專利名稱：一種微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于煙草加工技術領域，涉及一種微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙草薄片基礎物料--煙梗纖維素的方法。
背景技術：
目前煙草薄片的生產方法，有輥壓法、稠漿法和造紙法。以造紙法最為流行，如圖1 所示的造紙法煙草薄片生產工藝流程。但是造紙法中的機械磨漿和浸提工藝的能耗較高； 有的浸提技術需要耗用有機溶劑。不僅增加成本，且污染環(huán)境。煙草薄片中蛋白質含量過高，香氣不足，雜氣較大。而殘留在煙草薄片中的高含量蛋白質使得煙氣有燒焦的蛋白味， 使煙氣帶有不良氣味。造成這一問題的主要原因是在造紙法生產煙草薄片的過程中，采用的是物理_化學方法，蛋白質、果膠、淀粉等物質無法被有效降解成水溶性物質，這些大分子物質在機械磨漿過程中，仍與纖維素類物質緊密結合，從而殘留于煙草薄片中。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種以煙梗為原料，通過微生物固態(tài)發(fā)酵法處理煙梗，并采用生物降解煙梗制備煙草薄片基礎物料——煙梗纖維素的新方法。該新方法比現(xiàn)有的煙草薄片的造紙法更加節(jié)能，工藝相對簡單、設備投資較小，且與其它技術相配合可提高煙草薄片的綜合質量。本發(fā)明選擇高產蛋白酶、果膠酶、木質素酶、淀粉酶等復合酶的微生物，以煙梗、煙末和碎煙葉為原料，制備微生物種子，所制備的微生物種子接種到煙梗中，進行固態(tài)發(fā)酵， 發(fā)酵后的煙梗，富含復合酶，發(fā)酵后的煙梗在緩沖液中浸泡并進行更為徹底的酶解，進一步酶解后的煙梗，蛋白質、木質素、果膠質等大分子物質被降解成小分子物質，與煙梗中的纖維素類物質易于分離，再經攪拌打漿，并經過過濾、離心，可得到水溶性浸出物及水不溶性的煙草纖維類物質。本發(fā)明的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙草薄片基礎物料——煙梗纖維素的方法，依次經微生物種子培養(yǎng)步驟(如圖2所示)、微生物發(fā)酵煙梗步驟和煙梗纖維素的分離步驟(如圖3所示)，獲得所述煙梗纖維素；所述微生物種子培養(yǎng)步驟以黑曲霉為發(fā)酵微生物，采用液態(tài)種子逐級培養(yǎng)或固態(tài)種子逐級培養(yǎng)獲得一級、二級或三級微生物種子，所述微生物發(fā)酵煙梗步驟包括煙梗的固態(tài)發(fā)酵步驟和煙梗的浸泡酶解步驟。本發(fā)明所述微生物種子培養(yǎng)步驟，具體包括如下步驟(1)選擇黑曲霉為發(fā)酵微生物。所述微生物黑曲霉(Aspergillus niger)是食品和飼料工業(yè)常用菌種，如，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)保藏并提供的CICC40431-黑曲霉。(2)將黑曲霉經PDA斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)成熟后，制備孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中孢子的濃度不低于107個/ml。
所述PDA斜面培養(yǎng)基活化 培養(yǎng)為采用PDA斜面培養(yǎng)基，劃線接種后在30°C _32°C 培養(yǎng)5天，獲得成熟的黑曲霉孢子。所述孢子懸浮液采用包括如下步驟的方法制得在培養(yǎng)成熟的茄子瓶斜面菌種中加入無菌水，用接種鏟或接種針將孢子刮下；將孢子懸浮液移到一個含玻璃珠的無菌三角瓶中；打散后獲得孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中的孢子濃度不得低于IO7個/mL。如在8X24cm的茄子瓶斜面菌種中加入無菌水的量為60mL。(3)將孢子懸浮液采用液態(tài)逐級擴大培養(yǎng)或固態(tài)逐級擴大培養(yǎng)，依次獲得黑曲霉一級種子液、二級種子液和三級種子液，或者依次獲得黑曲霉一級種子液、二級固態(tài)種子和三級固態(tài)種子。較佳的，步驟(3)中，所述黑曲霉一級種子液、二級種子液和三級種子液采用包括如下步驟的方法制得a)在煙梗粉末和碎煙葉末中加水配成一級種子培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后，再將孢子懸浮液接入所述一級種子培養(yǎng)基中，然后經30-32°C搖瓶培養(yǎng)2-3天獲得黑曲霉一級種子液；優(yōu)選的，步驟a)中，所述一級種子培養(yǎng)基為含水量為85-95% (重量百分含量)的煙梗粉末和碎煙葉末培養(yǎng)基；進一步的，所述一級種子培養(yǎng)基為含水量為90-92% (重量百分含量)的煙梗粉末和碎煙葉末培養(yǎng)基。優(yōu)選的，步驟a)中，所述滅菌的溫度如為121°C，滅菌時間如為20-30min ；冷卻至如 30 0C οb)將黑曲霉一級種子液依次擴級培養(yǎng)獲得黑曲霉二級種子液和黑曲霉三級種子液，其中，培養(yǎng)黑曲霉二級種子液的培養(yǎng)基和培養(yǎng)黑曲霉三級種子液的培養(yǎng)基均為煙梗粉末和碎煙葉末中加水配成的培養(yǎng)基。