專利名稱：轉(zhuǎn)化植物以表達(dá)蘇云金芽孢桿菌δ－內(nèi)毒素的方法
1.0發(fā)明背景1.1發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來(lái)講涉及具有殺蟲能力的轉(zhuǎn)基因植物，以及涉及用來(lái)將賦予抗蟲性的基因轉(zhuǎn)移到植物基因組中的DNA構(gòu)成物。更具體地講，本發(fā)明涉及在用蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)δ-內(nèi)毒素編碼基因轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)殺蟲蛋白、導(dǎo)致有效防治敏感的目標(biāo)害蟲的方法。
1.2相關(guān)技術(shù)的描述1.2.1在植物中防治昆蟲侵染的方法眾所周知革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生蛋白性伴胞晶體或δ-內(nèi)毒素，δ-內(nèi)毒素對(duì)種類繁多的鱗翅目、鞘翅目和雙翅目幼蟲有毒性。蘇云金芽孢桿菌在孢子形成過(guò)程中產(chǎn)生對(duì)某些昆蟲物種具有特異性毒素的晶體蛋白。已經(jīng)表明許多不同菌株的蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白。包含產(chǎn)生具殺蟲活性蛋白的蘇云金芽孢桿菌菌株的組合物在商業(yè)上已經(jīng)用作環(huán)境可接受的局部殺蟲劑，因?yàn)樗鼈儗?duì)特定目標(biāo)昆蟲具有毒性，而對(duì)植物和其它非目標(biāo)生物沒(méi)有毒性。
δ-內(nèi)毒素晶體通過(guò)攝食對(duì)昆蟲幼蟲有毒性。該晶體在昆蟲中腸溶解，釋放前毒素形式的δ-內(nèi)毒素，這種形式的δ-內(nèi)毒素在大多數(shù)情況下隨后被中腸蛋白酶加工為活性毒素?；罨亩舅赝ㄟ^(guò)受體蛋白而識(shí)別并結(jié)合昆蟲中腸上皮的刷狀緣。已經(jīng)從某些昆蟲幼蟲中分離出幾種推定的晶體蛋白受體(Knight等，1995；Gill等，1995；Masson等，1995)。活性毒素結(jié)合后，毒素分子嵌入并聚集，在中腸上皮形成孔。這一過(guò)程導(dǎo)致襯于中腸上皮的細(xì)胞滲透失調(diào)、水腫、裂解，最終導(dǎo)致幼蟲死亡。1.2.2轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素作為生物殺蟲劑植物抗性和生物防治在應(yīng)用于大多數(shù)不同作物的大多數(shù)殺蟲改進(jìn)程序中是重要的防治策略。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的來(lái)臨，已經(jīng)分離出各種δ-內(nèi)毒素基因并且測(cè)定了其DNA序列。這些基因已經(jīng)用來(lái)構(gòu)建某些遺傳工程蘇云金芽孢桿菌制品，這些制品已經(jīng)被批準(zhǔn)用于商業(yè)用途。最新進(jìn)展已經(jīng)看到了開發(fā)的新的δ-內(nèi)毒素傳遞系統(tǒng)，包括含有并表達(dá)遺傳工程δ-內(nèi)毒素基因的植物。只要可以解決某些問(wèn)題，蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素在植物中的表達(dá)則保持有效控制植物害蟲的潛力。這些問(wèn)題包括昆蟲產(chǎn)生對(duì)所述植物中表達(dá)的特定Cry蛋白的抗性以及因?yàn)榇嬖谒鲛D(zhuǎn)基因而產(chǎn)生形態(tài)異常的植物。
已經(jīng)證明蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素在轉(zhuǎn)基因棉花、玉米和馬鈴薯中的表達(dá)是一種防治農(nóng)業(yè)上重要的害蟲的有效方法(Perlak等，1990；Koziel等，1993；Perlak等，1993)。表達(dá)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因作物使得栽培者能夠顯著減少昂貴的、有毒并且有時(shí)無(wú)效的局部化學(xué)殺蟲劑的應(yīng)用。當(dāng)編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因的插入對(duì)來(lái)自轉(zhuǎn)化植物的所需制品的產(chǎn)量沒(méi)有負(fù)面影響時(shí)，應(yīng)用所述轉(zhuǎn)基因特別有利。已經(jīng)觀察到，表達(dá)某些蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素(例如Cry1A或Cry3A)的作物的產(chǎn)量等于或優(yōu)于在其它方面相似的非轉(zhuǎn)基因商業(yè)植物品種。這表明某些蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)或發(fā)育沒(méi)有顯著的負(fù)面影響。然而，可以用來(lái)轉(zhuǎn)化植物的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的情況并不都是如此。
應(yīng)用局部蘇云金芽孢桿菌源殺蟲劑也可能導(dǎo)致產(chǎn)生抗所述殺蟲劑的昆蟲品系。至少在一種充分記載的情況下已經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)作為葉面噴灑劑應(yīng)用的Cry1A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的抗性(Shelton等，1993)。預(yù)期昆蟲可能同樣產(chǎn)生對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的抗性。如果這種抗性成為世界性的，則這種抗性可能明顯限制了含有編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的基因的玉米、棉花、馬鈴薯和其它種質(zhì)的商業(yè)價(jià)值。既增加所述殺蟲劑對(duì)目標(biāo)害蟲的效力、又減少殺蟲劑抗性害蟲的產(chǎn)生的一個(gè)可能的途徑，可能是確保轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)高水平的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素(McGaughey和Whalon，1993；Roush，1994)。
除產(chǎn)生高水平表達(dá)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物外，商業(yè)上可使用的蘇云金芽孢桿菌基因必須滿足另外幾種的標(biāo)準(zhǔn)。例如，這些基因在轉(zhuǎn)基因作物中的表達(dá)必須不降低所述植物的活力、生存力或育性，它也不能影響所述植物的正常形態(tài)。這樣的有害效應(yīng)有兩種不希望有的結(jié)果它們可能干擾轉(zhuǎn)基因植物的回收和繁殖；它們也可以阻礙產(chǎn)生成熟植物，或賦予不可接受的農(nóng)學(xué)特性。
仍需要可用于產(chǎn)生以足以有效防治目標(biāo)植物害蟲以及防止產(chǎn)生殺蟲劑抗性害蟲品系的高水平表達(dá)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物的組合物和方法。導(dǎo)致較高水平表達(dá)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的方法，也提供以下優(yōu)點(diǎn)以更高頻率獲得商業(yè)上可使用的轉(zhuǎn)化植物系和在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)抵抗侵染的更有效的保護(hù)。
也仍需要同時(shí)不導(dǎo)致干擾最佳生長(zhǎng)和所需植物組織發(fā)育的植物形態(tài)改變的、提高蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素表達(dá)水平的方法。例如，增強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素在玉米中的表達(dá)的方法應(yīng)該不產(chǎn)生對(duì)于栽培不能最適發(fā)育的玉米植株。例如高表達(dá)水平以及回收形態(tài)正常植物的這些目標(biāo)的達(dá)到一直是難以捉摸的，而其研究一直在進(jìn)行，并且是殺蟲植物制品長(zhǎng)期價(jià)值的一個(gè)重要方面。
2.0發(fā)明概述描述了在轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)缺乏顯著雙翅目抑制活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的新方法。這種方法有利地既導(dǎo)致提高蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素表達(dá)水平，又導(dǎo)致形態(tài)正常植株的回收率較高。
通過(guò)達(dá)到高表達(dá)率，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的另一個(gè)限制問(wèn)題產(chǎn)生昆蟲抗性。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種優(yōu)越的策略，用來(lái)延遲或消除對(duì)轉(zhuǎn)基因系最常表達(dá)的蘇云金芽孢桿菌蛋白的Cry1Aδ-內(nèi)毒素的抗性的產(chǎn)生。這種所公開的方法涉及表達(dá)Cry2A類的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素，特別是缺乏雙翅目抑制活性的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素。Cry2A類的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素與Cry1A型δ-內(nèi)毒素沒(méi)有顯著的同源性，并且表現(xiàn)出不同的結(jié)合和孔形成特性(English等，1994)，因此預(yù)期防治變?yōu)榭笴ry1Aδ-內(nèi)毒素或不受Cry1Aδ-內(nèi)毒素影響的昆蟲(Hofte和Whiteley，1989)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離和純化的DNA構(gòu)成物，所述構(gòu)成物包含定位至質(zhì)體或葉綠體或定位至植物細(xì)胞核基因組、且有效連接于編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(PTP)區(qū)的Cry2Aδ-內(nèi)毒素編碼區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)選DNA構(gòu)成物包括編碼Cry2Aδ-內(nèi)毒素的那些構(gòu)成物，所述構(gòu)成物缺乏雙翅目抑制活性，盡管不需要對(duì)雙翅目完全無(wú)活性。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)成物編碼有效連接于編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA區(qū)段(或序列)的Cry2Abδ-內(nèi)毒素，這是一種使Cry2Abδ-內(nèi)毒素能夠定位至質(zhì)體或葉綠體的方法。在某些實(shí)施方案中，所述Cry2Abδ-內(nèi)毒素包含SEQ ID NO2的序列。然而，本發(fā)明人設(shè)想，可以按照本發(fā)明利用任何缺乏雙翅目抑制活性的Cry2Aδ-內(nèi)毒素，特別優(yōu)選與Cry2Ab具有相當(dāng)大同源性的那些Cry2Aδ-內(nèi)毒素。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)成物利用編碼PTP的核酸區(qū)段來(lái)增強(qiáng)所述δ-內(nèi)毒素的表達(dá)。在美國(guó)專利5,500,365(該文獻(xiàn)通過(guò)引用全部具體結(jié)合到本文中)中公開了利用一種類型的PTP-葉綠體引導(dǎo)肽(CTP)結(jié)合cry1A蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因來(lái)促進(jìn)該轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)。然而，在觀察到表達(dá)增加的情況下，將其部分歸因于在表達(dá)載體中應(yīng)用新的5’非翻譯前導(dǎo)序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相反，本發(fā)明公開了一種引起產(chǎn)生編碼定向融合蛋白的RNA序列的結(jié)構(gòu)DNA序列，所述定向融合蛋白包含具有Cry2Abδ-內(nèi)毒素的氨基末端質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽；公開了一種3’非翻譯DNA序列，它在植物細(xì)胞中起作用以引起轉(zhuǎn)錄終止，并將聚腺苷酸化核苷酸添加至所述RNA序列的3’端。意想不到的是，這種DNA構(gòu)成物導(dǎo)致Cry2Aδ-內(nèi)毒素的表達(dá)水平提高。定向融合蛋白對(duì)所有物種均是無(wú)活性的，但作為使成熟的殺蟲活性δ-內(nèi)毒素蛋白定位至葉綠體的工具而產(chǎn)生，產(chǎn)生驚人和意想不到的有益農(nóng)學(xué)效應(yīng)。
本發(fā)明設(shè)想的一個(gè)實(shí)施方案是將編碼缺乏雙翅目活性的Cry2Aδ-內(nèi)毒素的基因引入葉綠體或質(zhì)體基因組中。或者，可以從位于葉綠體或質(zhì)體中的自主復(fù)制型附加型元件表達(dá)編碼缺乏雙翅目活性的Cry2Aδ-內(nèi)毒素的基因。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供已經(jīng)用分離和純化的DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述DNA構(gòu)成物由該植物以高水平翻譯和表達(dá)。單子葉植物和雙子葉植物均可以按照該方法、用本文公開的DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化。在再一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可以通過(guò)包括以下步驟的方法制備獲得所述分離和純化的DNA構(gòu)成物，然后用該構(gòu)成物轉(zhuǎn)化所述植物，以使所述植物表達(dá)該構(gòu)成物編碼的蛋白。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，通過(guò)所述公開的方法轉(zhuǎn)化植物，導(dǎo)致表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體的頻率增加以及從最初的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生形態(tài)更為正常的植株。
設(shè)想了在所述公開的發(fā)明中觀察到的表達(dá)水平提高將便于減少產(chǎn)生抗Btδ-內(nèi)毒素的昆蟲。通過(guò)用所述優(yōu)選DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化植物以達(dá)到單獨(dú)的Cry2A高表達(dá)率，或通過(guò)同時(shí)將目標(biāo)昆蟲暴露于在感病植物中表達(dá)的Cry1A和無(wú)雙翅目活性的Cry2Aδ-內(nèi)毒素，可以達(dá)到這一目的。這樣的昆蟲包括玉蜀黍(Zea mays)中的稈野螟(Ostrina spp.)、桿草螟(Diatraea spp.)、Helicoverpa spp.和貪夜蛾(Spodoptera spp.)；陸地棉(Gossypmm hirsutum)中的煙芽夜蛾(Heliothis virescens)、Helicoverpa spp.、Pectinophora spp.；和大豆(Glycine max)中的干煞夜蛾(Anticarsia spp.)、Pseudoplusia spp.、葉小卷蛾(Epinotia spp.)；和稻(Oryza sativa)中的三化螟(Scirpophaga incertulas)。
因此設(shè)想了本發(fā)明公開的方法將提供優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的許多優(yōu)點(diǎn)，包括以上具體概述的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括獲得改進(jìn)的對(duì)敏感昆蟲的防治；最大限度地減少殺蟲劑抗性昆蟲品系的產(chǎn)生；獲得大量商業(yè)上可利用的抗蟲性植物系；達(dá)到抵抗昆蟲病原體的全期保護(hù)；和提高形態(tài)正常的轉(zhuǎn)化植株的發(fā)生率。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是為鑒定具有正常生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因事件所需要產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因系數(shù)目減少。
因此設(shè)想了本發(fā)明公開的方法將提供優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的許多優(yōu)點(diǎn)，包括以上具體概述的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括獲得改進(jìn)的對(duì)敏感昆蟲的防治；最大限度地減少殺蟲劑抗性昆蟲品系的產(chǎn)生；獲得大量商業(yè)上可利用的抗蟲性植物系；達(dá)到抵抗昆蟲病原體的全期保護(hù)；和提高形態(tài)正常的轉(zhuǎn)化植株的發(fā)生率。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是為鑒定具有正常生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因事件所需要產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因系數(shù)目減少。2.1核酸組合物在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含一個(gè)Cry2A編碼區(qū)和一個(gè)PTP編碼區(qū)的分離和純化的核酸構(gòu)成物。這些DNA構(gòu)成物當(dāng)轉(zhuǎn)移到植物中時(shí)，經(jīng)歷導(dǎo)致δ-內(nèi)毒素在所述轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)增加的細(xì)胞過(guò)程。本發(fā)明的Cry2A內(nèi)毒素最好對(duì)雙翅目物種不是有效的，盡管可以耐受對(duì)雙翅目的某些副作用。在某些實(shí)施方案中，所述DNA構(gòu)成物編碼對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2Abδ-內(nèi)毒素，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Cry2Abδ-內(nèi)毒素具有SEQ ID NO2的多肽序列，或具有與SEQ IDNO2的多肽序列大致同源的序列。這樣的核苷酸同源物與SEQ IDNO2中公開的Cry2Abδ-內(nèi)毒素的同源性可能高于約88％，高于約90％，高于約95％，甚至高于約99％。典型的肽包括與SEQ ID NO2中公開的Cry2Abδ-內(nèi)毒素的同源性為約88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更高。
在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)成物包含具有SEQID NO1的核酸序列的Cry2Abδ-內(nèi)毒素編碼區(qū)、或與SEQ ID O1的序列大致同源的序列。也設(shè)想屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是具有與SEQ IDNO1中公開的核酸序列具有大致同源性的區(qū)段的那些DNA構(gòu)成物，例如同源性可以約為90％或約95％或甚至約99％的那些DNA構(gòu)成物。更具體地講，本發(fā)明中包括的同源核酸序列包括與SEQ ID NO1的核酸序列的同源性約為90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的那些核酸序列。
本文提供的DNA構(gòu)成物也包括位于cry2Aδ-內(nèi)毒素編碼區(qū)上游和啟動(dòng)子下游的一個(gè)PTP編碼區(qū)。這些質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)可以編碼任何植物功能性PTP，并且可以操作以將所編碼的蛋白導(dǎo)向該植物細(xì)胞內(nèi)的某些質(zhì)體，或增加所述DNA構(gòu)成物編碼的δ-內(nèi)毒素的表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括選自zmSSU、PTP1、PTP1Δ和PTP2或任何其它植物功能性PTP的一種PTP。更優(yōu)選的是，所述質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)編碼具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的氨基酸序列或與這些序列大致同源的任何多肽序列的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。甚至更優(yōu)選的是，本發(fā)明包括具有SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7或SEQ ID NO9的核酸序列或與這些序列大致同源的核酸序列的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)。
此外，本發(fā)明人設(shè)想，如果本文提供的DNA構(gòu)成物與其它殺蟲劑組合物例如其它蛋白一起共表達(dá)，則本發(fā)明還可以達(dá)到提高對(duì)害蟲的致病性并導(dǎo)致殺蟲劑抗性昆蟲的產(chǎn)生減少的目標(biāo)。因此，本發(fā)明提供還包含植物可表達(dá)的其它Cry蛋白編碼區(qū)的所公開的DNA構(gòu)成物的應(yīng)用。這些包括Cry1蛋白例如Cry1A、Cry1Ab、Cry1Bb或Cry1嵌合體的編碼區(qū)(參見共同待審的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/754,490和08/922,505以及共同待審的基于美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/721,259的PCT申請(qǐng)PCT/US97/17507，每個(gè)文獻(xiàn)通過(guò)引用全部具體結(jié)合到本文中)。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA構(gòu)成物是可以從所述質(zhì)粒切下并分離的表達(dá)盒。2.2其它核酸組合物元件本發(fā)明的多核苷酸組合物可用來(lái)轉(zhuǎn)化單子葉植物，也可用來(lái)轉(zhuǎn)化雙子葉植物。因此，本發(fā)明的DNA構(gòu)成物還可以包含其它各種調(diào)節(jié)元件，以有助于蛋白表達(dá)和進(jìn)一步促進(jìn)將所述DNA構(gòu)成物引入所述植物。該方面的一個(gè)實(shí)例是在所述DNA構(gòu)成物中包括一個(gè)位于非翻譯前導(dǎo)序列中、相對(duì)于質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)處于上游的內(nèi)含子。一種有用的前導(dǎo)序列是矮牽牛熱激蛋白。在不同的替代實(shí)施方案中，所述內(nèi)含子可以是以下內(nèi)含子中的任一種Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子、TMVΩ元件、玉米熱激蛋白(hsp)70或水稻Actl內(nèi)含子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述內(nèi)含子不是玉米熱激蛋白70，就是矮牽牛熱激蛋白70。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中提供置于植物可操作啟動(dòng)子控制下的包含一個(gè)對(duì)雙翅目基本上無(wú)活性的cry2Aδ-內(nèi)毒素編碼區(qū)和一個(gè)PTP編碼區(qū)的多核苷酸序列。驅(qū)動(dòng)細(xì)胞過(guò)程需要應(yīng)用啟動(dòng)子，以使該基因的表達(dá)最大化。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括以下啟動(dòng)子CaMV35S、組蛋白、CaMV 19S、nos、OCS、Adh、蔗糖合酶、α-微管蛋白、肌動(dòng)蛋白、cab、PEPC酶、ssRUBISCO、Actl、Famv、增強(qiáng)的FMV或R基因復(fù)合體相關(guān)的啟動(dòng)子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是增強(qiáng)或重復(fù)CaMV 35S啟動(dòng)子(Kay等，1987)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是FMV 35S啟動(dòng)子。植物葉綠體或質(zhì)體功能性啟動(dòng)子也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明還設(shè)想了在所述DNA構(gòu)成物中包括終止子區(qū)，以有助于涉及蛋白表達(dá)的細(xì)胞過(guò)程。在各種實(shí)施方案中，這種終止子可以是以下終止子中的任一種根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合酶基因終止子、根癌土壤桿菌章魚堿合酶基因終止子以及得自馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II基因的3’端。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述終止子是根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因終止子。2.3轉(zhuǎn)化載體因?yàn)楸景l(fā)明的DNA構(gòu)成物盡管不是僅計(jì)劃用于植物轉(zhuǎn)化，但主要計(jì)劃用于植物轉(zhuǎn)化，所以在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA構(gòu)成物包含在表達(dá)載體中。這種表達(dá)載體可以含有種類繁多的調(diào)節(jié)元件和計(jì)劃便于最佳表達(dá)所述表達(dá)載體編碼的所需蛋白的其它元件。這些其它元件可以包括在以上2.2一節(jié)中概述的啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子。含有所述DNA構(gòu)成物和任何調(diào)節(jié)元件或其它元件的載體可以選自酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體、質(zhì)?；蛘沉?。
此外，所述表達(dá)載體自身可以具有多種形式。這些形式可以因各種原因而不同，可能根據(jù)它們用來(lái)轉(zhuǎn)化單子葉植物還是轉(zhuǎn)化雙子葉植物而包括不同的組分。例如，

圖1描繪了一種可能的實(shí)施方案，其中所述單子葉植物表達(dá)載體含有在命名為(SEQ ID NO16)的質(zhì)粒中的cry2Ab基因。還設(shè)想了，含有包括在這些質(zhì)粒載體中的表達(dá)盒以及含有大致同源物的表達(dá)盒的其它表達(dá)載體也是有用的轉(zhuǎn)化構(gòu)成物。因此，含有得自SEQ ID NO16的核酸1781-5869的核酸序列的任何轉(zhuǎn)化載體。
圖2描繪了一種可能的雙子葉植物表達(dá)載體。它含有包括在命名為pMON33827(SEQ ID NO13)、pMON33828(SEQ ID NO14)和pMON33829(SEQ ID NO15)的質(zhì)粒中的cry2Ab基因。正如說(shuō)明性單子葉植物轉(zhuǎn)化載體一樣，本發(fā)明還設(shè)想了含有包括在這些質(zhì)粒載體中的表達(dá)盒、或與那些表達(dá)盒的大致同源物的其它表達(dá)載體，將可用作雙子葉植物轉(zhuǎn)化構(gòu)成物。優(yōu)選的雙子葉植物表達(dá)盒包括體現(xiàn)為SEQ IDNO13的核酸17-3182、SEQ ID NO14的核酸17-3092和SEQ IDNO15的核酸17-3155的那些表達(dá)盒。含有這種表達(dá)盒的載體的說(shuō)明性實(shí)施方案公開于本文命名為SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQID NO15的序列中。
進(jìn)一步設(shè)想在本發(fā)明范圍內(nèi)的載體包括能夠既含有公開于以上2.1一節(jié)中的對(duì)雙翅目無(wú)活性的cry2A核酸組合物又含有包含植物可表達(dá)的其它Cry蛋白(例如Cry1蛋白)編碼區(qū)的任何其它DNA構(gòu)成物的那些載體。能夠含有這兩種構(gòu)成物的載體還可以在所述DNA構(gòu)成物之間包含一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；它們也可以含有多種不同的順?lè)醋?，使得它們?yōu)槎囗樂(lè)醋印?.4轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案包括用本文公開于2.1和2.2小節(jié)的DNA構(gòu)成物以及利用公開于2.3一節(jié)的轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明中設(shè)想的轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括表達(dá)由本發(fā)明新DNA構(gòu)成物編碼的蛋白的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。一般而言，該方法包括用含有有效連接于編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的編碼區(qū)的啟動(dòng)子的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。這樣的編碼區(qū)一般有效連接于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，由此所述啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)所述編碼區(qū)在該細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，并因此提供所述細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生所述δ-內(nèi)毒素的能力。或者，在希望控制、調(diào)節(jié)或減少在特定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種特定δ-內(nèi)毒素的量的情況下，本發(fā)明也提供δ-內(nèi)毒素反義mRNA、內(nèi)含子反義mRNA、PTP反義mRNA或UTR反義mRNA的表達(dá)。將反義mRNA用作控制或減少細(xì)胞中給定目的蛋白的量的手段是本領(lǐng)域眾所周知的。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括已經(jīng)用本發(fā)明的核酸區(qū)段或DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化并且表達(dá)編碼一種或多種本文公開的對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的基因或基因區(qū)段的植物細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞”是指已經(jīng)摻入DNA序列的植物細(xì)胞，所述DNA序列包括但不限于也許不通常不存在的基因、通常不轉(zhuǎn)錄為RNA或翻譯為蛋白(“表達(dá)”)的DNA序列、或人們需要引入非轉(zhuǎn)化植物中的任何其它基因或DNA序列，例如可能通常存在于非轉(zhuǎn)化植物中、但人們希望或者對(duì)其進(jìn)行遺傳工程或者將其表達(dá)改變的基因。
設(shè)想了在某些情況下，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的基因組將通過(guò)穩(wěn)定引入以上2.1和2.2小節(jié)中公開的對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的編碼DNA構(gòu)成物而增加。在某些情況下，將一個(gè)以上的轉(zhuǎn)基因加入所述轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞的核基因組中，或加入葉綠體或質(zhì)體基因組中。當(dāng)將一種以上晶體蛋白編碼DNA區(qū)段加入這種植物的基因組中時(shí)，情況是這樣的。在某些情況下，可能希望在轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物中加入一種、兩種、三種、四種或甚至更多種蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白編碼多核苷酸(或者天然的或者重組工程化的)并且在其中穩(wěn)定表達(dá)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述轉(zhuǎn)基因引入所述植物細(xì)胞的基因組中導(dǎo)致穩(wěn)定整合，其中這種植物的后代在其基因組中也含有一個(gè)拷貝的該轉(zhuǎn)基因。最初引入所述基因的植物的后代的這種遺傳元件的遺傳性是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面?？梢砸氲膬?yōu)選基因包括例如蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素，特別是一個(gè)或多個(gè)本文描述的δ-內(nèi)毒素。
轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(如美國(guó)專利5,550,318、5,508,468、5,482,852、5,384,253、5,276,269和5,225,341中例舉的，所述專利通過(guò)引用全部具體結(jié)合到本文中)，并且在本文中簡(jiǎn)短地進(jìn)行了討論。當(dāng)然，用于轉(zhuǎn)化這種細(xì)胞的載體、質(zhì)粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)和DNA區(qū)段一般包含本發(fā)明的或者操縱子、基因或者得自基因的序列，它們或者是天然的，或者是合成衍生的，特別是編碼所公開的晶體蛋白的那些操縱子、基因或者序列。這些DNA構(gòu)成物根據(jù)需要可以還包括一些結(jié)構(gòu)，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多接頭或者甚至對(duì)特定目的基因有正調(diào)節(jié)活性或負(fù)調(diào)節(jié)活性的基因序列。所述DNA區(qū)段或基因可以編碼或者天然或者修飾的晶體蛋白，所述晶體蛋白將在所產(chǎn)生的重組細(xì)胞中表達(dá)和/或?qū)①x予所述再生植物改進(jìn)的表型。
