專(zhuān)利名稱(chēng)：用于遞送異源基因的定向腺病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)修飾尾絲蛋白或六鄰體蛋白的表面可及位點(diǎn)以包含導(dǎo)向氨基酸序列來(lái)獲得腺病毒載體的有效導(dǎo)向。本發(fā)明成功的關(guān)鍵在于，發(fā)現(xiàn)插入的導(dǎo)向序列的N端和C端的額外間隔氨基酸殘基對(duì)于提供導(dǎo)向序列可識(shí)別的結(jié)合結(jié)構(gòu)是關(guān)鍵的。因此，導(dǎo)向序列的可及性和功能性以及修飾蛋白的結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈取決于相鄰間隔的大小和性質(zhì)。其它結(jié)果提示短導(dǎo)向肽可與尾絲蛋白的C端有效融合。本發(fā)明還涉及這些載體在向體內(nèi)或體外特定靶細(xì)胞遞送治療基因中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腺病毒載體腺病毒顯示一些對(duì)用作基因治療的基因轉(zhuǎn)移載體特別有利的性質(zhì)。具體地，它們具有相當(dāng)寬的宿主譜，能夠感染靜止細(xì)胞，不整合進(jìn)入感染細(xì)胞的基因組，而且迄今未參與人類(lèi)主要疾病。因此，腺病毒已被用于將目的基因轉(zhuǎn)移至肌肉(Rogot等，1993，自然(Nature)361:647)、肝臟(Jaffe等，1992，自然遺傳學(xué)(Nature Genetics)1:372)、神經(jīng)系統(tǒng)(Akli等，1993，自然遺傳學(xué)3:224)、腫瘤(Griscelli等，1998,PNAS 95:6367)、完整或損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞(van Belle等，1998，人類(lèi)基因治療(Human Gene Therapy)9:1013)、滑膜組織(Ghivizzani等，1998,PNAS 95:4613)等。腺病毒載體可有效轉(zhuǎn)移基因至復(fù)制和非復(fù)制細(xì)胞(見(jiàn)如Crystal,1995，科學(xué)(Science)170:404-410)。
腺病毒衣殼腺病毒衣殼的特征是人們熟知的(見(jiàn)如國(guó)際專(zhuān)利出版物WO98/07877)。
許多參考文獻(xiàn)描述了腺病毒六鄰體蛋白，并估計(jì)了一些可及位點(diǎn)。例如，Athapilly等(1994，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.242:430-455)描述了2.9A分辨率的精細(xì)晶體結(jié)構(gòu)。Crawford-Miksza等(1996，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)70:1836-1844)報(bào)告了7個(gè)含有血清型特異殘基的六鄰體蛋白高變區(qū)的位置和結(jié)構(gòu)。的確，已有在腺病毒六鄰體表面表達(dá)外源表位的報(bào)道(Crompton等，1994，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)75:133-139)。然而，正如下面的例子所示，Crompton等的文章沒(méi)有給出通過(guò)修飾六鄰體蛋白導(dǎo)向腺病毒的可重復(fù)的方法。
其它參考文獻(xiàn)提供了關(guān)于尾絲蛋白的信息(Chroboczek等，1995，見(jiàn)Doerfler W.& P.Bohm(編)，腺病毒分子的所有組成部分(Themolecular repertoire of adenoviruses)，第163-200頁(yè)，Springer-Verlag；Stewart和Burnett,ibid.，第25-38頁(yè)；Xia等，1995，ibid.，第39-46頁(yè)；Fender等，1995，病毒學(xué)(Virol.),214:110-117；Hong和Engler,1996,病毒學(xué)雜志，70:7071-7078)。已報(bào)道了通過(guò)人腺病毒血清型2和3尾絲頭部的合成肽來(lái)抑制細(xì)胞對(duì)病毒的粘附和通過(guò)抗肽抗體中和病毒(Liebermann等，1996，病毒研究(Virus Research),45:111-121。Xia等(1994，結(jié)構(gòu)(Structure),2:1259-1270)報(bào)道了5型腺病毒尾絲蛋白受體結(jié)合域的1.7A分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。