所述黑曲霉一級種子液擴級培養(yǎng)黑曲霉二級種子液和黑曲霉三級種子液采用三角瓶或種子罐培養(yǎng)。其中，所述一級種子液和二級種子液接入到下一級種子液的培養(yǎng)基中的接種量為10-30% (以培養(yǎng)基重量為基準)；進一步的，所述一級種子液和二級種子液接入到下一級種子液的培養(yǎng)基中的接種量為20-30% (以培養(yǎng)基重量為基準)。優(yōu)選的，步驟b)中，所述黑曲霉二級和三級種子液的培養(yǎng)基為含水量為85-95% (重量百分含量)的煙梗粉末和碎煙葉末。進一步的，所述二級和三級種子液培養(yǎng)基的含水量為90-92% (重量百分含量)。較佳的，步驟(3)中，所述黑曲霉一級種子液、二級固態(tài)種子和三級固態(tài)種子采用包括如下步驟的方法制得A)在煙梗粉末和碎煙葉末中加水配成一級種子培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后，再將孢子懸浮液接入所述一級種子培養(yǎng)基，然后經30-32°C搖瓶培養(yǎng)2-3天獲得黑曲霉一級種子液；優(yōu)選的，步驟A)中，所述一級種子培養(yǎng)基為含水量為85-95% (重量百分含量)的煙梗粉末和碎煙葉末。進一步的，所述一級種子培養(yǎng)基的含水量為90-92% (重量百分含
量)O優(yōu)選的，步驟A)中，所述滅菌的溫度如為121°C，滅菌時間如為20-30min ；冷卻至如 30 0C οB)將黑曲霉一級種子液接入到含水量為20-40% (重量百分含量)的煙梗粉末培養(yǎng)基中，接種量為培養(yǎng)基重量的20-40%，攪勻，經三角瓶培養(yǎng)獲得黑曲霉二級固態(tài)種子，其中三角瓶培養(yǎng)的溫度為30°C-32°C，培養(yǎng)時間為4-6天。進一步的，所述黑曲霉二級固態(tài)種子的獲得時，接入的黑曲霉一級種子液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的20-30%。C)在黑曲霉二級固態(tài)種子中加入0.5-1. 5倍重量的無菌水，攪勻，接入到含水量為20-40% (重量百分含量)的煙梗粉末中，接種量為培養(yǎng)基重量的20-40%，攪勻，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中經淺盤培養(yǎng)獲得黑曲霉三級固態(tài)種子，其中淺盤培養(yǎng)的溫度為30°C -35 培養(yǎng)時間為4-6天。進一步的，所述在黑曲霉二級固態(tài)種子中加入1-1. 5倍重量的無菌水。 進一步的，所述黑曲霉三級固態(tài)種子的獲得時，接入的黑曲霉二級種子液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的20-30%。本發(fā)明所述煙梗的固態(tài)發(fā)酵步驟，具體包括如下步驟 (1)取煙梗，加水浸泡至少4h后，去除自由水得到濕基煙梗作為發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，濕基煙梗中水和煙梗的質量比為0.5-1. 2 1，接種黑曲霉二級種子液或三級種子液， 或者接種黑曲霉二級固態(tài)種子或三級固態(tài)種子，采用固態(tài)發(fā)酵法在30-35°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵4-5天，其中發(fā)酵時通風量為l-2vvm。較佳的，所述濕基煙梗中水和煙梗的質量比為 0.6-1.0 1。其中，黑曲霉二級種子液或三級種子液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10-30% ；或者黑曲霉二級固態(tài)種子或三級固態(tài)種子的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10-30%。所述接種的種子的級數(shù)則根據(jù)發(fā)酵生產的規(guī)模而定。進一步的，所述黑曲霉二級種子液或三級種子液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的15-25% ；或者黑曲霉二級固態(tài)種子或三級固態(tài)種子的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的 15-25%。較佳的，所述固態(tài)發(fā)酵時，可采用各種規(guī)格的強制通風，如采用間歇攪拌式的厚層通風發(fā)酵類型的反應器，在通風發(fā)酵池中，通風量為l-2vvm。(2)發(fā)酵結束后，分離除去孢子，獲得發(fā)酵后的煙梗。較佳的，發(fā)酵結束后，為除去煙梗上含有的大量的微生物孢子，通過分離裝置分離收集孢子；其中，小規(guī)模的分離收集孢子時可采用真空抽吸，大規(guī)模的分離收集孢子時可采用袋式除塵裝置。本發(fā)明所述煙梗的浸泡酶解步驟，具體包括如下步驟將發(fā)酵后的煙梗浸泡于檸檬酸與水配成的緩沖液中進行酶解，獲得酶解后的煙梗漿液；其中檸檬酸緩沖液與發(fā)酵后的煙梗濕基的重量比為1-1. 5 1，檸檬酸緩沖液的摩爾濃度為 0. 05-0. 2mol/L, pH 為 3. 5-5. 5。所述發(fā)酵后的煙梗濕基與水的配比以能順利進行機械攪拌為度。較佳的，所述浸泡酶解在20 50r/min.低速攪拌情況下，在30_55°C的保溫條件下，浸泡并酶解12-36h。本發(fā)明所述煙梗纖維素的分離步驟，具體包括如下步驟將酶解后的煙梗漿液加水進一步打漿、過濾或壓濾分離出煙梗纖維素，然后依次經水洗、40-60 V條件下烘干后，獲得所述煙草薄片基礎物料——煙梗纖維素。所述酶解后的煙梗漿液進一步打漿，可根據(jù)攪拌的需要加入適量的水，在罐內用攪拌器或攪拌槳進一步打成含纖維渣的漿液。
