專利名稱：：一種煙葉在線醇化酶制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及煙葉加工
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是一種用于煙葉在線醇化的酶制劑及其制備方法。技術(shù)背景在煙葉最后進(jìn)入到巻煙機(jī)之前，巻煙制造歷經(jīng)了煙葉田間生產(chǎn)、收獲、初烤、等級(jí)評(píng)定及流通環(huán)節(jié)、復(fù)烤、發(fā)酵或醇化、煙葉調(diào)配、備料、分片、真空回潮、定量喂料、超回加料、預(yù)配貯葉、切絲、烘絲、貯絲等重要的生產(chǎn)過程。其中，煙葉調(diào)配、備料、分片、真空回潮、定量喂料、超回加料、預(yù)配貯葉、切絲、烘絲、貯絲等是巻煙制造過程中的一系列在線處理過程。煙葉在線處理對(duì)于提高巻煙質(zhì)量、優(yōu)化組葉配方、改善巻煙香味及吃味至關(guān)重要。然而，由于煙葉本身在種植過程中自然環(huán)境和種植水平的差異，導(dǎo)致同一品種、同一部位的煙葉都存在不同的質(zhì)量缺陷，在線處理環(huán)節(jié)中的加香加料工藝雖然在一定程度上能起到修飾和掩蓋缺陷、賦予巻煙新風(fēng)味的作用，但是由于其添加的多是人工合成的香精香料，無法從本質(zhì)上改善煙葉品質(zhì)。因此，如何改良煙葉在線處理技術(shù)工藝以去除煙葉質(zhì)量缺陷、提高和穩(wěn)定巻煙品質(zhì)成為巻煙企業(yè)多年來關(guān)注的技術(shù)難題。而本發(fā)明專利即是針對(duì)這一技術(shù)難題而研究開發(fā)的。煙葉內(nèi)在質(zhì)量由香氣、吃味、刺激性及生理強(qiáng)度構(gòu)成，這些質(zhì)量特點(diǎn)主要是通過新鮮煙葉初烤、復(fù)烤及發(fā)酵(醇化)等環(huán)節(jié)的內(nèi)在物質(zhì)，即底物的酶解作用而顯露出來的。對(duì)于煙葉底物的酶解機(jī)理研究，早在1950年Frankenburg就提出了煙葉內(nèi)含物的酶催化理論框架，隨著研究的深入和積累，各國科學(xué)家及研究人員一致認(rèn)為，煙葉內(nèi)在底物的酶催化類型以氧化還原為主，而且這種酶解過程是多種酶聯(lián)合作用下完成的，最終達(dá)到底物向多種香氣物質(zhì)成分有效轉(zhuǎn)化的結(jié)果。這些酶促反應(yīng)過程主要包括一下幾個(gè)方面1、萜烯類化合物降解過程類胡蘿卜素是煙葉中最重要的一類萜烯化合物，而類胡蘿卜素是一類風(fēng)味和香氣物質(zhì)的前體物質(zhì)，類胡蘿卜素很容易被氧化，其分子中的多烯烴鏈可在多處斷裂，產(chǎn)物主要有C13、Cu、d。、"等降解物，可生成一大類揮發(fā)性芳香化合物，有不少是煙草中關(guān)鍵的致香成分，如紫羅蘭酮、大馬酮、巨豆三烯酮等，它們對(duì)巻煙吸食品質(zhì)有重要影響。2、Mailard反應(yīng)該反應(yīng)過程是還原糖和氨基酸經(jīng)分子重排后生成56種雜環(huán)化合物一類黑素，使煙葉表現(xiàn)陳煙香氣。盡管Mailard反應(yīng)本身不是由酶催化的反應(yīng)，但其底物一還原糖和氨基酸是酶促反應(yīng)的產(chǎn)物。蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下水解成氨基酸，淀粉和糖在水解酶的作用下水解生成葡萄糖、果糖等還原糖。因此，促進(jìn)多糖和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化將有利于Mailard反應(yīng)的進(jìn)行。