動(dòng)物中抗腫瘤效應(yīng)，抑制血管生長(zhǎng)，提高哺乳動(dòng)物的免疫機(jī)能。優(yōu)選該高分子量提取物除去分子量小于大約500道爾頓的成分。更優(yōu)選該除去的成分分子量小于大約1,000道爾頓，更加優(yōu)選該除去的成分小于大約3,000道爾頓。更加優(yōu)選地，該除去的成分分子量小于大約5000道爾頓，更優(yōu)選小于大約10,000道爾頓。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是應(yīng)用分子量過(guò)濾器或者用硫酸銨沉淀分離田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種用于分離田旋花(Convolvulusarvensis)的高分子量提取物的方法，其由于除去了粗提取物中毒性的低分子量成分而具有低的毒性。優(yōu)選除去分子量小于大約3,000道爾頓的成分。更優(yōu)選除去分子量小于大約6,500道爾頓的成分。更加優(yōu)選除去分子量小于大約10,000道爾頓的成分。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是應(yīng)用分子量過(guò)濾器或用硫酸銨沉淀除去田旋花(Convolvulus arvensis)的低分子量提取物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種應(yīng)用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其對(duì)動(dòng)物的正常細(xì)胞具有低的毒性，并能誘導(dǎo)抗腫瘤的效應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種應(yīng)用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其能抑制血管生長(zhǎng)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種應(yīng)用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其能使動(dòng)物產(chǎn)生免疫提高的效應(yīng)。
通過(guò)參照后面提出的材料和方法，本發(fā)明的這些和其它的目的是顯而易見(jiàn)的。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述我們發(fā)現(xiàn)田旋花的高分子量提取物出人意料地對(duì)正常細(xì)胞具有低的毒性，并能誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)，抑制血管生長(zhǎng)，提高哺乳動(dòng)物的免疫機(jī)能。我們還發(fā)現(xiàn)田旋花提取物的低分子量成分含有分子量在300-500道爾頓的生物堿，其對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞都有毒性。為了除去毒性的低分子量成分，我們使用分子篩。通常本發(fā)明用于獲得田旋花的高分子量提取物的方法在于在水性溶液中煮沸新鮮的或老化的旋花，以獲得棕色茶狀混合物。然后將混合物離心或過(guò)濾，除去固體物質(zhì)，得到一種溶液。為了除去對(duì)正常細(xì)胞的毒性，只需要除去分子量300-500的成分。然而，我們發(fā)現(xiàn)低分子量成分可能非特異性地粘附到膜上，之后又脫落下來(lái)。因此，優(yōu)選使用更大分子量的分子篩-1000道爾頓級(jí)別，更優(yōu)選3000道爾頓級(jí)別，更加優(yōu)選5000道爾頓級(jí)別。我們發(fā)現(xiàn)即使當(dāng)分子量達(dá)10,000的成分被除去后，該提取物仍保留其在動(dòng)物中抗腫瘤的效應(yīng)、其抑制血管生長(zhǎng)的能力、以及其提高哺乳動(dòng)物免疫機(jī)能的能力。在下面的實(shí)施例中，在水性溶液中煮沸新鮮的或老化的旋花以獲得棕色茶狀混合物后，然后將該溶液通過(guò)分子量過(guò)濾裝置，以獲得高分子量保留物(BWR)，或者應(yīng)用硫酸銨沉淀，以分離高分子量沉淀(BWP)。之后凍干高分子量提取物，或濃縮。隨后檢測(cè)該提取物的抗腫瘤、免疫提高和抗血管生成活性。
然后應(yīng)用SDS-Page、IEF和蛋白質(zhì)檢測(cè)以進(jìn)一步確定提取物的成分。應(yīng)用已知分子量標(biāo)準(zhǔn)并使用Superose12-HR排阻柱(PharrnaciaBiotech)檢測(cè)該提取物的分子量。
當(dāng)一起考慮后附的附圖
和權(quán)利要求書(shū)，參照優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本發(fā)明的進(jìn)一步特征和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
盡管本發(fā)明在實(shí)踐和測(cè)試中可以使用類(lèi)似于或等價(jià)于本文描述的那些材料和方法的其它材料和方法，優(yōu)選的方法和材料是目前描述的那些。實(shí)施例1描述了制備旋花的高分子量提取物所需的步驟。
在實(shí)施例2和3中，對(duì)該高分子量提取物進(jìn)行鑒定和毒性測(cè)試。
在實(shí)施例4-10高分子量提取物的效果實(shí)驗(yàn)中，分析了BWP和BWR的抗血管生成活性、抗腫瘤活性和對(duì)免疫機(jī)能的影響。
檢測(cè)了BWR的抗血管生成活性。通過(guò)將2mm含有10mcg肝素的甲基纖維素片放置于11天的雞蛋絨毛尿囊膜上，在雞蛋絨毛尿囊膜上誘導(dǎo)血管生成。BWR的200、100和50mcg三個(gè)劑量同時(shí)加入到含有肝素的片上，分三組，每組6個(gè)雞蛋。4天后，在絨毛尿囊膜上開(kāi)個(gè)大口，計(jì)數(shù)每個(gè)雞蛋上新血管的數(shù)量。
按照下列公式得到血管生成的抑制百分比血管生成的抑制百分比(％)＝(1-測(cè)試組新血管的平均數(shù)/對(duì)照組新血管的平均數(shù))×100結(jié)果如表1所示，發(fā)現(xiàn)血管生成或新血管的誘導(dǎo)通過(guò)給藥BWR被明顯抑制，并具有劑量依賴(lài)性特征。
表1血管生成的抑制

