專利名稱：用于疫苗的活減毒細菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于一種藥劑的活減毒細菌、基于對預防微生物致病機制有用的細菌而產生的疫苗、攜帶異源基因的活減毒細菌以及這些疫苗和細菌的制備方法。
溫血動物戰(zhàn)勝微生物致病的方式是一個復雜的過程。對微生物引起的疾病的免疫是溫血動物避免發(fā)病或遭受不強烈致病的一種方式。當群體接觸病原體時，對所給病原菌的不完全免疫引起發(fā)病和致死。一般認為基于活減毒微生物的疫苗(活減毒疫苗)誘導一種高效型的免疫應答。這種疫苗有個優(yōu)點，一旦動物宿主被接種疫苗，進入宿主的微生物病原菌誘導一個早期的細胞介導的或體液免疫的加速的回憶，其可以在感染呈現(xiàn)臨床的顯著比例之前控制微生物的進一步生長?；谒啦≡囊呙?死疫苗)一般來說不能獲得這種類型的免疫應答。然而，含活致病菌的疫苗，依賴于減毒的水平，會出現(xiàn)這樣的危險，即，接種宿主在預防接種后可能患人們試圖抵抗的疾病。因此，人們希望得到具有活微生物的免疫屬性但不會在預防接種后引起不希望的副作用的疫苗。
細菌減毒的基本方法是去除一個或多個毒性因子。然而在大多數(shù)的情況下，毒性因子也在誘導免疫方面起到重要的作用。在那些情況下，毒性因子的缺失不可避免地削弱了細菌的免疫原性能力。這當然是一種不希望的情形。活疫苗優(yōu)選地應保留野生型菌株的抗原成份。
此外，活疫苗應有充分的a-毒力以避免不可接受的病理學作用，但另一方面，其必須引起宿主足夠水平的免疫。最后，減毒活疫苗菌株最好應該基本上沒有回復為毒力野生型菌株的可能性。
現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)一個編碼已知在許多細菌屬的主要碳水化合物的代謝中起作用的蛋白質的基因可被缺失，引起在體內的減毒行為而沒有減弱這些細菌在體內的生存力。這種基因被缺失的細菌的確出人意料地顯示出一種減毒特征。此外，因為編碼的蛋白質在免疫的誘導中不起什么作用，被缺失這種基因的細菌的抗原負載和野生型的相同。因此，這種細菌可出人意料地被優(yōu)先應用于藥劑制備的領域。更為具體地是用于活減毒疫苗的制備。
本發(fā)明所指可以被缺失并導致缺失突變體的體內減毒行為的基因以前被稱為fruR基因，然而現(xiàn)在稱為cra基因。已知缺少這個基因的突變體可在體外生長，但僅當由缺乏cra活性而導致的缺陷被生長培養(yǎng)基所補償時才能生長。這意味著cra缺失突變體可以賴于生長的營養(yǎng)成分必須存在于生長培養(yǎng)基中。
一般地說，致病菌可自我支持是指其代謝能夠適應可利用的營養(yǎng)物。在許多的主要代謝途徑中(如下所示)cra基因起著這樣一種適應性作用。然而cra基因已被缺失的突變體可依靠葡萄糖和許多其它作為碳源的糖很好地生長。在宿主動物中，這樣的糖是可以利用的，因此人們不會期望cra基因在體內的條件下是有功能的。因此，人們不會料到cra缺失的突變體在宿主中顯示出減毒特性。這就解釋了為什么盡管這些突變體是本領域技術人員公知的但卻從來沒有人揭示其作為減毒活疫苗候選者的潛力。
本發(fā)明的一個實施方案涉及到用于疫苗的活減毒細菌，其由于Cra基因的突變導致不再能表達一種功能性的Cra蛋白。
基因產物(以前稱為FruR；果糖阻抑蛋白)，現(xiàn)在也稱為Cra(分解代謝物阻抑/激活蛋白)，是在許多碳水化合物代謝主要途徑中的調節(jié)蛋白。
cra基因產物Cra調節(jié)著主要的碳代謝。更為具體地是，Cra通過結合編碼生物合成酶和氧化酶(例如TCA循環(huán)、乙醛酸支路、葡糖異生途徑以及電子轉移中的關鍵酶)的基因的啟動子上游區(qū)正調節(jié)這些基因的轉錄，負調節(jié)編碼糖酵解酶(例如EM途徑和ED途徑中的關鍵酶)的基因的轉錄。
由于它在碳水化合物代謝中的關鍵地位，cra基因及其基因產物Cra廣泛地存在于細菌中。Cra蛋白是一種高度保守的蛋白。例如，它可以存在于大腸桿菌，腸沙門氏菌例如鼠傷寒，腸炎以及都柏林血清型，放線桿菌屬例如大葉性肺炎放線桿菌，嗜血桿菌屬例如副雞嗜血桿菌，殺鮭氣單胞菌屬、巴斯德氏菌屬例如條魚巴斯德氏菌，以及多殺巴斯德氏菌，鏈球菌屬例如馬鏈球菌、豬鏈球菌，耶爾森氏菌屬例如鼠疫耶爾森氏菌。
Jahreis,K等人在1991年已經闡述了沙門氏菌屬和埃希氏菌屬的基因本身及其核苷酸全序列(Mol.Gen.Genet.226:332-336(1991)).Jahreis闡明腸沙門氏菌，鼠傷寒血清型和大腸桿菌的Cra蛋白僅僅在四個位置不同，其中的兩個僅僅是保守性交換。這些當然符合對于一種在細菌碳水化合物代謝的如此眾多的通用途徑中起到一定作用的人們所期望的蛋白，尤其是在沙門氏菌和大腸桿菌在進化過程中趨異不那么遠的情況下。Ramseier,T.M.等人至少部分闡述了Cra蛋白結合的機理(分子生物學雜志234:28-44(1993))。Cra蛋白的作用和功能已經被正式地記載在文獻上，例如Saier,M.H.和Ramseier,T.M.最近發(fā)表的小綜述上(細菌學雜志178:3411-3417(1996))。
這種突變可以是插入、缺失、取代或幾種的組合，條件是突變導致了功能性Cra蛋白表達的失敗。功能性Cra蛋白被認為是一種具有野生型蛋白的調節(jié)特性的蛋白。因此，至少其一種功能缺陷的Cra蛋白被認為是非功能性Cra蛋白。
本發(fā)明使用的活減毒細菌可通過多種途徑獲得。獲得這種細菌的一種可能的途徑是通過傳統(tǒng)的方法例如用誘變劑例如堿基類似物處理帶有cra基因的野生型菌株，或用紫外線處理或溫度處理。