優(yōu)選的，所述過濾或壓濾采用孔徑為2_3mm的過濾器。 所述過濾或壓濾分離出煙梗纖維素和濾液，如可采用如下的步驟方法在一罐內安置一帶孔篩網容器，其篩網的孔徑為2_3mm，頂部空，自流或機械輸送含煙梗纖維素的漿液進入帶孔篩網容器內，在攪拌下，使?jié){液從篩孔中流下，保留煙梗纖維素在篩網容器內。必要時用清水洗滌過濾或壓濾后的煙梗纖維素；所得到的煙梗纖維素粗品可進一步采用適量水清洗，浙干，最后在40-60°C下烘干。本發(fā)明的有益效果如下在傳統(tǒng)的造紙法煙草薄片工藝中，機械磨漿和浸提工藝的能耗較高；有的浸提技術需要耗用有機溶劑。不僅增加成本，且污染環(huán)境。煙草薄片中蛋白質、果膠、淀粉等大分子物質含量過高，香氣不足，雜氣較大。本發(fā)明利用微生物發(fā)酵法來處理煙草原料，主要是基于生物酶解作用，在較溫和的條件下，對煙草原料(包括煙梗、煙末、碎煙和低次煙葉)中的蛋白質、果膠、木質素等物質進行有針對性的生物轉化。具有工藝相對簡單，節(jié)省能源、減少設備投資、提高煙草薄片綜合質量的優(yōu)點。本發(fā)明通過選擇合適的微生物黑曲霉，黑曲霉產生的復合酶及各種霉的配比以及各級培養(yǎng)基及其配比能使煙草中的纖維類物質不分解或少量分解。而且發(fā)酵條件相對溫和，對纖維類物質的破壞作用很小，不會使纖維帚化或變短。通過選擇合適的發(fā)酵用微生物，有針對性地水解煙草中的果膠、蛋白質和淀粉等大分子物質。煙草中的蛋白質、果膠和淀粉被酶解后所產生的氨基酸、還原糖等小分子物質，被轉移到水溶液中，故可大幅降低煙草薄片中蛋白質、果膠和淀粉等大分子的殘留量。


圖1傳統(tǒng)的造紙法生產煙草薄片的工藝流程圖2微生物種子培養(yǎng)步驟的工藝流程圖3微生物發(fā)酵煙梗步驟和煙梗纖維素的分離步驟的工藝流程圖4黑曲霉固態(tài)發(fā)酵煙梗實驗圖5黑曲霉固態(tài)發(fā)酵煙梗經清洗后所得的煙梗纖維素(不同時間)圖6固態(tài)發(fā)酵時間對果膠降解的影響圖7黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后分離水洗后得到的煙梗纖維素圖8孔徑對過濾的影響圖9固態(tài)發(fā)酵試驗裝置圖10煙梗殘渣浸泡和過濾操作圖11黑曲霉固態(tài)發(fā)酵煙梗，分離并水洗后得到的煙梗纖維素圖12實施例2中煙梗纖維素的固態(tài)發(fā)酵、浸泡酶解和煙梗纖維素的分離實驗流程
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1發(fā)酵時間對煙梗收率及殘余果膠含量的影響
固態(tài)發(fā)酵方法在滅菌過的IOOOml三角瓶中，加50g煙梗，加水30mL，接種黑曲霉二級種子液20mL，置于30°C固態(tài)培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)32h、38h、44h、50h、56h、62h，發(fā)酵結束后用0. lmol/L, pH為4. 4的檸檬酸緩沖水溶液浸泡24h，將發(fā)酵煙梗搓爛，用清水清洗，篩網過濾去除菌體以及雜物，剩余煙梗殘渣置于40°C環(huán)境中烘干，測其重量，計算得率。不同發(fā)酵時間對煙梗殘渣收率的影響如表1所示，發(fā)酵中的煙梗如圖4所示。發(fā)酵不同時間的煙梗殘渣由圖5所示。由表1可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，煙梗殘渣得率總體趨勢是下降的(排除洗滌程度以及其他因素)。從圖5可看出，隨著發(fā)酵時間的增加， 煙梗殘渣的顏色逐漸變淺，當用水清洗后，可見絲狀纖維素。表1煙梗固態(tài)發(fā)酵時間對得率的影響
發(fā)酵時間(h) 接種前煙梗干重(g)發(fā)酵后煙梗干重(g)得率(％「
325011.7523.50
385015.8031.60445010.3720.74 50507.3514.70 56505.7411.48