實(shí)施例5BWR的抗腫瘤活性如上所述進(jìn)行制備，檢測(cè)了BWR的抗腫瘤作用。每組10個(gè)6周雌雄混合的昆明小鼠用作測(cè)試動(dòng)物。隨后將S-180纖維肉瘤鐘形物(bells)皮下移植到左腹股溝區(qū)。在14天的每天中，將BWR皮下注射到右腹股溝區(qū)。在移植后15天，切除腫瘤，稱(chēng)重。按照下列公式得到腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比(％)＝(1-測(cè)試組平均腫瘤重量/對(duì)照組平均腫瘤重量)×100結(jié)果如下表2所示，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)通過(guò)給藥BWR被明顯抑制。
表2

實(shí)施例6BWP的抗腫瘤活性另外檢測(cè)了BWP的抗腫瘤作用。每組10個(gè)6周雌雄混合的昆明小鼠用作測(cè)試動(dòng)物。隨后將S-180纖維肉瘤鐘形物(bells)皮下移植到左腹股溝區(qū)。在14天的每天中，將BWP皮下注射到右腹股溝區(qū)。在移植后15天，切除腫瘤，稱(chēng)重。按照下列公式得到腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比(％)＝(1-測(cè)試組平均腫瘤重量/對(duì)照組平均腫瘤重量)×100結(jié)果如下表3所示，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)通過(guò)給藥BWP被明顯抑制。
表3

實(shí)施例7BWP進(jìn)一步的抗腫瘤效果另外進(jìn)一步檢測(cè)了BWP的抗腫瘤作用。每組10個(gè)6周C57雌雄混合的昆明小鼠用作測(cè)試動(dòng)物。隨后將LLC，Lewis肺癌細(xì)胞皮下移植到左腹股溝區(qū)。在21天的每天中，將BWR皮下注射到右腹股溝區(qū)。在移植后第22天，切除腫瘤，稱(chēng)重。按照下列公式得到腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比(％)＝(1-測(cè)試組平均腫瘤重量/對(duì)照組平均腫瘤重量)×100結(jié)果如下表4所示，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)通過(guò)給藥BWP被明顯抑制。
表4

實(shí)施例8BWR進(jìn)一步的抗腫瘤效果進(jìn)一步檢測(cè)了BWR的抗腫瘤作用。每組10個(gè)6周雌雄混合的昆明小鼠用作測(cè)試動(dòng)物。隨后將S-180細(xì)胞皮下移植到左腹股溝區(qū)。在14天的每天中，將BWP腹膜內(nèi)注射。在移植后第15天，切除腫瘤，稱(chēng)重。按照下列公式得到腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分比(％)＝(1-測(cè)試組平均腫瘤重量/對(duì)照組平均腫瘤重量)×100結(jié)果如下表5所示，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)通過(guò)給藥BWR被明顯抑制。
表5