腺病毒是直徑約65-80nm的無(wú)包膜的規(guī)則二十面體。腺病毒衣殼包含252個(gè)衣殼粒，其中240個(gè)是六鄰體，12個(gè)是五鄰體。六鄰體和五鄰體來(lái)自3個(gè)不同的病毒多肽(Maizel等，1968，病毒學(xué)，36:115-125；Weber等，1997，病毒學(xué)，76:709-724)。Ad5六鄰體包含3個(gè)相同的多肽，每個(gè)多肽有967個(gè)氨基酸，即多肽Ⅱ(Roberts等，1986，科學(xué)，232:1148-1151)。五鄰體包含一個(gè)五鄰體基座和一個(gè)三聚體尾絲蛋白，五鄰體基座提供附著衣殼的位點(diǎn)，而三聚體尾絲蛋白與五鄰體基座非共價(jià)連接并從它伸展出去。
尾絲蛋白包含多肽Ⅳ(582個(gè)氨基酸)的3個(gè)相同蛋白質(zhì)亞基，包括尾、軸(shaft)和頭部(knob)(Devaux等，1990，分子生物學(xué)雜志，215:567-588)。尾絲軸含有15個(gè)氨基酸的假重復(fù)，后者被認(rèn)為形成了兩個(gè)交替的β-鏈和β-轉(zhuǎn)角(Green等，1983,EMBO J.,2:1357-1365)。尾絲軸的整個(gè)長(zhǎng)度和15個(gè)氨基酸重復(fù)的數(shù)目在不同腺病毒血清型之間是不同的。例如，Ad2尾絲軸長(zhǎng)37nm，含有22個(gè)重復(fù)，而Ad3尾絲長(zhǎng)11nm，含有6個(gè)重復(fù)。來(lái)自不同腺病毒血清型的10個(gè)以上尾絲蛋白的序列測(cè)定揭示，其序列多樣性比其它腺病毒蛋白之間觀察到的多樣性更大。例如，緊密相關(guān)的Ad2和Ad5血清型的尾絲蛋白的頭部區(qū)域在氨基酸水平上僅63％相似(Chroboczek等，1992,病毒學(xué)，186:280-285)，而它們的五鄰體基座序列99％相同。然而，Ad2和Ad5尾絲蛋白均可結(jié)合相同細(xì)胞受體，因?yàn)樗鼈兘徊嬉种葡嗷サ慕Y(jié)合。相反，Ad2和Ad3的尾絲僅20％相同(Signas等，1985，病毒學(xué)雜志，53:672-678)，并結(jié)合不同受體(Defer等，1990，病毒學(xué)雜志，64(8),3661-3673)。
已證明腺病毒血清型2使用尾絲和五鄰體基座與不同細(xì)胞受體相互作用，以附著和有效感染細(xì)胞(Wickham等，1993，細(xì)胞(Cell),73:309-319)。首先，病毒利用位于尾絲頭部上的受體結(jié)合域(Henry等，1994，病毒學(xué)雜志，68(8):5239-5246)附著于至少兩個(gè)細(xì)胞表面受體中的一個(gè)上(Hong等，1997,EMBO J.,16:2294-2306；Bergelson等，1997，科學(xué)，275:1320-1323；Phillipson等，1968，病毒學(xué)雜志，2:1064-1075:Wickham等，1993見(jiàn)上；Svensson等，1981，病毒學(xué)雜志，38:70-81；和DiGuilmi等，1995，病毒研究，38:71-81)。其次，病毒附著后，五鄰體基座與異二聚體細(xì)胞表面受體(稱(chēng)為整聯(lián)蛋白)家族的特定成員結(jié)合。對(duì)于具有長(zhǎng)軸尾絲的Ad2和Ad5血清型，五鄰體基座沒(méi)有明顯參與病毒對(duì)宿主細(xì)胞的最初附著(Wickham等，1993，見(jiàn)上)。