_62_50_6JO_12.20 再次進行黑曲霉固態(tài)發(fā)酵煙梗實驗，取培養(yǎng)好的種子液于煙梗培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)，每隔Id取樣測定煙梗殘渣及其果膠含量，結果如圖6所示。由圖6可知，果膠含量隨著發(fā)酵時間呈下降趨勢，到第4天時，煙梗殘渣的果膠含量降至6. 43%，之后不再下降，基本穩(wěn)定在6. 40%左右。煙梗殘渣的收率約12% (以發(fā)酵前煙梗干重為基準)。由于煙梗經固態(tài)發(fā)酵之后結構發(fā)生變化，煙梗的骨架被破壞，由棒狀變成絲狀，果膠含量也基本不變，因此4d的固態(tài)發(fā)酵時間基本上可達到目的。發(fā)酵后的煙梗殘渣經水洗后，可得到雜質較少的煙梗纖維素，如圖7所示。實施例2煙梗的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵綜合實驗進行小型固態(tài)發(fā)酵罐通風發(fā)酵煙梗實驗，菌種采用黑曲霉。(1)孢子懸浮液的制備選擇黑曲霉為發(fā)酵微生物，采用PDA斜面培養(yǎng)基，劃線接種后在30°C培養(yǎng)5天，獲得成熟的黑曲霉孢子。在培養(yǎng)成熟的茄子瓶(8X24cm)斜面菌種中加入無菌水60mL，用接種鏟將孢子刮下；將孢子懸浮液移到一個含玻璃珠的無菌三角瓶中；打散后獲得孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中的孢子濃度不低于IO7個/mL。(2)黑曲霉一級、二級、三級種子液的制備在121°C滅菌30min的IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，加入煙梗粉末8g，碎煙葉末IOgJn 70°C的水200mL，保溫30min ；然后冷卻至30°C備用；接入斜面種子孢子懸浮液 40mL，搖瓶150r/min，30°C培養(yǎng)2天，獲得黑曲霉一級種子液。將黑曲霉一級種子液依次經種子罐擴級培養(yǎng)獲得黑曲霉二級種子液和黑曲霉三級種子液。以黑曲霉一級種子液為種子，在滅菌后的種子培養(yǎng)容器內，加入適量65°C的水、 煙梗粉末(含量為40g/L)、碎煙葉末(含量為50g/L)；保溫30min后，冷卻至30°C備用；接入占培養(yǎng)基重量20%的黑曲霉一級種子液，通風量控制為l-2vvm，攪拌轉速為150r/m，在30°C下培養(yǎng)2天，獲得黑曲霉二級種子液。以黑曲霉二級種子液為種子，按照黑曲霉二級種子液的制備步驟制備黑曲霉三級種子液。(3)煙梗的固態(tài)發(fā)酵煙梗的固態(tài)發(fā)酵接種方法可采用液體種子，也可采用固態(tài)種子。種子的級數(shù)二級或三級根據(jù)發(fā)酵規(guī)模而定。取500g煙梗，加水300mL浸泡4h后，接種黑曲霉三級種子液120mL。采用固態(tài)發(fā)酵法在30°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵5天，其中采用間歇攪拌式的厚層通風發(fā)酵類型的反應器， 在通風發(fā)酵罐中，發(fā)酵時通風量控制為l-2vvm;其中，黑曲霉種子液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的15%。發(fā)酵結束后，采用現(xiàn)有常規(guī)的分離裝置分離收集孢子，并除去孢子，獲得發(fā)酵后的煙梗。其中固態(tài)發(fā)酵裝置如圖9所示。(4)煙梗的浸泡酶解將發(fā)酵后的煙梗浸泡于檸檬酸緩沖液中進行酶解，獲得酶解后的煙梗漿液；其中檸檬酸緩沖液與發(fā)酵后的煙梗濕基的重量比為1 1，檸檬酸緩沖液的摩爾濃度為0. Imol/ L，pH*4.4。且浸泡酶解在30r/min.的低速攪拌情況下，在45°C的保溫條件下，浸泡并酶解 24h。(5)煙梗纖維素的分離 將酶解后的煙梗漿液加水打漿，采用孔徑為2mm的篩網過濾去除菌體以及雜物， 分離出煙梗纖維素，然后依次采用2倍的清水對煙梗纖維素的粗品進行水洗，在40°C條件下烘干后，獲得所述煙草薄片基礎物料——煙梗纖維素，74g，收率為14. 8%。其中煙梗殘渣的浸泡、過濾操作如圖10所示。上述煙梗纖維素的固態(tài)發(fā)酵、浸泡酶解和煙梗纖維素的分離實驗流程如圖12所
7J\ ο發(fā)酵并酶解后的煙梗纖維素與液體的分離煙梗纖維素與發(fā)酵液液體的分離屬于固液分離，固液分離一般有兩種方式即離心與過濾。由于煙梗中果膠被降解后，發(fā)酵液變得粘稠，本實施例選擇過濾法進行煙梗纖維素與發(fā)酵液的分離。而使用過濾的方法，過濾介質的孔徑就顯得尤為重要，因為發(fā)酵液較為粘稠，孔徑過小會造成過濾非常困難，而過大則會造成部分煙梗進入濾液，造成煙梗纖維素回收率的下降。分別選取孔徑為0. 5mm、lmm、2mm、 3mm的不銹鋼絲網作過濾介質，進行過濾實驗，以回收率與濾液體積為指標，結果如圖8。由圖8可知，孔徑越大，過濾效果越好。但是用孔徑為3mm的過濾介質時，會在濾液中發(fā)現(xiàn)部分梗絲，說明3mm的孔徑對于煙梗絲來說有點大。而孔徑小于2mm時，煙梗纖維素會將小孔堵塞，造成過濾困難，濾渣中還有部分液體附著在煙梗纖維素上。采用孔徑2mm 的過濾介質，在自然壓力下，煙梗纖維素與液體可以得到較好的分離，因此選擇2mm作為過濾介質所用孔徑。煙梗纖維素的純化經過初步固液分離后，可以得到煙梗纖維素與液體基本分離， 但是煙梗纖維素表面還附著少許粘稠狀的液體，這些液體中包含果膠降解物、纖維素降解物、微生物及其代謝產物等，所以要得到純凈的煙梗纖維素，首先要去除這些粘稠狀的液體，本實施例分別采用加熱法與加水稀釋法來去除附著在煙梗纖維素表面的粘稠狀液體。 