專利名稱：雷公藤屬植物提取物在預防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥新用途，特別是一種雷公藤屬植物提取物在預防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的用途。
所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏神經(jīng)退行性疾病。
老年神經(jīng)退行性疾病是隨年齡增長而出現(xiàn)的以腦實質特定區(qū)域內(nèi)某些神經(jīng)元進行性壞死為主要特征，以學習記憶障礙或運動、行為、心理障礙為主要表現(xiàn)的一類神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其中以阿爾茨海默病(Alzheimer s disease，簡稱AD)和帕金森病(Parkinson s disease，簡稱PD)最為常見，致殘率高，對老年人健康的影響也最大。
所述PD是多發(fā)于中老年期的一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)錐體外系退行性疾病，病人多出現(xiàn)震顫、肌肉僵直、運動遲緩等癥狀。PD的主要病理學改變?yōu)橹心X黑質和黑質紋狀體通路的多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性壞死，導致紋狀體DA含量顯著減少。因此，補充DA的前體一左旋多巴(L-DOPA)可以緩解PD的癥狀。但L-DOPA本身不能延緩多巴胺能神經(jīng)元的進一步壞死，且有其它副作用，因此，人們一直試圖找到一種可以延緩DA能神經(jīng)元的變性壞死，對DA能神經(jīng)元有營養(yǎng)保護作用的藥物。
神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)是維持和促進神經(jīng)細胞正常生存、生長和分化，在神經(jīng)損傷情況下促進其再生的一類特定多肽或蛋白質。包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NCF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived ncurotrophic factor，BDNF)、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophic-3，NT-3)等。其中GDNF能較為特異性地營養(yǎng)和保護DA能神經(jīng)元，并可促進DA能神經(jīng)元的再生，成為當前預防和治療PD的一個熱點。
但NGF、GDNF、BDNF等均為大分子蛋白，不能透過血腦屏障，不宜外周給藥。解決這一難點的方法有兩個1、由工程細胞、腺病毒等載體將外源GDNF基因導入腦內(nèi)，使其長期表達、分泌GDNF蛋白，起到營養(yǎng)、保護和修復作用；2、尋找具有神經(jīng)營養(yǎng)作用或促進內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的小分子物質。
阿爾茨海默病，又稱老年性癡呆，是一種發(fā)生于中老年的原發(fā)性腦退行性疾病。臨床主要表現(xiàn)為認知和學習記憶功能障礙，甚至情感或人格方面的缺陷。AD主要病理改變?yōu)槔夏臧?又稱淀粉斑)、神經(jīng)纖維纏結和選擇性膽堿能神經(jīng)元及突觸丟失。病理解剖顯示，AD患者大腦的新皮質、海馬區(qū)、邁內(nèi)特基底核和藍斑核等部位的神經(jīng)元大量丟失，特別是皮層和海馬的乙酰膽堿能神經(jīng)的減少尤為顯著。
現(xiàn)代研究認為，乙酰膽堿(acetycholine，ACh)是促進學習記憶的神經(jīng)遞質，M-膽堿能突觸為記憶基礎。而膽堿能神經(jīng)元的退化被認為是造成癡呆的重要病理因素。因此，能阻止膽堿能神經(jīng)退化的藥物是未來AD治療的首選。已證明NGF能有效防止模擬AD病變的動物基底前腦膽堿能神經(jīng)元變性和死亡。但因NGF分子量大，口服或注射難以到達大腦。有人試圖用側腦室插管腦內(nèi)反復給予NGF，并收到了肯定的效果。為了解決反復腦內(nèi)給藥所帶來的問題，近年來，科研人員在努力尋找NGF給藥的可替代途徑，這些途徑包括1、腦內(nèi)移植基因工程化的NGF生成細胞；2、服用能促進腦內(nèi)NGF生物合成的藥物。