在本發(fā)明中具體設(shè)想的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。特別優(yōu)選的植物細(xì)胞包括得自玉米、小麥、大豆、草坪草、觀賞植物、果樹、灌木、蔬菜、谷類、豆科植物等或希望引入對(duì)雙翅目無(wú)活性的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素轉(zhuǎn)基因的任何植物的那些細(xì)胞。2.5轉(zhuǎn)化植物另一方面，用本發(fā)明的任何DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化的、表達(dá)所述構(gòu)成物編碼的蛋白的植物設(shè)想為本發(fā)明的一部分。因此，本發(fā)明還提供已經(jīng)用在2.1和2.2小節(jié)中公開的DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化、以及利用2.3一節(jié)中公開的轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。農(nóng)學(xué)、園藝、觀賞和其它經(jīng)濟(jì)或商業(yè)上有用的植物可以按照本文描述的方法制備，以足以賦予對(duì)昆蟲病原體的抗性而同時(shí)保持形態(tài)正常的高水平表達(dá)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素。
這種植物可以與以下物質(zhì)一起共表達(dá)所述δ-內(nèi)毒素多肽其它抗真菌、抗細(xì)菌或抗病毒致病相關(guān)肽、多肽或蛋白；殺蟲蛋白；賦予除草劑抗性的蛋白；和參與改進(jìn)植物產(chǎn)品品質(zhì)或數(shù)量、或植物農(nóng)藝性能的蛋白。在植物中同時(shí)共表達(dá)多種蛋白的優(yōu)點(diǎn)是，它利用一種以上的作用方式來(lái)防治植物病原體損害。這可以最大限度地減小產(chǎn)生抗性病原體品系的可能性，擴(kuò)大抗性范圍和潛在地產(chǎn)生協(xié)同殺蟲效應(yīng)，因此增強(qiáng)植物抗昆蟲侵染的能力(國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào)WO 92/17591，1992年10月15日，其通過(guò)引用全文具體結(jié)合到本文中)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物可以是單子葉植物或者是雙子葉植物。當(dāng)所述植物是單子葉植物時(shí)，它可以是各種各樣物種中的任一種。本發(fā)明包括的優(yōu)選單子葉植物物種可以包括玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、小米、高粱、甘蔗、石刁柏、草坪草或多種其它谷類植物中的任一種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單子葉植物是玉米植株。
本發(fā)明也設(shè)想了各種各樣的雙子葉植物，例如棉花、大豆、番茄、馬鈴薯、柑桔、煙草、甜菜、苜蓿、蠶豆、豌豆、菜豆、蘋果、櫻桃、梨、草莓、懸鉤子或任何其它豆科植物、塊莖或果樹。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙子葉植物是大豆植株、煙草植株或棉花植株。
按照所公開的發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物中的許多種植物是經(jīng)濟(jì)作物。商品形式的這些植物可以是原始植株或是已經(jīng)遺傳了所需轉(zhuǎn)基因的其后代。因此，還設(shè)想在本發(fā)明范圍內(nèi)的植物包括在本申請(qǐng)中記錄的DNA構(gòu)成物的任何變更物轉(zhuǎn)化的植物的任何后代。具體地說(shuō)，所述后代可以定義為R0轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)化植物的其它后代也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，包括所轉(zhuǎn)化植物任何后代的任何后代植物，其中所述后代植物已經(jīng)從任何R0植物遺傳了所述DNA構(gòu)成物。
用特定DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化時(shí)，所述構(gòu)成物的核酸或多核苷酸區(qū)段可以以不同的部分摻入轉(zhuǎn)化體的染色體中。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括應(yīng)用本文公開的DNA構(gòu)成物制備的任何轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明包括的這種植物或細(xì)胞包括通過(guò)有以下步驟的方法制備的植物或細(xì)胞(1)獲得一種DNA構(gòu)成物，所述DNA構(gòu)成物包含一個(gè)對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素編碼區(qū)，該編碼區(qū)符合讀框定位并在該植物中有效的啟動(dòng)子控制下；和一個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)位于所述Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素編碼區(qū)上游和所述啟動(dòng)子下游；和(2)用所獲得的DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化所述植物，以使所述植物表達(dá)所述Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素。也可以轉(zhuǎn)化所述植物，以使進(jìn)一步摻入到植物基因組中并表達(dá)其它Cryδ-內(nèi)毒素。
在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明也包括由所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子、得自這種種子的后代和由按照上述方法產(chǎn)生的原始轉(zhuǎn)基因植物的后代產(chǎn)生的種子。這種后代和種子均具有穩(wěn)定加入其基因組中的對(duì)雙翅目無(wú)活性的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素轉(zhuǎn)基因，并且這種后代植物將通過(guò)以孟德爾方式遺傳引入穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因而獲得的性狀。所有這種其基因組中摻入編碼任何本文公開的DNA構(gòu)成物，特別是在2.1和2.2小節(jié)公開的DNA構(gòu)成物的轉(zhuǎn)基因DNA區(qū)段的轉(zhuǎn)基因植物，是本發(fā)明的多個(gè)方面。
也產(chǎn)生了重組植物、細(xì)胞、種子和其它組織，其中僅改變了線粒體或葉綠體DNA以摻入在本申請(qǐng)中設(shè)想的分子。本領(lǐng)域已知在葉綠體中起作用的啟動(dòng)子(Hanley-Bowden等，Trends in Biochemical Sciences1267-70，1987)。Daniell等的美國(guó)專利第5,693,507號(hào)(1997)已經(jīng)描述了獲得含已經(jīng)插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物。2.6植物轉(zhuǎn)化方法2.6.1在植物中表達(dá)Cry2Aδ-內(nèi)毒素的方法在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在轉(zhuǎn)基因植物中高水平表達(dá)對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的方法。所公開的方法可以利用以上2.1和2.2小節(jié)中公開的任何DNA構(gòu)成物以及例如在以上2.3小節(jié)中公開的任何轉(zhuǎn)化載體。所述設(shè)想的方法使得用于防治幾種害蟲的Cry1A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的替代物Cry2Aδ-內(nèi)毒素可以在植物中表達(dá)，而不會(huì)負(fù)面影響回收農(nóng)學(xué)數(shù)量的轉(zhuǎn)基因植物。本文描述的發(fā)明也使得能夠以高于用目前方法獲得的水平至多25倍的水平表達(dá)Cry2Aδ-內(nèi)毒素。
本文所述方法因此使得表達(dá)Cry2A的植物能夠用作表達(dá)Cry1A型蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的植物的或者替代或者補(bǔ)充，來(lái)防治重要的害蟲并且進(jìn)行重要害蟲的抗性管理，所述重要的害蟲包括玉蜀黍中的稈野螟、桿草螟、Helicoverpa spp.和貪夜蛾；陸地棉中的煙芽夜蛾、Helicoverpa spp.、Pectinophora spp.；和大豆中的干煞夜蛾、Psedoplusia spp.、葉小卷蛾。也設(shè)想了所述方法可以用來(lái)顯著增強(qiáng)包括Cry2A和與Cry2A相關(guān)的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的表達(dá)，因此增強(qiáng)其對(duì)目標(biāo)害蟲的效力，并減低產(chǎn)生對(duì)這些蛋白抗性的可能性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)Cry2Abδ-內(nèi)毒素。該蛋白的目標(biāo)害蟲及其通常的寄主示于以下表1中。
表1Cry2Ab的目標(biāo)害蟲和那些害蟲的通常植物寄主害蟲 寄主參考文獻(xiàn)玉米螟 玉蜀黍Donovan(Ostrina nubialis)巨座玉米螟 陸地棉美國(guó)專利5,338,544(Diatraea grandiosella)Helicoverpazea 大豆煙芽夜蛾棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)黎豆夜蛾(Pseudoplusia includens)Epinotia aporema本文公開的在植物中表達(dá)Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的方法包括以下步驟(1)獲得包含一個(gè)啟動(dòng)子的核酸區(qū)段，所述啟動(dòng)子有效連接于編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的第一多核苷酸序列和編碼缺乏雙翅目活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的第二核苷酸序列，以產(chǎn)生包含氨基末端質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和缺乏雙翅目活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的融合蛋白；和(2)用步驟1的DNA構(gòu)成物轉(zhuǎn)化所述植物，以使所述植物表達(dá)所述蛋白融合體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建該方法步驟(1)中使用的核酸區(qū)段，以使所述第二多核苷酸序列的5’端在同一翻譯讀框中有效連接于所述第一多核苷酸序列的3’端。
通過(guò)本文公開的方法轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞可以或者是單子葉植物或者是雙子葉植物。當(dāng)所述植物是單子葉植物時(shí)，它可以是多種物種的任一種。本發(fā)明包括的優(yōu)選單子葉植物物種可以包括玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、小米、高粱、甘蔗、石刁柏、草坪草或多種其它谷類植物中的任一種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單子葉植物是玉米植株。
本發(fā)明也設(shè)想了轉(zhuǎn)化各種各樣的雙子葉植物或植物細(xì)胞的方法。所述雙子葉植物可以包括例如棉花、大豆、番茄、馬鈴薯、柑桔、煙草、甜菜、苜蓿、蠶豆、豌豆、菜豆、蘋果、櫻桃、梨、草莓、懸鉤子或任何其它豆科植物、塊莖或果樹的植物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙子葉植物是大豆植株、煙草植株或棉花植株或細(xì)胞。2.6.2在后代植物中表達(dá)Cry2Abδ-內(nèi)毒素的方法如在本發(fā)明公開的其它實(shí)施方案所述，計(jì)劃按照所公開發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物中的許多植物是商品作物。商品形式的這些植物可以是原始植物或是已經(jīng)遺傳有所需轉(zhuǎn)基因的其后代。因此，本發(fā)明人還設(shè)想了，本文公開的方法包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代植物或后代植物細(xì)胞的方法。產(chǎn)生這樣的后代的方法包括本文所公開的在植物中表達(dá)Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的方法包括以下步驟(1)獲得核酸區(qū)段，所述核酸區(qū)段包含有效連接于第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的啟動(dòng)子，所述第一多核苷酸序列編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，而所述第二多核苷酸序列編碼缺乏雙翅目活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素，以產(chǎn)生由氨基末端質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和缺乏雙翅目活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素組成的融合蛋白；(2)獲得第二植物；和(3)使所述第一植物和所述第二植物雜交，獲得已經(jīng)遺傳了來(lái)自所述第一植物的核酸區(qū)段的雜交轉(zhuǎn)基因后代植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明特別包括所述單子葉植物或雙子葉植物中任一種的后代、后代植物或種子，所述單子葉植物和雙子葉植物包括以上2.5和2.6.1小節(jié)中所提及的。2.6.3 Cry2Ab和其它Cry蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素在植物和后代植物中共表達(dá)在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本文公開的表達(dá)對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的方法包括與Cry1蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素一起共表達(dá)在任何其各種實(shí)施方案中所公開的DNA構(gòu)成物。預(yù)期一起表達(dá)這些Cry蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的方法將通過(guò)提高表達(dá)和減少昆蟲抗性產(chǎn)生而達(dá)到在所述轉(zhuǎn)化植物中增加殺蟲特性-所有這些均是在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有的所需結(jié)果。這種共表達(dá)可以在原始轉(zhuǎn)化體中，或在已經(jīng)遺傳了所述基因以共表達(dá)本文公開的任一DNA構(gòu)成物編碼的蛋白的原始轉(zhuǎn)化體后代的任何數(shù)目的世代中。
3.0附圖簡(jiǎn)述以下附圖構(gòu)成本說(shuō)明書的部分，并包括以進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參考一個(gè)或多個(gè)這些附圖并結(jié)合本文敘述的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明。
圖1.單子葉植物cry2Ab表達(dá)載體pMON30464、pMON30463和pMON26800的元件的圖示說(shuō)明。
圖2.雙子葉植物cry2Ab表達(dá)載體pMON33830、pMON33827、pMON33828和pMON33829的元件的圖示說(shuō)明。
圖3.雙子葉植物cry2Aa表達(dá)載體pMON33803、pMON33812、pMON33811和pMON33806的元件的圖示說(shuō)明。
圖4.命名為pMON30464的質(zhì)粒。
圖5.命名為pMON33827的質(zhì)粒。
圖6.命名為pMON33828的質(zhì)粒。
圖7.命名為pMON33829的質(zhì)粒。
4.0說(shuō)明性實(shí)施方案的描述提供以下本發(fā)明的詳細(xì)描述，以有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。雖然如此，以下詳細(xì)描述不應(yīng)該被解釋為不當(dāng)?shù)叵拗票景l(fā)明，因?yàn)樵诓黄x本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本文所述的實(shí)施方案中進(jìn)行各種修改和變化。4.1序列的鑒別SEQ ID NO1.cry2Ab基因的核酸序列。
SEQ ID NO2.cryAb蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO3.zmSSU質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列。
SEQ ID NO4.zmSSU質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO5.質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽1(PTP1)的核酸序列。
SEQ ID NO6.PTP1的氨基酸序列。
SEQ ID NO7.質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽1Δ(PTP1Δ)的核酸序列。
SEQ ID NO8.PTP1Δ的氨基酸序列。
SEQ ID NO9.質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽2(PTP2)的核酸序列。
SEQ ID NO10.PTP2的氨基酸序列。
SEQ ID NO11.cry2Aa基因的核酸序列。
SEQ ID NO12.cry2Aa多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO13.pMON33827。
SEQ ID NO14.pMON33828。
SEQ ID NO15.pMON33829。
SEQ ID NO16.pMON30464。
SEQ ID NO17.蘇云金芽孢桿菌cry2Ab基因序列，UWGCG登錄號(hào)M23724(Widner和Whiteley)。
SEQ ID NO18.由SEQ ID NO17翻譯的蘇云金芽孢桿菌cry2Ab氨基酸序列。4.2定義本文中以下詞語(yǔ)和短語(yǔ)具有下文陳述的含義。
生物功能性等同物在本發(fā)明殺蟲蛋白方面本文使用的這種等同物是這樣的肽、多肽和蛋白，它們所含的序列或部分表現(xiàn)出與本發(fā)明的新肽(例如Cry2Ab)有序列相似性，并且表現(xiàn)出與本文公開的多肽相同或相似的功能特性，包括殺蟲活性。生物等同物也包括與針對(duì)Cry2Ab產(chǎn)生的抗體反應(yīng)即與其特異性結(jié)合、并表現(xiàn)出相同或相似殺蟲活性的肽、多肽和蛋白，所述抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
如本文所用的葉綠體或質(zhì)體定位的是指或者為多核苷酸或者為多肽的生物分子，它們定位于葉綠體或質(zhì)體中，以使所述分子與細(xì)胞質(zhì)環(huán)境分離，并在葉綠體或質(zhì)體胞質(zhì)中起作用以提供本發(fā)明中宣布的效應(yīng)。生物分子定位至葉綠體或質(zhì)體，在多核苷酸方面，可以通過(guò)人工機(jī)械方法，例如電穿孔、機(jī)械微注射或通過(guò)多核苷酸包被的微粒轟擊而發(fā)生，在多肽方面，可以通過(guò)分泌或輸入方法而發(fā)生，其中使用用來(lái)將所連接的多肽導(dǎo)向、插入、輔助或定位到葉綠體或質(zhì)體中的天然、合成或異源質(zhì)體或葉綠體引導(dǎo)肽序列。
在農(nóng)業(yè)方面的對(duì)抗或防治蟲害是指減少害蟲侵染引起的對(duì)作物的損害。更概括地講，該短語(yǔ)是指由于在任何特定位置存在不希望有的昆蟲所引起的副作用的減小。
事件是指由于外源DNA插入核基因組DNA中一個(gè)或多個(gè)特有位點(diǎn)而得到的轉(zhuǎn)基因植物。
表達(dá)編碼DNA分子例如結(jié)構(gòu)基因所經(jīng)歷的產(chǎn)生多肽的胞內(nèi)過(guò)程的組合，所述胞內(nèi)過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄、翻譯和其它胞內(nèi)蛋白和RNA加工和穩(wěn)定功能。
殺蟲多肽是指具有殺蟲特性的多肽，例如抑制目標(biāo)害蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、生存力或生殖力的多肽。
有效連接的符合讀框連接以使一種區(qū)段的特性影響另一種區(qū)段表達(dá)的核酸編碼區(qū)段。
植物可表達(dá)的編碼區(qū)由于含有促進(jìn)目的基因表達(dá)的典型的植物調(diào)節(jié)元件而可在植物中表達(dá)的編碼區(qū)。
質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可用于將所連接的氨基酸(例如蛋白融合體)導(dǎo)向亞細(xì)胞區(qū)室或亞細(xì)胞器(例如質(zhì)體)的任何氨基酸序列。
后代“后代”包括所述轉(zhuǎn)基因植物的任何后代，或在其譜系中具有所述轉(zhuǎn)化體的任何后來(lái)的植物。后代不限于一個(gè)世代，而是包括所述轉(zhuǎn)化體的后代，只要它們含有或表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因。含有轉(zhuǎn)基因胚的種子以及得自所述轉(zhuǎn)基因植物種子和它們的后代，也是本發(fā)明的重要部分。
啟動(dòng)子DNA序列或一組DNA序列上的識(shí)別位點(diǎn)，它為結(jié)構(gòu)基因提供表達(dá)控制元件，并且RNA聚合酶與其特異性結(jié)合并起動(dòng)該基因的RNA合成(轉(zhuǎn)錄)。
R0是得自培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原代再生植株。得自所述R0的后來(lái)的后代或世代稱為R1(第一代)、R2(第二代)等。
再生由植物細(xì)胞(例如植物原生質(zhì)體或外植體)培育植株的過(guò)程。
穩(wěn)定保持在植物質(zhì)體或葉綠體中是指通過(guò)電穿孔、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或微團(tuán)或脂質(zhì)體樣融合將多核苷酸或核酸引入葉綠體或質(zhì)體中，其引入方式使得所述核酸或者通過(guò)重組摻入到葉綠體或質(zhì)體基因組中，或者作為駐留在葉綠體或質(zhì)體中的自主復(fù)制型共價(jià)閉環(huán)復(fù)制子，通過(guò)含有這種轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體的任何植物、植物細(xì)胞或植物組織的生長(zhǎng)，同時(shí)在需要在所述復(fù)制子上存在的并從所述復(fù)制子表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)基因的化學(xué)物質(zhì)或化合物存在，以確保所述植物、植物細(xì)胞或植物組織中的所述轉(zhuǎn)化質(zhì)體或葉綠體及其后代質(zhì)體或葉綠體存活的情況下，使所述核酸保留在受體葉綠體或質(zhì)體中以及保留在所述受體葉綠體或質(zhì)體的所有后來(lái)的后代中。
結(jié)構(gòu)編碼序列是指編碼肽、多肽或蛋白的DNA序列，所述肽、多肽或蛋白的DNA序列是由細(xì)胞在從所述結(jié)構(gòu)編碼序列轉(zhuǎn)錄出信使RNA(mRNA)、然后由mRNA翻譯出所需肽、多肽或蛋白產(chǎn)物后而制備的。
結(jié)構(gòu)基因被表達(dá)而產(chǎn)生多肽的基因。
大致同源性當(dāng)本文使用該術(shù)語(yǔ)時(shí)，是指其同源性約為86％至約90％、至約95％、至約99％的核酸序列或多肽序列。更具體地講，本發(fā)明人設(shè)想了與多肽的參比核酸序列的同源性約為86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98和99百分比的大致同源性。
大致時(shí)序或空間調(diào)節(jié)是指植物或植物組織內(nèi)的基因從植物有效啟動(dòng)子的表達(dá)。關(guān)于時(shí)序調(diào)節(jié)，啟動(dòng)子可以受到調(diào)節(jié)以僅在植物細(xì)胞或組織或甚至整株植物的生長(zhǎng)和發(fā)育期間的特定時(shí)間內(nèi)表達(dá)。僅在種子萌發(fā)期間活性表達(dá)一個(gè)或多個(gè)基因的啟動(dòng)子是時(shí)序調(diào)節(jié)的一個(gè)實(shí)例。其它實(shí)例可以包括僅在所述植物、植物細(xì)胞或植物組織暴露于一定光強(qiáng)時(shí)或在完全黑暗時(shí)活性表達(dá)一個(gè)或多個(gè)基因的啟動(dòng)子。大致時(shí)序調(diào)節(jié)涉及這樣的啟動(dòng)子所述啟動(dòng)子在一定時(shí)間活性表達(dá)，但在其它時(shí)間可能完全或不完全受抑制，因此通過(guò)監(jiān)測(cè)某些指示物(例如從連接于這種啟動(dòng)子的編碼序列產(chǎn)生的酶)的存在，或根據(jù)在整個(gè)植物生長(zhǎng)、分化和發(fā)育的不同時(shí)間和/或?qū)Σ煌h(huán)境刺激應(yīng)答而產(chǎn)生的某些基因產(chǎn)物例如mRNA的增加或減少進(jìn)行測(cè)量，仍可以檢測(cè)出表達(dá)。大致空間調(diào)節(jié)是指與僅在植物內(nèi)某些細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)和發(fā)育期間進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子連接的基因的表達(dá)。例如，預(yù)期絨氈層啟動(dòng)子僅在花生長(zhǎng)和發(fā)育期間表達(dá)。同樣，預(yù)期根特異性或根增強(qiáng)啟動(dòng)子僅在根細(xì)胞或根組織內(nèi)表達(dá)。大致空間調(diào)節(jié)也涉及得自特定組織特異性啟動(dòng)子的在該特定組織中的表達(dá)水平，也與在其它組織中得自該啟動(dòng)子或相似啟動(dòng)子的表達(dá)水平相關(guān)，其中表達(dá)也可以在優(yōu)選啟動(dòng)子表達(dá)的該特定組織以外的組織中檢測(cè)到，但根據(jù)由連接于該啟動(dòng)子的編碼序列產(chǎn)生的酶的產(chǎn)生或根據(jù)某些可檢測(cè)的基因產(chǎn)物的出現(xiàn)進(jìn)行測(cè)量，其表達(dá)水平明顯較低。啟動(dòng)子也可以既受大致時(shí)序調(diào)節(jié)，又受大致空間調(diào)節(jié)，以及以協(xié)同調(diào)節(jié)方式同時(shí)受調(diào)節(jié)。
合成基因編碼本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的合成基因是其制備方式涉及任何種類基因分離或操作的那些合成基因。這包括從天然存在的狀態(tài)分離所述基因，如通過(guò)密碼子修飾(如本文所述)進(jìn)行基因操作或定點(diǎn)誘變(如本文所述)、將所述基因截短或任何其它的操作或分離方法。
終止子3’端轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
轉(zhuǎn)化將外源DNA序列(例如載體或重組DNA分子)引入細(xì)胞或原生質(zhì)體中的方法，其中所述外源DNA摻入染色體中，或能夠自主復(fù)制。
轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過(guò)引入一種或多種外源DNA分子而改變的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因包含希望在受體細(xì)胞、組織或生物中表達(dá)的基因的基因構(gòu)成物或DNA區(qū)段。這可以包括完整的質(zhì)?；蚱渌d體，或可以僅僅包括所述轉(zhuǎn)移的DNA構(gòu)成物的功能性編碼區(qū)、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段。
轉(zhuǎn)基因細(xì)胞得自或再生自轉(zhuǎn)化細(xì)胞或得自轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的任何細(xì)胞。典型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括得自轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和得自轉(zhuǎn)基因植物的特定細(xì)胞例如葉片、根、莖例如體細(xì)胞或生殖細(xì)胞的植物愈傷組織。
轉(zhuǎn)基因事件通過(guò)將外源DNA插入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的核基因組而得到的植物或其后代。
轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被遺傳修飾以含有外源DNA序列并將其表達(dá)為蛋白的植物或其后代。如本文具體例舉的，遺傳修飾轉(zhuǎn)基因大豆植株，使其含有并表達(dá)有效連接于在植物細(xì)胞或組織中或在整株植株中起作用的轉(zhuǎn)錄控制序列并在其調(diào)控之下的至少一種異源DNA序列。轉(zhuǎn)基因植物也可以稱為轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)基因植物也是指原始轉(zhuǎn)基因植物的后代，其中那些后代含有并能夠表達(dá)在本文所述植物可表達(dá)轉(zhuǎn)錄控制序列的調(diào)節(jié)控制下的所述異源編碼序列。
載體能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或可以有效連接另一DNA區(qū)段以導(dǎo)致所連接的區(qū)段復(fù)制的DNA分子。質(zhì)粒是一種典型的載體。4.3編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素和質(zhì)體引導(dǎo)序列的核酸區(qū)段的合成和分離本發(fā)明公開了包含編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素以及質(zhì)體引導(dǎo)序列的多核苷酸序列的新DNA構(gòu)成物。構(gòu)建合成的蘇云金芽孢桿菌基因并將其在植物中表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且詳細(xì)描述于美國(guó)專利5,500,365中。本發(fā)明設(shè)想了應(yīng)用Cry2A蘇云金芽孢桿菌基因轉(zhuǎn)化單子葉植物和雙子葉植物。為了增強(qiáng)這些基因的表達(dá)，本發(fā)明提供了DNA構(gòu)成物，所述DNA構(gòu)成物包含位于編碼所需蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的多核苷酸序列上游的編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的多核苷酸區(qū)段。特別是，設(shè)想了編碼基本缺乏雙翅目物種抑制活性的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的序列。4.4探針和引物一方面，本發(fā)明提供的核苷酸序列信息可供用來(lái)制備有能力與本文公開的選定多核苷酸的基因序列特異性雜交的相對(duì)短的DNA序列。在這些方面，基于編碼Cry2Aδ-內(nèi)毒素多肽的選定多核苷酸序列(例如示于SEQ ID NO1的序列)的考慮，制備合適長(zhǎng)度的核酸探針。也可以基于編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的選定多核苷酸序列(例如示于SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9的那些序列)的考慮，制備這些核酸探針。這種核酸探針與編碼δ-內(nèi)毒素多肽或質(zhì)體引導(dǎo)肽序列的基因序列特異性雜交的能力，為它們提供了在多種實(shí)施方案中的特定用途。最為重要的是，所述探針可以用于多種測(cè)定中，以檢測(cè)特定樣品中互補(bǔ)序列的存在。
在某些實(shí)施方案中，最好使用寡核苷酸引物。采用本發(fā)明的多核苷酸設(shè)計(jì)這種引物的序列，以用來(lái)采用PCRTM技術(shù)對(duì)得自蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白基因的限定區(qū)段進(jìn)行檢測(cè)、擴(kuò)增或突變。該方法也可以用來(lái)對(duì)編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的多核苷酸的限定區(qū)段進(jìn)行檢測(cè)、擴(kuò)增或突變。與本發(fā)明編碼所述δ-內(nèi)毒素多肽和質(zhì)體引導(dǎo)肽的多核苷酸相關(guān)的基因區(qū)段也可以采用這種引物經(jīng)PCRTM來(lái)擴(kuò)增。
為了提供按照本發(fā)明的某些優(yōu)點(diǎn)，用于雜交研究或測(cè)定的優(yōu)選核酸序列包括與編碼晶體蛋白的多核苷酸序列(例如示于SEQ ID NO1的序列)的至少長(zhǎng)14-30個(gè)核苷酸等的一段序列互補(bǔ)的序列；與編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的序列(例如示于SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7和SEQ ID NO9的序列)的至少長(zhǎng)14-30個(gè)核苷酸等的一段序列互補(bǔ)的序列。