3、葉綠素的降解反應(yīng)煙葉中葉綠素的含量與煙葉品質(zhì)有關(guān)，因?yàn)樵跓熑~調(diào)制過程中，葉綠素的降解是煙葉黃色品質(zhì)形成和香氣物質(zhì)形成的基礎(chǔ)。如果調(diào)制后的煙葉中殘留的葉綠素過多，會(huì)使煙葉產(chǎn)生青雜氣。具體原理是，葉綠素在葉綠素氧化酶作用下被降解。即在葉綠素降解過程中產(chǎn)生的葉綠醇(植醇)脫水可產(chǎn)生新植二烯，而新植二烯在煙草揮發(fā)物性中含量最大，其本身是一種C2。聚類異戊二烯，是煙葉中重要的萜烯類化合物，也是煙草中一種重要的致香物質(zhì)，其本身具有清香氣，并且新植二烯可進(jìn)一步分解轉(zhuǎn)化形成低分子香味成分，如新植二烯發(fā)生光氧化反應(yīng)后產(chǎn)生植物呋喃。因此，新植二烯進(jìn)一步降解的產(chǎn)物能增加烤煙香氣。盡管煙葉葉綠素絕大部分已經(jīng)在煙葉烘烤過程中被降解，但殘存的葉綠素仍然會(huì)對(duì)巻煙制品帶來不良影響，所以，促進(jìn)煙葉中殘存葉綠素的降解能有效改善煙葉品質(zhì)。4、游離煙堿降解，消除強(qiáng)烈刺激性和不良余味煙堿被煙堿氧化酶降解主要通過吡啶途徑產(chǎn)生多種致香物質(zhì)，煙堿的吡咯烷被氧化脫氫并自發(fā)水解打開，生成吡啶化合物——煙酸，煙酸又可與脫氨作用中的氨氣化合形成維生素P(煙酰胺)，吡啶環(huán)也可通過羥基化被打開，相應(yīng)降解物有3-吡啶基甲基酮、3-吡啶基丙酮、可的寧等。5、蛋白質(zhì)降解與易分解氨氮化合物的脫氨揮發(fā)作用蛋白質(zhì)是煙葉含氮化合物中含量最豐富的一大類組成性成分，過高的蛋白含量對(duì)巻煙具有極為明顯的不利影響，其降解的中間產(chǎn)物氨基酸為多種生理生化過程的順利完成提供物質(zhì)準(zhǔn)備。蛋白質(zhì)和其他含氮化合物在蛋白酶和氨基化合物脫氨酶作用下產(chǎn)生各種有機(jī)酸和氨氣，如a-酮酸、a-酮戊二酸、草酰乙酸等。氨氣在發(fā)酵過程中揮發(fā)掉，而各種有機(jī)酸與煙葉中的游離煙堿結(jié)合形成有機(jī)酸鹽，使游離煙堿變成結(jié)合態(tài)，減少了煙葉中游離煙堿的含量，顯著降低了煙氣的刺激性。以上五個(gè)方面是煙葉內(nèi)含物(糖類、含氮化合物及其它化學(xué)成分)在生物酶調(diào)控參與條件下發(fā)生的主要酶促反應(yīng)過程，這些反應(yīng)過程對(duì)提高煙葉內(nèi)在品質(zhì)、協(xié)調(diào)化學(xué)成分、改善煙葉可用性至關(guān)重要。然而，煙葉在烘烤過程中的高溫和干燥脫水使煙葉內(nèi)酶群的活力喪失殆盡，因此上述酶促反應(yīng)無法進(jìn)行，從而導(dǎo)致了煙葉在經(jīng)歷自然(或人工)發(fā)酵后，煙葉仍然會(huì)存在諸多質(zhì)量缺陷。由于生物酶具有高效催化、專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此，通過煙葉在線處理過程中添加專一性酶系或復(fù)合酶種在短時(shí)間內(nèi)快速促進(jìn)煙葉內(nèi)含物轉(zhuǎn)化，從而可以達(dá)到進(jìn)一步增加煙葉香氣、改善煙葉質(zhì)量缺陷的目的。張立昌報(bào)道了一種適合在打葉復(fù)烤時(shí)添加的酶制劑，對(duì)自然醇化和人工發(fā)酵煙葉的質(zhì)量有明顯的改善作用。該酶制劑可明顯增加巻煙香氣，減輕青雜氣和刺激性，改善巻煙吸味品質(zhì)。趙銘欽等利用4種具有生物活性的ci-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的煙草發(fā)酵增質(zhì)劑進(jìn)行煙葉發(fā)酵，試驗(yàn)表明煙葉香氣質(zhì)改善、香氣量增加、煙葉固有雜氣和刺激性減輕，煙葉內(nèi)部的糖、氮、堿等主要化學(xué)成分及其比值趨于協(xié)調(diào)、平衡。