研究結果顯示，加熱法并不能使液體粘度下降，從而有利于煙梗絲的純化。這可能是由于加熱法是通過高溫增加物質溶解度的原理來降解液體粘度的，而在本實施例中造成液體粘稠的物質不溶于水，加熱并不 能使這些物質溶于水中，因此加熱法不適合本實施例。加水稀釋法可以顯著改變液體的粘度，從而有利于去除煙梗纖維素表面的粘稠狀液體，實驗結果表明，過濾后的煙梗纖維素用2倍的清水洗滌，即可將表面粘稠狀物質去除，得到純凈的煙梗絲，因此本實施例選用加水稀釋法來實現(xiàn)煙梗纖維素的純化。水洗并烘干后的煙草纖維素見圖11。經檢測，本實施例所得的煙梗殘渣的果膠含量為6. 2%,由于發(fā)酵條件相對溫和， 對纖維類物質的破壞作用很小，不會使煙梗纖維帚化或變短；發(fā)酵后的煙梗骨架被破壞，由棒狀變成絲狀；煙梗中的蛋白質、果膠和淀粉被發(fā)酵、酶解后產生的氨基酸、還原糖等小分子物質轉移到水溶液中，發(fā)酵后的煙梗殘渣再經過濾、水洗后可得到蛋白質、果膠和淀粉等大分子雜質更少的煙梗纖維素。實施例3煙梗的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵綜合實驗進行了小型固態(tài)發(fā)酵罐通風發(fā)酵煙梗實驗，菌種采用黑曲霉。(1)孢子懸浮液的制備選擇黑曲霉為發(fā)酵微生物，采用PDA斜面培養(yǎng)基，劃線接種后在32°C培養(yǎng)5天，獲得成熟的黑曲霉孢子。在培養(yǎng)成熟的茄子瓶(8X24cm)斜面菌種中加入無菌水60mL，用接種鏟將孢子刮下；將孢子懸浮液移到一個含玻璃珠的無菌三角瓶中；打散后獲得孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中的孢子濃度為IO7個/mL。(2)黑曲霉一級、二級、三級種子液的制備在121°C滅菌30min的IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，加入煙梗粉末8g，碎煙葉末IOgJn 70°C的水200mL，保溫30min ；然后冷卻至30°C備用；接入斜面種子孢子懸浮液 40mL，搖瓶150r/min，32°C培養(yǎng)2天，獲得黑曲霉一級種子液。將黑曲霉一級種子液依次經種子罐擴級培養(yǎng)獲得黑曲霉二級種子液和黑曲霉三級種子液。以黑曲霉一級種子液為種子，在空罐滅菌后的種子罐內，加入適量65°C的水、煙梗粉末(含量為40g/L)、碎煙葉末(含量為50g/L)；保溫30min后，冷卻至30°C備用；接入占培養(yǎng)基重量30%的黑曲霉一級種子液，通風量控制為l-2vvm，攪拌轉速為150r/m，在 32°C下培養(yǎng)2天，獲得黑曲霉二級種子液。以黑曲霉二級種子液為種子，按照黑曲霉二級種子液的制備步驟制備黑曲霉三級種子液。(3)煙梗的固態(tài)發(fā)酵煙梗的固態(tài)發(fā)酵接種方法可采用液體種子，也可采用固態(tài)種子。種子的級數(shù)二級或三級根據(jù)發(fā)酵規(guī)模而定。取500g煙梗，加水300mL浸泡4h后，接種黑曲霉三級種子液200mL采用固態(tài)發(fā)酵法在33°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵4天，其中采用間歇攪拌式的厚層通風發(fā)酵類型的反應器，在通風發(fā)酵池罐中，發(fā)酵時通風量控制為l-2vvm;其中，控制黑曲霉種子液的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的25%。發(fā)酵結束后，采用現(xiàn)有常規(guī)的分離裝置分離收集孢子，并除去孢子，獲得發(fā)酵后的煙梗。(4)煙梗的浸泡酶解將發(fā)酵后的煙梗浸泡于檸檬酸緩沖液中進行酶解，獲得酶解后的煙梗漿液；其中檸檬酸緩沖液與發(fā)酵后的煙梗濕基的重量比為1.5 1，檸檬酸緩沖液的摩爾濃度為0. 2mol/L, pH為3. 5。且浸泡酶解在50r/min.的低速攪拌情況下，在30°C的保溫條件下， 浸泡并酶解36h。 (5)煙梗纖維素的分離將酶解后的煙梗漿液加水打漿，采用孔徑為2_3mm的篩網過濾去除菌體以及雜物，分離出煙梗纖維素，然后依次采用2倍的清水對煙梗纖維素的粗品進行水洗，在60°C條件下烘干后，獲得所述煙草薄片基礎物料——煙梗纖維素，71g，收率為14. 2%。隨著水洗程度的加大，纖維純度越高，纖維中所含雜質含量越低。經檢測，本實施例所得的煙梗殘渣的果膠含量為6. 2%,由于發(fā)酵條件相對溫和， 對纖維類物質的破壞作用很小，不會使煙梗纖維帚化或變短；發(fā)酵后的煙梗骨架被破壞，由棒狀變成絲狀；煙梗中的蛋白質、果膠和淀粉被發(fā)酵、酶解后產生的氨基酸、還原糖等小分子物質轉移到水溶液中，發(fā)酵后的煙梗殘渣再經過濾、水洗后可得到蛋白質、果膠和淀粉等大分子雜質更少的煙梗纖維素。實施例4煙梗的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵綜合實驗進行小型固態(tài)發(fā)酵罐通風發(fā)酵煙梗實驗，菌種采用黑曲霉。(1)孢子懸浮液的制備選擇黑曲霉為發(fā)酵微生物，采用PDA斜面培養(yǎng)基，劃線接種后在32°C培養(yǎng)5天，獲得成熟的黑曲霉孢子。