近年的研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(cyclosporin A，CsA)、FK506和Rapamycin(RAPA)等也具有神經(jīng)營養(yǎng)作用。Snyder等人的體外實驗研究表明，極微量(ng級)免疫抑制劑FK506和RAPA可以協(xié)同神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)的促PC12細胞軸索生長效應，使NGF誘發(fā)最佳軸索生長效應的有效濃度降低了20-50倍，半數(shù)最佳效應劑量也降至0.1ng/ml。在體外培養(yǎng)的鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞上，F(xiàn)K506單獨應用就可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)營養(yǎng)作用，認為其機制依然是憑借神經(jīng)節(jié)中的雪旺氏細胞等膠質細胞產(chǎn)生的NGF發(fā)揮作用。
體內(nèi)實驗也表明，CsA能夠減緩6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)在小鼠腦內(nèi)誘發(fā)的DA能神經(jīng)元的退變。同樣，F(xiàn)K506、CsA也能對抗MPTP誘導的C57/BLACK帕金森病模型小鼠腦中DA的耗竭。CsA和FK506都能明顯升高紋狀體中的DA和DOPAC的含量，具有顯著意義。二者中尤以FK506為著。CsA還能保護腦組織的缺血一再灌注損傷。
目前認為免疫抑制劑的神經(jīng)營養(yǎng)作用的機制在于，CsA、FK506、RAPA等分別作用于各自的胞內(nèi)受體，CsA對應的是環(huán)菲林(Cyclophilin，Cyp)。FK506和RAPA對應的是FK506結合蛋白(FK506 binding protein，F(xiàn)KBP)。免疫抑制劑特異地與FKBP、Cyp形成復合物，再與磷脂酶2B(Calcineurin，CaN)結合，抑制了此酶催化蛋白去磷酸反應的活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)CaN在腦內(nèi)影響了兩種酶的磷酸化過程1、一氧化氮合成酶(NOS)，NOS的磷酸化形式將會抑制它的催化活性，免疫抑制劑通過提高NOS的磷酸化程度而抑制NO的生成從而阻斷過量谷氨酸的神經(jīng)毒性作用；2、生長相關蛋白(GAP-43)。GAP-43參與了神經(jīng)元的生長過程并且其磷酸化形式能增強此種促生長作用。PC12細胞在NGF的刺激下可發(fā)生軸索延長。很低濃度(nmol級)的FK506就可提高細胞對NGF的敏感性，誘發(fā)PC12細胞的軸索生長效應，可將NGF的作用提高100倍。因此，選擇性抑制CaN某些作用底物的藥物，如GAP-43脫磷酸反應的抑制因子可能在治療神經(jīng)退行性病變中有著重大的潛在治療價值。
雷公藤為衛(wèi)矛科(Celastraceae)雷公藤屬植物，(Tripterygium WilfordiiHook.f)，雷公藤屬植物還包括昆明山海棠[T.Hypoglacum(Levl)Hutch]和黑蔓(T.Regelli Sprague et Tak)，均具有藥用價值。雷公藤含有生物堿、二萜、三萜、倍半萜等多種有效成份。其中，二萜類為主要活性成份，三萜和生物堿亦具活性。目前已知的雷公藤單體成分包括雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide)、雷公藤氯內(nèi)酯醇(tripc hlorolide)、雷公藤內(nèi)酯二醇(tripdiolide)、雷公藤內(nèi)酯三醇等二萜類化合物以及雷公藤紅素(tripterine)等三萜類化合物，見

圖1。
圖中，(1)為雷公藤內(nèi)酯醇，(2)為雷公藤氯內(nèi)酯醇，(3)為雷公藤內(nèi)酯三醇，(4)為雷公藤酮，(5)為雷公藤內(nèi)酯二醇，(6)為16-羥基雷公藤內(nèi)酯醇，(7)為雷公藤紅素。