不產生功能性Cra蛋白的菌株很容易被挑出。它們在僅含葡萄糖和其他糖做為碳源的基本培養(yǎng)基中生長(這使它們和cya與crp突變體區(qū)分開來)但它們不能在利用以葡糖異生性底物作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(Chin等人，細菌學雜志169:897-899(1987))。它們因此很容易在體外被選擇。
傳統(tǒng)突變技術引起的突變的本性是未知的。這可能是一個點突變，雖然不可能一定發(fā)生，但是通過點突變可能最終回復為野生型。為了避免這種小的危險，轉座子誘變將是一個好的選擇。轉座子誘變引起的突變也是一個本領域的普通技術人員公知的突變技術。這是一個在染色體的局部位點完成的突變。轉座子的插入不是針對一個特定的基因。由于cra-突變株在沒有對缺乏Cra活性進行營養(yǎng)補償?shù)臈l件下不能在體外生長，所以很容易被篩選出來。因此它們從一群隨機轉座子突變的細菌中很容易被篩選出來。
重組DNA技術提供了有意地而不是隨機地在預定位點導入一個突變的可能性。這種突變可以是核苷酸的插入、缺失或一個核苷酸被另一個核苷酸取代或它們的組合，唯一的條件是突變的基因不再編碼功能性Cra。這種突變可以例如是一些核酸的缺失。甚至例如少至10個核酸的一段序列的缺失已經可以致使Cra無功能。甚至例如一個單核酸的缺失已經可以致使Cra無功能，由于此突變的結果，其它的核苷酸不再在正確的閱讀框架內。大量的由三個不可分割的核酸所組成的核酸插入的缺失引起這種框移。更為優(yōu)選的是一段長序列例如100個核酸被缺失，進一步優(yōu)選的是整個cra基因被缺失。很容易發(fā)現(xiàn)，在開放閱讀框架中導入了一個終止子的特定的突變，或在開放閱讀框架中引起框移的突變非常適于去獲得不再編碼功能性Cra的菌株。
所有的構建Cra-缺失突變體的技術均為公知的標準技術。其包括cra基因的克隆，定點誘變引起的基因序列修飾，限制性酶的降解，然后是再連接或PCR-法及用突變基因取代野生型的cra基因(等位交換或等位取代)。標準的重組DNA技術如在質粒中克隆cra基因，用限制性酶降解基因，然后用內切核酸酶處理，再連接以及在宿主菌株中進行同源重組，均為本領域公知的技術并且描述在Maniatis/Sambrook上(Sambrook,J.等人，分子克隆實驗室手冊。ISBN 0-87969-309-6)。定點誘變可以通過例如使用購自Clontech.PCR-techniques的Transformer試劑盒在體外定點誘變，其描述在(Dieffenbach & Dreksler；PCR引物，實驗室手冊。ISBN 0-87969-447-3和ISBN 0-87969-447-5)上。
cra基因不僅含有編碼Cra蛋白的編碼序列，而且含有如啟動子的調控序列，此基因也含有Cra mRNA的正確翻譯所必需的位點，例如核糖體結合位點。
因此，不僅編碼區(qū)的突變而且正確的轉錄和翻譯所必需的序列的突變都被認為屬于本發(fā)明的范圍之內。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于疫苗的埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，放線桿菌屬，嗜血桿菌屬，氣單胞菌屬，巴斯德氏菌，鏈球菌屬和耶爾森氏菌屬的活減毒細菌。
在本發(fā)明的一個更為優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的活減毒細菌選自腸沙門氏菌鼠傷寒，腸炎，豬霍亂，都柏林，傷寒，雞，綿羊流產，馬流產，雞白痢血清型，大腸桿菌或鼠疫耶爾森氏菌。這些細菌含有大量對人類和不同動物品種致病的種。本發(fā)明的活減毒細菌優(yōu)選為腸沙門氏菌，大腸桿菌或鼠疫耶爾森氏菌。
在其更優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的活減毒細菌是腸沙門氏菌，大腸桿菌或鼠疫耶爾森氏菌。
在一個更為優(yōu)選的形式中，此實施方案涉及本發(fā)明所述的活減毒細菌，其中已利用重組DNA技術導致了cra基因的突變。
較好限定并周密進行的包括cra基因片段或甚至整個基因的缺失或異源DNA片段的插入的突變或二者同時發(fā)生的突變有以下優(yōu)點和傳統(tǒng)的誘導突變相比，其不會回復到野生型狀態(tài)。
因此，在一個更為優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的這個實施方案是指活減毒細菌，其中cra基因含有插入和/或缺失。
如今一旦大量的疫苗用于寵物和農場動物，如果僅僅為了降低疫苗的成本，很顯然幾種疫苗的共同給藥將是可取的。因此使用活減毒細菌作為異源基因的重組載體是非常具有吸引力的，其中的異源基因編碼的抗原選自其它的致病微生物或病毒。這種重組載體的給藥有一個優(yōu)點即誘導同時抵抗兩種或多種疾病的免疫力。由于編碼Cra蛋白的基因可作為異源基因插入位點，本發(fā)明的用于疫苗的活減毒細菌便提供了用于這種異源基因的適合的載體。cra基因作為插入位點的應用有一個優(yōu)點即cra基因失活的同時新導入的異源基因可被表達(和同源的細菌基因一起)。這種重組載體的構建可使用標準的分子生物學技術例如等位交換按常規(guī)進行。因此，本發(fā)明活減毒重組細菌的另一個實施方案優(yōu)選為埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，放線桿菌屬，嗜血桿菌屬，氣單胞菌屬，巴斯德氏菌屬，鏈球菌屬和耶爾森氏菌屬，其中插入了異源基因但并不能產生功能性Cra蛋白。如此的異源基因可以如上所述例如是編碼選自其它致病微生物或病毒的抗原的基因。此基因可得自例如致病皰疹病毒(例如編碼皰疹病毒的結構蛋白的基因)，逆轉錄病毒(例如gp160包膜蛋白)，腺病毒等。異源基因也可得自致病細菌。作為一個實例，編碼細菌毒素例如大葉性肺炎放線桿菌毒素，梭狀芽胞桿菌毒素，外膜蛋白等的基因是很合適的細菌異源基因。另一種可能性是插入編碼與觸發(fā)免疫系統(tǒng)有關的蛋白，例如白介素或干擾素的基因，或另一個涉及免疫調控的基因。