在這些研究過程中所用的酶主要為糖化酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶。阮祥穩(wěn)等申請(qǐng)的中國專利CN200510042773.7公開了一種由多種外源生物酶(纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶)及酵母粉組成的復(fù)合酶制劑，其特征在于多種生物酶及酵母粉按照特定的比例直接進(jìn)行組配。專利CN03114578.7公開了由纖維素酶、蛋白酶、轉(zhuǎn)化酶、麥芽糖酶、溶菌酶組成的酶制劑。武怡等(CN1947604)等公開了一種煙葉在線改性處理生物隧道裝置，但對(duì)處理過程中使用的酶制劑沒有進(jìn)行描述。以上文獻(xiàn)和專利的共同特征，一是外源(微)生物酶的組配利用，二是其作用環(huán)節(jié)是針對(duì)煙葉發(fā)酵，而且他們采用的酶均是來自于商業(yè)化酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種煙葉在線醇化酶制劑及其制備方法，該酶制劑由復(fù)合酶組成，其酶群均來源于新鮮煙葉，具有安全、高效、活性可靠及針對(duì)性強(qiáng)的特點(diǎn)，滿足了巻煙工業(yè)的煙葉在線醇化技術(shù)要求。煙葉在線處理特指巻煙生產(chǎn)企業(yè)通過生產(chǎn)線設(shè)備在封閉或半封閉條件下對(duì)煙葉原料進(jìn)行一段連續(xù)的生產(chǎn)工藝處理過程，其目的在于通過控制一系列環(huán)境條件(溫、濕度)、添加香精香料及改變煙葉物理性狀(切絲)等，從而根據(jù)原料的功能特征進(jìn)行組合配方而賦予巻煙制品新風(fēng)味及適于進(jìn)行巻煙的工藝要求。煙葉在線處理一般包括煙葉備料、分片、真空回潮、定量喂料、超回加料、預(yù)配貯葉、定量喂料、潤葉加料、配葉貯葉、切絲、定量喂料、HT(高溫)、烘絲、冷卻以及其他下游處理過程，直至貯絲完成煙葉的在線處理。其中在潤葉加料在線處理過程中施加生物活性酶，促使煙葉內(nèi)含物(底物)在貯葉期間(2-4hr)內(nèi)進(jìn)行酶促分解，不利成分的轉(zhuǎn)化達(dá)到了改善煙絲口腔余味、去除青雜氣及煙香豐滿的目的。本發(fā)明中的酶全部來源于新鮮煙葉，按照自主設(shè)計(jì)的一套生物酶純化和活性保護(hù)措施，可得到主要包括葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶、煙堿氧化酶在內(nèi)的復(fù)合型酶制劑。制備環(huán)節(jié)包括新鮮煙葉組織勻漿、酶群純化、輔基置換分子f彥飾及蔗糖低聚物保護(hù)，最后得到由葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶及煙堿氧化酶五類酶組成的復(fù)合酶制劑。具體生產(chǎn)工藝如下1、取鮮活煙葉或頂杈，破碎細(xì)胞得汁液，按體積比V緩沖is:V汁液二l:810加緩沖液A:0.1MTris-HCL'pH7.7,0.1MPMSF(苯甲基磺酰氟)，于4'C，2600g離心20min;2、取上清液，緩慢加入(NH4)2S04溶液(144g/L，即每升含(NH4)2S04144g)至飽和，4。C緩慢混合30min，4。C15000g離心40min;3、取上清液，加入等體積(NH4)2S。4溶液(390g/L,即每升含(NH4)2S04390g)，緩慢混合2小時(shí)或過夜，4°C15000g離心2h，收集沉淀，加緩沖液A:0.1MTris-HCL,pH7.7，0.1MPMSF(苯甲基磺酰氟)至沉淀充分溶解；4、溶解完全后，按1:0.10.2體積比加入緩沖液B:0.1MTris-HCl，pH7.7，0.1%EDTA(W/W)(乙二胺四乙酸)于4。