雷公藤提取物具有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤及抗生育等多種藥理活性，特別是免疫抑制作用為其主要藥理活性。雷公藤提取的單體成分中免疫抑制活性最強的為雷公藤內(nèi)酯醇，其免疫抑制的ED50為0.06mg/kg。雷公藤煎劑、雷公藤“總甙”(TII)或雷公藤內(nèi)酯醇及雷公藤紅素對刀豆蛋白(concanavallin A，ConA)誘導的小鼠脾細胞分泌IL-2的作用均有明顯抑制作用。
此外，雷公藤的主要活性成分之一的雷公藤氯內(nèi)酯醇對小鼠脾NK細胞活性具有一種劑量依賴性的雙向調節(jié)作用，表明雷公藤并非只具有免疫抑制作用。
以前，臨床上主要將雷公藤總提取物用于治療類風濕性關節(jié)炎及慢性腎小球腎炎、腎病綜合征、過敏性紫癜腎炎等腎病。另外，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎、皮膚炎等結締組織病以及一些皮膚病均有一定療效。然而，將雷公藤總提取物或其單體成分作為神經(jīng)元保護劑，用于預防和治療老年神經(jīng)退化性疾病，迄今未見任何報道。
本發(fā)明的目的是提供一種雷公藤屬植物提取物在預防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的用途。
所述雷公藤屬植物提取物包括雷公藤內(nèi)酯醇、雷公藤氯內(nèi)酯醇、雷公藤內(nèi)酯二醇、雷公藤內(nèi)酯三醇、16-羥基雷公藤內(nèi)酯醇、雷醇內(nèi)酯、雷酚內(nèi)酯以及雷公藤紅素和雷公藤春堿中的一種或多種。
所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏神經(jīng)退行性疾病和脊髓損傷、脊髓側索硬化疾病。
所述雷公藤屬植物提取物與神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合使用，也用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。所述神經(jīng)營養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長因子、膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。
為了從天然藥物中尋找具有神經(jīng)保護和營養(yǎng)作用的免疫抑制劑，對目前臨床應用的有免疫抑制活性的多種單劑和復方天然藥物進行了評價，結果發(fā)現(xiàn)，天然藥用植物雷公藤提取物中的單體成分在離體和體內(nèi)實驗條件下均具有顯著的免疫抑制活性。進一步的體內(nèi)和體外研究表明，作為雷公藤提取物中的主要活性成分，雷公藤氯內(nèi)酯醇(以下簡稱968)對培養(yǎng)的DA能神經(jīng)元具有明顯的營養(yǎng)作用。與作為對照組的環(huán)孢菌素相比，968在較低濃度(0.001ng/ml)和較高濃度(0.1ng/ml)下，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)4天后，存活的DA能神經(jīng)元分別比對照組高87％和29％。另外低于10-13mol/L的968就可促進中腦神經(jīng)細胞的生長，軸突長度比對照組高出113％。968的神經(jīng)營養(yǎng)作用似乎并不局限于DA能神經(jīng)元，968在極低的濃度下就能促進原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細胞的突起延長。968的這種促軸突出生長作用對于PD、AD和脊髓損傷等疾病中神經(jīng)細胞間的突觸重新構建具有重要意義。
雷公藤氯內(nèi)酯醇的另一個重要特點是能夠拮抗一些神經(jīng)毒素對神經(jīng)細胞的損傷作用。環(huán)境毒素、內(nèi)源性毒素和興奮性神經(jīng)毒素是PD、AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要機制之一。實驗中發(fā)現(xiàn)(1)、1pM的雷公藤氯內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯醇(T10)都能拮抗DA能神經(jīng)毒素MPP+對PC12的毒性作用，對細胞的存活有明顯的保護作用；(2)、968能夠對抗大劑量的興奮性谷氨酸對原代皮層神經(jīng)元的損傷作用，有利于維護神經(jīng)細胞形態(tài)的完整性，降低由谷氨酸誘導的細胞凋亡；(3)、在整體動物實驗中發(fā)現(xiàn)968能有效阻止DA能神經(jīng)毒素MPTP誘導的小鼠腦內(nèi)DA能神經(jīng)元損傷。