長(zhǎng)度至少為14個(gè)核苷酸的大小有助于確保所述片段具有足夠長(zhǎng)度，以形成穩(wěn)定且選擇性的雙鏈分子。一般優(yōu)選具有在長(zhǎng)14個(gè)堿基以上的區(qū)段內(nèi)互補(bǔ)序列的分子。為了提高所述雜交體的穩(wěn)定性和選擇性，并因此提高所獲得的特定雜交分子的質(zhì)量和程度，人們一般優(yōu)選設(shè)計(jì)具有14-20個(gè)核苷酸或必要時(shí)更長(zhǎng)的基因互補(bǔ)序列的核酸分子。通過(guò)例如化學(xué)方法直接合成所述片段，通過(guò)應(yīng)用核酸復(fù)制技術(shù)例如美國(guó)專利4,683,195和4,683,202(每個(gè)專利具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)的PCRTM技術(shù)，或通過(guò)從含有合適插入片段和合適限制位點(diǎn)的重組質(zhì)粒切下選定的DNA片段，可以容易地制備這樣的片段。4.5表達(dá)載體本發(fā)明也設(shè)想了包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是包含有效連接于編碼本發(fā)明多肽的編碼區(qū)的啟動(dòng)子的分離和純化的DNA分子，所述編碼區(qū)有效連接于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，因此所述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。所述編碼區(qū)可以包括編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的區(qū)段和編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的區(qū)段。包含所述DNA分子的表達(dá)載體也可以含有一個(gè)功能內(nèi)含子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“操作性連接的”或“有效連接的”是指啟動(dòng)子與編碼區(qū)連接的方式，使得該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄受該啟動(dòng)子的控制和調(diào)節(jié)。將啟動(dòng)子操作性連接于編碼區(qū)以調(diào)節(jié)上游和下游的方法是本領(lǐng)域熟知的。
優(yōu)選的植物轉(zhuǎn)化載體包括衍生自根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒的載體以及Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P 0120516(每個(gè)文獻(xiàn)具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)公開的那些載體。
在細(xì)菌中起作用的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域熟知的。用于蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的典型和優(yōu)選的啟動(dòng)子包括sigA、sigE和sigK基因的啟動(dòng)子。或者，可以使用天然的、誘變的、異源的或重組的晶體蛋白編碼基因啟動(dòng)子本身。
當(dāng)用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物時(shí)，選擇能夠在該特定植物種中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。在不同植物種中有功能的啟動(dòng)子也是本領(lǐng)域熟知的?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)多肽的啟動(dòng)子是如描述的誘導(dǎo)型、病毒的、合成的或組成型的那些啟動(dòng)子(Odell等，1985)和/或時(shí)序調(diào)節(jié)、空間調(diào)節(jié)和時(shí)空調(diào)節(jié)的那些啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子和FMV35S啟動(dòng)子。4.5.1具有質(zhì)體引導(dǎo)肽編碼區(qū)段的載體按照本發(fā)明，設(shè)計(jì)以特異性地增強(qiáng)所述多肽在轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)的表達(dá)載體可以包括編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽(PTP)的某些區(qū)域。這些區(qū)域當(dāng)與某些蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素結(jié)合時(shí)便于涉及所編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)的細(xì)胞過(guò)程完全被利用。這種質(zhì)體引導(dǎo)肽以多種方式起作用，例如通過(guò)將所表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至其最為有效操作的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，或通過(guò)將所表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至表達(dá)所必需的細(xì)胞過(guò)程集中的細(xì)胞區(qū)域。
PTP的應(yīng)用也可以提高形態(tài)正常植株的回收率和可以回收的轉(zhuǎn)基因植物的頻率。已知通過(guò)表達(dá)保持定位于細(xì)胞溶膠中的蛋白形式(即非定向形式)，已經(jīng)達(dá)到Cry1A和Cry3A型蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的商業(yè)上可利用的表達(dá)，因此最初在轉(zhuǎn)基因棉花、煙草和玉米中也嘗試了非定向形式的Cry2Aa和Cry2Ab兩者的表達(dá)。
在玉米中，非定向Cry2Ab表達(dá)轉(zhuǎn)化載體產(chǎn)生相對(duì)少的Cry2Ab的表達(dá)水平足以用于商業(yè)上可接受的蟲害防治的轉(zhuǎn)基因事件(即獨(dú)立的插入玉米基因組的事件)。此外，表達(dá)非定向Cry2Ab的許多玉米轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出使得所述植物為商業(yè)上不可接受的明顯的生長(zhǎng)缺陷，例如株型嚴(yán)重減小(矮化)或葉片嚴(yán)重黃化(缺綠癥)。非定向Cry2Ab在玉米中的表達(dá)水平不高于約15ppm，這是Cry2Ab介導(dǎo)的歐洲玉米螟(ECB)防治所需的最低水平。
雖然已經(jīng)描述了涉及質(zhì)體定向Cry1A型蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的研究(Wong等，1992)，但先前尚未描述過(guò)非同源Cry2A或Cry2A蛋白的定向。一篇質(zhì)體定向Cry1Ac表達(dá)的報(bào)道指出，這種定向?qū)е翪ry1Ac表達(dá)很少增加或不增加(美國(guó)專利第5,500,365號(hào))。另一篇報(bào)道指出，質(zhì)體定向形式的Cry1Ac表達(dá)的增加需要包括一段新的5’非翻譯前導(dǎo)序列(Wong等，1992)，并且該前導(dǎo)序列和引導(dǎo)序列對(duì)表達(dá)的影響非常依賴于所述結(jié)構(gòu)基因的編碼序列。Wong等推斷，包括前導(dǎo)序列和質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽這兩種將Cry1Ac的表達(dá)提高18倍，但所述相同的序列僅將β-葡糖醛酸糖苷酶的表達(dá)提高6倍。最后，先前的報(bào)道中沒(méi)有一篇預(yù)測(cè)質(zhì)體定向會(huì)導(dǎo)致形態(tài)正常的蘇云金芽孢桿菌表達(dá)植株的回收增加。
本發(fā)明公開了當(dāng)使用質(zhì)體定向形式的Cry2A時(shí)，以顯著更高的頻率回收以至多比ECB防治所需水平高10倍的水平表達(dá)對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2Aδ-內(nèi)毒素(例如Cry2Ab)的轉(zhuǎn)基因玉米植株。在Cry2Ab的情況下，在獲得防治ECB的轉(zhuǎn)基因玉米方面，提高的表達(dá)是關(guān)鍵性的，因?yàn)镃ry2Ab抗ECB的LC50顯著高于目前用來(lái)在轉(zhuǎn)基因玉米中防治ECB的Cry1Ab蘇云金芽孢桿菌的LC50ECB(美國(guó)專利5,338,544，1994；MacIntosh等，1990；Armstrong等，1995)。
增加的表達(dá)也尤其有價(jià)值，因?yàn)樗ㄟ^(guò)高劑量策略提供阻止抗性產(chǎn)生的額外保護(hù)(McGaughey和Whalon，1993；Roush，1994)。高水平表達(dá)甚至是更加希望的，因?yàn)樗跉⑾x基因表達(dá)由于環(huán)境條件而減低的情況下提供持久的昆蟲防護(hù)。另外并且意想不到的是，用質(zhì)體定向Cry2Ab表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的玉米植株表現(xiàn)出正常生長(zhǎng)和發(fā)育。
在Cry2Ab的定向和非定向(細(xì)胞溶膠)表達(dá)之間的顯著不同是Cry2Ab蛋白在用質(zhì)體定向Cry2Ab表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物中的水平相對(duì)于用細(xì)胞溶膠Cry2Ab載體轉(zhuǎn)化的植物顯著增加。這一結(jié)果是非常意想不到的。此外，與先前研究的內(nèi)容相反，本文公開的發(fā)明揭示出，采用所公開的質(zhì)體定向表達(dá)的方法，可以達(dá)到表型正常的轉(zhuǎn)基因植株的回收增加。
質(zhì)體引導(dǎo)肽(PTP)的一個(gè)實(shí)例是葉綠體引導(dǎo)肽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葉綠體引導(dǎo)肽在草甘膦抗性選擇標(biāo)記系統(tǒng)中特別有用。在該系統(tǒng)中，經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)賦予草甘膦抗性的蛋白的植物用將所述肽導(dǎo)向細(xì)胞的葉綠體的PTP轉(zhuǎn)化。草甘膦抑制莽草酸途徑，莽草酸途徑導(dǎo)致包括氨基酸和維生素在內(nèi)的芳族化合物的生物合成。具體地說(shuō)，草甘膦通過(guò)抑制5-烯酰丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPS)，抑制磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸莽草酸轉(zhuǎn)化為5-烯酰丙酮酰-3-磷酸莽草酸。通過(guò)插入編碼該酶的轉(zhuǎn)基因提供的補(bǔ)充的EPSPS，使得所述細(xì)胞可以抗草甘膦的效應(yīng)。因此，由于除草劑草甘膦的作用是通過(guò)特別是在所述細(xì)胞的葉綠體中中斷芳族氨基酸的生物合成而殺傷所述細(xì)胞，因此PTP通過(guò)將所述細(xì)胞表達(dá)的草甘膦抗性酶集中于葉綠體中，即集中于所述細(xì)胞的靶細(xì)胞器中，提供對(duì)該除草劑的增強(qiáng)抗性。典型的除草劑抗性酶包括上述的ESPS、草甘膦氧化還原酶(GOX)和aroA基因(參見美國(guó)專利第4,535,060號(hào),其具體通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中)。
PTP可以將蛋白導(dǎo)向葉綠體和其它質(zhì)體。例如，所述靶細(xì)胞器可以是造粉體。本發(fā)明優(yōu)選的PTP包括導(dǎo)向葉綠體以及其它質(zhì)體的那些PTP。優(yōu)選PTP的具體實(shí)例包括玉米R(shí)UBISCO SSU蛋白PTP和功能相關(guān)的肽，例如PTP1、PTPΔ和PTP2。這些PTP的實(shí)例為示于SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10中的多肽。編碼這些PTP多肽的多核苷酸序列示于SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9中。
也可以產(chǎn)生其中線粒體或葉綠體DNA已經(jīng)被改變以摻入本申請(qǐng)中設(shè)想的分子的重組植物、細(xì)胞、種子和其它植物組織。在葉綠體中起作用的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的(Hanley-Bowden等，Trends inBiochemical Sciences 1267-70，1987)。獲得含插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物已經(jīng)由Daniell等的美國(guó)專利第5,693,507號(hào)(1997)描述。McBride等(WO 95/24492)公開了編碼Cry1Aδ-內(nèi)毒素蛋白的基因在煙草植株葉綠體基因組中的定位和表達(dá)。如本文公開的，Cry2Aa定位至葉綠體或質(zhì)體，根據(jù)Cry2Aaδ-內(nèi)毒素的積累測(cè)定，導(dǎo)致表達(dá)水平降低，這與定位葉綠體或質(zhì)體的Cry2Abδ-內(nèi)毒素的表達(dá)提高相反。4.5.2啟動(dòng)子在表達(dá)載體中的應(yīng)用以雙鏈DNA形式存在的基因的表達(dá)，涉及由RNA聚合酶從所述DNA的編碼鏈轉(zhuǎn)錄出信使RNA(mRNA)，隨后在細(xì)胞核內(nèi)加工mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物。從DNA轉(zhuǎn)錄出mRNA受通常稱為“啟動(dòng)子”的DNA區(qū)的調(diào)節(jié)。啟動(dòng)子區(qū)含有一段堿基序列，該序列對(duì)RNA聚合酶發(fā)送信號(hào)以使其與所述DNA結(jié)合，并采用所述DNA鏈中的一條作為模板啟動(dòng)mRNA的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生相應(yīng)的RNA鏈。選定的特定啟動(dòng)子應(yīng)該能夠引起該酶編碼序列的足夠表達(dá)，以導(dǎo)致產(chǎn)生有效殺蟲量的所述蘇云金芽孢桿菌蛋白。
本發(fā)明的嵌合植物基因的3’非翻譯區(qū)也含有一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)，該信號(hào)在植物中起作用，以使得腺苷酸核苷酸添加至所述RNA的3’端。優(yōu)選的3’區(qū)的實(shí)例是(1)含有土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因例如胭脂堿合酶(NOS)基因的聚腺苷酸化信號(hào)的3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)，和(2)植物基因例如豌豆ssRUBISCO E9基因的3’端(Fischhoff等，1987)。
根據(jù)啟動(dòng)子將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)錄活性導(dǎo)向編碼區(qū)的能力來(lái)選擇啟動(dòng)子，以確保所述酶編碼序列的足夠表達(dá)，以導(dǎo)致產(chǎn)生殺蟲量的蘇云金芽孢桿菌蛋白。在植物組織中結(jié)構(gòu)基因可以由各種各樣的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。啟動(dòng)子可以是近組成型的(near-constitutive)(即它們?cè)谒薪M織中均驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄)，例如CaMV35S啟動(dòng)子；或影響雙子葉植物或單子葉植物的組織特異性或發(fā)育特異性的啟動(dòng)子。當(dāng)啟動(dòng)子為近組成型啟動(dòng)子，例如為CaMV35S或FMV35S時(shí)，在許多轉(zhuǎn)化植物組織和大多數(shù)植物器官(例如愈傷組織、葉片、種子和根)中發(fā)現(xiàn)多肽表達(dá)的增加。增強(qiáng)的或重復(fù)形式的CaMV35S和FMV35S啟動(dòng)子在本發(fā)明的實(shí)施中特別有用(Kay等，1987；Rogers，美國(guó)專利5,378,619)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，有許多啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中有活性，并且已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述。這樣的啟動(dòng)子可以得自植物或植物病毒，包括但不限于胭脂堿合酶(NOS)啟動(dòng)子和章魚堿合酶(OCS)啟動(dòng)子(它們載于根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動(dòng)子、來(lái)自核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)小亞基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、水稻Actl啟動(dòng)子和玄參花葉病毒(FMV)35S啟動(dòng)子。所有這些啟動(dòng)子已經(jīng)用來(lái)創(chuàng)造各種類型的DNA構(gòu)成物，所述構(gòu)成物已經(jīng)在植物中表達(dá)(參見例如McElroy等，1990，美國(guó)專利5,463,175)。
另外，也可能最好采用含有組織特異性啟動(dòng)子的植物整合型載體，促使蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素在植物的特定組織中表達(dá)。具體的靶組織可以包括葉片、莖、根、塊莖、種子、果實(shí)等，所選擇的啟動(dòng)子應(yīng)該具有所需的組織和發(fā)育特異性。因此，應(yīng)該通過(guò)選擇具有所需組織表達(dá)能力和接近的啟動(dòng)子強(qiáng)度的啟動(dòng)子，并選擇在所述靶組織中產(chǎn)生所需殺蟲活性的轉(zhuǎn)化體，使啟動(dòng)子功能最佳化。在異源結(jié)構(gòu)基因在植物中表達(dá)方面，這種來(lái)自轉(zhuǎn)化體庫(kù)(pool)的選擇方法是常規(guī)使用的，因?yàn)樵诤型划愒椿虻霓D(zhuǎn)化體之間有由于在所述植物基因組中基因插入位點(diǎn)而引起的變異(通常稱為“位置效應(yīng)”)。除已知引起DNA在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄(組成型或組織特異性的)的啟動(dòng)子外，可以通過(guò)在植物cDNA文庫(kù)中篩選選擇性或優(yōu)選在靶組織中表達(dá)的基因，鑒定其它啟動(dòng)子以用于本發(fā)明中，然后確定所述啟動(dòng)子區(qū)。
典型的組織特異性啟動(dòng)子是凝集素啟動(dòng)子，它是種子組織特異性的。大豆種子中的凝集素蛋白由僅在種子成熟期間表達(dá)的單基因(Lel)編碼，并且占總種子mRNA的約2-5％。已經(jīng)全面表征了凝集素基因和種子特異性啟動(dòng)子，并用來(lái)指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植株中的種子特異性表達(dá)(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。可以將含有編碼目的多肽的編碼區(qū)的表達(dá)載體工程改造，以將其置于所述凝集素啟動(dòng)子控制之下，并且可以采用例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(Dhir等，1991)，將該載體引入植物中。所述多肽的表達(dá)則應(yīng)特異性地導(dǎo)向轉(zhuǎn)基因植物的種子。
由用組織特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物可以與由用不同的組織特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生的第二轉(zhuǎn)基因植物雜交，以產(chǎn)生在一個(gè)以上的特定組織中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化效應(yīng)的雜種轉(zhuǎn)基因植物。
其它典型的組織特異性啟動(dòng)子是玉米蔗糖合成酶1(Yang等，1990)、玉米乙醇脫氫酶1(Vogel等，1989)、玉米集光復(fù)合體(Simpson，1986)、玉米熱激蛋白(Odell等，1985)、豌豆小亞基RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)、Ti質(zhì)粒甘露堿合酶(McBride和Summerfelt，1989)、Ti質(zhì)粒胭脂堿合酶(Langridge等，1989)、矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶(Van Tunen等，1988)、菜豆富甘氨酸蛋白1(Keller等，1989)、CaMV35s轉(zhuǎn)錄物(Odell等，1985)和馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)。優(yōu)選的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動(dòng)子和S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動(dòng)子。
如有需要，可以對(duì)用于本發(fā)明DNA構(gòu)成物中的啟動(dòng)子進(jìn)行修飾，以影響其控制特性。例如，可以將CaMV35S啟動(dòng)子連接于ssRUBISCO基因代表在缺乏光時(shí)表達(dá)ssRUBISCO的部分，以產(chǎn)生在葉片有活性而在根中無(wú)活性的啟動(dòng)子。所得的嵌合啟動(dòng)子可以如本文所述使用。為了這種描述，短語(yǔ)“CaMV35S”啟動(dòng)子因此包括CaMV35S啟動(dòng)子的變異，例如由于與操縱基因區(qū)連接、隨機(jī)誘變或控制誘變等得到的啟動(dòng)子。此外，可以將所述啟動(dòng)子改變，以含有多個(gè)“增強(qiáng)子序列”，以有助于提高基因表達(dá)。這類增強(qiáng)子序列的實(shí)例已經(jīng)由Kay等(1987)報(bào)道。葉綠體或質(zhì)體特異性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的(Daniell等，美國(guó)專利第5,693,507號(hào)；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，例如可得自例如以下葉綠體基因的啟動(dòng)子得自菠菜或豌豆的psbA基因、得自玉米的rbcL和atpB啟動(dòng)子區(qū)和rRNA啟動(dòng)子。任何葉綠體或質(zhì)體有效啟動(dòng)子均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
由本發(fā)明DNA構(gòu)成物產(chǎn)生的RNA也含有5’非翻譯前導(dǎo)序列。該序列可以得自選擇用來(lái)表達(dá)所述基因的啟動(dòng)子，并且可以對(duì)其進(jìn)行特異性地修飾，以增加所述mRNA的翻譯。5’非翻譯區(qū)也可以得自病毒RNA、合適的真核基因或合成的基因序列。本發(fā)明不限于其中非翻譯區(qū)得自伴隨所述啟動(dòng)子序列的5’非翻譯序列的構(gòu)成物。如下所示，可用于本發(fā)明的植物基因前導(dǎo)序列是矮牽牛熱激蛋白70(hsp70)前導(dǎo)序列(Winter等，1988)。
本發(fā)明的一個(gè)典型實(shí)施方案包括所述蘇云金芽孢桿菌氨基酸序列的質(zhì)體定向或質(zhì)體定位。質(zhì)體導(dǎo)向序列已經(jīng)從許多核編碼的植物基因中分離出來(lái)，并且已經(jīng)顯示引導(dǎo)胞質(zhì)合成的蛋白輸入質(zhì)體(Keegstra和Olsen的綜述，1989)。本領(lǐng)域熟知的各種各樣的質(zhì)體導(dǎo)向序列可以用于實(shí)施本發(fā)明，它們包括但不限于ADPGPP、EPSP合酶或ssBUBISCO。在可供選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于單子葉作物的質(zhì)體導(dǎo)向序列(肽和核酸)可以包含含內(nèi)含子序列的基因組編碼片段以及在編碼的質(zhì)體導(dǎo)向序列中的重復(fù)(duplicated)蛋白酶切位點(diǎn)。
最優(yōu)選的核酸序列在此稱為zmSSU PTP(SEQ ID NO3)，它包含一個(gè)含內(nèi)含子序列的基因組編碼片段以及一個(gè)在編碼的質(zhì)體導(dǎo)向序列中的重復(fù)蛋白酶切位點(diǎn)，衍生自質(zhì)體導(dǎo)向序列zmS1(Russell等，1993)。zmSSU PTP肽序列(SEQ ID NO4)與所述序列氨基末端的直接翻譯融合體，可用于在轉(zhuǎn)基因玉米中獲得提高水平的所述多肽。可以通過(guò)將zmSSU PTP序列3’(C末端編碼)末端的NcoI位點(diǎn)與cry2Ab序列的5’NcoI位點(diǎn)(N末端編碼)連接，實(shí)現(xiàn)zmSSU PTP核酸序列(SEQ IDNO3)與cry2Ab基因(SEQ ID NO1)符合讀框的融合。
用于雙子葉作物的在此稱為PTP2(SEQ ID NO9)的優(yōu)選序列包含一個(gè)含葉綠體引導(dǎo)肽序列的基因組編碼片段，所述葉綠體引導(dǎo)肽序列得自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的EPSP合酶基因，其中豌豆ssRUBISCO PTP的轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)取代了所述天然EPSP合酶的PTP切割位點(diǎn)(Klee等，1987)。
如上所述，本發(fā)明的嵌合植物基因的3’非翻譯區(qū)含有一個(gè)在植物中起作用的聚腺苷酸化信號(hào)，使得腺苷酸核苷酸添加至所述RNA的3’端。優(yōu)選的3’區(qū)的實(shí)例是(1)3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)，含有土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因如胭脂堿合酶(NOS)基因的聚腺苷酸化信號(hào)，和(2)植物基因，例如豌豆ssRLUBISCO E9基因(Fischhoff等，1987)。4.5.3內(nèi)含子在表達(dá)載體中的應(yīng)用為了使在單子葉植物中的表達(dá)最佳化，在所述DNA表達(dá)構(gòu)成物中也可以包含內(nèi)含子。這種內(nèi)含子通常置于非翻譯序列中mRNA 5’端附近。這種內(nèi)含子可以得自但不限于以下一組內(nèi)含子玉米熱激蛋白(HSP)70內(nèi)含子(美國(guó)專利5,424,412；1995)、水稻Actl內(nèi)含子(McElroy等，1990)、Adh內(nèi)含子1(Callis等，1 987)或蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等，1989)。正如本文所示，玉米HSP70內(nèi)含子可用于本發(fā)明中。4.5.4終止子在表達(dá)載體中的應(yīng)用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄核基因組編碼DNA序列通過(guò)聚腺苷酸化發(fā)生的位點(diǎn)。通常，位于聚腺苷酸化位點(diǎn)下游數(shù)百個(gè)堿基對(duì)的DNA序列用來(lái)終止轉(zhuǎn)錄。那些DNA序列在此稱為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄的信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化需要那些區(qū)。對(duì)于引入葉綠體或質(zhì)體、或引入葉綠體或質(zhì)體基因組中的編碼序列，mRNA轉(zhuǎn)錄的終止與細(xì)菌基因表達(dá)領(lǐng)域中熟知的方法相似。例如，通過(guò)干環(huán)結(jié)構(gòu)或類似于依賴于rho的序列的結(jié)構(gòu)，可以終止或者多順?lè)醋踊騿雾樂(lè)醋有蛄械霓D(zhuǎn)錄。
構(gòu)成物通常包括目的基因與用作終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)并且在構(gòu)成物中計(jì)劃用于核基因組表達(dá)的3’端DNA序列，便于產(chǎn)生的mRNA聚腺苷酸化。最優(yōu)選的3’元件設(shè)想為得自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因的那些3’元件(nos3’端)(Bevan等，1983)、根癌土壤桿菌章魚堿合酶基因T7轉(zhuǎn)錄物的終止子和馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑i或ii基因的3’端。如有需要，可以再包括調(diào)節(jié)元件例如TMVΩ元件(Gallie等，1989)。4.5.5其它表達(dá)增強(qiáng)元件可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的另一種類型的元件是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列起點(diǎn)之間的DNA序列，稱為非翻譯前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列可以影響基因表達(dá)?？梢赃M(jìn)行前導(dǎo)序列的編譯(compilation)，以預(yù)測(cè)最適或亞適序列，并產(chǎn)生“共有序列”和優(yōu)選的前導(dǎo)序列(Joshi，1987)。設(shè)想優(yōu)選的前導(dǎo)序列包括包含預(yù)測(cè)指導(dǎo)所連接的結(jié)構(gòu)基因最佳表達(dá)的序列的那些前導(dǎo)序列，即包括可以增加或保持mRNA穩(wěn)定性并防止翻譯不正確起始的優(yōu)選共有前導(dǎo)序列。按照本說(shuō)明書，這類序列的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。最優(yōu)選由在植物、特別是在玉米中高表達(dá)的基因衍生的序列。一個(gè)特別有用的前導(dǎo)序列可以是矮牽牛HSP70前導(dǎo)序列。
轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或增強(qiáng)子重復(fù)可以用來(lái)增加表達(dá)。這些增強(qiáng)子通常發(fā)現(xiàn)位于在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子中的轉(zhuǎn)錄起始處的5’，但通常可以以正向或反向插入所述編碼序列的5’或3’。增強(qiáng)子的實(shí)例包括得自CaMV 35S啟動(dòng)子、章魚堿合酶基因(Ellis等，1987)、水稻肌動(dòng)蛋白基因和非植物真核生物(例如酵母；Ma等，1988)啟動(dòng)子的元件。4.5.6多基因載體構(gòu)成物和IRES在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)元件的應(yīng)用用來(lái)產(chǎn)生多基因或多順?lè)醋有畔ⅰRES元件能夠繞過(guò)依賴于5’甲基化帽翻譯的核糖體掃描模型，并在內(nèi)部位點(diǎn)開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已經(jīng)描述了得自小RNA病毒科兩個(gè)成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及得自哺乳動(dòng)物信息的IRES元件(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以連接于異源可讀框。多個(gè)可讀框可以一起轉(zhuǎn)錄，每個(gè)可讀框由一個(gè)IRES分隔，產(chǎn)生多順?lè)醋有畔?。借助所述IRES元件，每個(gè)可讀框可為核糖體所及，以有效翻譯。采用單啟動(dòng)子/增強(qiáng)子可以有效表達(dá)多基因，以轉(zhuǎn)錄一個(gè)單一信息。
任何異源可讀框均可以連接于IRES元件。這包括以下蛋白的基因分泌蛋白、由獨(dú)立的基因編碼的多亞基蛋白、胞內(nèi)蛋白或膜結(jié)合蛋白和選擇標(biāo)記。這樣，可以用一種構(gòu)成物和一種選擇標(biāo)記，將幾種蛋白的表達(dá)同時(shí)工程化到一個(gè)細(xì)胞中。
計(jì)劃利用葉綠體或質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器在葉綠體或質(zhì)體內(nèi)表達(dá)的構(gòu)成物可以含有或者單順?lè)醋踊蚨囗樂(lè)醋有蛄小?.5.7表達(dá)載體的構(gòu)建選擇哪種表達(dá)載體以及選擇哪種與多肽編碼區(qū)最終操作性連接的啟動(dòng)子直接取決于所需的功能特性，例如蛋白表達(dá)的位置和時(shí)間以及待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在構(gòu)建重組DNA分子的領(lǐng)域中有固有的眾所周知的限制。然而，可用于實(shí)施本發(fā)明的載體能夠指導(dǎo)與其操作性連接的多肽編碼區(qū)的表達(dá)。
可用于在高等植物中表達(dá)基因的典型的載體是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括衍生自描述的根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒(Rogers等，1987)的載體。然而，已知幾種其它植物整合型載體系統(tǒng)在植物中起作用，包括描述的pCaMVCN轉(zhuǎn)移控制載體(Fromm等，1985)。pCaMVCN(可得自Pharmacia，Piscataway，NJ)包括CaMV35S啟動(dòng)子。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，用來(lái)表達(dá)所述多肽的載體包括一個(gè)在植物細(xì)胞中有效的選擇標(biāo)記，最好是抗藥性選擇標(biāo)記。一個(gè)優(yōu)選的抗藥性標(biāo)記是其表達(dá)導(dǎo)致卡那霉素抗性的基因，即已描述的含有胭脂堿合酶啟動(dòng)子、Tn5新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)和胭脂堿合酶3’非翻譯區(qū)的嵌合基因(Rogers等，1988)。