C沉淀20min，8000g離心10min，獲上清液，棄沉淀；5、上清液按1:0.0010.002體積比先后加入0.3%Ca(N03)2'4H20和0.2%MgS(V溶液，充分混勻，靜置8—12小時(shí)或過夜；，6、按1:0.010.02體積比加入0.01%蔗糖低聚物溶液，靜置1一1.5小時(shí)；溶液樣品于-8'C干燥濃縮至原體積的1/8時(shí)停止，4'C解凍分裝即獲得煙葉在線醇化酶制劑原液。酶活測(cè)定按國標(biāo)QB/T1803-93《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》執(zhí)行。成品酶制劑在施用前用水稀釋至0.10.3%，煙葉分片后在真空回潮至含水率15.5%時(shí)，均勻噴施于煙葉上，用量約50ml/50kg煙葉，酶促反應(yīng)在lt葉柜中經(jīng)2-4小時(shí)完成(具體施用方法見附圖1)。本發(fā)明的煙葉在線醇化酶制劑的特點(diǎn)與效果本發(fā)明滿足了巻煙在線的生產(chǎn)工藝要求，即酶制劑在煙葉真空回潮后添加(含水率至15.5%)，酶在后續(xù)的在線處理過程中發(fā)揮催化作用，快速促進(jìn)底物轉(zhuǎn)化。由于該酶制劑來源于新鮮煙葉，因此不存在一些食品添加劑的安全性問題，并且可增加煙葉純正天然煙香，減少人工合成化合物的使用量，從而顯著改善煙葉品質(zhì)。與現(xiàn)有酶制劑相比，用本發(fā)明工藝生產(chǎn)的新型煙葉發(fā)酵酶制劑具有安全、針對(duì)性強(qiáng)、作用迅速的特點(diǎn)。具體表現(xiàn)在如下9個(gè)方面1、酶源安全性所有酶種都來自于新鮮煙葉，不存在食品安全方面的問題；2、酶制劑中含有的5種酶(葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿'卜素氧化酶、蛋白酶、煙堿氧化酶)均來自于煙葉，可催化煙葉內(nèi)相應(yīng)底物的酶促氧化還原反應(yīng))，無需添加外源酶；3、降解煙葉殘存葉綠素，消除青雜氣；4、催化分解煙葉內(nèi)部萜烯類化合物，為香氣物質(zhì)的產(chǎn)生提供前體，達(dá)到增強(qiáng)煙葉天然香氣，發(fā)揮煙葉潛在品質(zhì)；5、加速煙葉在線醇化的酸化過程；降低pH值一個(gè)單位，提高煙葉可用性；6、加快氨氮化合物脫氨揮發(fā)，降低煙葉總氮含量，減少刺激性，改善吃味；7、促進(jìn)游離煙堿分解，降低巻煙刺激性；8、保持自然煙香，減少人工香精香料的使用量；9、酶活性在烘絲過程的高溫下自然終止，達(dá)到可調(diào)控的目的。感官評(píng)吸結(jié)果表明，處理煙樣品質(zhì)有較明顯改善，具體表現(xiàn)為勁頭、刺激性減弱，香氣質(zhì)、口感得到改善。表1中，CKA1、CKB1和CKB2為對(duì)照煙樣，7-Al、7-Bl和7-B2為處理樣。(下同)表1酶制劑處理煙樣評(píng)吸結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>吸煙機(jī)分析結(jié)果顯示處理煙樣與對(duì)照煙樣相比，煙氣總粒相物平均下降了8.4%，焦油量下降了5.1%,煙氣煙堿量下降了28.0%，一氧化碳下降了1.6%，說明該酶制劑的在線處理有利于巻煙產(chǎn)品的降焦減害(表2)。表2吸煙機(jī)煙氣分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>同時(shí)，常規(guī)化學(xué)成分分析結(jié)果表明，處理煙樣與對(duì)照樣相比，其煙堿下降9.3%，總氮下降5.7%，蛋白質(zhì)下降7.1%，這一結(jié)果說明，通過該酶制劑的在線處理可進(jìn)一步協(xié)調(diào)煙葉的內(nèi)在化學(xué)成分(表3)。