在cra基因中插入異源基因是有益的，因為其不需要去尋找異源基因的插入位點，并且同時cra基因被敲除。
因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，異源基因被插入cra基因。異源基因可被插在cra基因的任一位置或被插入cra基因部分或全部缺失時的位點。
因為它們在體內除了致免疫特性之外出人意料地減毒，本發(fā)明用于疫苗的細菌非常適合作為活減毒疫苗的基礎。因而，本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于保護動物和人類抵抗含cra基因的野生型細菌感染的活減毒疫苗。
這些疫苗含有免疫有效量的本發(fā)明的用于疫苗的活減毒細菌或本發(fā)明的所述活重組載體細菌以及藥學上可接受的載體。
更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明含有活減毒細菌的疫苗選自埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，放線桿菌屬，嗜血桿菌屬，氣單胞菌屬，巴斯德氏菌屬，鏈球菌屬和耶爾森氏菌屬。
免疫有效性是指用于免疫給藥的活減毒細菌的量足以在宿主中誘導引起抗細菌的毒性形式的有效免疫應答。
除了如上所述免疫有效量的活減毒細菌之外，本發(fā)明所述疫苗也含有藥學上可接受的載體。這種載體可以簡單地如水，但是，其也可以含有例如培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)液。另一種合適的載體例如是生理鹽濃度的溶液。
給藥的有用劑量取決于年齡、體重、接種的動物，給藥的方式以及疫苗作用的病原體的類型的不同而變化。
疫苗可以含有任意劑量的足以充分激起免疫應答的細菌。劑量范圍在103和1010細菌之間是非常合適的劑量。
可選擇地，一種或多種有佐劑活性的化合物可以被加到疫苗中。佐劑是免疫系統(tǒng)的非特異性刺激物。其增強宿主對疫苗的免疫應答。本領域技術人員公知的佐劑的實例為弗氏完全和不完全佐劑，維生素E，非離子嵌段聚合物，胞壁酰二肽，ISCOMs(免疫刺激性復合物，例如參見EP 109942)，皂苷，礦物油，植物油以及Carbopol。
特別適用于粘膜用的佐劑為例如大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)或霍亂毒素(CT)。
其它合適的佐劑為例如氫氧化鋁，磷酸鋁或氧化鋁，油乳劑(例如，Bayol F(R)或Marcol 52(R)，)皂苷或維生素E可溶性鹽。
因此，本發(fā)明所述疫苗優(yōu)選含有佐劑。
其它的用于本發(fā)明的藥學上可接受的載體或稀釋劑的例子包括例如SPGA，碳水化合物(例如山梨醇，甘露糖醇，淀粉，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖)，如白蛋白或酪蛋白的蛋白質，含牛血清或脫脂奶和緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液)的蛋白質。
尤其當這種穩(wěn)定劑加入疫苗的時候，疫苗非常適于冷凍干燥。因此，在一種優(yōu)選的形式中，疫苗是一種凍干的形式。
為了給動物或人類給藥，本發(fā)明所述疫苗可鼻內給藥，真皮內給藥，皮下給藥，口服，吸入或肌內給藥。家禽給藥時，翅膀給藥和滴眼給藥是非常合適的。
另一個實施方案涉及細菌在疫苗中的應用或本發(fā)明重組細菌用于制備保護動物和人類抵抗野生型細菌感染或感染的致病性影響的疫苗中的應用。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及本發(fā)明所述疫苗的制備方法。此方法包括將本發(fā)明活減毒細菌或本發(fā)明重組載體細菌與藥學上可接受的載體混合。
提供SR-11 Fad- a-毒力的突變基因的核苷酸序列公開于SEQ ID NO:1中。
SEQ ID NO:2公開了SEQ ID NO:1的核苷酸序列編碼的蛋白分子的氨基酸序列。
現(xiàn)在已鑒定出鼠傷寒沙門氏菌SR-11 Fad-是cra基因突變株。轉座子插入的點已被發(fā)現(xiàn)位于距cra翻譯終止密碼子的3｀末端的約45個堿基對處。
一個含有1.5kb Tn 10d Cam插入子的4.5kb的Pst1片段(一端側接一段1.9kb鼠傷寒沙門氏菌SR-11 DNA片段而另一端側接一段1.1kb鼠傷寒沙門氏菌SR-11 DNA片段)被插入到pBluescriptⅡ SK(+)的Pst1位點中。結果得到的質粒pJHA 7通過電穿孔進入到E.Coli HB101中。通過Sanger雙脫氧熱循環(huán)法測序側接Tn 10d Cam插入子的區(qū)域。直接側接Tn 10d Cam插入子每側的核苷酸序列被發(fā)現(xiàn)與鼠傷寒沙門氏菌cra(fruR)基因有100％的同源性并發(fā)現(xiàn)插入點距cra翻譯終止密碼子的3｀末端45個核苷酸。這些表明了鼠傷寒沙門氏菌SR-11 Fad-是一個cra突變株。
與SR-11對比，SR-11 Fad-不能夠在含有檸檬酸鹽，油酸鹽，丙酮酸鹽，醋酸鹽，丁二酸鹽和延胡索酸鹽的M9基本瓊脂培養(yǎng)基平板上生長。