下面結合附圖和具體實驗進一步描述本發(fā)明。
圖1顯示的是雷公藤提取物中主要的活性單體的化學結構。
圖2顯示的是不同濃度968對原代培養(yǎng)的大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元存活的影響。
計數(shù)的多巴胺能神經(jīng)元是指TH免疫組織化學陽性的細胞。每點數(shù)據(jù)為三組平行實驗的平均計數(shù)。
圖3顯示的是不同濃度968對原代培養(yǎng)的大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元存活百分率的影響。
圖4顯示的不同劑量968預處理對MPTP損毀的C57BL/6J小鼠紋狀體內(nèi)DA含量的影響。
圖5顯示的是不同劑量968預處理對MPTP損毀的C57BL/6J小鼠紋狀體內(nèi)DA代謝率(DOPAC+HVA/DA)的影響。
實驗一、雷公藤氯內(nèi)酯醇保護多巴胺能神經(jīng)元的體外研究取胎齡為14-17天的SD孕鼠，斷頭處死，取胚胎鼠中腦在24孔細胞培養(yǎng)板行中腦DA能神經(jīng)元原代培養(yǎng)。次日，換有血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基并加入不同濃度968(10、1、0.1、0.01、0.001ng/ml)。TH免疫組化法鑒定DA能神經(jīng)元的存活狀態(tài)。實驗發(fā)現(xiàn)，加入不同濃度的968后，在有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第四天，0.001、0.01、0.1ng/ml組的細胞數(shù)目分別為對照組的187％、148％、129％，NEWMAN-KEULS單因子方差分析具有顯著性(表1、圖2、圖3)。表中所列為平均值±標準誤，與對照組差別顯著性用*標出，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。結果說明968在有血清培養(yǎng)基中對體外培養(yǎng)的原代多巴胺能神經(jīng)元具有明確的營養(yǎng)作用。
表1不同濃度968對胎鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元(TH陽性神經(jīng)元)的保護作用。
對照組 968(ng/ml)n＝4分組n＝4 0.0010.01 0.1 1 10TH+神223±8.9 478±9.6** 357±10.3*289±7.3*279±15.6 220±8.3經(jīng)元數(shù)另外，在原代的無血清培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)968具有明確的DA能神經(jīng)元的營養(yǎng)作用，實驗組與對照組的神經(jīng)元數(shù)目沒有顯著性差別。這與CsA和FK506在無血清培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)有營養(yǎng)作用是一致的。實驗二 雷公藤氯內(nèi)酯醇保護多巴胺能神經(jīng)元的在體研究。
MPTP是一種特異性損傷DA能神經(jīng)的毒素，外周注射可透過血腦屏障，特異性損毀黑質一紋狀體多巴胺能神經(jīng)元。C57BL/6J小鼠，每天ip MPTP 30mg/kg體重，連注三天，可使紋狀體中DA含量的降低達到80％以上。
在968對C57/BLACK帕金森模型小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元保護作用的實驗中，我們共分8個組(1)N.S+N.S.組，作為空白對照；(2)N.S+MPTP，作為陰性對照；(3)-(7)組為不同濃度的968(10-6μg/kg體重-10-1μg/kg體重)實驗組；(8)CsA(10mg/kg體重)+MPTP，作為陽性對照組。
在MPTP損毀的前一天下注射一次968或生理鹽水；之后每天上午注射968或生理鹽水，下午注射MPTP或生理鹽水三天；再繼續(xù)每天一次注射968或生理鹽水至處死動物前一天，共注射11d。實驗用HPLC方法對小鼠紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物HVA(高香草酸)、DOPAC(二羥苯乙酸)的含量進行了檢測，并對DA、(HVA+DOPAC)/DA的比值進行了計算及統(tǒng)計學分析。