用于制備表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用來(lái)轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)(轉(zhuǎn)化)載體和制備那些載體的方法描述于美國(guó)專利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011(每個(gè)文獻(xiàn)具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)?？梢孕揎椖切┹d體，以使其包括按照本發(fā)明的編碼序列。
已經(jīng)開發(fā)了多種方法以通過(guò)互補(bǔ)粘性末端或平端將DNA操作性地連接于載體。例如，可以將互補(bǔ)同聚物序列段加至待插入的DNA區(qū)段以及加至載體DNA。然后通過(guò)互補(bǔ)同聚物尾之間的氫鍵連接所述載體和DNA區(qū)段，形成重組DNA分子。
編碼有能力賦予細(xì)胞殺蟲活性的多肽的編碼區(qū)，最好是編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的多核苷酸或這種多核苷酸的功能等同體。按照這種實(shí)施方案，也優(yōu)選包含SEQ ID NO1的DNA序列的編碼區(qū)。
已經(jīng)表明結(jié)合質(zhì)體引導(dǎo)肽編碼基因成功轉(zhuǎn)化植物、以高水平表達(dá)特定蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的所述δ-內(nèi)毒素多肽編碼基因，是包含在所述質(zhì)粒載體中的那些基因。含質(zhì)體引導(dǎo)肽的優(yōu)選質(zhì)粒包括pMON30464、pMON33827、pMON33828、pMON33829。這些質(zhì)粒由SEQ ID NO16、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ IDNO15中所示序列編碼。更優(yōu)選的是，可以用含有包含以下核苷酸序列的表達(dá)盒的任何載體成功地轉(zhuǎn)化植物SEQ ID NO16的核苷酸1781-5869、SEQ ID NO13的核苷酸17-3182、SEQ ID NO14的核苷酸17-3092或SEQ ID NO15的核苷酸17-3155。
本文所述的研究已經(jīng)鑒定出在植物中增強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素表達(dá)的方法，所述內(nèi)毒素當(dāng)加入感病植物的核基因組、質(zhì)體或葉綠體基因組中時(shí)賦予對(duì)昆蟲病原體的抗性。美國(guó)專利5,500,365(具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)描述了用于合成植物基因以優(yōu)化所合成基因編碼的蛋白的表達(dá)水平的方法。該方法涉及對(duì)外源轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)基因序列的修飾，以使其更“象植物”，并因此更有可能被所述植物翻譯和表達(dá)。用于最好在單子葉植物中增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)的相似方法公開于美國(guó)專利5,689,052(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。農(nóng)學(xué)、園藝、觀賞和其它經(jīng)濟(jì)或商業(yè)上有用的植物可以按照本文所述的方法制備，使所述植物以足以賦予對(duì)昆蟲病原體抗性的高水平表達(dá)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素。
這類植物可以共表達(dá)所述蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素多肽以及以下其它物質(zhì)抗真菌、抗細(xì)菌或抗病毒的致病相關(guān)肽、多肽或蛋白；殺蟲蛋白；賦予除草劑抗性的蛋白；和涉及提高植物制品質(zhì)量或植物農(nóng)藝性能的蛋白。在植物中同時(shí)共表達(dá)多種蛋白是有利的，因?yàn)樗靡环N以上的作用方式來(lái)防治植物病原體損害。這可以使產(chǎn)生抗性病原體品系的概率減至最小、擴(kuò)大抗性譜和潛在地導(dǎo)致協(xié)同殺蟲效應(yīng)，由此增強(qiáng)植物抗昆蟲侵染的能力(WO 92/17591)。
具體設(shè)想了按照本發(fā)明使用包括ocs增強(qiáng)子元件的載體。該元件首先作為16bp回文增強(qiáng)子從土壤桿菌章魚堿合酶(ocs)基因中鑒定出(Ellis等，19870，并存在于至少10種其它啟動(dòng)子中(Bouchez等，1989)。提出當(dāng)在單子葉植物轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用時(shí)，增強(qiáng)子元件例如ocs元件、特別是多拷貝的該元件的應(yīng)用可以用來(lái)提高來(lái)自相鄰啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。
設(shè)想了可能希望引入包含一種以上基因的大DNA序列。利用細(xì)菌或酵母人工染色體(分別為BAC或YAC)或甚至植物人工染色體，有助于這種序列的引入。例如，Hamilton等(1996)公開了應(yīng)用BAC進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
最后，用于引入單子葉植物基因組中的最理想的DNA區(qū)段可以是編碼所需性狀(例如增產(chǎn))的同源基因或基因家族，它們?cè)谛聠?dòng)子或增強(qiáng)子等、或許甚至同源或組織特異性(例如根頸/根鞘、輪生體、莖、穗梗(earshank)、籽?；蛉~片特異性)啟動(dòng)子或控制元件控制下被引入。事實(shí)上，設(shè)想了本發(fā)明的具體應(yīng)用可以是產(chǎn)生包含被以組織特異性方式導(dǎo)向的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體。例如，抗蟲性基因可以在輪生體和根頸/根鞘組織中特異性表達(dá)，這些組織分別是ECB的第一批和第二批卵(broods)的目標(biāo)。同樣，可以將具有抗根蟲(rootworm)特殊活性的蛋白的編碼基因直接導(dǎo)向根組織。
用于在轉(zhuǎn)基因植物中組織特異性地導(dǎo)向基因表達(dá)的載體通常包括組織特異性啟動(dòng)子，也可以包括其它組織特異性控制元件，例如增強(qiáng)子序列。按照本說(shuō)明書，在某些植物組織中指導(dǎo)特異性的或增強(qiáng)的表達(dá)的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
也設(shè)想了通過(guò)將組成型表達(dá)的基因(在所有組織中)和僅在不需要所述基因產(chǎn)物的組織中表達(dá)的反義基因共同引入，可以功能性地實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)。例如，可以引入編碼蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶毒素蛋白的基因，以使采用花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子將其在所有組織中表達(dá)?；蛘撸炯?dòng)蛋白啟動(dòng)子或雙子葉植物或單子葉植物種的組蛋白啟動(dòng)子也可以用于組成型基因表達(dá)。此外，設(shè)想了結(jié)合得自一種以上啟動(dòng)子的元件的啟動(dòng)子可能是有用的。例如，美國(guó)專利5,491,288公開了將花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子與組蛋白啟動(dòng)子結(jié)合。因此，采用例如玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子在玉米籽粒中表達(dá)Bt基因反義轉(zhuǎn)錄物可能防止所述δ-內(nèi)毒素在種子中累積。因此，由所引入的基因編碼的蛋白就存在于除籽粒外的所有組織中。本發(fā)明人特別設(shè)想了相似的策略可以用于本發(fā)明，以指導(dǎo)可篩選標(biāo)記或選擇標(biāo)記在種子組織中的表達(dá)。
另一方面，人們可能希望獲得按照本發(fā)明使用的新組織特異性啟動(dòng)子序列。為此，人們可以首先從所關(guān)注的組織中分離cDNA克隆，并例如采用RNA印跡法鑒定在該組織中特異性表達(dá)的那些克隆。理想的是，人們有可能鑒定出不以高拷貝數(shù)存在的基因，但所述基因產(chǎn)物在特定組織中相對(duì)豐富?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)技術(shù)，將相應(yīng)的基因組克隆的啟動(dòng)子和控制元件定位。
設(shè)想了僅需要在特定條件下在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)某些基因。例如，建議賦予對(duì)環(huán)境脅迫因素例如干旱的抗性的某些基因僅需要在真正的脅迫條件下表達(dá)。進(jìn)一步設(shè)想了這類基因在植物的整個(gè)發(fā)育期間的表達(dá)可能具有有害效應(yīng)。已知存在著大量對(duì)環(huán)境應(yīng)答的基因。例如，由光通過(guò)植物光敏素介導(dǎo)調(diào)節(jié)某些基因例如編碼核酮糖二磷酸羧化酶小亞基的rbcS的表達(dá)。其它基因由次級(jí)刺激物誘導(dǎo)。例如，脫落酸(ABA)的合成由某些環(huán)境因素誘導(dǎo)，包括但不限于水脅迫。已經(jīng)表明許多基因由ABA誘導(dǎo)(Skriver和Mundy，1990)。也預(yù)期可能僅需要在實(shí)際昆蟲侵襲的條件下表達(dá)賦予抗昆蟲掠食的基因。因此，對(duì)于某些所需性狀，需要在轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)型表達(dá)基因。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提出僅需要在植物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基因。發(fā)育的定時(shí)通常與組織特異性基因表達(dá)相關(guān)。例如，在傳粉后約15天在胚乳中啟動(dòng)玉米醇溶蛋白貯存蛋白的表達(dá)。
也設(shè)想了就一個(gè)細(xì)胞而言DNA自身定向可能是有用的。例如，將所引入的DNA導(dǎo)向細(xì)胞核可能是有用的，因?yàn)檫@可以提高轉(zhuǎn)化頻率。在細(xì)胞核自身中，將基因定向以便達(dá)到定點(diǎn)整合可能是有用的。例如，讓通過(guò)轉(zhuǎn)化引入的基因取代該細(xì)胞中現(xiàn)有的基因可能是有用的。4.6殺蟲蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素和基因的鑒定和分離設(shè)想了本發(fā)明中所述方法可以用來(lái)獲得多種新的如下文所述分離的蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素的大大提高的表達(dá)。先前已經(jīng)描述了對(duì)于編碼具殺蟲活性的結(jié)晶內(nèi)毒素的新蘇云金芽孢桿菌菌株的鑒定(Donovan等，1992)。分離出蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素，然后進(jìn)行氨基末端的氨基酸序列分析、反向翻譯(back-translation)所述氨基酸序列，以設(shè)計(jì)寡核苷酸探針或應(yīng)用相關(guān)的蘇云金芽孢桿菌基因作為探針，然后通過(guò)雜交克隆編碼所述內(nèi)毒素的基因，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的，并且已有描述(參見例如Donovan等，1992，美國(guó)專利5,264,364，每個(gè)文獻(xiàn)具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
通過(guò)本發(fā)明描述的方法，可以達(dá)到在轉(zhuǎn)基因植物中提高表達(dá)對(duì)雙翅目無(wú)活性的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素。一種獲得提高表達(dá)的蛋白是Cry2Ab。
先前的研究表明，某些Cry2Aδ-內(nèi)毒素能夠具有比其它密切相關(guān)的Cry2Aδ-內(nèi)毒素更寬的寄主范圍特異性，其中不僅鱗翅目物種，而且雙翅目物種也對(duì)非常低的毒素劑量特別敏感。相反，沒(méi)有表現(xiàn)出顯著雙翅目抑制活性的密切相關(guān)的Cry2A內(nèi)毒素因此表現(xiàn)出其寄主范圍特異性更窄(Widner等，1989，J.Bacteriol.171965-974；Widner等(a)，1990，J.Bacteriol.1722826-2832)。這些研究表明，此中所用的Cry2Ab不是完全缺乏雙翅目抑制活性，而是僅僅比其它密切相關(guān)的Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的效力低得多。那些研究表明，特別是Cry2Ab比Cry2Aa的效力低得多，因此當(dāng)針對(duì)埃及伊蚊(Aedes egyptii)測(cè)試時(shí)缺乏雙翅目活性。然而，對(duì)于密切相關(guān)的δ-內(nèi)毒素之間的鑒別沒(méi)有一種單一可接受的方法，如本文所述，通過(guò)采用一種方法或幾種方法的組合可以完成合適Cry2A的選擇，所述方法包括但不限于比較總體氨基酸序列同源性、在由氨基酸序列307-382指定的區(qū)域中將Cry2A之間進(jìn)行狹窄集中的相似性比較，或基于IC50數(shù)據(jù)。Widner等證實(shí)，為了獲得對(duì)雙翅目物種相似的IC50效應(yīng)，需要Cry2Ab比Cry2Aa多50-100倍。因此，雙翅目物種對(duì)Cry2A蛋白的敏感性范圍，可以用作測(cè)量和鑒別在不同類Cry2A蛋白之間目標(biāo)昆蟲敏感性差異的一種方法。例如，比Cry2Aa對(duì)埃及伊蚊表現(xiàn)出的IC50 PPM高約3倍的IC50PPM數(shù)值，可以用作排除某些缺乏顯著雙翅目物種抑制活性的Cry2A蛋白的特征。然而，利用基于IC50抑制活性范圍的方法應(yīng)該小心采用，因?yàn)檫@些數(shù)值非常依賴于多種高度可變的條件，包括但不限于用于分析該蛋白的方法和材料以及所檢測(cè)昆蟲的物理?xiàng)l件。鑒別缺乏顯著雙翅目物種抑制活性的、得自不在本發(fā)明范圍內(nèi)的δ-內(nèi)毒素的Cry2Aδ-內(nèi)毒素的一個(gè)可供選擇的方法，可以包括排除在氨基酸序列上與Cry2Aa的相似性高于約87％的Cry2A蛋白，或更優(yōu)先排除在氨基酸序列上與Cry2Aa的相似性高于約90％的Cry2A蛋白。特別是，認(rèn)為Cry2Aa中對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基約307-382的區(qū)域?qū)τ谠摰鞍椎碾p翅目抑制活性是關(guān)鍵性的，并且當(dāng)取代Cry2Ab中不相似的互補(bǔ)區(qū)時(shí)，賦予Cry2Ab蛋白雙翅目抑制活性。因此，鑒別屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的Cry2Aδ-內(nèi)毒素的另一種方法可以包括所述蛋白該區(qū)域的相似性比較，當(dāng)將任何特定Cry2Aδ-內(nèi)毒素與Cry2Aa中的該區(qū)比較時(shí)，考慮要避免的同源性水平。確定屬于本發(fā)明范圍的Cry2Aδ-內(nèi)毒素在該76個(gè)氨基酸序列結(jié)構(gòu)域中的可變氨基酸，可能優(yōu)選是在該序列中與Cry2Aa的相似性高于約80-99％的那些氨基酸，或更優(yōu)選是在該序列中與Cry2Aa的相似性高于約60-79％的那些氨基酸，或是在該序列中與Cry2Aa的相似性高于約40-59％的那些氨基酸，或甚至優(yōu)選是在該序列中與Cry2Aa的相似性高于約24-39％的那些氨基酸，或最優(yōu)選是在該序列中與Cry2Aa的相似性高于約0-23％的那些Cry2Aδ-內(nèi)毒素的氨基酸。4.7轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物也設(shè)想了用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物。也設(shè)想了衍生自這種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以用本領(lǐng)域熟知的方法，將含本發(fā)明結(jié)構(gòu)編碼序列的嵌合植物基因插入植物的基因組中。用于植物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化的這種方法包括土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化、應(yīng)用脂質(zhì)體、采用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化、電穿孔、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、將基因轉(zhuǎn)移到花粉中，注射到生殖器官、注射到未成熟胚中和粒子轟擊。這些方法中的每種都具有不同的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。因此，將基因引入特定植物品系的一種特定方法對(duì)于另一種植物品系可能不一定是最有效的，但眾所周知哪些方法可用于特定的植物品系。
有許多將轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段引入細(xì)胞中的方法，但不是所有的方法均適合于將DNA傳遞至植物細(xì)胞。認(rèn)為合適的方法事實(shí)上包括可以將DNA引入細(xì)胞中的任何方法，例如通過(guò)根癌土壤桿菌和相關(guān)土壤桿菌菌株感染、例如通過(guò)以下方法直接傳遞DNAPEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993)、干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝入、電穿孔、與碳化硅纖維一起攪拌、DNA包被粒子的加速等。在某些實(shí)施方案中，加速方法是優(yōu)選的，包括例如微粒轟擊等。
將DNA引入細(xì)胞中的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。已經(jīng)描述了用于將基因傳遞至細(xì)胞中的4種常用方法(1)化學(xué)方法(Graham和van der Eb，1973)；(2)物理方法，例如微注射(Capecchi，1980)、電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985)和基因槍(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。4.7.1電穿孔將短高壓電脈沖施加到多種動(dòng)物和植物細(xì)胞上，導(dǎo)致在質(zhì)膜中形成納米大小的孔。DNA或者通過(guò)這些孔，或者由于伴隨孔封閉的膜組分重分配，而被直接吸收到細(xì)胞質(zhì)中。電穿孔可能非常有效，并且可以既用于瞬時(shí)表達(dá)所克隆的基因，又用來(lái)建立攜帶整合拷貝目的基因的細(xì)胞系。與磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)體融合相反，電穿孔時(shí)常產(chǎn)生攜帶一個(gè)整合拷貝、或最多幾個(gè)整合拷貝的外源DNA的細(xì)胞系。
通過(guò)電穿孔的方法引入DNA是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。為了通過(guò)電穿孔實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，人們可以利用或者易碎的組織例如細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物、或胚胎發(fā)生愈傷組織，或者人們可以直接轉(zhuǎn)化未成熟胚或其它構(gòu)成組織。人們可以通過(guò)將選定細(xì)胞暴露于果膠降解酶(果膠溶酶)，或者以控制的方式機(jī)械制造傷口使所述細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化更加敏感，部分降解其細(xì)胞壁。則這種細(xì)胞對(duì)于經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化DNA為感受態(tài)，可以在該階段進(jìn)行電穿孔，然后根據(jù)新?lián)饺氲腄NA的性質(zhì)，通過(guò)合適的選擇或篩選方案鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。4.7.2微粒轟擊將轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段傳遞到植物細(xì)胞的再一種有利方法是微粒轟擊。在該方法中，可以用核酸包被粒子，通過(guò)推進(jìn)力將其傳遞至細(xì)胞中。典型的粒子包括由鎢、金、鉑等構(gòu)成的粒子。采用這些粒子，所述小金屬粒子表面上的DNA穿過(guò)細(xì)胞壁被攜帶到胞質(zhì)中(Klein等，1987；Klein等，1988；Kawata等，1988)。金屬粒子穿透數(shù)層細(xì)胞，因此使得可以轉(zhuǎn)化組織外植體中的細(xì)胞。對(duì)于鑒定葉綠體或質(zhì)體定向轉(zhuǎn)化事件，優(yōu)選微粒轟擊法。
微粒轟擊除了是可再現(xiàn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的有效方法外，其一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是既不需要分離原生質(zhì)體(Cristou等，1988)，又不需要對(duì)土壤桿菌感染的敏感性。用于通過(guò)加速將DNA傳遞至植物細(xì)胞中的方法的一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案是Biolistics粒子傳遞系統(tǒng)，它可以用來(lái)將包有DNA或細(xì)胞的粒子通過(guò)篩網(wǎng)，例如不銹鋼或Nytex篩網(wǎng)，推進(jìn)到覆蓋有懸浮液中的植物培養(yǎng)細(xì)胞的濾膜表面上。所述篩網(wǎng)分散所述粒子，使得它們不會(huì)以大聚集物傳遞至受體細(xì)胞。人們認(rèn)為間插在發(fā)射裝置和待轟擊的細(xì)胞之間的篩網(wǎng)減小轟擊粒子聚集物的大小，并且可能通過(guò)減小太大的轟擊粒子對(duì)受體細(xì)胞施加的損害，而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較高。
關(guān)于所述轟擊，最好就將懸浮液中的細(xì)胞在濾膜或固體培養(yǎng)基上濃縮?；蛘?，可以在固體培養(yǎng)基上布置未成熟胚或其它靶細(xì)胞。待轟擊的細(xì)胞位于微粒(microprojectile)阻止板之下適當(dāng)?shù)木嚯x處。如有需要，還可在加速裝置和待轟擊細(xì)胞之間放置一個(gè)或多個(gè)篩網(wǎng)。通過(guò)利用本文敘述的技術(shù)，人們可以獲得高達(dá)1000個(gè)或更多的瞬時(shí)表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶。在轟擊后48小時(shí)轉(zhuǎn)化灶中表達(dá)所述外源基因產(chǎn)物的細(xì)胞數(shù)范圍通常為1-10個(gè)，平均1-3個(gè)。
在轟擊轉(zhuǎn)化中，人們可以優(yōu)化轟擊前培養(yǎng)條件和轟擊參數(shù)，以產(chǎn)生最大數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。轟擊的物理參數(shù)和生物學(xué)參數(shù)在該技術(shù)中均是重要的。物理因素是涉及操作所述DNA/微粒沉淀或影響宏彈或微彈射程和速度的因素。生物因素包括涉及在轟擊之前以及緊隨轟擊后的細(xì)胞操作的所有步驟、有助于減輕與轟擊相關(guān)創(chuàng)傷的靶細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)，例如線性化DNA或完整的超螺旋質(zhì)粒。人們認(rèn)為轟擊前操作對(duì)于成功轉(zhuǎn)化未成熟植物胚尤為重要。
因此，設(shè)想了人們可能需要在小規(guī)模研究中調(diào)節(jié)各種轟擊參數(shù)，以全面優(yōu)化所述條件。人們可能特別希望調(diào)節(jié)諸如間隙距離、飛行距離、組織距離和氦氣壓之類的物理參數(shù)。人們也可以通過(guò)修改影響受體細(xì)胞生理狀態(tài)和可以因此影響轉(zhuǎn)化和整合效率的條件，使創(chuàng)傷減少因素(TRF)最小化。例如，可以調(diào)節(jié)滲透狀態(tài)、組織水合作用和受體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)階段或細(xì)胞周期，以使轉(zhuǎn)化最佳。根據(jù)本說(shuō)明書，其它常規(guī)調(diào)節(jié)的實(shí)施是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
粒子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。美國(guó)專利5,015,580(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)描述了采用這種技術(shù)轉(zhuǎn)化大豆。4.7.3土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移是將基因引入植物細(xì)胞中的廣泛適用的系統(tǒng)，因?yàn)榭梢詫⑺鯠NA引入全株植物組織中，由此繞過(guò)由原生質(zhì)體再生完整植株的需要。應(yīng)用土壤桿菌介導(dǎo)的植物整合型載體將DNA引入植物細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的。參見例如(Fraley等，1985；Rogers等，1987)描述的方法。在美國(guó)專利5,004,863(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述了用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移對(duì)棉花植株進(jìn)行基因工程；在美國(guó)專利5,349,124(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述了萵苣植株的相似轉(zhuǎn)化；以及在美國(guó)專利5,416,011(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述了大豆的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。此外，Ti-DNA的整合是一種相對(duì)精確的方法，幾乎不導(dǎo)致重排。轉(zhuǎn)移的DNA區(qū)由邊界(border)序列限定，通常將間插DNA插入植物基因組中，如已描述的(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。
現(xiàn)代土壤桿菌轉(zhuǎn)化載體能夠在大腸桿菌以及土壤桿菌中復(fù)制，提供方便的操作，如已描述的(Klee等，1985)。此外，近來(lái)在用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的載體方面的技術(shù)進(jìn)展已經(jīng)改進(jìn)了所述載體中基因和限制位點(diǎn)的布置，以便于構(gòu)建能夠表達(dá)各種多肽編碼基因的載體。所述載體(Rogers等，1987)具有方便的多接頭區(qū)，多接頭區(qū)側(cè)翼為用于指導(dǎo)所插入多肽編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化位點(diǎn)，這些載體適用于本發(fā)明目的。另外，含有致瘤性(armed)和非致瘤性(disarmed)Ti基因的土壤桿菌可以用于轉(zhuǎn)化。在土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有效的那些植物品種中，所述基因轉(zhuǎn)移由于其易得和限定的特性而成為選擇的方法。
土壤桿菌介導(dǎo)的葉圓盤和其它組織(例如子葉和下胚軸)的轉(zhuǎn)化看來(lái)限于土壤桿菌天然感染的植物。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在雙子葉植物中是最有效的?？磥?lái)幾乎沒(méi)有單子葉植物是土壤桿菌的天然宿主，盡管如所述用土壤桿菌載體已經(jīng)在石刁柏中產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植物(Bytebier等，1987)。最近也已經(jīng)用土壤桿菌轉(zhuǎn)化了其它單子葉植物。在該組中包括玉米(Ishida等)和水稻(Cheng等)。
用土壤桿菌轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物通常在一條染色體上僅含有單個(gè)基因。這種轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于所加入的基因可以稱為雜合的。然而，因?yàn)槭褂迷~語(yǔ)“雜合的”通常暗示在一對(duì)染色體的第二條染色體的同一基因座上存在互補(bǔ)基因，而在含一個(gè)加入的基因的植物中沒(méi)有這種基因，所以人們認(rèn)為這種植物更準(zhǔn)確的名稱是獨(dú)立分離子，因?yàn)樗尤氲耐庠椿蛟谟薪z分裂和減數(shù)分裂期間獨(dú)立地分離。
當(dāng)所述植物作為雜種商品化時(shí)，例如玉米，可能優(yōu)選獨(dú)立分離子。在這種情況下，使含有該基因的獨(dú)立分離子與另一植株雜交，以形成目的基因雜合的雜種植物。
另一種優(yōu)選是所加入的結(jié)構(gòu)基因純合的轉(zhuǎn)基因植物，即含有兩個(gè)加入的基因的轉(zhuǎn)基因植物，一對(duì)染色體的每條染色體上的同一基因座都有一個(gè)基因。通過(guò)使含有單個(gè)所加入基因的獨(dú)立分離轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行有性雜交(自交)，將所產(chǎn)生的某些種子萌發(fā)，并分析所產(chǎn)生的植株的目的基因活性和孟德爾遺傳性，表明相對(duì)于對(duì)照(天然的非轉(zhuǎn)基因植物)或獨(dú)立分離轉(zhuǎn)基因植物為純合性，可以獲得純合的轉(zhuǎn)基因植物。
可以使兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物交配，以產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立分離的所加入的外源基因的后代。使合適的子代自交可以產(chǎn)生兩個(gè)所加入的編碼目的多肽的外源基因均純合的植物。也設(shè)想了與親本植株回交和與非轉(zhuǎn)基因植物異型雜交(out-crossing)。
采用基于磷酸鈣沉淀法、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的方法，可以完成植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。
這些系統(tǒng)對(duì)不同植物種質(zhì)的應(yīng)用取決于由原生質(zhì)體再生該特定植物品種的能力。描述了用于由原生質(zhì)體再生谷類作物的說(shuō)明性方法(參見例如Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。
為了轉(zhuǎn)化不能由原生質(zhì)體成功再生的植物種質(zhì)，可以利用將DNA引入完整細(xì)胞或組織的其它方法。例如，如已描述的，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了由未成熟胚或外植體再生谷類作物(Vasil，1988)。4.8植物中的基因表達(dá)未修飾的細(xì)菌基因通常在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)差。植物密碼子選擇更加非常類似人類和高于單細(xì)胞生物例如細(xì)菌的其它高等生物。幾篇報(bào)道已經(jīng)公開了改進(jìn)重組基因在植物中表達(dá)的方法(Murray等，1989；Diehn等，1996；Iannacone等，1997；Rouwendal等，1997；Futterer等，1997；和Futterer和Hohn，1996)。這些報(bào)道公開了各種方法，用于將根據(jù)植物密碼子頻率表編碼序列工程化，以代表更有效翻譯的序列；采用避免可疑的聚腺苷酸化或富A/T結(jié)構(gòu)域或內(nèi)含子剪接共有序列的重組序列改進(jìn)密碼子第三堿基位置偏倚。盡管用于合成基因構(gòu)建的這些方法是值得注意的，但按照Brown等的方法(美國(guó)專利第5,689,052號(hào)，1997；其通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中)制備本發(fā)明的合成基因。因此，本發(fā)明提供制備在植物中以顯著高于野生型基因的水平表達(dá)所需蛋白產(chǎn)物的合成植物基因的方法。簡(jiǎn)而言之，按照Brown等的方法，減小編碼所需蛋白的多核苷酸序列中稀有和半稀有單子葉植物密碼子的頻率，并用更優(yōu)選的單子葉植物密碼子取代。在單子葉植物中由修飾的多核苷酸序列編碼的所需多肽累積的增強(qiáng)是提高優(yōu)選密碼子頻率的結(jié)果，所述優(yōu)選密碼子頻率的提高是通過(guò)以連續(xù)6個(gè)核苷酸的片段分析所述編碼序列，并基于就單子葉植物中最稀少的284、484和664六聚體的出現(xiàn)頻率而論的所述六聚體出現(xiàn)的頻率，改變所述序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，Brown等公開了通過(guò)應(yīng)用降低罕用密碼子頻率的方法增加重組基因表達(dá)，降低稀有密碼子頻率通過(guò)以下方法進(jìn)行在所述核苷酸序列中減少聚腺苷酸化信號(hào)和內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的出現(xiàn)，除去所述核苷酸序列中自身互補(bǔ)的序列，并用非自身互補(bǔ)的核苷酸取代這種序列，同時(shí)維持編碼所述多肽的結(jié)構(gòu)基因，并降低所述核苷酸序列中5’-CG-3’二核苷酸對(duì)出現(xiàn)的頻率。這些步驟順序進(jìn)行，并且有累積效應(yīng)，產(chǎn)生對(duì)于所需多肽中存在的大多數(shù)氨基酸而言含有單子葉植物優(yōu)先利用的更優(yōu)選的單子葉植物密碼子的核苷酸序列。