將該研究的腫瘤放入到石蠟中，染色，顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)從治療組切除的腫瘤含有大量的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，只有10％的腫瘤組織。因此，在治療組腫瘤組織中得到的腫瘤組織重量只是紀(jì)錄的10％，即是0.08克，而不是0.8克。因此，實(shí)際抑制為96.8％。這些結(jié)果還表明BWR具有提高對(duì)腫瘤組織免疫反應(yīng)的性能。
淋巴細(xì)胞的增加百分比(％)＝(測(cè)試組淋巴細(xì)胞的平均數(shù)/對(duì)照組淋巴細(xì)胞的平均數(shù)×100)-100得到的結(jié)果如下表6所示。發(fā)現(xiàn)BWR和BWP誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增生，并具有劑量依賴(lài)性特征。
表6

實(shí)施例10BWR和BWP對(duì)人吞噬細(xì)胞活性的影響檢測(cè)了BWR和BWP對(duì)人吞噬細(xì)胞活性的影響。通過(guò)含有兩個(gè)受試者的抗凝結(jié)人血液的離心管制備兩個(gè)buffy涂層樣品。然后將該樣品分成兩份。向每個(gè)受試者的一個(gè)buffy涂層樣品中加入2微克BWR和BWP。每個(gè)測(cè)試者的一個(gè)buffy涂層樣品作為對(duì)照。將所有樣品培養(yǎng)5小時(shí)。然后將30微克新鮮再水合的發(fā)面酵母加入到所有樣品中。1小時(shí)后，將吖啶橙色著色劑2x儲(chǔ)備液加入到每個(gè)樣品中。將每個(gè)樣品的一部分置于顯微鏡玻片上。紀(jì)錄每個(gè)樣品的含有細(xì)胞內(nèi)發(fā)面酵母的吞噬細(xì)胞百分比。
結(jié)果表明與對(duì)照相比，治療樣品中含有細(xì)胞內(nèi)發(fā)面酵母的吞噬細(xì)胞百分比平均增加85％。這證明了通過(guò)BWR和BWP刺激免疫系統(tǒng)的另一機(jī)理。
權(quán)利要求
1.一種用于治療癌癥、抑制新血管生長(zhǎng)和/或提高哺乳動(dòng)物免疫機(jī)能的藥物組合物，所述組合物含有有效量的田旋花提取物，其中已除去分子量小于大約500道爾頓的成分，和藥物可接受的載體。
2.按照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中分子量小于大約1,000道爾頓的成分已被除去。
3.按照權(quán)利要求2的藥物組合物，其中分子量小于大約3,000道爾頓的成分已被除去。
4.按照權(quán)利要求3的藥物組合物，其中分子量小于大約5,000道爾頓的成分已被除去。
5.按照權(quán)利要求4的藥物組合物，其中分子量小于大約10,000道爾頓的成分已被除去。
6.一種用于制備非毒性田旋花提取物的方法，其特征在于除去分子量小于大約500道爾頓的成分。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中分子量小于大約1,000道爾頓的成分被除去。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中分子量小于大約3,000道爾頓的成分被除去。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中分子量小于大約5,000道爾頓的成分被除去。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其中分子量小于大約10,000道爾頓的成分被除去。
11.按照權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)應(yīng)用分子量過(guò)濾器除去所述成分。
12.按照權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)用硫酸銨沉淀除去所述成分。
13.權(quán)利要求1的組合物在制備用于治療癌癥的醫(yī)藥中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1的組合物在制備用于延緩或阻止血管生長(zhǎng)的醫(yī)藥中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求1的組合物在制備用于提高哺乳動(dòng)物免疫機(jī)能的醫(yī)藥中的應(yīng)用。
16.按照權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述免疫機(jī)能選自淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)和吞噬細(xì)胞活性。
全文摘要
純化的旋花提取物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制血管生長(zhǎng)和提高免疫機(jī)能。該旋花提取物通過(guò)除去田旋花的毒性低分子量成分而制備。
文檔編號(hào)A61P37/04GK1338941SQ00803339
公開(kāi)日2002年3月6日 申請(qǐng)日期2000年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月16日
發(fā)明者孟小龍, 休·D·賴(lài)爾登, 尼爾·H·賴(lài)爾登 申請(qǐng)人:人機(jī)能改善中心國(guó)際有限公司