我們發(fā)現(xiàn)，0.01ng/ml濃度組的968能使小鼠紋狀體中DA的含量顯著地增高(圖4)；同時，(HVA+DOPAC)/DA的比值為所有組中最低(圖5)。HVA和DOPAC是DA在腦內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物。(HVA+DOPAC)/DA比值升高，說明DA的代謝速率增快，代謝產(chǎn)物生成增多，多見于DA能神經(jīng)元不完全損傷時。968能使(HVA+DOPAC)/DA的比值降低，說明其能減緩MPTP損傷鼠DA能神經(jīng)元中的DA代謝更新速率，從而有效地保護了神經(jīng)元的存活。對MPTP導致的帕金森小鼠中腦DA能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護作用。
表2 968預處理對MPTP損傷造成的C57BL/6J小鼠紋狀體多巴胺含量的影響(x±SE)968(ng/kg) CsA分組正常組 對照組0.0010.01 1 10 100 (10mg/kg)紋狀體多巴胺含量 5.01±0.32 0.98±0.11 0.96±0.03 0.97±0.23 1.32±0.21 2.44±0.31*1.37±0.13 1.34±0.11(ng/mg)從圖4可以看出0.01-0.1μg/kg的968能夠維持DA的正常代謝。
通過離體細胞實驗和在體動物實驗，我們發(fā)現(xiàn)968確實具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)效應。根據(jù)在有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基中968作用的不同，推測其機制可能是提高神經(jīng)元對血清中的神經(jīng)生長因子(NGF)等的敏感性，從而發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用的。實驗三 968對原代培養(yǎng)的胎鼠中腦神經(jīng)細胞突觸長度的影響。
胎齡16天的SD孕鼠取胎鼠中腦行原代神經(jīng)元培養(yǎng)，將中腦組織切碎、消化、吹散，使之成為單個細胞，以3×105個細胞/孔的密度種植在24孔培養(yǎng)板中。先用DMEM加入10％胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃、5％ CO2孵箱培養(yǎng)24小時，然后換成DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基，加入N2添加劑繼續(xù)培養(yǎng)(主要是抑制膠質細胞增生)，其它條件不變。同時加入10-15-10-6mol/L的968處理，每個劑量組4孔。72小時后，在倒置相差顯微鏡(200×)下觀察，并用圖像處理系統(tǒng)采集圖像，每孔采集4個視野，用圖像處理系統(tǒng)測量神經(jīng)細胞的軸突長度，軸突定義為每個細胞最長的突起，每個視里取軸突最長的8個細胞。每個劑量組所得數(shù)據(jù)合并，求平均值，計算標準偏差，列于下表(表3)。數(shù)據(jù)用ANOVA分析，并用Dunnet多重比較檢驗，與對照組差別有顯著性的用*標出，*p＜0.05，**p＜0.01。結果表明10-15-10-7mol/L968處理可明顯促進中腦神經(jīng)細胞的突起生長，軸突長度較之對照組長213％-150％，差別有顯著意義。說明968對神經(jīng)細胞的軸突生長具有促進作用，其有效濃度范圍寬，增加了將來臨床用藥劑量的選擇余地和用藥的安全性。