本文所述研究已經(jīng)鑒定出在植物中增強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素表達(dá)的方法，當(dāng)所述內(nèi)毒素?fù)饺敫胁≈参锏暮嘶蚪M、質(zhì)體基因組或葉綠體基因組中時(shí)，賦予對(duì)昆蟲病原體的抗性。美國(guó)專利5,500,365(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)描述了合成植物基因以優(yōu)化所合成基因編碼的蛋白的表達(dá)水平的方法。該方法涉及修飾外源轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)基因序列，以使其更“象植物”，并因此更有可能被所述單子葉植物或雙子葉植物翻譯和表達(dá)。然而，美國(guó)專利5,689,052中公開的方法提供了最好在單子葉植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增強(qiáng)。4.9抗蟲性轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生因此，可以采用諸如本文4.7一節(jié)公開的轉(zhuǎn)化方法，通過(guò)轉(zhuǎn)化植物在那些植物中增加編碼目的多肽(即細(xì)菌晶體蛋白或δ-內(nèi)毒素多肽和質(zhì)體引導(dǎo)肽)的基因量。特別是，葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以在含這些亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的組織中產(chǎn)生以至多約10,000拷貝/細(xì)胞存在的所需編碼序列(McBride等，Bio/Technology 13362-365，1995)。
也可以如所述(Zhou等，1983；Hess，1987)將DNA直接轉(zhuǎn)移到花粉中，將DNA引入植物中。如描述的方法(Pena等，1987)，通過(guò)將所述DNA注射到植物生殖器官，可以獲得多肽編碼基因的表達(dá)。也可以將DNA直接注射到未成熟胚的細(xì)胞中，并如描述的方法(Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986)將干燥的胚再水合。4.9.1轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇在實(shí)現(xiàn)外源DNA傳遞至受體細(xì)胞后，獲得轉(zhuǎn)基因植物的下一步一般涉及鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，用于進(jìn)一步培養(yǎng)和植株再生。如本文所述，為了提高鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，人們可以希望使用選擇標(biāo)記基因或可篩選標(biāo)記基因作為可表達(dá)的目的基因，或除可表達(dá)的目的基因外，可以使用所述標(biāo)記或可篩選基因。在這種情況下，則人們通常應(yīng)該通過(guò)將所述細(xì)胞暴露于一種或多種選擇劑來(lái)分析潛在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體，或人們應(yīng)該篩選具有所需標(biāo)記基因性狀的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞鑒定方法的一個(gè)典型實(shí)施方案涉及將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物暴露于選擇劑，例如代謝抑制劑、抗生素、除草劑等。已經(jīng)被轉(zhuǎn)化并穩(wěn)定整合了賦予對(duì)所用的選擇劑抗性的標(biāo)記基因的細(xì)胞，將在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)并分裂。敏感細(xì)胞經(jīng)不起進(jìn)一步培養(yǎng)。優(yōu)選標(biāo)記基因的一個(gè)實(shí)例是賦予草甘膦抗性的基因。當(dāng)將該基因用作選擇標(biāo)記時(shí)，推定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物用草甘膦處理。處理后，將可得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于進(jìn)一步培養(yǎng)，而不能得到敏感的或非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。該方法詳細(xì)地描述于美國(guó)專利5,569,834，其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中。優(yōu)選選擇標(biāo)記系統(tǒng)的另一實(shí)例是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)抗性系統(tǒng)，該系統(tǒng)賦予對(duì)抗生素卡那霉素的抗性，如美國(guó)專利5,569,834(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中所述。另外，在用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后，當(dāng)用卡那霉素處理時(shí)，將可得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于進(jìn)一步培養(yǎng)，而不能得到非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。再一優(yōu)選選擇標(biāo)記系統(tǒng)涉及應(yīng)用賦予對(duì)巴龍霉素抗性的基因構(gòu)成物。該類型選擇標(biāo)記系統(tǒng)的應(yīng)用描述于美國(guó)專利5,424,412(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
所有設(shè)想的分析均是非破壞性的，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以在鑒定后進(jìn)一步培養(yǎng)。可以使用的另一可篩選標(biāo)記是編碼綠熒光蛋白的基因。
壯觀霉素是一種質(zhì)體或葉綠體蛋白合成的抑制劑，但不是由核基因組編碼的胞質(zhì)核糖體的蛋白合成的抑制劑，通過(guò)利用葉綠體或質(zhì)體對(duì)壯觀霉素的敏感性，簡(jiǎn)化transplastonomic選擇(質(zhì)體或葉綠體轉(zhuǎn)化事件的選擇)。壯觀霉素防止光合作用所需的葉綠體蛋白的積累，因此可以基于在其顏色方面的差異辨別抗壯觀霉素轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞抗壯觀霉素的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是綠色的，而敏感細(xì)胞由于質(zhì)體蛋白合成受抑制則是白色的。用合適的細(xì)菌aad基因轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體，或用編碼壯觀霉素抗性質(zhì)體或葉綠體功能核糖體RNA的基因轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體，提供了選擇和維持transplastonomic事件的方法(Maliga，Trends inBiotechnology 11101-106，1993)。
還設(shè)想了可篩選和可選擇標(biāo)記的組合將可用于鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在某些細(xì)胞或組織類型中，例如草甘膦或卡那霉素的選擇劑可能或者未提供足夠的殺傷活性以清楚地識(shí)別轉(zhuǎn)化細(xì)胞，或者可能引起對(duì)轉(zhuǎn)化體以及同樣對(duì)非轉(zhuǎn)化體的顯著的非選擇性抑制，因此使得所述選擇技術(shù)不很有效。建議用一種生長(zhǎng)抑制化合物例如草甘膦在低于引起100％抑制的那些濃度的濃度下進(jìn)行選擇，然后篩選例如卡那霉素的可篩選標(biāo)記基因表達(dá)的生長(zhǎng)中的組織，將使得人們可以從經(jīng)不起單獨(dú)選擇的細(xì)胞或組織類型中回收轉(zhuǎn)化體。我們提出選擇和篩選的組合可能使得人們能夠在更多細(xì)胞類型和組織類型中鑒定轉(zhuǎn)化體。4.9.2轉(zhuǎn)化體的再生由或者單個(gè)植物原生質(zhì)體或者各種外植體發(fā)育或再生植株是本領(lǐng)域熟知的(Weissbach和Weissbach，1988)。這種再生和生長(zhǎng)過(guò)程通常包括以下步驟選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、培養(yǎng)那些個(gè)體化細(xì)胞通過(guò)通常的胚胎發(fā)育階段通過(guò)生根的小植株階段。轉(zhuǎn)基因胚和種子的再生是相似的。此后將所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生根苗種植在合適的植物生長(zhǎng)介質(zhì)中，例如土壤。
得自葉片外植體、含有由土壤桿菌引入的編碼目的多肽的外來(lái)、外源基因的植株的發(fā)育或再生，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法完成，如已描述的方法(Horsch等，1985)。在該方法中，在選擇劑存在下，并于誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的植物品系苗再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，如已描述的方法(Fraley等，1983)。特別是，美國(guó)專利5,349,124(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)詳細(xì)描述了創(chuàng)造表達(dá)雜種晶體蛋白的基因轉(zhuǎn)化萵苣細(xì)胞和由其產(chǎn)生的植株，其中所述雜種晶體蛋白賦予這種植株對(duì)鱗翅目幼蟲的殺蟲活性。
該方法通常在2-4個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生苗，然后將這些苗轉(zhuǎn)移至合適的含所述選擇劑和防止細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素的促進(jìn)生根培養(yǎng)基。然后將在所述選擇劑存在下生根形成小植株的苗移植至土壤或其它介質(zhì)中，以允許產(chǎn)生根。這些步驟根據(jù)所用的具體植物品系而不同，這種變化是本領(lǐng)域眾所周知的。
最好是，讓所述再生植株自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物，或用得自所述再生植株的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的種子生長(zhǎng)的植株(最好是近交系)雜交。相反，用得自這些重要系的花粉給再生植株傳粉。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，培育本發(fā)明的含有所需多肽的轉(zhuǎn)基因植物。
因此，在本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物中，編碼蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素多肽和質(zhì)體引導(dǎo)肽的編碼區(qū)的量增加。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是獨(dú)立分離子，并且可以將該基因和其活性傳遞至其后代。更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是該基因純合的，并且當(dāng)有性交配時(shí)將該基因傳遞至其所有后代。可以將得自轉(zhuǎn)基因植物的種子種植在大田或溫室中，使所得的性成熟轉(zhuǎn)基因植物自花傳粉，以產(chǎn)生純育植株。這些植株的后代成為純育系，評(píng)價(jià)其蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增加。4.10具有耐蟲性的轉(zhuǎn)基因植物事件的鑒定為了鑒定表達(dá)高水平目的δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物，根據(jù)殺蟲活性和/或目的基因的表達(dá)篩選所述除草劑抗性或抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因再生植株(R0代)是必不可少的?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法完成這一步驟，所述方法包括但不限于1)從轉(zhuǎn)基因R0植株中獲得小組織樣品，直接平行分析所述組織與得自非表達(dá)的陰性對(duì)照植株的組織對(duì)敏感昆蟲的活性。例如，通過(guò)分析得自這種植株的葉片組織對(duì)ECB的活性，可以鑒定表達(dá)蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素例如Cry2Ab的R0轉(zhuǎn)基因玉米植株；2)通過(guò)對(duì)目的基因(Cry2Ab)特異性的酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)分析蛋白提取物；或3)反轉(zhuǎn)錄酶PCRTM(RT PCRTM)，以鑒定表達(dá)目的基因的事件。4.11分離同源基因和基因片段按照本發(fā)明的基因和δ-內(nèi)毒素不僅包括本文公開的全長(zhǎng)序列，而且也包括保留本文所具體例舉序列的特征性殺蟲活性的這些序列的片段或融合蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明顯看出，可以通過(guò)幾種方法鑒定并獲得殺蟲δ-內(nèi)毒素。特定的基因或其部分可以得自培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，或例如利用基因機(jī)合成構(gòu)建?？梢圆捎弥苽潼c(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地構(gòu)建這些基因的變異物。此外，采用市售的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，可以制備這些基因的片段。例如，諸如Bal31的酶或定點(diǎn)誘變可以用來(lái)從這些基因的末端有規(guī)則地切下核苷酸。此外，采用多種其它限制酶可以獲得編碼活性片段的基因。蛋白酶可以用來(lái)直接獲得這些δ-內(nèi)毒素的活性片段。
采用本文提供的內(nèi)容，也可以從芽孢桿菌屬菌株和/或DNA文庫(kù)中分離出等同的δ-內(nèi)毒素和/或編碼這些δ-內(nèi)毒素的基因。例如，本文公開和要求保護(hù)的抗δ-內(nèi)毒素的抗體可以用來(lái)從蛋白混合物中鑒定并分離出其它δ-內(nèi)毒素。具體地說(shuō)，可以針對(duì)所述δ-內(nèi)毒素最恒定并且與其它蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素最不同的部分產(chǎn)生抗體。這些抗體則可以用來(lái)通過(guò)免疫沉淀、酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)或蛋白質(zhì)印跡法，特異性地鑒定出具有特征性殺蟲活性的等同δ-內(nèi)毒素。
用于鑒定本發(fā)明δ-內(nèi)毒素和基因的另一方法是通過(guò)應(yīng)用寡核苷酸探針。這些探針是具有可檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸序列。正如本領(lǐng)域眾所周知的，如果所述探針?lè)肿雍秃怂針悠吠ㄟ^(guò)在這兩種分子之間形成強(qiáng)結(jié)合而雜交，則可以合理地假設(shè)所述探針和樣品基本相同。所述探針的可檢測(cè)標(biāo)記提供了以已知方式確定雜交是否發(fā)生的手段。這種探針?lè)治鎏峁┝吮景l(fā)明殺蟲δ-內(nèi)毒素基因的快速鑒定方法。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法，利用DNA合成儀可以合成用作按照本發(fā)明探針的核苷酸區(qū)段。在所述核苷酸區(qū)段作為探針的應(yīng)用中，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所述特定的探針，所述標(biāo)記包括放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。典型的放射性標(biāo)記包括32P、125I、35S等。采用DNA酶和DNA聚合酶，通過(guò)常規(guī)切口平移反應(yīng)，可以從與所述DNA樣品互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)建用放射性同位素標(biāo)記的探針。然后可以將探針和樣品在雜交緩沖液中混合，并于合適的溫度下保持直至發(fā)生退火。此后，洗滌下膜上無(wú)關(guān)的物質(zhì)，留下樣品和結(jié)合的探針?lè)肿?，通常通過(guò)放射自顯影和/或液閃計(jì)數(shù)檢測(cè)和定量。
非放射性標(biāo)記包括例如配體，如生物素或甲狀腺素；以及酶，例如水解酶或過(guò)氧化物酶；或各種化學(xué)發(fā)光劑，例如螢光素，或熒光化合物如熒光蛋白及其衍生物。所述探針也可以在兩端用不同類型的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記以易于分離，例如在上述末端采用同位素標(biāo)記標(biāo)記，而在另一端采用生物素標(biāo)記。
雙鏈體的形成和穩(wěn)定性取決于雜交體兩條鏈之間的大致互補(bǔ)，如上所述，可以容許一定程度的錯(cuò)配。因此，本發(fā)明的探針包括所述序列的突變(單突變和多突變)、缺失、插入以及它們的組合，其中所述突變、插入和缺失允許與所述目的靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜交體。以許多方式，采用目前本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法，也許通過(guò)將來(lái)可能已知的其它方法，可以在給定的多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失。
所列的所述探針的可能變異是部分由于遺傳密碼的豐余性。由于遺傳密碼的豐余性，對(duì)于用來(lái)制備蛋白的大多數(shù)氨基酸而言，可以使用一種以上的編碼核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。因此，不同的核苷酸序列可以編碼一種特定的氨基酸。因此，蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素和肽和質(zhì)體引導(dǎo)肽的氨基酸序列以及編碼它們的多核苷酸，可以由編碼所述蛋白或肽的同一氨基酸序列的等同核苷酸序列制備。因此，本發(fā)明包括這種等同核苷酸序列。此外，反向或互補(bǔ)序列是本發(fā)明的一個(gè)方面，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地使用。另外，已經(jīng)表明，已鑒定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白可以通過(guò)改變氨基酸序列來(lái)構(gòu)建，只要這種改變不改變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(Kaiset和Kezdy，1984)。因此，本發(fā)明包括本文描述的氨基酸序列的突變體，其中所述突變體不改變蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，或如果結(jié)構(gòu)被改變，則大致保留所述生物活性。此外，如本發(fā)明中所討論的，本發(fā)明也包括帶有編碼δ-內(nèi)毒素的基因或編碼質(zhì)粒引導(dǎo)肽的基因的整個(gè)基因或其部分的生物的突變體。這樣的突變體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備。例如，可以用UV輻射制備宿主生物突變體。同樣，這樣的突變體可以包括也可以采用本領(lǐng)域熟知的方法制備的無(wú)孢子宿主細(xì)胞。4.12定點(diǎn)誘變定點(diǎn)誘變是可用于通過(guò)對(duì)作為基礎(chǔ)的DNA進(jìn)行特異性誘變來(lái)制備單個(gè)肽或生物功能等同蛋白或肽的技術(shù)。所述技術(shù)還提供制備并測(cè)試序列變異體的現(xiàn)成可用的能力，其中所述變異體例如通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列變化引入所述DNA中而加入一個(gè)或多個(gè)上述考慮。定點(diǎn)誘變?cè)试S通過(guò)利用特定寡核苷酸序列產(chǎn)生突變體，所述特定寡核苷酸序列編碼具有所需突變的所述DNA序列以及具有足夠數(shù)目的相鄰核苷酸，以提供足夠大小的引物序列以及在缺失接點(diǎn)相反的兩側(cè)形成穩(wěn)定雙鏈體的序列復(fù)雜性。通常最好是長(zhǎng)約17-25個(gè)核苷酸的引物，在該序列結(jié)構(gòu)兩側(cè)約5-10個(gè)殘基被改變。
一般而言，定點(diǎn)誘變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，如各種出版物例舉的。正如人們將認(rèn)識(shí)到的，該技術(shù)通常使用以單鏈或雙鏈形式存在的噬菌體載體?？捎糜诙c(diǎn)誘變的典型載體包括載體例如M13噬菌體。這些噬菌體容易從市場(chǎng)上獲得，并且其用法一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。雙鏈質(zhì)粒也常規(guī)用于定點(diǎn)誘變，它消除了將目的基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至噬菌體的步驟。
一般而言，通過(guò)首先獲得單鏈載體或?qū)⒃谛蛄兄邪ň幋a所需肽的DNA序列的雙鏈載體的兩條鏈解鏈，進(jìn)行按照本文的定點(diǎn)誘變。一般合成制備帶有所需突變序列的寡核苷酸引物。然后將該引物與單鏈載體一起退火，并經(jīng)過(guò)DNA聚合酶例如大腸桿菌聚合酶IKlenow片段處理，以便完成含突變鏈的合成。因此，形成其中一條鏈編碼原始非突變序列而第二條鏈帶有所需突變的雜雙鏈體。然后用這種雜雙鏈體載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇包括帶突變序列布置的重組載體的克隆。
作為產(chǎn)生潛在有用的種類并且不是限制性的方法，提供采用定點(diǎn)誘變制備編碼選定肽的DNA區(qū)段的序列變體，盡管有可以獲得肽變體序列及編碼其的DNA序列的其它方法。例如，編碼所需肽序列的重組載體可以用誘變劑例如羥胺處理，以獲得序列變體。這樣的方法可以順利地改變所述蛋白的生物化學(xué)和生物物理特性或其作用方式。這些包括但不限于1)增加δ-內(nèi)毒素的形成，2)提高蛋白穩(wěn)定性或減少蛋白酶降低，3)增加對(duì)昆蟲膜受體的識(shí)別和結(jié)合，4)在昆蟲中腸內(nèi)皮中增加寡聚或形成通道，和5)由于上述任何原因或所有原因而提高殺蟲活性或殺蟲特異性。4.13生物功能等同物可以在本發(fā)明肽的結(jié)構(gòu)和編碼它們的DNA區(qū)段中制造修飾和變化，仍獲得編碼具有所需特性的蛋白或肽的功能分子。本文設(shè)想的生物功能等同肽、多肽和蛋白應(yīng)該與基礎(chǔ)的Cry2Ab氨基酸序列的序列或其中相應(yīng)的部分具有約80％或更高的序列相似性，優(yōu)選具有約85％或更高的序列相似性，最優(yōu)選具有約90％或更高的序列相似性。
以下的討論基于改變蛋白的氨基酸，以產(chǎn)生等同的或甚至改進(jìn)的第二代分子。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，設(shè)想突變的晶體蛋白可用于提高所述蛋白的殺蟲活性，并因此在植物細(xì)胞中提高所述重組轉(zhuǎn)基因的殺蟲活性和/或表達(dá)。根據(jù)表3中給出的密碼子，通過(guò)改變所述DNA序列的密碼子，可以完成所述氨基酸改變。
表3氨基酸 密碼子丙氨酸 Ala AGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys CUGC UGU天冬氨酸 Asp DGAC GAU谷氨酸 G1u EGAA GAG苯丙氨酸 Phe FUUC UUU甘氨酸 G1y GGGA GGC GGG GGU組氨酸 His HCAC CAU異亮氨酸 I1e IAUA AUC AUU賴氨酸 Lys KAAA AAG亮氨酸 Leu LUUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 Met MAUG天冬酰胺 Asn NAAC AAU脯氨酸 Pro PCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Ghn QCAA CAG精氨酸 Arg RAGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸 Ser SAGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸 Thr TACA ACC ACG ACU纈氨酸 Val VGUA GUC GUG GUU色氨酸 Trp WUGG酪氨酸 Tyr YUAC UAU
例如，在蛋白結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以用其它氨基酸取代，而不明顯損失所述蛋白結(jié)構(gòu)與例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力。由于正是蛋白的相互作用能力和特性限定該蛋白的生物學(xué)功能活性，因此在蛋白序列中，當(dāng)然還有其作為基礎(chǔ)的DNA編碼序列中，可以進(jìn)行某些氨基酸序列取代，依然獲得具有相似特性的蛋白。因此本發(fā)明人考慮到，在所公開的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)的DNA序列中，可以進(jìn)行各種改變，而不明顯損失其生物利用性或生物活性。
在制備這種改變時(shí)，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用性生物功能方面的重要性是本領(lǐng)域普通了解的(Kyte和Doolittle，1982，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。普遍認(rèn)為，所述氨基酸的相對(duì)親水特性有助于所產(chǎn)生的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所述二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而又限定了該蛋白與其它分子的相互作用，所述其它分子例如為酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等。
根據(jù)氨基酸的疏水性和電荷特性，已經(jīng)確定了每種氨基酸的親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)，它們是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-39)；和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域已知某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或計(jì)分的其它氨基酸取代，仍產(chǎn)生具有相似生物活性的蛋白，即仍獲得生物功能等同的蛋白。在制備這樣的改變時(shí)，優(yōu)選親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸取代，特別優(yōu)選親水指數(shù)在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，甚至更特別優(yōu)選親水指數(shù)在±0.5以內(nèi)的氨基酸的取代。
本領(lǐng)域也知道，根據(jù)親水性可以有效地進(jìn)行相似氨基酸的取代。美國(guó)專利4,554,101(其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)敘述了取決于其相鄰氨基酸親水性的蛋白的最大局部平均親水性與所述蛋白的生物特性相關(guān)。
如美國(guó)專利4,554,101中詳細(xì)描述了，已經(jīng)確定了氨基酸殘基的以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
人們理解，一種氨基酸可以被具有相似親水性值的另一氨基酸取代，并且仍獲得生物學(xué)等同的、特別是免疫學(xué)等同的蛋白。在制備這樣的改變時(shí)，優(yōu)選親水性值在±2以內(nèi)的氨基酸取代，特別優(yōu)選親水性值在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，甚至更特別優(yōu)選親水性值在±0.5以內(nèi)的氨基酸的取代。
如上概述的，因此氨基酸取代一般基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]各種上述特征的典型取代基是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，編碼得自蘇云金芽孢桿菌的δ-內(nèi)毒素的多核苷酸當(dāng)加入轉(zhuǎn)基因植物的核DNA中時(shí)表達(dá)差(Diehn等的綜述，1996)。最好是，基本上如美國(guó)專利5,500,365和5,689,052(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中所述，設(shè)計(jì)編碼目的δ-內(nèi)毒素的核苷酸序列?？捎糜诒磉_(dá)的核苷酸序列的實(shí)例包括但不限于cry2Ab(SEQ IDNO1)。
與Cry2Ab生物功能等同的肽、多肽和蛋白包括在示于SEQ IDNO2的基礎(chǔ)序列中含有保守氨基酸改變的氨基酸序列。在這類氨基酸序列中，所述基礎(chǔ)序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被另外的其電荷和極性類似于所述天然氨基酸的氨基酸取代(即保守氨基酸取代)，導(dǎo)致沉默變化。
在所述基礎(chǔ)多肽序列中的氨基酸取代可以選自所述天然存在的氨基酸所屬類別的其它成員?？梢詫被岱譃橐韵?組(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。這些不同組中的代表性氨基酸包括但不限于(1)酸性(帶負(fù)電)氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(帶正電)氨基酸，例如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸，例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非極性(疏水性)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
通過(guò)用這些組中的一種氨基酸取代同一組中的另一種氨基酸，可以進(jìn)行所述基礎(chǔ)多肽序列中的保守氨基酸改變。cry2Ab的生物功能等同物可以具有10個(gè)或更少的保守氨基酸改變，更優(yōu)選為7個(gè)或更少的保守氨基酸改變，最優(yōu)選具有5個(gè)或更少的保守氨基酸改變。所述編碼核苷酸序列(基因、質(zhì)粒DNA、cDNA或合成DNA)因此將具有相應(yīng)的堿基置換，使得它編碼cry2Ab的生物功能等同形式。
5.0實(shí)施例包括以下實(shí)施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實(shí)施本發(fā)明中工作良好的技術(shù)，并因此被認(rèn)為構(gòu)成本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說(shuō)明書應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以在所公開的具體實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變，且仍獲得同樣或相似的結(jié)果。5.1實(shí)施例1-采用定向載體的Cry2Ab的增加表達(dá)比較用定向和非定向CryAb表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的玉米植株中Cry2Ab蛋白的表達(dá)，用定向載體的植物中的表達(dá)顯著較高。非定向Cry2Ab植物表達(dá)載體pMON26800和pMON30463含有一種包含以下成分的表達(dá)盒一個(gè)增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子、一個(gè)玉米hsp70內(nèi)含子、一個(gè)具有翻譯起始和終止密碼子的合成cry2Ab基因(SEQ ID NO1)和一個(gè)胭脂堿合酶聚腺苷酸化位點(diǎn)。
定向植物表達(dá)載體pMON30464(SEQ ID NO16)含有一個(gè)包含以下成分的表達(dá)盒一個(gè)增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子、一個(gè)玉米hsp70內(nèi)含子、一個(gè)與合成cry2Ab基因符合讀框融合的玉米ssRUBSICO葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID NO3)和一個(gè)胭脂堿合酶聚腺苷酸化位點(diǎn)。
所有的載體(pMON26800、pMON30463和pMON30464)也含有一個(gè)賦予轉(zhuǎn)化植物組織巴龍霉素抗性的盒。在pMON26800的情況下，該盒包含一個(gè)增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子、一個(gè)玉米hsp70內(nèi)含子、一個(gè)具有翻譯起始和終止密碼子的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和一個(gè)胭脂堿合酶聚腺苷酸化位點(diǎn)。在pMON30463和pMON30464的情況下，該盒包含一個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子、一個(gè)具有翻譯起始和終止密碼子的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和一個(gè)胭脂堿合酶聚腺苷酸化位點(diǎn)?；旧先缑绹?guó)專利5,424,412(其具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中所述，得到抗巴龍霉素的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
通過(guò)定量ELISA測(cè)定，對(duì)得自R0階段中獨(dú)立轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因事件葉片組織定量分析Cry2Ab蛋白水平。該ELISA使用采用針對(duì)Cry2Aa和作為標(biāo)準(zhǔn)的純合Cry2Aa產(chǎn)生的單克隆捕獲抗體的直接夾層技術(shù)，所述單克隆捕獲抗體是一種作為第二抗體的與堿性磷酸酶綴合的不同Cry2Aa單克隆抗體。