通過PCR擴增鼠傷寒沙門氏菌SR-11野生型cra(fruR)并且將其插入pBR322的氨芐青霉素抗性基因的pst1位點。所得pJHA8質?；謴土耸髠抽T氏菌SR-11 Fad的能力也可以象野生型菌株一樣利用上述的每一種化合物作為碳源。這些實驗確定鼠傷寒沙門氏菌SR-11-是cra(fruR)突變株。
SR-11 Fad的構建是通過將來自于LT-2d的微轉座子突變株的氯霉素抗性通過噬菌體P22HT105int-轉導入SR-11中實現(xiàn)的。盡管未必可能，SR-Fad-無毒性的可能性取決于一些SR-11 DNA在轉導時的丟失，例如，致病性島的丟失，而不是取決于缺陷性cra基因。因此，如下所描述，一個等同于SR-11的菌株，下文的SR-11 CramodAX-2，除了含有相同的存在于SRFad-中的cra基因突變，其是通過等位交換來構建的。
含有SR-11 Fad-突變cra基因(cra基因含有氯霉素抗性基因)的4.3kb的Pst1 SR-11 Fad-DNA片段被插入到一個含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因的自殺載體pLD55的Pst1位點。其被稱為pMJN10。pMJN10通過電穿孔進入E.coli S17-1λpir中。E.coli S17-1λpir(pMJN10)與SR-11接合之后，檢測了一些氨芐青霉素，四環(huán)素和氯霉素SR-11轉接合子利用油酸鹽，檸檬酸鹽，醋酸鹽，丙酮酸鹽，丁二酸鹽和延胡索酸鹽作為唯一碳源的能力。如果pMJN10已經通過同源序列的單交換整合到染色體中，則所有轉接合子都能如所期望的那樣利用上述鹽類，即好象突變和野生型的cra等位基因都存在于染色體中。這樣的五個“整合子”被用來檢測其中是否存在作為游離質粒的pMJN10，結果并不存在，從而進一步確定該質粒已經插入到SR-11染色體中。五個整合子中的每一個被劃線培養(yǎng)在含有氯霉素的Luria瓊脂平皿上。在這種情況下，只要留在染色體中的cra等位基因是含有氯霉素抗性基因的突變等位基因則發(fā)生二次交換的細胞便能存活。劃線培養(yǎng)的接合子樣品然后劃線培養(yǎng)在四環(huán)素敏感性篩選瓊脂(TSS瓊脂)上。TSS瓊脂含有延胡索酸和四環(huán)素敏感性細胞，即已丟失自殺質粒的細胞相對于在染色體中仍然含有質粒的四環(huán)素抗性細胞長成很大的集落?？偣?4個大集落被用于檢測氯霉素抗性，氨芐青霉素和四環(huán)素的敏感性以及利用油酸鹽，醋酸鹽，丙酮酸鹽，檸檬酸鹽，丁二酸鹽和延胡索酸鹽作為唯一碳源的能力。在34個分離物中，6個具有氯霉素抗性，但對氨芐青霉素和四環(huán)素敏感，不能利用上述化合物作為唯一碳源。其中一個分離物，被稱為SR-11CramoddAX-2(AX是指等位基因交換)，被用pBR322或pJHA8轉化(pJHA8含有野生型cra基因)且二菌株均被檢測了用油酸鹽，醋酸鹽，丙酮酸鹽，檸檬酸鹽，丁二酸鹽和延胡索酸鹽作為唯一碳源的能力。對比SR-11CramodAX-2(pBR322),SR-11CramodAX-2(pJHA8)能夠利用上述化合物作為唯一碳源，此表明SR-11CramodAX-2是cra突變株。此兩個菌株，正如所預料的，能夠利用葡萄糖和甘油作為唯一碳源。
為了確定功能性cra(fruR)基因是否使鼠傷寒沙門氏菌具有SR-11毒力，進行了以下的實驗。
四只BALB/c小鼠用SR-11(2.1×108cfu/小鼠)經口感染以及五只小鼠用SR-11CramodAX-2(2.8×108cfu/小鼠)感染。到感染后第8天，所有4只感染SR-11的小鼠都死亡，然而5只感染SR-11CramodAX-2的小鼠仍然健康和活躍(表1)。因為除了存在于SR-11Cramod中的cra的相同的突變外，SR-11CramodAX-2和SR-11是一樣的，在通過從LT-2菌株轉導構建SR-11Cramod過程中發(fā)生的一些異常事件與cra無關的可能性已被排除，這可能是毒力喪失的原因。
也有可能氯霉素抗性元件在cra基因中的插入導致對下游基因的極性作用，因此SR-11 Fad-的減毒不取決于缺陷性cra基因。因此，SR-11Cramod用僅含有野生型cra基因的pJHA8來補償，以檢測是否SR-11Cramod(pJHAB)恢復毒力。作為一個對照，SR-11Cramod用pBR332來補償，此載體用來構建pJHA8。四只BALB/c小鼠被用3.1×108cfu/小鼠的SR-11Cramod(pBR322)經口感染并且另外四只BALB/c小鼠被用4.3×108cfu/小鼠的SR-11 Fad-(pJHA8)感染。到感染后第9天，四只用SR-11Cramod(pJHA8)感染的小鼠中的三只死亡而用SR-11Cramod(pBR322)感染的4只小鼠仍然健康和活躍(表1)。所有死亡小鼠的肝臟與脾臟都含有大于108cfu/器官的SR-11 Fad-(pJHA8)。此結果排除了帶有氯霉素抗性元件的cra基因的失活引起下游效應從而導致無毒力的可能性并且證明了功能性cra基因是SR-11毒力所必需的。鼠傷寒沙門氏菌菌株 感染數(shù)a存活數(shù)SR-11 4 0SR-11CramodAX-2 5 5SR-11Cramod(pBR322) 4 4SR-11Cramod(pJHA8)4 1a根據(jù)菌株的不同，用2.0×108cfu/小鼠～5.0×108cfu/小鼠的劑量口服感染小鼠。所有的死亡鼠都是到感染后第9天死亡。所有存活鼠完全恢復。表1檢測不同細菌屬中的cra基因鼠傷寒沙門氏菌四株，腸沙門氏菌，雞沙門氏菌，都柏林沙門氏菌，和豬霍亂沙門氏菌各一株通過Southern雜交來檢測cra基因。在所有的情況下，cra基因被發(fā)現(xiàn)與SR-11一樣有4.3kb大小的Pst1 DNA片段。六個不同的致病E.Coli菌株也被檢測都有cra基因，雖然六株菌中的cra基因存在于三種不同大小的Pst1片段中。此外，一株殺鮭氣單胞菌和放線桿菌屬，嗜血桿菌屬，巴斯德氏菌屬，鏈球菌屬和耶爾森氏菌屬的一些菌株經檢測都顯示出cra基因的存在。