表3 不同濃度968處理對胎鼠中腦原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞突起長度的影響(X±SE)對照 968處理濃度(mol/L)組 10-1510-1410-1310-1210-1110-1010-910-810-710-6突起長85.9± 141.7± 141.8± 183.3± 168.5± 146.6± 156.8±128.8± 147.4±130.0±104.3±度(μm) 15.225.0** 25.1** 32.4** 29.8** 25.9** 27.2** 22.8* 26.1** 23.0* 18.4實驗四 968對原代培養(yǎng)的胎鼠中腦神經(jīng)細胞存活數(shù)目的影響胎鼠中腦原代培養(yǎng)的方法同實施例3，不同之處在于換成DMEM/F-12+1％N2培養(yǎng)基后，用968處理7天，于第8天吸走培養(yǎng)液，并用PBS沖洗。加入0.01％啶橙染色，在熒光顯微鏡(100×)下觀察，細胞核呈現(xiàn)綠色熒光，每孔取三個視野，用手動計數(shù)器計數(shù)。數(shù)據(jù)采用ANOVA分析，并用Dunnet多重比較檢驗，發(fā)現(xiàn)10-12-10-11mol/L 968處理組存活細胞數(shù)明顯高于對照組，說明968有助于神經(jīng)細胞的存活。
表4 不同濃度968處理對胎鼠中腦原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞存活的影響(x±SE)968濃度(mol/L)對照組10-1210-1110-1010-910-810-710-6細胞數(shù) 173±16.9 427±64.2**355±40.2**201±34.8 228±29.4 258±77.4 148±13.5 17.8±6.5實驗五 968可以拮抗多巴胺能神經(jīng)毒素MPP+對PC12細胞的毒性。
PC12細胞采用RPMI 1640+10％新生牛血清培養(yǎng)，然后以1.5×105的密度均勻地種植到96孔板中，待細胞貼壁良好后加入968或T10預處理2小時，然后在實驗組中加入多巴胺能神經(jīng)毒素MPP+60μmol/L損傷PC12細胞。我們在另外的實驗中已經(jīng)證明MPP+損傷PC12細胞的半數(shù)致死濃度(LC50)為60μmol/L。72小時后吸走培養(yǎng)基，每孔中加入0.5mg/ml的噻唑藍(MTT)100μl，37℃孵育4小時，此時原來黃綠色的MTT在活細胞所具有的琥珀酸酶的催化下形成藍色的顆粒，每孔中加入100μl助溶劑(異丙醇∶Triton X-100∶水＝5∶1∶4)，37℃搖床過夜使藍色顆粒完全溶解，用Bio-Rad ELISA讀板機，在490nm波長下檢測各孔的吸光度。同樣條件下吸光度與各孔的細胞數(shù)成正比。實驗組(包括對照組和968、T10處理組)的吸光度與MPP+未損傷組之比即為細胞的存活百分率。表5所列為每組8個孔的細胞存活率的平均值±標準偏差。*表示經(jīng)過ANOVA分析，繼之以Dunnet多重比較檢驗，與對照組差別有顯著性，*P＜0.05，**P＜0.01。結果表明10-9-10-7mol/L的968和T10處理具有拮抗MPP+對PC12的毒性作用，使細胞的存活率提高了約30％。
表5 968和T10在10％血清條件下對MPP+的PC12細胞毒性的拮抗作用(x+SE)藥物對照組藥物濃度(log mol/L)-12 -11 -10 -9-8-7T4(968) 74.3±2.74 74.1±2.49 89.3±3.20**92.4±4.57**88.3±1.50**59.9±4.59T1080.1±3.00*73.8±7.11 72.9±7.24 83.6±1.34**80.3±4.17*80.9±1.33*上述實驗是在RPMI1640+10％新生牛血清條件下的結果，為了排除血清在其中起的作用，我們降低了血清的濃度，由10％降為1％，其它條件不變，觀察了968和T10對PC12細胞存活的影響。數(shù)據(jù)列于表6。表6 968和T10在1％血清條件下對MPP+的PC12細胞毒性的拮抗作用(x+SE)濃度(log mol/L)藥物 對照組-13-12 -11 -10 -9 -8-7 -6-538.6± 71.2± 80.2± 71.2±61.7±70.0±78.6± 66.7±59.9±50.0±9682.5711.7**10.9**10.4**9.44*10.0**10.1**9.82**8.74*7.2665.2± 80.4± 86.8± 122.3± 129.8± 113.2± 117.0± 110.5± 62.8±T105.8816.314.212.1**11.2**10.0*11.2*14.0*4.44上述結果表明，在低濃度血清(1％)的條件下，968和T10依然具有拮抗MPP+毒性的作用。實驗六 968對谷氨酸誘發(fā)胎鼠大腦皮層神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用材料和方法1、鋪板于接種前2-3天，用12.5μg/ml多聚L-賴氨酸鋪板，6孔板，500μL/孔，24孔板400μL/孔，自然晾干。