在pMON30463(非定向)和pMON30464(定向)玉米植株中Cry2Ab表達(dá)水平的比較表明，非定向Cry2Ab表達(dá)不超過(guò)15ppm，而定向表達(dá)通常高于100ppm(表4)。蛋白印跡分析證實(shí)，pMON30464(定向)產(chǎn)生的交叉反應(yīng)性物質(zhì)水平的增加是因?yàn)榕c由pMON30463(非定向)產(chǎn)生的Cry2Ab和得自蘇云金芽孢桿菌的Cry2Aa標(biāo)準(zhǔn)共遷移的約Mr71,000蛋白累計(jì)的增加。該數(shù)據(jù)表明，與Cry2Ab蛋白N末端融合的引導(dǎo)肽被有效地加工或去除。
在得自原始R0轉(zhuǎn)基因事件的R1子代植物中也觀察到，Cry2Ab在pMON30464(定向)載體中表達(dá)相對(duì)于在pMON26800(非定向)載體中的表達(dá)增加，表明高度表達(dá)是可遺傳的(表5)。
表4Cry2Ab在用定向(pMON30464)和非定向(pMON30463)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的R0玉米中的表達(dá)在不同事件中表達(dá)水平的分布載體總 總 0 0-5 5-15 15-50 50- 100- ＞200事件 ECB+ppm ppm ppmppm100 200 ppmppm ppm非定向 16 3 0 0 3 0 0 0 0(30463) (19％)定向40 14 0 2 2 0 0 4 5(30464) (35％)表5Cry2Ab在用定向(pMON30464)和非定向(pMON26800)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的R0玉米中的表達(dá)在不同事件中表達(dá)水平的分布載體 分析的總 0 0-5 5-15 15-50 50-100 100-200 ＞200事件數(shù)ppm ppm ppmppm ppm ppm ppm非定向2801810 0 0 00(26800)定向 3353 2 0 2 417(30464)為了有效地防治攝食多種玉米組織的昆蟲，關(guān)鍵是在所有潛在攝食部位均以高水平表達(dá)殺蟲蛋白。為了確定Cry2Ab定向表達(dá)在其它組織中是否增加，對(duì)代表用相應(yīng)載體類型獲得的高表達(dá)系的獨(dú)立定向和非定向轉(zhuǎn)基因事件，平行分析Cry2Ab表達(dá)水平。通過(guò)定向表達(dá)，Cry2Ab的表達(dá)實(shí)際上在被害蟲例如玉米螟和Helicoverpazea侵襲的所有玉米組織中均增加(表6)。這種類型的一致高水平表達(dá)尤其有價(jià)值，因?yàn)椴惶赡茉试S目標(biāo)害蟲通過(guò)行為(攝食)適應(yīng)產(chǎn)生抗性。
表6轉(zhuǎn)基因玉米中的定向和非定向Cry2Ab表達(dá)載體事 N 根 葉片 鞘 莖 柄 苞葉 玉米穗 玉米芯 籽粒件N30pMON #1 1 13.1117.6 140.8 514.9 397.5 121.8 130.5 165.2 106.930464#2 4 11.3±4.5 105±12121±2596±18 134±3852±9.1101±11113±45170±36N30pMON #1 2 1.2±0.410±5.320±12 28±5.629±7.57.6±7.6 46±9.99.6±9.6 10.9±4.626800表達(dá)以所示μgCry2Ab/gm鮮重(根和葉片)或干重組織(鞘、莖、柄、苞葉、玉米穗、玉米芯、籽?！场罉?biāo)準(zhǔn)差(L30464#2)或范圍(L26800#1)計(jì)進(jìn)一步的分析表明，pMON30464產(chǎn)生的Cry2Ab蛋白水平增加導(dǎo)致直接在攝食測(cè)定中測(cè)量的物活性水平的相稱增加。為了評(píng)價(jià)產(chǎn)生的殺蟲活性水平，在組織飲食續(xù)加測(cè)定(tissue diet overlay studies)中分析得自對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因)、定向(pmon30464)和非定向(pMON30464)植株的玉米葉片組織對(duì)煙芽夜蛾的活性(表7)。對(duì)兩種濃度的組織(0.0016％和0.0031％)進(jìn)行生物測(cè)定，也對(duì)用于飲食續(xù)加中的給以同一組織樣品進(jìn)行定量ELISA測(cè)定Cry2Ab水平。Cry2Ab水平在定向(pMON30464)樣品中相對(duì)于非定向(pMON30463)樣品中增加7.5倍，這明顯與在兩種濃度比率下觀察到的平均幼蟲重量的6倍差異相關(guān)。這些數(shù)據(jù)因此表明，pMON30464產(chǎn)生的Cry2Ab水平的增加導(dǎo)致生物活性水平的相稱增加。
表7Cry2Ab表達(dá)水平的增加與煙芽夜蛾組織飲食續(xù)加生物測(cè)定中的生物活性增加的相關(guān)性組織濃度1 組織濃度2Cry2Ab濃度 (0.0031％組織)(0.0016％組織)組織樣品 (ppm) 平均幼蟲重量(mg) 平均幼蟲重量(mg)對(duì)照 0.0 22.00 24.6定向 444 1.2 2.1非定向 60 7.3 12.75.2實(shí)施例2-Cry2Ab的質(zhì)體定向提高從轉(zhuǎn)化回收的農(nóng)學(xué)正常植株的頻率為了獲得商業(yè)上可利用的基于轉(zhuǎn)基因的蟲害防治性狀，關(guān)鍵是獲得具有正常植株生長(zhǎng)特性的事件。在大多數(shù)情況下，在田間試驗(yàn)中增加相當(dāng)大數(shù)量的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件，以確保鑒定出滿足所有重要標(biāo)準(zhǔn)(有效的害蟲防治、轉(zhuǎn)基因正常的孟德爾行為和正常生長(zhǎng)特性或農(nóng)藝性狀)。提高獲得正常事件的頻率的方法顯然是有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈冊(cè)黾予b定出可以商業(yè)化的事件的可能性。它也可用來(lái)放大預(yù)期事件的庫(kù)(pool)大小，以通過(guò)提高能育性R0事件(原代再生植株)的百分比來(lái)進(jìn)行篩選。因?yàn)橹仓贽D(zhuǎn)化的工作強(qiáng)度大，所以減少必須產(chǎn)生以獲得合適性能和生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因事件R0事件數(shù)的任何方法也是有價(jià)值的。
產(chǎn)生非定向pMON26800和pMON30463載體和定向pMON30464載體的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因R0插入事件大群體，并記錄其能育性。也觀察到，用所述定向載體產(chǎn)生的R0事件的較高百分比是能育的(表8)。隨后將能育的R0事件的子代引入田間試驗(yàn)，在此記錄它們的歐洲玉米螟抗性(ECB1)和正常分離。
確定ECB1評(píng)級(jí)和分離值的方法基本上如所述方法進(jìn)行(Armstrong等，1995)。通過(guò)ECB1和分離標(biāo)準(zhǔn)的事件隨后記錄其矮化或株高的降低。雖然60％的非定向事件表現(xiàn)出株高降低，但僅有3％的定向事件矮化(表8)。能育性提高和矮化降低導(dǎo)致用定向Cry2Ab載體的非矮化ECB1陽(yáng)性事件的回收率顯著提高(37％對(duì)8％)?？偠灾谵D(zhuǎn)化研究中，必須產(chǎn)生并篩選4倍以上的非定向R0事件，以獲得與用定向Cry2Ab載體所獲得的正常ECB＋R0事件數(shù)目相同的正常ECB＋R0事件。
表8用非定向和定向Cry2Ab表達(dá)載體獲得的能育、矮化和正常玉米植株的百分比比較載體 ECBLD＋R0可育事件％b矮化％c正常、ECB1＋％d事件數(shù)a非定向192 66 63 7定向 78 85 4 31aECB LD＋R0事件數(shù)是ECB葉圓盤攝食測(cè)定陽(yáng)性的R0事件數(shù)。
b產(chǎn)生有活力R1子代(種子)的ECBLD＋R0事件％。
c矮化％是株型減小的ECB1陽(yáng)性和適當(dāng)分離事件的百分比。(非定向的總ECB1陽(yáng)性和正確分離為38，而定向的為25).
d4)正常、ECB1＋％是所獲得的相對(duì)于篩選的ECB LD＋R0事件總數(shù)的正常ECB＋事件的百分比。5.3實(shí)施例3-Cry2Ab的質(zhì)體定向提高轉(zhuǎn)基因玉米中高水平歐洲玉米螟防治的頻率也根據(jù)第二代歐洲玉米螟侵染(ECB2)的抗性，篩選先前描述的得自定向(pMON30464)和非定向(pMON30463或pMON26800)Cry2Ab表達(dá)載體的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件群體。為了促進(jìn)這些研究，包括用Cry1Ab基因轉(zhuǎn)化的商業(yè)上有效轉(zhuǎn)基因玉米事件MON810(YieldgardTM)作為陽(yáng)性對(duì)照。在田間試驗(yàn)中，基本上如所述方法(Armstrong等，1995)測(cè)試抗ECB2的功效。在1996年田間試驗(yàn)中，將18個(gè)獨(dú)立的非定向pMON26800事件與MN810(Cry1Ab)相比。在這18個(gè)事件中，僅1個(gè)傳遞的ECB2保護(hù)既在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能與MON810區(qū)別，又顯著低于非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照(表9中的事件UT1)。在1997年的田間試驗(yàn)中，與3個(gè)非定向事件(得自1996年試驗(yàn)的1個(gè)pMON30463事件和2個(gè)pMON26800事件)以及MON810平行測(cè)試了18個(gè)獨(dú)立的定向事件(pMON30464)(表10)。18個(gè)定向pMON30464事件中的9個(gè)事件傳遞了既在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能與商業(yè)上有效的表達(dá)Cry1Ab的MON810(YieldgardTM)事件賦予的ECB2保護(hù)區(qū)別、又均顯著低于非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照的ECB2損害的ECB2保護(hù)(表10)。
這些數(shù)據(jù)組表明，得自定向pMON30464載體的商業(yè)上有效的Cry2Ab系的絕對(duì)數(shù)目和頻率均比得自非定向pMON26800載體高得多。18個(gè)定向Cry2Ab事件中的9個(gè)事件(50％)傳遞了既在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能與MON810 Cry1Ab的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)區(qū)別、又顯著低于非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照的ECB2防治，而18個(gè)非定向Cry2Ab事件中的1個(gè)事件(6％)表現(xiàn)出既在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能與MON810 cry1Ab的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)區(qū)別、又顯著低于非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照的ECB2防治。如若人們考慮到9個(gè)商業(yè)上有效的Cry2Ab事件得自總共78個(gè)ECB葉圓盤陽(yáng)性R0植株，其回收率為11.5％，而僅3個(gè)商業(yè)上有效的Cry2Ab事件得自總共192個(gè)ECB葉圓盤攝食陽(yáng)性R0，回收率為1.6％(得自表6的R0ECB數(shù)據(jù))，則定向Cry2Ab表達(dá)載體的優(yōu)越性是尤其明顯的。
表9在田間試驗(yàn)中非定向(UT)Cry2Ab轉(zhuǎn)基因玉米相對(duì)于MON810Cry1Ab YieldgardTM轉(zhuǎn)基因玉米中ECB2保護(hù)的比較事件 樣品大小 莖蛀道(英寸)MON810(+對(duì)照)20 0.3aUT1 10 0.7aUT2 10 1.9aUT3 10 2.0aUT4 10 2.5bUT5 82.6bUT6 10 2.9bUT7 10 3.1bUT8 10 3.4bUT9 10 3.4bUT10 10 3.5bUT11 43.6b野生型 10 3.7bUT12 10 3.8bUT13 10 4.6bUT14 10 5.8bUT15 10 6.8bUT16 10 7.6cUT17 10 9.3cUT18 10 10.1ca，b以相同上標(biāo)(a)標(biāo)記的數(shù)值在預(yù)定比較中在P＝0.05下在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能與MON810區(qū)別。具有上標(biāo)(b)的數(shù)值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同。莖蛀道數(shù)值顯著高于Cry1Ab商品標(biāo)準(zhǔn)MON810的事件以粗體顯示。所有事件的遺傳背景均是相同的(B73×H99)。c，*以星號(hào)標(biāo)記的數(shù)值在與陰性對(duì)照的預(yù)定比較中顯著低于野生型非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照(P＝0.05)。以上標(biāo)(c)標(biāo)記的數(shù)值在與陰性對(duì)照的預(yù)定比較中顯著高于野生型非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照(P＝0.05)。UT1-UT18非定向pMON26800事件#1-18。
表10在田間試驗(yàn)中定向(T)和非定向(UT)Cry2Ab轉(zhuǎn)基因玉米相對(duì)于MON810 Cry1Ab YieldgardTM轉(zhuǎn)基因玉米中ECB2保護(hù)的比較事件 樣品大小莖蛀道(英寸)T1 9 0.6aT2 10 0.6aMON810(+對(duì)照)30 0.9aT3 14 1aT4 12 1.3aT5 7 1.4aUT1 10 1.6aT6 13 1.6aT7 11 1.6aT8 10 1.7aUT2 10 1.8aT9 10 2.4aT10 12 2.5bT11 7 2.6bT12 9 2.9bT13 10 3.2bT14 11 3.3bT15 10 3.5bT16 10 4.0bT17 10 4.3bUT3 8 4.8bT18 8 5.4b野生型(-對(duì)照)20 13.7ca，b，c以上標(biāo)(a)標(biāo)記的數(shù)值在預(yù)定比較中在P＝0.05下在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能與MON810區(qū)別。具有上標(biāo)的數(shù)值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同。莖蛀道數(shù)值顯著高于Cry1Ab商品標(biāo)準(zhǔn)MON810的事件以粗體顯示；在與陰性對(duì)照的預(yù)定比較中(P＝0.5)所有轉(zhuǎn)基因事件均表現(xiàn)出蛀道顯著小于野生型非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照。所有事件的遺傳背景均是相同的(B73×H99)。T1-T18定向pMON30464事件#1-18。UT1-UT3非定向pMON30463和pMON26800事件#1-3。1997年田間試驗(yàn)中的UT1是與1996年田間試驗(yàn)中UT3相同的pMON26800事件。5.4實(shí)施例4-Cry2Ab蛋白的質(zhì)體定向?qū)е罗D(zhuǎn)基因棉花愈傷組織中表達(dá)增加比較了Cry2Ab蛋白在用質(zhì)體定向和非定向Cry2Ab表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織中的水平。在已經(jīng)用質(zhì)體定向基因轉(zhuǎn)化的愈傷組織中Cry2Ab水平顯著較高(表11)。
植物表達(dá)載體pMON33830含有一個(gè)Cry2Ab表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含以下有效連接以在植物細(xì)胞中產(chǎn)生功能Cry2Ab蛋白的遺傳元件一個(gè)增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子、一個(gè)矮牽牛hsp705’非翻譯前導(dǎo)序列、一個(gè)具有翻譯起始密碼子的合成cry2Ab基因(SEQ ID NO1)和一個(gè)得自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶(NOS)基因的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
植物表達(dá)載體pMON33827(SEQ ID NO13)、pMON33828(SEQID O14)和pMON33829(SEQ ID NO15)含有類似于pMON33830中存在的Cry2Ab表達(dá)盒，只是每個(gè)載體中不同的葉綠體引導(dǎo)序列與所述合成cry2Ab基因N末端翻譯上融合。pMON33827含有PTP1編碼序列(SEQ ID NO5)，該編碼序列包含擬南芥ssRUBISCO(SSU)葉綠體引導(dǎo)序列和編碼ssRUBISCO(SSU)蛋白前24個(gè)氨基酸的序列(Wong等，1992)。SEQ ID NO6代表PTP1引導(dǎo)肽序列。該肽含有完整的天然引導(dǎo)序列，包括質(zhì)體引導(dǎo)肽切割位點(diǎn)與成熟RUBISCOSSU蛋白的前24個(gè)氨基酸，后者與含有RUBISCOSSU質(zhì)體引導(dǎo)肽切割位點(diǎn)(SEQ IDNO6氨基酸位置80-87)的重復(fù)氨基酸(SEQ ID NO6氨基酸50-57)的序列順序連接。為此PTP1含有一個(gè)重復(fù)質(zhì)體引導(dǎo)肽切割位點(diǎn)。含有該P(yáng)TP編碼序列的多核苷酸盒于其3’端連接于一個(gè)NcoI限制位點(diǎn)，以便于插入與所述PTP編碼序列符合讀框地翻譯的編碼序列，例如編碼Cry2Ab、Cry2Aa、這些序列的變體和其它有用的多肽編碼序列。
pMON33828含有PTP1Δ(SEQ ID NO7)的編碼序列，這是一種PTP1的修飾物，其中在所述兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)之間的SSU的24個(gè)氨基酸通過(guò)用限制酶SphI切割而去除，SphI在每個(gè)拷貝的所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)中切割一次，然后再連接，導(dǎo)致僅存在PTP1的轉(zhuǎn)運(yùn)肽部分，后接一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)和一個(gè)NcoI位點(diǎn)。PTP1Δ的肽序列命名為SEQ ID NO8。
pMON33829含有PTP2的編碼序列(SEQ ID NO9)，這是得自擬南芥EPSP合酶基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。PTP2的肽序列命名為SEQ IDNO10。
所有上述植物轉(zhuǎn)化表達(dá)載體也含有一個(gè)選擇標(biāo)記基因盒，賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗性。
得自分別用pMON33827、pMON33828、pMON33829和pMON33830轉(zhuǎn)化的12個(gè)隨機(jī)選擇的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件的棉花愈傷組織，采用定量ELISA測(cè)定經(jīng)過(guò)Cry2Ab蛋白水平的定量分析。這種ELISA采用使用針對(duì)Cry2Aa產(chǎn)生的單克隆捕獲抗體和純合Cry2Aa蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)的直接夾層技術(shù)，所述單克隆捕獲抗體是與作為第二抗體的堿性磷酸酶綴合的不同的Cry2Aa單克隆抗體。在定向和非定向愈傷組織中Cry2Ab表達(dá)水平的比較顯示出當(dāng)包括葉綠體引導(dǎo)序列時(shí)表達(dá)顯著增加(表11)。當(dāng)通過(guò)應(yīng)用t檢定測(cè)定與非定向Cry2Ab比較時(shí)，PTP1Δ提供顯著更高的平均表達(dá)水平(t＝2.31，p＝0.03)。應(yīng)用G檢定測(cè)定，PTP2提供顯著更高的獲得表達(dá)較高水平Cry2Ab的愈傷組織系的可能性(G2/X2＝5.6，p＝0.02)。
表11在比較葉綠體定向和非定向cry2Ab基因的獨(dú)立轉(zhuǎn)化棉花愈傷組織系中的Cry2Ab水平棉花愈傷組織系 Cry2Ab ng/ml愈傷組織提取物非轉(zhuǎn)化愈傷組織系10系20系30系40pMON33827，PTP1-cry2Ab基因系1464系261系30系425系50系6368系774系8101系920系10 652系11 0系12 0pMON33828，PTP1Δ-cry2Ab基因系1252系2235系30系4416系50系60系70系8101系9393系10 587系11 788系12 277pMON33829，PTP2-cry2Ab基因系160系20系32220系42036系50系638系7674系82440系915系1091系11290系1271pMON33830，cry2Ab基因系119系2166系347系420系533系647系7781系835系931系10 0系11 0系12 1365.5實(shí)施例5-將Cry2Aa蛋白導(dǎo)向質(zhì)體導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉花愈傷組織中表達(dá)降低與上述實(shí)施例4相反，并且例證采用質(zhì)體引導(dǎo)序列獲得的表達(dá)增加對(duì)于特定的cry基因的特異性的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述相同的質(zhì)體引導(dǎo)序列PTP1、PTP1Δ和PTP2導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉花愈傷組織中密切相關(guān)cry2Aa基因的表達(dá)水平顯著降低(表12)。植物表達(dá)載體pMON33803含有一個(gè)cry2Aa表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有一個(gè)有效連接以在植物細(xì)胞中產(chǎn)生功能Cry2Aa蛋白的以下遺傳元件一個(gè)FMV35S啟動(dòng)子、一個(gè)矮牽牛熱激HSP705’非翻譯前導(dǎo)序列、一個(gè)具有一個(gè)翻譯起始密碼子和于5’端一個(gè)Nco限制酶位點(diǎn)的合成cry2Aa基因(SEQ ID NO11)和得自豌豆E9 SSU基因的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。該Cry2Aa蛋白的肽序列命名為SQE ID NO12。pMON33812、pMON33811和pMON33806含有類似于pMON33803中存在的cry2Aa表達(dá)盒，只是在每個(gè)表達(dá)盒中不同的葉綠體引導(dǎo)序列(分別為PTP1、PTP1Δ和PTP2)與所述合成cry2Aa基因的N末端在轉(zhuǎn)換(transitional)融合。所有這些載體也含有一個(gè)選擇標(biāo)記基因盒，賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞草甘膦抗性。
得自分別用pMON33803、pMON33812、pMON33811和pMON33806轉(zhuǎn)化的10個(gè)隨機(jī)選擇的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件的棉花愈傷組織，采用定量Cry2ELISA測(cè)定經(jīng)過(guò)Cry2Aa蛋白水平的定量分析。在定向和非定向愈傷組織中Cry2Aa表達(dá)水平的比較顯示出當(dāng)包括葉綠體引導(dǎo)序列時(shí)表達(dá)顯著降低(表12)。當(dāng)通過(guò)Tukey-Kramer HSD檢定測(cè)定，非定向Cry2Aa基因賦予的表達(dá)水平顯著不同于采用所述三種質(zhì)體定向cry2Aa基因獲得的表達(dá)水平(α＝0.05)。
表12在比較葉綠體定向和非定向cry2Aa基因的獨(dú)立轉(zhuǎn)化棉花愈傷組織系中的Cry2Aa水平棉花愈傷組織系Cry2Aa ng/mL提取物非轉(zhuǎn)化愈傷組織系1 0系2 0系3 0系4 0pMON33812，PTP1-Cry2Aa基因系1 29系2 32
系3 22系4 41系5 24系6 47系7 43系8 49系9 0系10 23pMON33811，PTP1Δ-Cry2Aa基因系1 0系2 59系3 48系4 72系5 29系6 37系7 44系8 32系9 20系10 0pMON33806，PTP2-Cry2Aa基因系1 27系2 0系3 10系4 84系5 205系6 0系7 13系8 6系9 0系10 8pMON33803，Cry2Aa基因系1 63系2 2278系3 181系4 3131系5 3752
系6 851系7 303系8 1365系9 1601系10 16485.6實(shí)施例6-將Cry2Aa蛋白導(dǎo)向質(zhì)體導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草植株中表達(dá)降低和植物毒性增加采用非定向cry2Aa植物表達(dá)載體pMON33803和葉綠體定向PTP2-cry2Aa植物表達(dá)載體pMON33806產(chǎn)生轉(zhuǎn)化煙草植株。在等體積提取緩沖液中提取得自48株pMON33803植株和41株pMON33806植株的等重量葉片組織樣品，并采用定量ELISA測(cè)定cry2Aa相對(duì)水平(表13)。這種ELISA采用使用針對(duì)Cry2Aa產(chǎn)生的多克隆捕獲抗體和純合的Cry2Aa蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)的直接夾層技術(shù)，所述多克隆捕獲抗體是與作為第二抗體的堿性磷酸酶綴合的同一多克隆抗體。
從高水平表達(dá)非定向Cry2Aa的轉(zhuǎn)化回收的植株總數(shù)的比例，高于回收的高水平表達(dá)定向Cry2Aa的植株的比例。相反，從不能表達(dá)可檢測(cè)定向Cry2Aa的轉(zhuǎn)化回收的植株總數(shù)的比例高于回收的不能表達(dá)非定向Cry2Aa的植株的比例。所有具有可檢測(cè)Cry2Aa表達(dá)水平的PTP2-Cry2Aa植株均表現(xiàn)出嚴(yán)重的異常表型；這些植株極度矮化，節(jié)間縮短，具有變形的皺葉并且不育。所有缺乏Cry2Aa表達(dá)的PTP2-Cry2Aa植株外表均正常。相反，僅某些高表達(dá)非定向Cry2Aa的植株表現(xiàn)出矮化表型。
表13在比較葉綠體定向和非定向cry2Aa基因的獨(dú)立轉(zhuǎn)化煙草植株中的Cry2Aa水平
5.7實(shí)施例7-用Cry2Ab基因轉(zhuǎn)化煙草葉綠體可以產(chǎn)生其中僅線粒體或葉綠體DNA已經(jīng)改變以摻入在該應(yīng)用設(shè)想的分子的重組植物。在葉綠體中起作用的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的(Hanley-Bowden等，Trends in Biochemical Sciences 1267-70，1987)。獲得含已經(jīng)插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物已經(jīng)例如由Daniell等(美國(guó)專利第5,693,507；1997)和Maliga等(美國(guó)專利第5,451,513；1995)描述?？梢詷?gòu)建含從中產(chǎn)生Cry2A蛋白的表達(dá)盒的載體。表達(dá)盒可以含有葉綠體有效的驅(qū)動(dòng)cry2A晶體蛋白基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列，其構(gòu)建方式與本文其它多核苷酸大致相似，采用熱擴(kuò)增法，限制性內(nèi)切核酸酶消化和連接等。葉綠體可表達(dá)基因?qū)⑻峁┮粋€(gè)得自異源基因或葉綠體基因例如psbA的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)，這將可供用于編碼Cry2A蛋白的DNA序列在葉綠體中轉(zhuǎn)錄和翻譯；一個(gè)編碼Cry2A蛋白的DNA序列；和一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)，例如葉綠體基因的3’反向重復(fù)區(qū)，它可以穩(wěn)定表達(dá)的cry2A mRNA。所述葉綠體中的表達(dá)將增強(qiáng)cry2A基因產(chǎn)物的積累。含葉綠體或質(zhì)體的宿主細(xì)胞可以用所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，然后可以培養(yǎng)所產(chǎn)生的含轉(zhuǎn)化葉綠體的細(xì)胞，以表達(dá)所述Cry2A蛋白。一個(gè)盒除含有所述cry2A基因外，也可以含有抗生素、除草劑耐受性或其它選擇標(biāo)記基因。所述表達(dá)盒可以鄰接得自葉綠體DNA、能夠促進(jìn)特別是通過(guò)同源重組將所述表達(dá)盒穩(wěn)定整合到葉綠體基因組中的DNA序列?；蛘?，所述表達(dá)盒可以不整合，而是通過(guò)包括得自葉綠體DNA的復(fù)制起點(diǎn)，能夠保證異源cry2A基因在葉綠體中復(fù)制?？梢杂珊D(zhuǎn)化葉綠體的細(xì)胞產(chǎn)生植株，然后可以將其培養(yǎng)以產(chǎn)生種子，從所述種子可以產(chǎn)生另外的植株。這種轉(zhuǎn)化法優(yōu)于核基因組轉(zhuǎn)化，特別是在通過(guò)整合到葉綠體基因組中實(shí)現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化的情況下是有利的，因?yàn)槿~綠體基因一般是母性遺傳。這提供了環(huán)境上“安全的”轉(zhuǎn)基因植物，事實(shí)上消除了逃逸到環(huán)境中的可能性。此外，可以轉(zhuǎn)化葉綠體多次，以產(chǎn)生表達(dá)多種所需重組蛋白的功能性葉綠體基因組，而已經(jīng)表明當(dāng)需要多基因時(shí)核基因組轉(zhuǎn)化相當(dāng)有限。因此，采用葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化避免了分離事件。與核基因組表達(dá)的植物不同，葉綠體或質(zhì)體中的表達(dá)可以僅從一個(gè)啟動(dòng)子起始，并且繼續(xù)通過(guò)多順?lè)醋訁^(qū)以由一個(gè)mRNA產(chǎn)生多種肽。
所述表達(dá)盒將以構(gòu)建其它植物轉(zhuǎn)化載體的大致相同方式產(chǎn)生?？梢詫⒅参锶~綠體有效DNA序列插入細(xì)菌質(zhì)粒中并連接至表達(dá)所需基因產(chǎn)物例如Cry2A蛋白的DNA序列，以使Cry2A蛋白在葉綠體中產(chǎn)生，避免了核調(diào)節(jié)基因的核基因調(diào)節(jié)、加帽、剪接或聚腺苷酸化、或者葉綠體或質(zhì)體引導(dǎo)序列的需要。包含或者合成構(gòu)建或者為直接得自蘇云金芽孢桿菌基因組或蘇云金芽孢桿菌附加體型元件的天然基因的cry2A基因的表達(dá)盒，可以插入構(gòu)建用于葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體中的限制位點(diǎn)中。該盒上游可以鄰接葉綠體或質(zhì)體功能性啟動(dòng)子，下游可以鄰接葉綠體或質(zhì)體功能性轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。所得的盒可以采用熟知的異源重組法摻入葉綠體或質(zhì)體基因組中。
或者，可以通過(guò)采用自主復(fù)制型質(zhì)?；蚰軌蛟谌~綠體或質(zhì)體中繁殖的其它載體獲得葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化。實(shí)現(xiàn)該方法的一個(gè)方法可能是利用葉綠體或質(zhì)體復(fù)制起始所需的葉綠體或質(zhì)體基因組的一部分，作為在轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體中保持所述質(zhì)?；蜉d體的工具。通過(guò)在也含有一個(gè)葉綠體或質(zhì)體選擇標(biāo)記基因的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌載體中隨機(jī)克隆葉綠體或質(zhì)體基因組，然后轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體，并且在合適的選擇培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以容易地鑒定能夠穩(wěn)定復(fù)制葉綠體或質(zhì)粒外遺傳元件的序列。將本文所述的表達(dá)盒引入葉綠體或質(zhì)體可復(fù)制外遺傳元件中，將提供將Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素定位至葉綠體或質(zhì)體的有效方法。
6.0參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)在其提供示例性方法或補(bǔ)充本文敘述的內(nèi)容的其它細(xì)節(jié)的程度上，具體通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
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根據(jù)本說(shuō)明書，可以在不進(jìn)行過(guò)多試驗(yàn)的情況下可以進(jìn)行并實(shí)現(xiàn)本文公開和要求保護(hù)的所有組合物和方法。雖然在優(yōu)選實(shí)施方案方面描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明概念、精神和范圍的情況下可以將變體應(yīng)用于所述組合物和方法，以及應(yīng)用到本文所述方法的步驟和步驟順序中。更具體地講，顯然化學(xué)上和生理上相關(guān)的某些因子可以取代本文所述的因子，而可以獲得相同或相似結(jié)果。所有對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的這樣的相似取代和修改均被認(rèn)為在所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