在培養(yǎng)成熟的茄子瓶(8X24cm)斜面菌種中加入無菌水60mL，用接種鏟將孢子刮下；將孢子懸浮液移到一個含玻璃珠的無菌三角瓶中；打散后獲得孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中的孢子濃度為IO7個/mL。(2)黑曲霉一級種子液、二級固態(tài)種子、三級固態(tài)種子的制備—級種子液的制備在121°C滅菌30min的IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，加入煙梗粉末10g，碎煙葉12g，加70°C的水200mL，保溫30min ；然后冷卻至30°C備用；接入斜面種子孢子懸浮液 40mL，搖瓶150r/min，30°C培養(yǎng)2天，獲得黑曲霉一級種子液。煙梗用粉碎機粉碎，用30目篩過濾后，加無菌水進行調配，得到煙梗粉末培養(yǎng)基；將黑曲霉一級固態(tài)種子接入到含水量為30 %的煙梗粉末培養(yǎng)基中，接入的種子量為培養(yǎng)基重量的20%，攪勻，經三角瓶培養(yǎng)獲得黑曲霉二級種子，其中三角瓶培養(yǎng)的溫度為 30°C°C，培養(yǎng)時間為6天。在黑曲霉二級固態(tài)種子中加入1倍重量的無菌水，接入到含水量為20%的煙梗粉末中，接入的種子量為培養(yǎng)基重量的30%，攪勻，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中經淺盤培養(yǎng)獲得黑曲霉三級種子，其中淺盤培養(yǎng)的溫度為30°C，培養(yǎng)時間為6天。(3)煙梗的固態(tài)發(fā)酵煙梗的固態(tài)發(fā)酵接種方法可采用液體種子，也可采用固態(tài)種子。種子的級數(shù)二級或三級根據(jù)發(fā)酵規(guī)模而定。取500g煙梗，加水500mL浸泡4h后，接種黑曲霉三級固態(tài)種子其中，黑曲霉三級固態(tài)種子的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的15%。采用固態(tài)發(fā)酵法在35°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵4 天，其中采用間歇攪拌式的厚層通風發(fā)酵類型的反應器，在通風發(fā)酵池罐中，發(fā)酵時通風量控制為l-2vvm。發(fā)酵結束后，采用現(xiàn)有常規(guī)的分離裝置分離收集孢子，并除去孢子，獲得發(fā)酵后的煙梗。其中固態(tài)發(fā)酵裝置如圖9所示。(4)煙梗的浸泡酶解將發(fā)酵后的煙梗浸泡于檸檬酸緩沖液中進行酶解，獲得酶解后的煙梗漿液；其中檸檬酸緩沖液與發(fā)酵后的煙梗濕基的重量比為1.3 1，檸檬酸緩沖液的摩爾濃度為 0. 05mol/L,pH為5. 5。且浸泡酶解在20r/min.的低速攪拌情況下，在55°C的保溫條件下， 浸泡并酶解12h。(5)煙梗纖維素的分離將酶解后的煙梗漿液加水打漿，采用孔徑為2_3mm的篩網過濾去除菌體以及雜物，分離出煙梗纖維素，然后依次采用2倍的清水對煙梗纖維素的粗品進行水洗，在60°C條件下烘干后，獲得所述煙草薄片基礎物料——煙梗纖維素，74g，收率為14. 8%。經檢測，本實施例所得的煙梗殘渣的果膠含量為6. 2%,由于發(fā)酵條件相對溫和， 對纖維類物質的破壞作用很小，不會使煙梗纖維帚化或變短；發(fā)酵后的煙梗骨架被破壞，由棒狀變成絲狀；煙梗中的蛋白質、果膠和淀粉被發(fā)酵、酶解后產生的氨基酸、還原糖等小分子物質轉移到水溶液中，發(fā)酵后的煙梗殘渣再經過濾、水洗后可得到蛋白質、果膠和淀粉等大分子雜質更少的煙梗纖維素。實施例5煙梗的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵綜合實驗進行小型固態(tài)發(fā)酵罐通風發(fā)酵煙梗實驗，菌種采用黑曲霉。(1)孢子懸浮液的制備選擇黑曲霉為發(fā)酵微生物，采用PDA斜面培養(yǎng)基，劃線接種后在32°C培養(yǎng)5天，獲得成熟的黑曲霉孢子。在培養(yǎng)成熟的茄子瓶(8X24cm)斜面菌種中加入無菌水60mL，用接種鏟將孢子刮下；將孢子懸浮液移到一個含玻璃珠的無菌三角瓶中；打散后獲得孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中的孢子濃度為IO7個/mL。(2)黑曲霉一級種子液、二級固態(tài)種子、三級固態(tài)種子的制備一級種子液的制備在121°C滅菌30min的IL三角瓶中(棉塞同時滅菌)，加入煙梗粉末8g，碎煙葉末IOgJn 70°C的水200mL，保溫30min ；然后冷卻至30°C備用；接入斜面種子孢子懸浮液 40mL，搖瓶150r/min，32°C培養(yǎng)2天，獲得黑曲霉一級種子液。煙梗用粉碎機粉碎，用30目篩過濾后，加無菌水進行調配，得到煙梗粉末培養(yǎng)基；將黑曲霉一級種子接入到含水量為30%的煙梗粉末培養(yǎng)基中，接入的種子量為培養(yǎng)基重量的30%，攪勻，經三角瓶培養(yǎng)獲得黑曲霉二級固態(tài)種子，其中三角瓶培養(yǎng)的溫度為 30°C，培養(yǎng)時間為5天。