cra基因存在于上述細菌的證明如下這些菌株的基因組DNA在37℃用20單位的Pst1(Promega)過夜降解。凝膠電泳(0.7％瓊脂糖，1×TAE)用來分離不同大小的Pst1DNA片段。分離的DNA用S&S Turboblotter系統(tǒng)(Schleicher和Schuell)在堿性的條件下轉移到帶正電的尼龍膜上3小時。膜在90℃下烘焙30分鐘將DNA連接到膜上。然后，鼠傷寒沙門氏菌cra基因的700堿基對片段被DIG標記并用于探測膜。膜在62℃下在含有5×SSC,0.1％的N-月桂酰肌氨酸，0.02％SDS,1.5％封閉試劑(帶CSPD的DIG檢測起子藥盒Ⅱ,Boehringer Mannheim)中預雜交(在一個滾瓶雜交爐中)2～4小時。標記的探針被變性并加入新鮮的雜交緩沖液中，印跡在62℃下培養(yǎng)16-20小時。印跡用0.1％SDS,2×SSC在62～65℃下5分鐘洗兩次。然后用0.1％SDS,0.1×SSC在60℃下15分鐘洗兩次。通過下述的修飾來展開印跡2％封閉試劑被用于封閉溶液(通常使用1％)，印跡被封閉一個小時(通常封閉的時間為30分鐘)且抗體的較低濃度(通常使用70％濃度)被用于DIG-標記探針的檢測。這些變化被制造商建議用于較低的背景信號。
SR11CramodSR11Cramod對照第1天接種時劑量 6.0×1076.0×107-第11天接種時劑量- 8.3×107-第18天攻擊時劑量1.9×1091.9×1091.9×109死亡率(％) 15 10 100表2聯(lián)合接種的安全性與效力實驗。在第二個實驗中檢測疫苗的效力和疫苗的安全性。疫苗的安全性在生長阻滯的基礎上測得。一組15只小雞被口服接種溶于培養(yǎng)基中的2.7×108CFU鼠傷寒沙門氏菌SR11Cramod。另一組15只小雞口服接種溶于PBS中的1.3×108CFU的同一菌株。18天后，兩組均用6.5×108毒力野生型菌株進行攻擊。表3顯示了結果。
SR11Cramod(ⅰ)SR11Cramod(ⅱ) 對照第1天接種時的劑量 2.7×1081.3×108--第7天的重量 178 ND 185第18天的重量 733 722749第18天攻擊時的劑量6.5×1086.5×1086.5×108死亡率(％)0 13 100表3ⅰ=培養(yǎng)基，ⅱ=PBS結果兩個實驗顯示，盡管所用的高攻擊劑量，Cra-陰性的鼠傷寒沙門氏菌菌株獲得了很高水平的保護。此外，發(fā)現(xiàn)接種疫苗的結果沒有顯著的生長阻滯。因此可以斷定Cramod陰性的鼠傷寒沙門氏菌菌株非常適于用于保護家禽抵抗野生型細菌的感染的活減毒疫苗。
每一組的5頭豬在5-6周齡時被攻擊。豬被鼻內(0.5ml/鼻)攻擊和口服攻擊(1.0ml培養(yǎng)物+4.0ml細菌稀釋劑)。攻擊培養(yǎng)物大約為9.0×108CFU/ml。然后，豬被每日監(jiān)視沙門氏菌感染的典型的臨床癥狀包括體重損失，腹瀉，和升高的直腸的溫度。C．安樂死攻擊后第7天，豬被實施安樂死。豬被尸體剖檢且肺，肝臟，脾臟，腸系膜淋巴節(jié)(MLN)以及回腸被培養(yǎng)用于豬霍亂沙門氏菌的生長。D．體重增加平均日增加(ADG)是通過從最終體重中扣除起初體重再除以從攻擊到安樂死的天數(shù)得到的。組ADG是個體豬ADG的平均數(shù)。2．小鼠安全性試驗一個小鼠攻擊實驗被完成以檢測不同豬霍亂沙門氏菌菌株的LD50，即Cra陽性親本34682和35276菌株以及cra陰性的34682和35276敲除(KO)菌株的LD50。A．動物兩百(200)只16-20克的CF-1Sasco小鼠被分成20組每組10只小鼠用于小鼠的安全性測試。在整個實驗期間小鼠被放在同一房間內，但在不同的桶中。B．攻擊每一個菌株供試于5個含有10只小鼠的亞組。這些亞組用0.25ml菌株的5種不同的稀釋液(10-3-10-7)腹膜內(lP)攻擊。
四種菌株的每一種的冷凍種子被稀釋為10-3-10-7。這些稀釋液的每一種被腹膜內注射(0.25ml)到10只小鼠中。結果Ⅰ．豬安全性試驗A．體重增加豬的體重增加顯示于

圖1中。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示用KO菌株攻擊和用親本菌株攻擊的豬的不同。數(shù)據(jù)也反映動物的全面健康狀況的不同。兩組用親本菌株攻擊的豬從攻擊時到安樂死都減輕了體重；然而用KO菌株攻擊的豬每天增加了大約0.75公斤。Ⅱ．小鼠安全性實驗A．死亡小鼠實驗的結果顯示于下面表4中。右欄顯示了不同菌株CFU的半致死劑量。敲除菌株清楚地顯示出高水平的減毒。菌株 LD50cfu35276親本 ＜7.7cfu35276敲除 1.5E+04cfu34682親本 12.5cfu34682敲除 ＞9.0E+04cfu表4結論從豬安全性實驗顯示了經過攻擊Cra敲除(KO)菌株相對于親本菌株產生了明顯較高的體重增加。其證明了CraKO突變株的減毒特性。除了豬安全性試驗，小鼠安全性試驗也顯示Cra KO菌株被減毒KO突變株的LD50顯著地高于親本菌株的LD50。