序列表<110>David R.CorbinCharles P.Romano<120>轉(zhuǎn)化植物以表達(dá)δ-內(nèi)毒素的改進(jìn)方法<130>38-21(13547)<140>申請(qǐng)?zhí)?9/186,002<141>申請(qǐng)日11/04/98<160>18<170>FastSEQ for windows Version 3.0<210>1<211>1934<212>DNA<213>人工序列<220><223>完全合成的<400>1ccatggacaa ctccgtcctg aactctggtc gcaccaccat ctgcgacgcc tacaacgtcg 60cggcgcatga tccattcagc ttccagcaca agagcctcga cactgttcag aaggagtgga 120cggagtggaa gaagaacaac cacagcctgt acctggaccc catcgtcggc acggtggcca 180gcttccttct caagaaggtc ggctctctcg tcgggaagcg catcctctcg gaactccgca 240acctgatctt tccatctggc tccaccaacc tcatgcaaga catcctcagg gagaccgaga 300agtttctcaa ccagcgcctc aacactgata cccttgctcg cgtcaacgct gagctgacgg 360gtctgcaagc aaacgtggag gagttcaacc gccaagtgga caacttcctc aaccccaacc 420gcaatgcggt gcctctgtcc atcacttctt ccgtgaacac catgcaacaa ctgttcctca 480accgcttgcc tcagttccag atgcaaggct accagctgct cctgctgcca ctctttgctc 540aggctgccaa cctgcacctc tccttcattc gtgacgtgat cctcaacgct gacgagtggg 600gcatctctgc agccacgctg aggacctacc gcgactacct gaagaactac accagggact 660actccaacta ttgcatcaac acctaccagt cggccttcaa gggcctcaat acgaggcttc 720acgacatgct ggagttcagg acctacatgt tcctgaacgt gttcgagtac gtcagcatct 780ggtcgctctt caagtaccag agcctgctgg tgtccagcgg cgccaacctc tacgccagcg 840gctctggtcc ccaacaaact cagagcttca ccagccagga ctggccattc ctgtattcgt 900tgttccaagt caactccaac tacgtcctca acggcttctc tggtgctcgc ctctccaaca 960ccttccccaa cattgttggc ctccccggct ccaccacaac tcatgctctg cttgctgcca 1020gagtgaacta ctccggcggc atctcgagcg gcgacattgg tgcatcgccg ttcaaccaga 1080acttcaactg ctccacctrc ctgccgccgc tgctcacccc gttcgtgagg tcctggctcg 1140acagcggctc cgaccgcgag ggcgtggcca ccgtcaccaa ctggcaaacc gagtccttcg 1200agaccaccct tggcctccgg agcggcgcct tcacggcgcg tgggaattct aactacttcc 1260ccgactactt catcaggaac atctctggtg ttcctctcgt cgtccgcaac gaggacctcc 1320gccgtccact gcactacaac gagatcagga acatcgcctc tccgtccggg acgcccggag 1380gtgcaagggc gtacatggtg agcgtccata acaggaagaa caacatccac gctgtgcatg 1440agaacggctc catgatccac ctggcgccca atgattacac cggcttcacc atctctccaa 1500tccacgccac ccaagtgaac aaccagacac gcaccttcat ctccgagaag ttcggcaacc 1560agggcgactc cctgaggttc gagcagaaca acaccaccgc caggtacacc ctgcgcggca 1620acggcaacag ctacaacctg tacctgcgcg tcagctccat tggcaactcc accatcaggg 1680tcaccatcaa cgggagggtg tacacagcca ccaatgtgaa cacgacgacc aacaatgatg 1740gcgtcaacga caacggcgcc cgcttcagcg acatcaacat tggcaacgtg gtggccagca 1800gcaactccga cgtcccgctg gacaccaacg tgaccctgaa ctctggcacc cagttcgacc 1860tcatgaacat catgctggtg ccaactaaca tctcgccgct gtactgatag gagctctgat 1920ccccatggga attc 1934<210>2<211>634<212>PRT<213>蘇云金芽孢桿菌<400>2Met Asp Asn Ser Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala1 5 10 15Tyr Asn Val Ala Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Gln His Lys Ser Leu20 25 30Asp Thr Val Gln Lys Glu Trp Thr Glu TrP Lys Lys Asn Asn His Ser35 40 45Leu Tyr Leu Asp Pro Ile Val Gly Thr Val Ala Ser Phe Leu Leu Lys50 55 60Lys Val Gly Ser Leu Val Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asn65 70 75 80Leu Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Gln Asp Ile Leu Arg85 90 95Glu Thr Glu Lys Phe Leu Asn Gln Arg Leu Asn Thr Asp Thr Leu Ala100 105 110Arg Val Asn Ala Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ala Asn Val Glu Glu Phe115 120 125Asn Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Arg Asn Ala Val Pro130 135 140Leu Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu Phe Leu Asn145 150 155 160Arg Leu Pro Gln Phe Gln Met Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro165 170 175Leu Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Sar Phe Ile Arg Asp Val180 185 190Ile Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Leu Arg Thr195 200 205Tyr Arg Asp Tyr Leu Lys Asn Tyr Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys210 215 220Ile Asn Thr Tyr Gln Ser Ala Phe Lys Gly Leu Asn Thr Arg Leu His225 230 235 240Asp Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr245 250 255Val Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Val Ser Ser260 265 270Gly Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser275 280 285Phe Thr Ser Gln Asp Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn290 295 300Ser Asn Tyr Val Leu Asn Gly Phe Ser Gly Ala Arg Leu Ser Asn Thr305 310 315 320Phe Pro Asn Ile Val Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ala Leu325 330 335Leu Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Ile Ser Ser Gly Asp Ile340 345 350Gly Ala Ser Pro Phe Asn Gln Asn Phe Asn Cys Ser Thr Phe Leu Pro355 360 365Pro Leu Leu Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Ser Asp370 375 380Arg Glu Gly Val Ala Thr Val Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Glu385 390 395 400Thr Thr Leu Gly Leu Arg Ser Gly Ala Phe Thr Ala Arg Gly Asn Ser405 410 415Asn Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu420 425 430Val Val Arg Asn Glu Asp Leu Arg Arg Pro Leu His Tyr Asn Glu Ile435 440 445Arg Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr450 455 460Met Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile His Ala Val His Glu465 470 475 480Asn Gly Ser Met Ile His Leu Ala Pro Asn Asp Tyr Thr Gly Phe Thr485 490 495Ile Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe500 505 510Ile Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln515 520 525Asn Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr530 535 540Asn Leu Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val545 550 555 560Thr Ile Asn Gly Arg Val Tyr Thr Ala Thr Asn Val Asn Thr Thr Thr565 570 575Asn Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn580 585 590Ile Gly Asn Val Val Ala Ser Ser Asn Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile595 600 605Asn Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Gln Phe Asp Leu Met Asn Ile Met610 615 620Leu Val Pro Thr Asn Ile Ser Pro Leu Tyr625 630<210>3<211>415<212>DNA<213>玉蜀黍<400>3tctagaggat cagcatggcg cccaccgtga tgatggcctc gtcggccacc gccgtcgctc 60cgttcctggg gctcaagtcc accgccagcc tccccgtcgc ccgccgctcc tccagaagcc 120tcggcaacgt cagcaacggc ggaaggatcc ggtgcatgca ggtaacaaat gcatcctagc 180tagtagttct ttgcattgca gcagctgcag ctagcgagtt agtaatagga agggaactga 240tgatccatgc atggactgat gtgtgttgcc catcccatcc catcccattt cccaaacgaa 300ccgaaaacac cgtactacgt gcaggtgtgg ccctacggca acaagaagtt cgagacgctg 360tcgtacctgc cgccgctgtc gaccggcggg cgcatccgct gcatgcaggc catgg 415<210>4<211>79<212>PRT<213>玉蜀黍<400>4Met Ala Pro Thr Val Met Met Ala Ser Ser Ala Thr Ala Val Ala Pro1 5 10 15Phe Leu Gly Leu Lys Ser Thr Ala Sar Leu Pro Val Ala Arg Arg Ser20 25 30Ser Arg Ser Leu Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met35 40 45Gln Val Trp Pro Tyr Gly Asn Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu50 55 60Pro Pro Leu Ser Thr Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met Gln Ala Met65 70 75<210>5<211>268<212>DNA<213>人工序列<220><221>轉(zhuǎn)運(yùn)肽<222>1-267<223>PTP1的編碼序列，包含擬南芥ssRUBISCO(SSU)葉綠體引導(dǎo)序列和編碼ssRUBISCO(SSU)蛋白的前24個(gè)氨基酸的序列(Wong等，1992)<400>5atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120aacgacatta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct l80ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgattccggt 240ggtcgcgtca actgcatgca ggccatgg 268<210>6<211>89<212>PRT<213>擬南芥<400>6Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Va1 Ala Ser Pro Ala1 5 10 15Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala20 25 30Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser35 40 45Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys50 55 60Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly65 70 75 80Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala Met85<210>7<211>178<212>DNA<213>擬南芥<400>7atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atffttgcct ctccggctca ggccactatg 60gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120aacgacatta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggccatgg178<210>8<211>59<212>pRT<213>擬南芥<400>8Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Va1 Ala Ser Pro Ala1 5 10 15Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala20 25 30Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser35 40 45Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Meg Gln Ala Met50 55<210>9<211>240<212>DNA<213>擬南芥<400>9atggcgcaag ttagcagaat ctgcaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc 60tcgaaatcca gtcaacgcaa atctccctta tcggtttctc tgaagacgca gcagcatcca 120cgagcttatc cgatttcgtc gtcgtgggga ttgaagaaga gtgggatgac gttaattggc 180tctgagcttc gtcctcttaa ggtcatgtct tctgtttcca cggcgtgcat gcttgccatg 240<210>10<211>80<212>PRT<213>擬南芥<400>10Met Ala Gln Val Ser Arg Ile Cys Asn Gly Val Gln Asn Pro Ser Leu1 5 10 15Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Ser Gln Arg Lys Ser Pro Leu Ser Val20 25 30Ser Leu Lys Thr Gln Gln His Pro Arg Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Ser35 40 45Trp Gly Leu Lys Lys Ser Gly Met Thr Leu Ile Gly Ser Glu Leu Arg50 55 60Pro Leu Lys Val Met Ser Ser Val Ser Thr Ala Cys Met Leu Ala Met65 70 75 80<210>11<211>1907<212>DNA<213>人工序列<220>完全合成的<223><400>11ccatggacaa caacgtcttg aactctggta gaacaaccat ctgcgacgca tacaacgtcg60tggctcacga tccattcagc ttcgaacaca agagcctcga cactattcag aaggagtgga 120tggaatggaa acgtactgac cactctctct acgtcgcacc tgtggttgga acagtgtcca 180gcttccttct caagaaggtc ggctctctca tcggaaaacg tatcttgtcc gaactctggg 240gtatcatctt tccatctggg tccactaatc tcatgcaaga catcttgagg gagaccgaac 300agtttctcaa ccagcgtctc aacactgata ccttggctag agtcaacgct 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tagccttcgg tgtggagctt tctctgcacg tgggaattca aactactttc 1260cagactactt cattaggaac atctctggtg ttcctctcgt catcaggaat gaagacctca 1320cccgtccact tcattacaac cagattagga acatcgagtc tccatccggt actccaggag 1380gtgcaagagc ttacctcgtg tctgtccata acaggaagaa caacatctac gctgccaacg 1440agaatggcac catgattcac cttgcaccag aagattacac tggattcacc atctctccaa 1500tccacgctac ccaagtgaac aatcagacac gcaccttcat ctccgaaaag ttcggaaatc 1560aaggtgactc cttgaggttc gagcaatcca acactaccgc taggtacact ttgagaggca 1620atggaaacag ctacaacctt tacttgagag ttagctccat tggtaactcc accatccgtg 1680ttaccatcaa cggacgtgtt tacacagtct ctaatgtgaa cactacaacg aacaatgatg 1740gcgttaacga caacggagcc agattcagcg acatcaacat tggcaacatc gtggcctctg 1800acaacactaa cgttactttg gacatcaatg tgaccctcaa ttctggaact ccatttgatc 1860tcatgaacat catgtttgtg ccaactaacc tccctccatt gtactaa 1907<210>12<211>634<212>pRT<213>蘇云金芽孢桿菌<400>12Met Asp Asn Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala1 5 10 15Tyr Asn Val Val Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Glu His Lys Ser Leu20 25 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Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr245 250 255Val Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Met Val Ser Ser260 265 270Gly Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser275 280 285Phe Thr Ala Gln Asn Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn290 295 300Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Gly Ile Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Thr305 310 315 320Phe Pro ASn Ile Gly Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ser Leu325 330 335Asn Ser Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser ser Gly Leu Ile340 345 350Gly Ala Thr Asn Leu Asn His Asn Phe Asn Cys Ser Thr Val Leu Pro355 360 365Pro Leu Ser Thr Pro Phe Val Arg SerTrp Leu Asp Ser Gly Thr Asp370 375380Arg Glu Gly Val Ala Thr Ser Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Gln385 390 395 400Thr Thr Leu Ser Leu Arg Cys Gly Ala Phe Ser Ala Arg Gly Asn Ser405 410 415Asn Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu420 425 430Val Ile Arg Asn Glu Asp Leu Thr Arg Pro Leu His Tyr Asn Gln Ile435 440 445Arg Asn Ile Glu Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr450 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tccaccatca gggtcaccat caacgggagg gtgtacacag 2700ccaccaatgt gaacacgacg accaacaatg atggcgtcaa cgacaacggc gcccgcttca 2760gcgacatcaa cattggcaac gtggtggcca gcagcaactc cgacgtcccg ctggacatca 2820acgtgaccct gaactctggc acccagttcg acctcatgaa catcatgctg gtgccaacta 2880acatctcgcc gctgtactga taggagctct gatccccatg ggaattcccg atcgttcaaa 2940catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 3000ataatttctg ttgaattacg tcaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 3060tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 3120caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 3180tcggggatat ccccggggcg gccgctcgag tggtggccgc atcgatcgtg aagtttctca 3240tctaagcccc catttggacg tgaatgtaga cacgtcgaaa taaagatttc cgaattagaa 3300taatttgttt attgctttcg cctataaata cgacggatcg taatttgtcg ttttatcaaa 3360atgtactttc attttataat aacgctgcgg acatctacat ttttgaattg aaaaaaaatt 3420ggtaattact ctttcttttt ctccatattg accatcatac tcattgctga tccatgtaga 3480tttcccggac atgaagccat ttacaattga atatatcctg ccgccgctgc cgctttgcac 3540ccggtggagc ttgcatgttg gtttctacgc agaactgagc cggttaggca gataatttcc 3600attgagaact gagccatgtg caccttcccc ccaacacggt gagcgacggg gcaacggagt 3660gatccacatg ggacttttcc tagcttnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3720nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccgggagggt tcgagaaggg 3780ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgccagggc gcagccctgg ttaaaaacaa 3840ggtttataaa tattggttta aaagcaggtt aaaagacagg ttagcggtgg ccgaaaaacg 3900ggcggaaacc cttgcaaatg ctggattttc tgcctgtgga cagcccctca aatgtcaata 3960ggtgcgcccc tcatctgtca tcactctgcc cctcaagtgt caaggatcgc gcccctcatc 4020tgtcagtagt cgcgcccctc aagtgtcaat accgcagggc acttatcccc aggcttgtcc 4080acatcatctg tgggaaactc gcgtaaaatc aggcgttttc gccgatttgc gaggctggcc 4140agctccacgt cgccggccga aatcgagcct gcccctcatc tgtcaacgcc gcgccgggtg 4200agtcggcccc tcaagtgtca acgtccgccc ctcatctgtc agtgagggcc aagttttccg 4260cgtggtatcc acaacgccgg cggccggccg cggtgtctcg cacacggctt cgacggcgtt 4320tctggcgcgt ttgcagggcc atagacggcc gccagcccag cggcgagggc aaccagcccg 4380gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngtcgat 4440cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg 4500actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg 4560gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc 4620ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc 4680gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg gcatggcggc cgacgcgctg 4740ggctacgtct tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg ccttccccat tatgattctt 4800ctcgcttccg gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca tgctgtccag gcaggtagat 4860gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc ttaccagcct aacttcgatc 4920actggaccgc tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg cgagcacatg gaacgggttg 4980gcatggattg taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc ccgcgttgcg tcgcggtgca 5040tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac ggattcacca 5100ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt 5160ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc 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aaggaaaggc catcgttgaa 2220gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa 2280aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac 2340gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt 2400tcatttcatt tggagaggac acgctgacaa gctgactcta gcagatctac cgtcttcggt 2460acgcgctcac tccgccctct gcctttgtta ctgccacgtt tctctgaatg ctctcttgtg 2520tggtgattgc tgagagtggt ttagctggat ctagaattac actctgaaat cgtgttctgc 2580ctgtgctgat tacttgccgt cctttgtagc agcaaaatat agggacatgg tagtacgaaa 2640cgaagataga acctacacag caatacgaga aatgtgtaat ttggtgctta gcggtattta 2700tttaagcaca tgttggtgtt atagggcact tggattcaga agtttgctgt taatttaggc 2760acaggcttca tactacatgg gtcaatagta tagggattca tattataggc gatactataa 2820taatttgttc gtctgcagag cttattattt gccaaaatta gatattccta ttctgttttt 2880gtttgtgtgc tgttaaattg ttaacgcctg aaggaataaa tataaatgac gaaattttga 2940tgtttatctc tgctccttta ttgtgaccat aagtcaagat cagatgcact cgttttaaat 3000attgttgtct gaagaaataa gtactgacag tattttgatg cattgatctg cttgtttgtt 3060gtaacaaaat ttaaaaataa agagtttcct ttttgttgct ctccttacct cctgatggta 3120tctagtatct accaactgac actatattgc ttctctttac atacgtatct tgctcgatgc 3180cttctcccta gtgttgacca gtgttactca catagtcttt gctcatttca ttgtaatgca 3240gataccaagc ggcctctaga ggatcagcat ggcgcccacc gtgatgatgg cctcgtcggc 3300caccgccgtc gctccgttcc tggggctcaa gcccaccgcc agcctccccg tcgcccgccg 3360ctcctccaga agcctcggca acgtcagcaa cggcggaagg atccggtgca tgcaggtaac 3420aaatgcatcc tagctagtag ttctttgcat tgcagcagct gcagctagcg agttagtaat 3480aggaagggaa ctgatgatcc atgcatggac tgatgtgtgt tgcccatccc atcccatccc 3540atttcccaaa cgaaccgaaa acaccgtact acgtgcaggt gtggccctac ggcaacaaga 3600agttcgagac gctgtcgtac ctgccgccgc tgtcgaccgg cgggcgcatc cgctgcatgc 3660aggccatgga caactccgtc ctgaactctg gtcgcaccac catctgcgac gcctacaacg 3720tcgcggcgca tgatccattc agcttccagc acaagagcct cgacactgtt cagaaggagt 3780ggacggagtg gaagaagaac aaccacagcc tgtacctgga ccccatcgtc ggcacggtgg 3840ccagcttcct tctcaagaag gtcggctctc tcgtcgggaa gcgcatcctc tcggaactcc 3900gcaacctgat ctttccatct ggctccacca acctcatgca agacatcctc agggagaccg 3960agaagtttct caaccagcgc ctcaacactg atacccttgc tcgcgtcaac gctgagctga 4020cgggtctgca agcaaacgtg gaggagttca accgccaagt ggacaacttc ctcaacccca 4080accgcaatgc ggtgcctctg tccatcactt