在黑曲霉二級固態(tài)種子中加入1. 5倍重量的無菌水，接入到含水量為20%的煙梗粉末中，接入的種子量為培養(yǎng)基重量的20%，攪勻，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中經淺盤培養(yǎng)獲得黑曲霉三級固態(tài)種子，其中淺盤培養(yǎng)的溫度為32°C，培養(yǎng)時間為5天。(3)煙梗的固態(tài)發(fā)酵煙梗的固態(tài)發(fā)酵接種方法可采用液體種子，也可采用固態(tài)種子。種子的級數(shù)二級或三級根據(jù)發(fā)酵規(guī)模而定。取500g煙梗，加水300mL浸泡4h后，接種黑曲霉三級固態(tài)種子其中，黑曲霉三級固態(tài)種子的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基重量的25 %。采用固態(tài)發(fā)酵法在33°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵4 天，其中采用間歇攪拌式的厚層通風發(fā)酵類型的反應器，在通風發(fā)酵池中，發(fā)酵時通風量控制為l-2vvm。發(fā)酵結束后，采用現(xiàn)有常規(guī)的分離裝置分離收集孢子，并除去孢子，獲得發(fā)酵后的煙梗。其中固態(tài)發(fā)酵裝置如圖9所示。(4)煙梗的浸泡酶解將發(fā)酵后的煙梗浸泡于檸檬酸緩沖液中進行酶解，獲得酶解后的煙梗漿液；其中檸檬酸緩沖液與發(fā)酵后的煙梗濕基的重量比為1.2 1，檸檬酸緩沖液的摩爾濃度為 0. lmol/L, pH*4.4。且浸泡酶解在30r/min.的低速攪拌情況下，在45°C的保溫條件下， 浸泡并酶解24h。(5)煙梗纖維素的分離 將酶解后的煙梗漿液加水打漿，采用孔徑為2_3mm的篩網過濾去除菌體以及雜物，分離出煙梗纖維素，然后依次采用2倍的清水對煙梗纖維素的粗品進行水洗，在50°C條件下烘干后，獲得所述煙草薄片基礎物料——煙梗纖維素，74g，收率為14. 8%。經檢測，本實施例所得的煙梗殘渣的果膠含量為6. 2%,由于發(fā)酵條件相對溫和， 對纖維類物質的破壞作用很小，不會使煙梗纖維帚化或變短；發(fā)酵后的煙梗骨架被破壞，由棒狀變成絲狀；煙梗中的蛋白質、果膠和淀粉被發(fā)酵、酶解后產生的氨基酸、還原糖等小分子物質轉移到水溶液中，發(fā)酵后的煙梗殘渣再經過濾、水洗后可得到蛋白質、果膠和淀粉等大分子雜質更少的煙梗纖維素。
權利要求
1.一種微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，依次經微生物種子培養(yǎng)步驟、微生物發(fā)酵煙梗步驟和煙梗纖維素的分離步驟，獲得所述煙梗纖維素；所述微生物種子培養(yǎng)步驟以黑曲霉為發(fā)酵微生物，采用液態(tài)種子培養(yǎng)或固態(tài)種子培養(yǎng)獲得二級或三級微生物種子，所述微生物發(fā)酵煙梗步驟包括煙梗的固態(tài)發(fā)酵步驟和煙梗的浸泡酶解步驟。
2.如權利要求1所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，所述微生物種子培養(yǎng)步驟，具體包括如下步驟(1)選擇黑曲霉為發(fā)酵微生物；(2)將黑曲霉經PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，制備孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中孢子的濃度不低于IO7個/ml ；(3)將孢子懸浮液采用液態(tài)逐級擴大培養(yǎng)或固態(tài)逐級擴大培養(yǎng)，依次獲得黑曲霉一級種子液、二級種子液和三級種子液，或者依次獲得黑曲霉一級種子液、二級固態(tài)種子和三級固態(tài)種子。
3.如權利要求2所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述黑曲霉一級種子液、二級種子液和三級種子液采用包括如下步驟的方法制得a)在煙梗粉末和碎煙葉末中加水配成一級種子培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后，再將孢子懸浮液接入所述一級種子培養(yǎng)基，然后經30-32°C搖瓶培養(yǎng)2-3天獲得黑曲霉一級種子液；其中，所述一級種子培養(yǎng)基的含水量為85-95% (重量百分含量)；b)將黑曲霉一級種子液依次擴級培養(yǎng)獲得黑曲霉二級種子液和黑曲霉三級種子液，其中，培養(yǎng)黑曲霉二級種子液的培養(yǎng)基和培養(yǎng)黑曲霉三級種子液的培養(yǎng)基均為煙梗粉末和碎煙葉末中加水配成的培養(yǎng)基，所述黑曲霉二級種子液和三級種子液的培養(yǎng)基的含水量均為 85-95% (重量百分含量)。