表3煙葉常規(guī)分析部分結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>圖1是本發(fā)明的煙葉酶制劑在線處理工藝流程圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:1、取鮮活煙葉或頂杈，破碎細(xì)胞，按體積比VSM:V賺=1:9加緩沖液A:0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1MPMSF，于4。C，2600g離心20min;2、取上清液，緩慢加入(NH4)2S(V溶液(144g/L)至飽和，4'C緩慢混合30min，于4。C，15000g離心40min;3、取上清液，加入等體積(NH4)2S(X溶液(390g/L)，緩慢混合2小時(shí)或過夜，于4。C，15000g離心2h，收集沉淀，加緩沖液A:0.1MTris-HCL,pH7.7,0.1MPMSF至沉淀充分溶解；4、溶解完全后，按1:0.1體積比加入緩沖液B:0.1MTris-HC1，pH7.7，0.1%EDTA(W/W)，于4。C沉淀20min，8000g離心10min，獲上清液，棄沉淀；5、上清液按1:0.001體積比先后加入0.3%Ca(N03)24H20和0.2%MgS(X溶液，充分混勻，靜置8—12小時(shí)或過夜；6、按1:0.01體積比加入0.01%蔗糖低聚物溶液，靜置1一1.5小時(shí)；溶液樣品于-8t干燥濃縮至原體積的1/8時(shí)停止，4'C解凍分裝即獲得煙葉在線醇化酶制劑原液。實(shí)施例2:1、取鮮活煙葉或頂杈，破碎細(xì)胞，按體積比Vg沖液:V汁液=1:10加緩沖液A:0.1MTris-HCL，pH7.7,0.1MPMSF，于4°C,2600g離心20min;2、取上清液，緩慢加入(NH4)2S04溶液(144g/L)至飽和，4。C緩慢混合30min，于4。C，15000g離心40min;3、取上清液，加入等體積(NH4)2S(V溶液(390g/L)，緩慢混合2小時(shí)或過夜，于4。C，15000g離心2h，收集沉淀，加緩沖液A:0.1MTris-HCL,pH7.7，0.1MPMSF至沉淀充分溶解；4、溶解完全后，按1:0.2體積比加入緩沖液B:0.1MTris-HC1,pH7.7，0.1%EDTA(W/W)，于4。C沉淀20min，8000g離心10min,獲上清液，棄沉淀；5、上清液按1:0.002體積比先后加入0.3%Ca(N03)24H20和0.2%MgS04溶液，充分混勻，靜置8—12小時(shí)或過夜；6、步驟5所得上清液再按1:0.02體積比加入0.01%蔗糖低聚物溶液，靜置l一l.5小時(shí)；溶液樣品于-8'C干燥濃縮至原體積的1/8時(shí)停止，4'C解凍分裝即獲得煙葉在線醇化酶制劑原液。以上實(shí)施例所得的醇化酶制劑按如下方法加入1、配制0.10.3%醇化酶制劑溶液，煙葉定量喂料后均勻噴施煙葉至含水率15.5%±1.5，設(shè)置清水對(duì)照；2、超回加料保持工藝條件(40_52°C，煙葉含水率18.5-20%)2hr;3、切絲保持含水率20.5士1.0;4、烘絲保持熱風(fēng)溫度ll(TC，葉面溫度85。C以上，45min;5、反應(yīng)完成后對(duì)煙樣進(jìn)行專業(yè)評(píng)吸、吸煙機(jī)分析與常規(guī)化學(xué)分析；6、應(yīng)用MATLAB統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如圖1所示，煙葉酶制劑在線處理工藝流程首先從鮮活煙葉中獲取生物活性酶群，經(jīng)活性保護(hù)后于煙葉在線處理過程中的"超回加料"前施加，酶反應(yīng)經(jīng)歷預(yù)配貯葉、定量喂料、潤葉加料、配葉貯葉、切絲、定量喂料六個(gè)生產(chǎn)工藝過程。