攻擊9天后，豬被實施安樂死，并被尸體剖檢且在含有80μg/ml萘啶酮酸的Hektoen腸道(HE)瓊脂平皿上培養(yǎng)肺，肝臟，脾臟，腸系膜淋巴節(jié)(MLN)和回腸來增殖豬霍亂沙門氏菌。腹瀉評分腹瀉評分是通過給攻擊后每頭豬每天的腹瀉一個點來計算的。在試驗結束時，實驗期間的總點數(shù)除以從攻擊到安樂死的天數(shù)。此數(shù)乘以100就得到所觀察到的腹瀉天數(shù)的百分數(shù)。沙門氏菌釋放每日取豬的排泄物來檢測在免疫后和攻擊后豬霍亂沙門氏菌釋放的時間。在兩天的陰性結果后，停止取排泄物。排泄物被滴定在HE平皿上進行分離。在樣品進行不同的稀釋后發(fā)現(xiàn)與生長有關的點。點數(shù)如下所分配10-11點10-22點10-33點10-44點10-55點體重增加平均日增加(ADG)是通過從最終體重中扣除起初體重再除以從攻擊到安樂死的天數(shù)得到的。組ADG是個體豬ADG的平均數(shù)。結果免疫后死亡有兩頭用豬霍亂沙門氏菌野生型親本菌株34682接種的豬在接種后死亡。此組中的其它三頭豬在實驗終止的自始至終都活著。沙門氏菌分離/尸體剖檢評分圖2顯示了每一個器官豬霍亂沙門氏菌分離的結果。對比親本和非接種組，用KO疫苗免疫的豬的組中任何器官都沒有分離到豬霍亂沙門氏菌。非接種組的所有5頭豬的回腸和MLN中都分離到豬霍亂沙門氏菌而親本組的那些器官中沒有分離到。通過將每個分離到霍亂沙門氏菌的器官標記為一個點，每組分離評分被計算出來。結果證明了用KO疫苗接種的豬相對于親本菌株接種的豬有較低的評分，且明顯低于非接種組的評分。腹瀉評分日平均腹瀉評分顯示于圖3。此圖顯示出KO評分相對于其它的三組有明顯的不同。KO組清楚地顯示了最低的評分。沙門氏菌釋放在接種疫苗和攻擊后，豬的沙門氏菌的釋放顯示于圖4和5中。接種疫苗后，圖顯示出親本具有最高水平的釋放。在攻擊后的圖中，非接種疫苗的動物釋放的豬霍亂沙門氏菌持續(xù)最長的時間，因此得到最高的評分。體重的增加豬體重的增加顯示于圖6中。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示了不同組之間的差異。它們也反映出不同動物之間整體的健康水平。非接種疫苗組每天平均減重0.15公斤，而KO組平均每天增重0.6公斤。討論豬霍亂沙門氏菌敲除菌株34682被證明為有效的和安全的疫苗菌株。沙門氏菌在尸體剖檢時的分離對于敲除菌株是完全陰性的。非接種疫苗的評分在二次分離中最高。鑒于攻擊后的日平均增重，基因敲除菌株接種的動物有最高的增重且非接種動物的增重明顯較低。結論活KO-34682豬霍亂沙門氏菌疫苗株是安全且有效的。
附圖的說明圖1攻擊后每頭豬每天平均體重增加的磅數(shù)。該重量乘以0.4536就得到了公斤數(shù)。圖2能從不同的組織中重新分離出豬霍亂沙門氏菌的豬的百分數(shù)(MLN=腸系膜淋巴節(jié))。圖3攻擊后腹瀉評分的平均百分比。圖4免疫后沙門氏菌釋放評分的日平均數(shù)。圖5攻擊后細菌釋放評分的日平均數(shù)。圖6攻擊后每頭豬增重的日平均磅數(shù)。
序列表(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度1200個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置118..1119(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置118..120(C)其它資料/產物=“編碼氨基酸甲硫氨酸”(ⅹ)序列描述SEQ ID NO:1GTGGTAACCC GGAATAAAAG CGGTTGCCGG AGTGATCAAA CTGCGCTTAG ATGTTAACGA 60TTTTAACCCA TGCCGACATA AAGGTTATGG TTTGTACAAT TTACACAAGG GGCAATT 117GTG AAA CTG GAT GAA ATC GCT CGG CTG GCC GGT GTC TCG CGC ACA ACT 165Val Lys Leu Asp Glu Ile Ala Arg Leu Ala Gly Val Ser Arg Thr Thr1 5 10 15GCA AGC TAC GTT ATA AAC GGT AAA GCA AAG CAA TAC CGC GTG AGC GAC 213Ala Ser Tyr Val Ile Asn Gly Lys Ala Lys Gln Tyr Arg Val Ser Asp20 25 30AAA ACC GTA GAA AAA GTC ATG GCG GTA GTG CGT GAG CAC AAT TAC CAT 261Lys Thr Val Glu Lys Val Met Ala Val Val Arg Glu His Asn Tyr His35 40 45CCT AAC GCT GTG GCT GCC GGG CTG CGT GCT GGA CGC ACA CGT TCC ATT 309Pro Asn Ala Val Ala Ala Gly Leu Arg Ala Gly Arg Thr Arg Ser Ile50 55 60GGT CTG GTG ATC CCG GAC CTT GAA AAC ACG AGC TAC ACC CGT ATC GCA 357Gly Leu Val Ile Pro Asp Leu Glu Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Ile Ala65 70 75 80AAC TAT CTT GAG CGC CAG GCA CGC CAG CGT GGC TAC CAA CTG CTG ATC 405Asn Tyr Leu Glu Arg Gln Ala Arg Gln Arg Gly Tyr Gln Leu Leu Ile85 90 95GCC TGT