4.如權利要求2所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述黑曲霉一級種子液、二級固態(tài)種子和三級固態(tài)種子采用包括如下步驟的方法制得A)在煙梗粉末和碎煙葉末中加水配成一級種子培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后，再將孢子懸浮液接入所述一級種子培養(yǎng)基，然后經30-32°C搖瓶培養(yǎng)2-3天獲得黑曲霉一級種子液；其中，所述一級種子培養(yǎng)基的含水量為85-95% (重量百分含量)；B)將黑曲霉一級種子液接入到含水量為20-40%的煙梗粉末培養(yǎng)基中，接種量為培養(yǎng)基總重的20-40 %，攪勻，經三角瓶培養(yǎng)獲得黑曲霉二級固態(tài)種子，其中三角瓶培養(yǎng)的溫度為30°C -32°C，培養(yǎng)時間為4-6天；C)在黑曲霉二級固態(tài)種子中加入0.5-1. 5倍重量的無菌水，攪勻，接入到含水量為 20-40%的煙梗粉末中，接種量為培養(yǎng)基總重的20-40%，攪勻，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中經淺盤培養(yǎng)獲得黑曲霉三級固態(tài)種子，其中淺盤培養(yǎng)的溫度為30°C _35°C，培養(yǎng)時間為4-6天。
5.如權利要求1所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，所述煙梗的固態(tài)發(fā)酵步驟，具體包括如下步驟(1)取煙梗，加水浸泡至少4h后，去除自由水得到濕基煙梗作為發(fā)酵培養(yǎng)基，接種黑曲霉二級種子液或三級種子液，或者接種黑曲霉二級固態(tài)種子或三級固態(tài)種子，采用固態(tài)發(fā)酵法在30-35°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵4-5天，其中發(fā)酵時通風量為l-2vvm ；(2)發(fā)酵結束后，分離除去孢子，獲得發(fā)酵后的煙梗。
6.如權利要求5所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，步驟 (1)中，所述濕基煙梗中水和煙梗的質量比為0.5-1. 2 1 ；所述黑曲霉二級種子液或三級種子液占發(fā)酵培養(yǎng)基總重的10-30% ；所述黑曲霉二級固態(tài)種子或三級固態(tài)種子的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)基總重的10-30%。
7.如權利要求1所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，所述煙梗的浸泡酶解步驟，具體包括如下步驟將發(fā)酵后的煙梗浸泡于檸檬酸與水配成的緩沖液中進行酶解，獲得酶解后的煙梗漿液；其中檸檬酸緩沖液與發(fā)酵后的煙梗濕基的重量比為1-1. 5 1，檸檬酸緩沖液的摩爾濃度為0. 05-0. 2mol/L，pH為3. 5-5. 5。
8.如權利要求7所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，所述浸泡酶解在20-50r/min.的低速攪拌情況下，在30-55°C的保溫條件下，浸泡并酶解 12-36h。
9.如權利要求1所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，所述煙梗纖維素的分離步驟，具體包括如下步驟將酶解后的煙梗漿液加水進一步打漿、過濾或壓濾分離出煙梗纖維素，然后依次經水洗、40-60°C條件下烘干后，獲得所述煙梗纖維素。
10.如權利要求9所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法，其特征在于，所述過濾或壓濾采用孔徑為2-3mm的過濾器。
11.如權利要求1-10任一所述的微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙梗纖維素的方法所制得的煙梗纖維素作為煙草薄片基礎物料的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于煙草加工技術領域，涉及一種微生物固態(tài)發(fā)酵法制備煙草薄片基礎物料-煙梗纖維素的方法。本發(fā)明選擇高產蛋白酶、果膠酶、木質素酶、淀粉酶等酶的微生物，以煙梗、煙末和碎煙葉為原料，制備微生物種子，所制備的微生物種子接種到煙梗中，進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后的煙梗在緩沖液中浸泡并進行酶解，酶解后的煙梗，蛋白質、木質素、果膠質等大分子物質被降解成小分子物質，與煙梗中的纖維素類物質易于分離，再經攪拌打漿、過濾、分離得到水溶性浸出物及水不溶性的煙梗纖維素。本發(fā)明方法具有工藝簡單、節(jié)省能源、減少設備投資、提高煙草薄片的綜合質量的優(yōu)點，可大幅降低煙草薄片中蛋白質、果膠和淀粉等大分子的殘留量。
文檔編號A24B15/20GK102217786SQ20111011623
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權日2011年5月6日
發(fā)明者于興偉, 湯朝起, 盛科, 胡慧東, 許贛榮 申請人:上海煙草集團有限責任公司, 江南大學