2、接種培養(yǎng)無菌條件下分離孕期16-18d胎鼠大腦皮層置于預冷的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，仔細剔除軟腦膜和血管，將腦組織移至另一個含冰DMEM/F-12中(含體積分數(shù)為10％胎牛血清和10％馬血清)的小燒杯中，用尖頭拋光玻璃管輕輕吹打20-30次，直至全部腦組織分散成細胞懸液，并經(jīng)200目尼龍篩過濾除去未消化的組織塊，濾液用DMEM/F-12培養(yǎng)基，(10％胎牛血清，10％馬血清，100kU.L-1鏈霉素，pH7.2-7.4)，臺盤蘭染色后，在倒置相差顯微鏡下計數(shù)500個細胞，著色細胞為死細胞，并調整密度至1×109個.L-1。將0.5ml細胞懸液接種到12.5μg/ml的過夜處理的6孔培養(yǎng)板中，置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，24h后待細胞貼壁換液1次去除死細胞，以后每3-4d換液一次，第3天加入5-氟尿嘧啶(終濃度為10μmol.L-1)培養(yǎng)24h，以抑制非神經(jīng)元的增殖。繼續(xù)培養(yǎng)至第5d后開始實驗。
實驗結果1、968在有血清的培養(yǎng)基中對體外培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元有明顯的營養(yǎng)作用用不同濃度的968(10-13-10-7mol/L)在有血清(10％胎牛血清+10％馬血清)的DMEM/F-12孵育體外培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元(5d，Wistar乳鼠14-16d)，24h后固定并對細胞數(shù)目、突起長度和胞體面積進行顯微圖象分析。結果可見，胞體數(shù)目在24h內(nèi)無顯著變化，而胞體面積和突起長度在10-13-10-6各濃度均顯著增加。
表7 968在有血清條件下對胎鼠大腦皮層神經(jīng)元生長狀況的影響(x+SE)968濃度(log mol/L)對照組-13 -12 -11 -10 -9 -8 -767.67±3 66.40± 78.00± 74.00± 79.20± 85.3± 82.20± 42.67±細胞數(shù)8413.383.56 10.306.30 6.7212.9212.2840.27±2 83.70± 120.83± 110.63±103.92±97.10± 68.36± 43.46±胞體面積(μm2).97 3.07**6.18**2.83**4.04**2.81**2.48**2.4350.11±8 73.98± 79.16± 83.78± 99.79± 97.11±75.83± 68.19±突觸長度(μm).91 13.10**10.44**25.16**18.02**9.20**6.31**15.38**選取在含血清的培養(yǎng)基中神經(jīng)營養(yǎng)作用最顯著的三個濃度10-12，10-11，10-10mol/L的968孵育不含血清的DMEM/F-12(亦不含N2添加劑)中的原代皮層神經(jīng)元(5b，Wistar乳鼠14-16d)，24h后固定同時對細胞數(shù)目、突起長度和胞體面積進行顯微圖象分析。發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)目無明顯變化，而胞體面積顯著減小，突起長度也有一定的縮短。說明968在無血清的培養(yǎng)基中對體外培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元無營養(yǎng)作用。從機理上推測968是通過增強血清中NGF的營養(yǎng)作用發(fā)揮功能的。
2、968可以明顯對抗Glu誘導的原代皮層神經(jīng)細胞損傷首先將968(10-12-10-10mol/L)與體外培養(yǎng)的原代皮層細胞(5d)在DMEM/F-12+10％胎牛血清中共同孵育24h，以加入100ng/mlNGF作為陽性對照。然后加入250μmol/L的Giu作用30min，立即固定進行顯微圖象分析。Glu的興奮性神經(jīng)毒作用可以使細胞突觸縮短或缺失，而968可以顯著保護Glu引起的皮層神經(jīng)細胞的胞體面積和突起長度的減小。