在這一連續(xù)的在線處理(酶解反應(yīng))過程中，溫度維持在40-52'C，煙葉含水率保持在15.5±1.521%±1.5，反應(yīng)2-4小時(shí)后，酶活性在高溫階段受到抑制并在接下來的烘絲階段(熱風(fēng)溫度ll(TC)完全失活，酶制劑在線處理過程全部結(jié)束。權(quán)利要求1、一種煙葉在線醇化的酶制劑的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行1)取鮮活煙葉或頂杈，破碎細(xì)胞，按體積比V緩沖液∶V汁液＝1∶9～10加緩沖液A0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1MPMSF，于4℃，2600g離心20min；2)取上清液，緩慢加入(NH4)2SO4溶液至飽和，4℃緩慢混合30min，4℃15000g離心40min；3)取上清液，加入等體積(NH4)2SO4溶液，緩慢混合2小時(shí)或過夜，4℃15000g離心2h，收集沉淀，加緩沖液A0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1MPMSF至沉淀充分溶解；4)溶解完全后，按1∶0.1～0.2體積比加入緩沖液B0.1MTris-HCl，pH7.7，0.1％EDTA(W/W)于4℃沉淀20min，8000g離心10min，獲上清液，棄沉淀；5)上清液按1∶0.001～0.002體積比先后加入0.3％Ca(NO3)2·4H2O和0.2％MgSO4溶液，充分混勻，靜置8-12小時(shí)或過夜；6)按1∶0.01～0.02體積比加入0.01％蔗糖低聚物溶液，靜置1-1.5小時(shí)；溶液樣品于-8℃干燥濃縮至原體積的1/8時(shí)停止，4℃解凍分裝即獲得煙葉在線醇化酶制劑原液。2、一種用權(quán)利要求1所述的煙葉在線醇化的酶制劑的制備方法制備的煙葉在線醇化的酶制劑。3、權(quán)利要求2所述的煙葉在線醇化的酶制劑的應(yīng)用，其特征在于成品酶制劑在施用前用水稀釋至0.10.3%，煙葉分片后在真空回潮至含水率15.5%時(shí)，均勻噴施于煙葉上。全文摘要本發(fā)明是一種煙葉在線醇化酶制劑及其制備方法。主要解決煙葉在線工藝中在短時(shí)間內(nèi)如何改善煙葉品質(zhì)的技術(shù)問題。原料用新鮮煙葉或頂杈，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀獲得粗酶液后，用蔗糖低聚物完成酶活性保護(hù)，由此提高酶活性的穩(wěn)定性和高效性，延長酶制劑的半衰期。酶制劑主要由氧化還原酶類組成，即葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶及煙堿氧化酶五類酶，這些酶全部來源于新鮮煙葉或頂杈，其配比均是自然生成，不添加任何外源酶。該酶制劑在煙葉的在線處理過程中用清水稀釋至施用，酶促反應(yīng)在煙葉柜中2-4小時(shí)內(nèi)完成。該技術(shù)利用生物酶的專一性和高效性，在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)煙葉內(nèi)含物轉(zhuǎn)化，達(dá)到煙葉在線處理過程中提高煙葉品質(zhì)的目的，滿足卷煙企業(yè)生產(chǎn)工藝的要求。文檔編號(hào)A24B15/00GK101260387SQ20081005818公開日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年3月14日優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日發(fā)明者何寶玉,勇謝,偉韓申請(qǐng)人:云南萬芳生物技術(shù)有限公司