TCT GAA GAT CAG CCG GAT AAC GAA ATG CGC TGC ATT GAG CAC 453Ala Cys Ser Glu Asp Gln Pro Asp Asn Glu Met Arg Cys Ile Glu His100 105 110CTT TTG CAA CGC CAG GTG GAT GCA ATC ATT GTT TCA ACT TCG TTA CCG 501Leu Leu Gln Arg Gln Val Asp Ala Ile Ile Val Ser Thr Ser Leu Pro115 120 125CCG GAG CAT CCC TTC TAT CAG CGC TGG GCC AAC GAT CCG TTC CCC ATC 549Pro Glu His Pro Phe Tyr Gln Arg Trp Ala Asn Asp Pro Phe Pro Ile130 135 140GTC GCG CTC GAC CGC GCG CTG GAT CGC CAA CAT TTC ACC AGC GTG GTC 597Val Ala Leu Asp Arg Ala Leu Asp Arg Glu His Phe Thr Ser Val Val145 150 155 160GGC GCC GAT CAG GAT GAT GCC GAG ATG TTG GCG GAA GAG CTG CGT AAA 645Gly Ala Asp Gln Asp Asp Ala Glu Met Leu Ala Glu Glu Leu Arg Lys165 170 175TTC CCG GCG GAA ACG GTG CTT TAT TTG GGC GCG CTG CCG GAG TTG TCC 693Phe Pro Ala Glu Thr Val Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Pro Glu Leu Ser180 185 190GTC AGT TTC CTG CGC GAG CAG GGG TTC CGC ACC GCA TGG AAA GAC GAT 741Val Ser Phe Leu Arg Glu Gln Gly Phe Arg Thr Ala Trp Lys Asp Asp195 200 205CCG CGG GAG GTG AAT TTC TTA TAT GCC AAC AGC TAT GAG CGC GAA GCC 789Pro Arg Glu Val Asn Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Ala210 215 220GCC GCG CAG TTG TTT GAG AAA TGG CTG GAA ACG CAT CCT ATG CCG CAG837Ala Ala Gln Leu Phe Glu Lys Trp Leu Glu Thr His Pro Met Pro Gln225 230 235 240GCG CTC TTT ACG ACA TCG TTC GCG CTA TTA CAG GGC GTG ATG GAC GTA885Ala Leu Phe Thr Tnr Ser Phe Ala Leu Leu Gln Gly Val Met Asp Val245 250 255ACG CTG CGG CGC GAT GGA AAA CTG CCT TCG GAT TTA GCG ATT GCG ACC933Thr Leu Arg Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ser Asp Leu Ala Ile Ala Thr260 265 270TTC GGC GAT CAT GAG CTG CTG GAT TTT CTG CAA TGC CCG GTA CTG GCG981Phe Gly Asp His Glu Leu Leu Asp Phe Leu Gln Cys Pro Val Leu Ala275 280 285GTG GCG CAG CGT CAT CGT GAT GTC GCG GAA CGC GTG CTG GAG ATT GTG 1029Val Ala Gln Arg His Arg Asp Val Ala Glu Arg Val Leu Glu Ile Val290 295 300CTG GCA AGT CTT GAT GAA CCG CGT AAA CCG AAA CCC GGC TTA ACG CGT 1077Leu Ala Ser Leu Asp Glu Pro Arg Lys Pro Lys Pro Gly Leu Thr Arg305 310 315 320ATT CGG CGA AAC CTT TAT CGT CGC GGC ATT CTG AGC CGT AGC 1119Ile Aro Arg Asn Leu Tyr Arg Arg Gly Ile Leu Ser Arg Ser325 330TAAAGGACCG GCGGTAAAAG ACTCTCTCTT CTGCCGCCGT CAAACAAATG CGTATCAGTA 1179AAAATATCCC TTAAATAATT A 1200(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度334個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Val Lys Leu Asp Glu Ile Ala Arg Leu Ala Gly Val Ser Arg Thr Thr1 5 10 15Ala