表8 968對谷氨酸造成胎鼠皮層神經(jīng)細胞損傷的影響(x±SE)NGF 968濃度(log mol/L)對照組(100ng/ml) -12 -11 -10細胞數(shù)19.00±4.7342.20±3.88*28.67±3.18 31.00±4.01 32.33±2.75胞體面積(μm2) 50.98±4.7580.06±1.64**72.28±2.75**75.40±2.56**69.20±2.36**突觸長度(μm) 34.51±2.3559.94±2.01**49.02±2.75**49.19±1.45**39.49±1.29大量文獻報道，細胞凋亡是PD、AD等神經(jīng)退行性疾病中大量神經(jīng)元死亡的主要形式，而大劑量Glu處理可以誘導神經(jīng)細胞的凋亡，我們在原代培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)細胞中加入Glu 250μmol/L孵育30min誘導細胞凋亡，收集細胞，進行碘化丙啶(PI)熒光染色，用流式細胞儀檢測、分析凋亡細胞的百分率。發(fā)現(xiàn)Glu在給定濃度和作用時間下可以使38.9％的神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡，而10-10mol/L968處理組只有22.5％的細胞發(fā)生凋亡，與100ng/ml的NGF的作用相當(21.9％)。
表9 不同濃度968處理對谷氨酸誘導原代培養(yǎng)的胎鼠皮層神經(jīng)細胞凋亡的影響(x±SE)NGF968濃度(log mol/L)正常組 對照組(100ng/ml) -12-11 -10凋亡細胞百分率(％) 16.13±1.44 38.91±1.92 21.94±1.01**25.2±3.25**29.91±1.89**22.45±1.85**
權利要求
1.雷公藤屬植物提取物的用途，其特征是用于預防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
2.如權利要求1所述的用途，其特征是所述雷公藤屬植物包括雷公藤、昆明山海棠和黑蔓。
3.如權利要求1所述的用途，其特征是所述雷公藤屬植物提取物包括雷公藤內(nèi)酯醇、雷公藤氯內(nèi)酯醇、雷公藤內(nèi)酯二醇、雷公藤內(nèi)酯三醇、16-羥基雷公藤內(nèi)酯醇、雷醇內(nèi)酯、雷酚內(nèi)酯以及雷公藤紅素和雷公藤春堿中的一種或多種。
4.如權利要求1所述的用途，其特征是所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏神經(jīng)退行性疾病和脊髓損傷、脊髓側索硬化疾病。
5.如權利要求1所述的用途，其特征是雷公藤屬植物提取物與神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合使用，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。
6.如權利要求5所述的用途，其特征是所述神經(jīng)營養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長因子、膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。
全文摘要
本發(fā)明為一種雷公藤屬植物提取物在預防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏神經(jīng)退行性疾病和脊髓損傷、脊髓側索硬化疾病。雷公藤屬提取物中的單體成分在離體和體內(nèi)實驗條件下不僅具有顯著的免疫抑制活性,還對培養(yǎng)的DA能神經(jīng)元具有明顯的營養(yǎng)作用,可促進中腦神經(jīng)細胞的生長,促進原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細胞的突起延長,能夠拮抗環(huán)境毒素、內(nèi)源性毒素和興奮性神經(jīng)毒素對神經(jīng)細胞的損傷作用,對細胞的存活有明顯的保護作用。
文檔編號A61K31/56GK1276209SQ00107779
公開日2000年12月13日 申請日期2000年5月26日 優(yōu)先權日2000年5月26日
發(fā)明者王曉民, 韓濟生, 李豐橋, 馬端端, 蔣延文, 田如錦, 吳曉東 申請人:北京大學醫(yī)學部, 北京緯曉生物技術開發(fā)有限責任公司