cttccgtgaa caccatgcaa caaccgttcc 4140tcaaccgctt gcctcagttc cagatgcaag gctaccagct gctcctgctg ccactctttg 4200ctcaggctgc caacctgcac ctctccttca ttcgtgacgt gatcctcaac gctgacgagt 4260ggggcatctc tgcagccacg ctgaggacct accgcgacta cctgaagaac tacaccaggg 4320actactccaa ctattgcatc aacacctacc agtcggcctt caagggcctc aatacgaggc 4380ttcacgacat gctggag5tc aggacctaca tgttcctgaa cgtgttcgag tacgtcagca 4440tctggtcgct cttcaagtac cagagcctgc tggtgtccag cggcgccaac ctctacgcca 4500gcggctctgg tccccaacaa actcagagct tcaccagcca ggactggcca ttcctgtatt 4560cgttgttcca agtcaactcc aactacgtcc tcaacggctt ctctggtgct cgcctctcca 4620acaccttccc caacattgtt ggcctccccg gctccaccac aactcatgct ctgcttgctg 4680ccagagtgaa ctactccggc ggcatctcga gcggcgacat tggtgcatcg ccgttcaacc 4740agaacttcaa 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atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 6640tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 5700aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 5760gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt 5820atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggggatat ccccggggcg gccgcgggga 5880attcggtacc aagcttacgc gtggccgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 5940tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 6000taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 6060cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 6120gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 6180ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 6240agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 6300ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 6360caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 6420gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 6480cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 6540tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 6600gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 6660cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 6720tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 6780tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 6840caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 6900aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 6960cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 7020ccttttgggg tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc 7080ggcgtcccgg aaaacgattc cgaagcccaa cctttcatag aaggcggcgg tggaatcgaa 7140atctcgtgat ggcaggttgg gcgtcgcttg gtcggtcatt tcgaacccca gagtcccgct 7200cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata 7260ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg 7320gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat 7380ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg 7440acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg 7500agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta 7560cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc 7620gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga 7680gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca 7740gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc 7800gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc 7860gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt 7920gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca 7980tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat cctgtctctt gatcagatct tgatcccctg 8040cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg cttcccaacc 8100ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa aaccgcccag 8160tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc gcttgcgttt 8220tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg tttctgcgga 8280ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg cttgcggcag 8340cgtgaagct 8349<210>17<211>1912<212>DNAt213>蘇云金芽孢桿菌<400>17atgaatagtg tattgaatag cggaagaact actatttgtg atgcgtataa tgtagcggct 60catgatccat ttagttttca acacaaatca ttagataccg tacaaaagga atggacggag 120tggaaaaaaa ataatcatag tttataccta gatcctattg ttggaactgt ggctagtttt 180ctgttaaaga aagtggggag tcttgttgga aaaaggatac taagtgagtt acggaattta 240atatttccta gtggtagtac aaatctaatg caagatattt taagagagac agaaaaattc 300ctgaatcaaa gacttaatac agacactctt gcccgtgtaa atgcggaatt gacagggctg 360caagcaaatg tagaagagtt taatcgacaa gtagataatt ttttgaaccc taaccgaaac 420gctgttcctt tatcaataac ttcttcagtt aatacaatgc aacaattatt tctaaataga 480ttaccccagt tccagatgca aggataccaa ctgttattat tacctttatt tgcacaggca 540gccaatttac atctttcttt tattagagat gttattctaa atgcagatga atggggaatt 600tcagcagcaa cattacgtac gtatcgagat tacttgaaaa attatacaag agattactct 660aactattgta taaatacgta tcaaagtgcg tttaaaggtt taaacactcg tttacacgat 720atgttagaat ttagaacata tatgttttta aatgtatttg agtatgtatc tatctggtcg 780ttgtttaaat atcaaagtct tctagtatct tccggtgcta atttatatgc aagtggtagt 840ggaccacagc agacccaatc atttacttca caagactggc catttttata ttctcttttc 900caagttaatt caaattatgt gttaaatgga tttagtggtg ctaggctttc taataccttc 960cctaatatag ttggtttacc tggttctact acaactcacg cattgcttgc tgcaagggtt 1020aattacagtg gaggaatttc gtctggtgat ataggtgcat ctccgtttaa tcaaaatttt 1080aattgtagca catttctccc cccattgtta acgccatttg ttaggagttg gctagattca 1140ggttcagatc gggagggcgt tgccaccgtt acaaattggc aaacagaatc ctttgagaca 1200actttagggt taaggagtgg tgcttttaca gctcgcggta attcaaacta tttcccagat 1260tattttattc gtaatatttc tggagttcct ttagttgtta gaaatgaaga tttaagaaga 1320ccgttacact ataatgaaat aagaaatata gcaagtcctt caggaacacc tggtggagca 1380cgagcttata tggtatctgt gcataacaga aaaaataata tccatgctgt tcatgaaaat 1440ggttctatga ttcatttagc gccaaatgac tatacaggat ttactatttc gccgatacat 1500gcaactcaag tgaataatca aacacgaaca tttatttctg aaaaatttgg aaatcaaggt 1560gattctttaa ggtttgaaca aaacaacacg acagctcgtt atacgcttag agggaatgga 1620aatagttaca atctttattt aagagtttct tcaataggaa attccactat tcgagttact 1680ataaacggta gggtatatac tgctacaaat gttaatacta ctacaaataa cgatggagtt 1740aatgataatg gagctcgttt ttcagatatt aatatcggta atgtagtagc aagtagtaat 1800tctgatgtac cattagatat aaatgtaaca ttaaactccg gtactcaatt tgatcttatg 1860aatattatgc ttgtaccaac taatatttca ccactttatt aaggtttgag ta 1912<210>18<211>633<212>PRT<213>蘇云金芽孢桿菌<400>18Met Asn Ser Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala Tyr1 5 10 15Asn Val Ala Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Gln His Lys Ser Leu Asp20 25 30Thr Val Gln Lys Glu Trp Thr Glu Trp Lys Lys Asn Asn His Ser Leu35 40 45Tyr Leu Asp Pro Ile Val Gly Thr Val Ala Ser Phe Leu Leu Lys Lys50 55 60Val gly Ser Leu Val Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asn Leu65 70 75 80Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Gln Asp Ile Leu Arg Glu85 90 95Thr Glu Lys Phe Leu Asn Gln Arg Leu Asn Thr Asp Thr Leu Ala Arg100 105 110Val Asn Ala Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ala Asn Val Glu Glu Phe Asn115 120 125Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Arg Asn Ala Val Pro Leu130 135 140Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu Phe Leu Asn Arg145 150 155 160Leu Pro Gln Phe Gln Met Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu165 170 175Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile180 185 190Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Leu Arg Thr Tyr195 200 205Arg Asp Tyr Leu Lys Asn Tyr Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile210 215 220Asn Thr Tyr Gln Ser Ala Phe Lys Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp225 230 235 240Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Pha Glu Tyr Val245 250 255Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Val Ser Ser Gly260 265 270Ala Asn Leu Tyr Ala sar Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser Phe275 280 285Thr Ser Gln Asp Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser290 295 300Asn Tyr Val Leu Asn Gly Phe Ser Gly Ala Arg Leu Ser Asn Thr Phe305 310 315 320Pro Asn Ile Val Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ala Leu Leu325 330 335Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Ile Ser Ser Gly Asp Ile Gly340 345 350Ala Ser Pro Phe Asn Gln Asn Phe Asn Cys Ser Thr Phe Leu Pro Pro355 360 365Leu Leu Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Ser Asp Arg370 375 380Glu Gly Val Ala Thr Val Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Glu Thr385 390 395 400Thr Leu Gly Leu Arg Ser Gly Ala Phe Thr Ala Arg Gly Asn Ser Asn405 410 415Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu Val420 425 430Val Arg Asn Glu Asp Leu Arg Arg Pro Leu His Tyr Asn Glu Ile Arg435 440 445Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr Met450 455 460Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile His Ala Val His Glu Asn465 470 475 480Gly Ser Met Ile His Leu Ala Pro Asn Asp Tyr Thr Gly Phe Thr Ile
485 490495Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe Ile500 505 510Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln Asn515 520 525Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg GlyAsn Gly Asn Ser Tyr Asn530 535540Leu Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val Thr545 550 555 560Ile Asn Gly Arg Val Tyr Thr Ala Thr Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn565 570 575Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile580 585 590Gly Asn Val Val Ala Ser Ser Asn Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Asn595 600 605Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Gln Phe Asp Leu Met Asn Ile Met Leu610 615 620Val Pro Thr Asn Ile Ser Pro Leu Tyr625 630
權(quán)利要求
1.包含含植物功能性啟動(dòng)子序列的核酸序列的植物，所述啟動(dòng)子序列有效連接于編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的多核苷酸序列，所述δ-內(nèi)毒素蛋白缺乏顯著的雙翅目物種抑制活性，其中所述核酸序列在所述植物中的表達(dá)產(chǎn)生定位至亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室的所述蛋白。
2.包含含植物功能性啟動(dòng)子序列的核酸序列的植物，所述啟動(dòng)子序列有效連接于編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列與編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的第二多核苷酸序列符合讀框地連接，所述δ-內(nèi)毒素蛋白缺乏顯著的雙翅目物種抑制活性，其中所述第二多核苷酸序列有效連接于植物功能性3’端轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列，其中所述核酸序列在所述植物中的表達(dá)產(chǎn)生包含共價(jià)連接于所述δ-內(nèi)毒素蛋白的氨基末端質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合蛋白，并且其中所述融合蛋白的作用是將所述δ-內(nèi)毒素蛋白定位至亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室。
3.權(quán)利要求1的植物，其中編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列包括編碼Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的序列。
4.權(quán)利要求2的植物，其中編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列包括編碼Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的序列。
5.權(quán)利要求1的植物，其中所述亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室是植物質(zhì)體或葉綠體。
6.權(quán)利要求2的植物，其中所述亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室是植物質(zhì)體或葉綠體。
7.權(quán)利要求1的植物，其中將所述核酸序列引入并穩(wěn)定保持在植物質(zhì)體或葉綠體中。
8.得自按照權(quán)利要求5的植物的后代的植物組織，其中所述植物組織包括包含編碼所述δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列的植物、植物種子或植物細(xì)胞。
9.得自按照權(quán)利要求6的植物的后代的植物組織，其中所述植物組織包括包含編碼所述δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列的植物、植物種子或植物細(xì)胞。
10.按照權(quán)利要求1的植物，其中包含啟動(dòng)子的所述核酸序列是植物葉綠體或質(zhì)體功能性啟動(dòng)子。
11.按照權(quán)利要求2的植物，其中包含植物功能性啟動(dòng)子的所述核酸序列是在植物中天然表達(dá)的啟動(dòng)子序列。
12.按照權(quán)利要求1的植物，其中編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO11和SEQ ID NO17。
13.按照權(quán)利要求2的植物，其中編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO11和SEQ ID NO17。
14.按照權(quán)利要求1的植物，其中所述Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白選自SEQ ID NO2、SEQID NO12和SEQID NO18。
15.按照權(quán)利要求2的植物，其中所述Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白選自SEQ ID NO2、SEQID NO12和SEQID NO18。
16.權(quán)利要求2的植物，其中所述核酸序列還包含植物功能性內(nèi)含子序列。
17.權(quán)利要求16的植物，其中所述內(nèi)含子序列選自Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子、TMVΩ元件、玉米熱激蛋白70內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。
18.權(quán)利要求16的植物，其中所述內(nèi)含子序列是玉米熱激蛋白70內(nèi)含子。
19.權(quán)利要求2的植物，其中所述第一多核苷酸序列編碼選自zmSSU PTP、PTP1、PTP1Δ和PTP2的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
20.權(quán)利要求19的植物，其中包含SEQ ID NO4的所述zmSSUPTP質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽由包含SEQ ID NO3的核酸序列編碼。
21.權(quán)利要求19的植物，其中包含SEQ ID NO6的所述PTP1質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽由包含SEQ ID NO5的核酸序列編碼。
22.權(quán)利要求19的植物，其中包含SEQ ID NO8的所述PTP1Δ質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽由包含SEQ ID NO7的核酸序列編碼。
23.權(quán)利要求19的植物，其中包含SEQ ID NO10的所述PTP2質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽由包含SEQ ID NO9的核酸序列編碼。
24.權(quán)利要求2的植物，包含SEQ ID NO13的核苷酸17-3182。
25.權(quán)利要求2的植物，包含SEQ ID NO14的核苷酸17-3092。
26.權(quán)利要求2的植物，包含SEQ ID NO15的核苷酸17-3155。
27.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是單子葉植物。
28.權(quán)利要求2的植物，其中所述植物是單子葉植物。
29.權(quán)利要求27的植物，其中所述植物是選自玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、小米、高粱、甘蔗和草坪草的單子葉植物。
30.權(quán)利要求28的植物，其中所述植物是選自玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、小米、高粱、甘蔗和草坪草的單子葉植物。
31.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
32.權(quán)利要求2的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
33.權(quán)利要求31的植物，其中所述植物是選自棉花、大豆、番茄、馬鈴薯、柑桔、煙草、canola和草莓的雙子葉植物。
34.權(quán)利要求32的植物，其中所述植物是選自棉花、大豆、番茄、馬鈴薯、柑桔、煙草、canola和草莓的雙子葉植物。
35.權(quán)利要求1植物，還包括R0轉(zhuǎn)基因植物。
36.權(quán)利要求2植物，還包括R0轉(zhuǎn)基因植物。
37.權(quán)利要求35的植物的任何世代的后代植物，其中所述植物遺傳有來(lái)自所述R0轉(zhuǎn)基因植物的所述核酸序列。
38.權(quán)利要求36的植物的任何世代的后代植物，其中所述植物遺傳有來(lái)自所述R0轉(zhuǎn)基因植物的所述核酸序列。
39.按照權(quán)利要求1的植物，其中所述植物還包含一種含植物有效啟動(dòng)子的額外的核酸序列，所述啟動(dòng)子有效連接于編碼Cry1蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的多核苷酸序列。
40.按照權(quán)利要求2的植物，其中所述植物還包含一種含植物有效啟動(dòng)子的額外的核酸序列，所述啟動(dòng)子有效連接于編碼Cry1蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的多核苷酸序列。
41.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物后代植株的方法，包括(a)獲得含有一種含植物功能性啟動(dòng)子的核酸序列的第一植物，所述啟動(dòng)子有效連接于編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列與編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的第二多核苷酸序列符合讀框地連接，所述δ-內(nèi)毒素蛋白缺乏顯著的雙翅目物種抑制活性，其中所述第二多核苷酸序列有效連接于植物功能性3’端轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列，其中所述核酸序列在所述植物中的表達(dá)產(chǎn)生包含共價(jià)連接于所述δ-內(nèi)毒素蛋白的氨基末端質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合蛋白，并且其中所述融合蛋白的作用是將所述δ-內(nèi)毒素蛋白定位至亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室；(b)獲得第二植物；和(c)使所述第一植物與所述第二植物雜交，獲得雜交的轉(zhuǎn)基因后代植物，所述后代植物遺傳有得自所述第一植物的所述核酸序列。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述后代植物是單子葉植物，所述單子葉植物選自玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、小米、高粱、甘蔗和草坪草。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述后代植物是雙子葉植物，所述雙子葉植物選自棉花、大豆、番茄、馬鈴薯、柑桔和煙草。
44.包含有效連接于編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的第一多核苷酸序列的啟動(dòng)子的核酸序列，所述第一多核苷酸序列與編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的第二多核苷酸序列符合讀框地連接，所述δ-內(nèi)毒素蛋白缺乏顯著的雙翅目抑制活性，其中植物細(xì)胞表達(dá)所述核酸序列產(chǎn)生包含共價(jià)連接于所述δ-內(nèi)毒素蛋白的氨基末端質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合蛋白，并且其中所述融合蛋白的作用是將所述δ-內(nèi)毒素蛋白定位至亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室
45.權(quán)利要求44的核酸序列，其中所述第二多核苷酸序列編碼Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白。
46.權(quán)利要求45的核酸序列，其中所述第二多核苷酸序列編碼選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO18的序列的Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白。
47.權(quán)利要求46的核酸序列，其中所述第二多核苷酸序列選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO17的序列。
48.包含含啟動(dòng)子的核酸序列的植物細(xì)胞，所述啟動(dòng)子有效連接于編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的多核苷酸序列，所述δ-內(nèi)毒素蛋白缺乏顯著的雙翅目抑制活性，其中所述核酸序列在所述植物中的表達(dá)產(chǎn)生定位至亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室的所述蛋白。
49.權(quán)利要求48的植物細(xì)胞，其中編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列編碼Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素蛋白。
50.權(quán)利要求49的植物細(xì)胞，其中所述亞細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室是植物質(zhì)體或葉綠體。
51.權(quán)利要求48的植物細(xì)胞，其中將所述核酸序列引入并穩(wěn)定保持在植物質(zhì)體或葉綠體中。
52.權(quán)利要求51的植物細(xì)胞，其中所述核酸序列在所述質(zhì)體或葉綠體中表達(dá)，所述表達(dá)產(chǎn)生殺蟲有效量的定位至所述質(zhì)體或葉綠體的所述δ-內(nèi)毒素蛋白。
53.得自按照權(quán)利要求48的植物細(xì)胞的后代的植物組織，其中所述植物組織包括包含表達(dá)定位至植物質(zhì)體或葉綠體的所述δ-內(nèi)毒素蛋白的所述多核苷酸序列的植物、植物種子、植物細(xì)胞或其后代組織。
54.按照權(quán)利要求50的植物細(xì)胞，其中包含啟動(dòng)子的所述核酸序列是植物葉綠體或質(zhì)體功能性啟動(dòng)子。
55.按照權(quán)利要求54的植物細(xì)胞，其中編碼Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的所述多核苷酸序列選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO11和SEQ ID NO17。
56.按照權(quán)利要求55的植物細(xì)胞，其中所述Cry2Ab蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO12和SEQ ID NO18。
全文摘要
公開了通過(guò)在植物中表達(dá)Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ－內(nèi)毒素的新方法防治植物害蟲的方法。本發(fā)明包括編碼包含Cry2A蘇云金芽孢桿菌δ－內(nèi)毒素的蛋白的核酸區(qū)段。公開了所述核酸區(qū)段,也公開了包含所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)化載體、用要求保護(hù)的區(qū)段轉(zhuǎn)化的植物、轉(zhuǎn)化植物的方法和控制害蟲侵染的方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1332800SQ99815106
公開日2002年1月23日 申請(qǐng)日期1999年11月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月4日
發(fā)明者D·R·科爾賓, C·P·羅馬諾 申請(qǐng)人:孟山都公司