Ser Tyr Val Ile Asn Gly Lys Ala Lys Gln Tyr Arg Val Ser Asp20 25 30Lys Thr Val Glu Lys Val Met Ala Val Val Arg Glu His Asn Tyr His35 40 45Pro Asn Ala Val Ala Ala Gly Leu Arg Ala Gly Arg Thr Arg Ser Ile50 55 60Gly Leu Val Ile Pro Asp Leu Glu Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Ile Ala65 70 75 80Asn Tyr Leu Glu Arg Gln Ala Arg Gln Arg Gly Tyr Gln Leu Leu Ile85 90 95Ala Cys Ser Glu Asp Gln Pro Asp Asn Glu Met Arg Cys Ile Glu His100 105 110Leu Leu Gln Arg Gln Val Asp Ala Ile Ile Val Ser Thr Ser Leu Pro115 120 125Pro Glu His Pro Phe Tyr Gln Arg Trp Ala Asn Asp Pro Phe Pro Ile130 135 140Val Ala Leu Asp Arg Ala Leu Asp Arg Glu His Phe Thr Ser Val Val145 150 155 160Gly Ala Asp Gln Asp Asp Ala Glu Met Leu Ala Glu Glu Leu Arg Lys165 170 175Phe Pro Ala Glu Thr Val Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Pro Glu Leu Ser180 185 190Val Ser Phe Leu Arg Glu Gln Gly Phe Arg Thr Ala Trp Lys Asp Asp195 200 205Pro Arg Glu Val Asn Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Ala210 215 220Ala Ala Gln Leu Phe Glu Lys Trp Leu Glu Thr His Pro Met Pro Gln225 230 235 240Ala Leu Phe Thr Thr Ser Phe Ala Leu Leu Gln Gly Val Met Asp Val245 250 255Thr Leu Arg Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ser Asp Leu Ala Ile Ala Thr260 265 270Phe Gly Asp His Glu Leu Leu Asp Phe Leu Gln Cys Pro Val Leu Ala275 280 285Val Ala Gln Arg His Arg Asp Val Ala Glu Arg Val Leu Glu Ile Val290 295 300Leu Ala Ser Leu Asp Glu Pro Arg Lys Pro Lys Pro Gly Leu Thr Arg305 310 315 320Ile Arg Arg Asn Leu Tyr Arg Arg Gly Ile Leu Ser Arg Ser325 330
權利要求
1用于保護動物免受致病細菌感染或其致病作用的活減毒疫苗，其含有由于cra基因突變導致其不能表達功能性Cra蛋白的活減毒細菌，和藥學上可接受的載體。
2．如權利要求1所述的活減毒疫苗，其特征在于其中的致病細菌屬于埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，放線桿菌屬，嗜血桿菌屬，氣單胞菌屬，巴斯德氏菌屬，鏈球菌屬和耶爾森氏菌屬的任一種。
3．如權利要求1所述的活減毒疫苗，其特征在于活減毒細菌攜帶異源基因。
4．如權利要求3所述的活減毒疫苗，其特征在于其中的致病細菌屬于埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，放線桿菌屬，嗜血桿菌屬，氣單胞菌屬，巴斯德氏菌屬，鏈球菌屬和耶爾森氏菌屬中的任一種。
5．如權利要求1-4所述的活減毒疫苗，其特征在于含有佐劑。
6．如權利要求1-5所述的活減毒疫苗，其特征在于為凍干的形式。
7．由于cra基因突變導致其不能表達功能性Cra蛋白的活減毒細菌用于制備保護動物免受致病細菌感染或其致病作用的疫苗的用途。
8．如權利要求7的用途，其特征在于活減毒細菌攜帶異源基因。
9．權利要求1所述疫苗的制備方法，包括將活減毒細菌與藥學上可接受的載體混合。
10．用致病細菌免疫動物以抵抗感染的方法，包括給動物施用權利要求1所述的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作藥劑的活減毒細菌。本發(fā)明也涉及基于活減毒細菌,對阻止微生物發(fā)病有用的疫苗。另外,本發(fā)明涉及帶有異源基因的活減毒重組細菌及基于該細菌的疫苗。最后本發(fā)明涉及這些疫苗和細菌的制備方法。
文檔編號A61K39/02GK1325731SQ00121980
公開日2001年12月12日 申請日期2000年6月9日 優(yōu)先權日2000年6月9日
發(fā)明者P·S·科恩, D·C·勞克斯, P·J·M·努杰恩 申請人:阿克佐諾貝爾公司, 羅得島大學