大多數(shù)整聯(lián)蛋白識(shí)別配體中氨基酸的短線性片段，如在大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)配體中發(fā)現(xiàn)的三肽RGD。整聯(lián)蛋白αⅡbβ3通過(guò)氨基酸序列KQAGD(SEQ ID NO:)結(jié)合纖維蛋白原(Kloczewiak等，1984，生物化學(xué)(Biochemistry),23,1767-1774),α4β1通過(guò)核心序列EILDV(SEQID NO:)結(jié)合纖連蛋白(Komoriya等，1991，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),266:15075-15079)。另一個(gè)存在于含有αv的整聯(lián)蛋白的β亞基中的結(jié)構(gòu)基序NPXY(SEQ ID NO:)也顯示對(duì)于整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化十分重要(Suzuki等，1990，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),87:5354)。
一旦Ad2或Ad5通過(guò)其尾絲附著于細(xì)胞上，它就通過(guò)與整聯(lián)蛋白結(jié)合的五鄰體基座經(jīng)過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)化過(guò)程進(jìn)入披網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞小泡中。最后，病毒顆粒被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的核孔復(fù)合物中，在此病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，從而開(kāi)始從病毒染色體的表達(dá)。
然而，在基因治療中使用腺病毒的一個(gè)缺點(diǎn)是，所有含有腺病毒尾絲和五鄰體基座的受體的細(xì)胞--而不只是需要治療處理的細(xì)胞--都會(huì)內(nèi)化腺病毒，因而也內(nèi)化施用的一或多個(gè)基因。而且，缺乏尾絲受體或五鄰體基座受體的細(xì)胞在腺病毒介導(dǎo)的基因遞送中將會(huì)被削弱?？雌饋?lái)缺乏腺病毒尾絲受體的細(xì)胞以非常低的效率被腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(Curiel等，1992，見(jiàn)上；Cotton等，1990，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，87:4033-4037；Wattel等，1996，白血病(Leukemia),10:171-174)。因此，有效指導(dǎo)腺病毒進(jìn)入特定細(xì)胞以及在一些情況下擴(kuò)充可接受腺病毒介導(dǎo)的基因治療的細(xì)胞的所有組成部分，代表了改良當(dāng)前載體的一個(gè)重要目的。兩種解決方法也可能潛在地降低在靶細(xì)胞中獲得基因表達(dá)所必需的腺病毒載體的量，因而潛在地降低與較高劑量腺病毒有關(guān)的副作用和并發(fā)癥。
腺病毒導(dǎo)向策略已采用各種策略改變腺病毒的趨性，即將腺病毒導(dǎo)向野生型腺病毒載體通常不能有效感染的特定細(xì)胞類(lèi)型(見(jiàn)例如國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 98/07877)。所采用的策略包括修飾尾絲蛋白、六鄰體蛋白和五鄰體基座蛋白。
美國(guó)專(zhuān)利5,559,099描述了一個(gè)包含嵌合五鄰體基座蛋白和治療基因的重組病毒，其中嵌合五鄰體基座蛋白在野生型五鄰體基座序列之外或替代野生型五鄰體基座序列含有對(duì)受體、抗體或表位特異的非五鄰體氨基酸序列。
美國(guó)專(zhuān)利5,543,328要求一種腺病毒，其中腺病毒尾絲包括對(duì)位于目的細(xì)胞類(lèi)型上的受體特異的配體。這種腺病毒尾絲可通過(guò)除去全部或部分尾絲蛋白頭部并用配體替代它來(lái)制備，或通過(guò)構(gòu)建全長(zhǎng)尾絲蛋白和配體間的融合物來(lái)制備。
國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 95/26412公開(kāi)了修飾腺病毒全長(zhǎng)尾絲蛋白以包含用以結(jié)合配體的C端接頭的策略。據(jù)說(shuō)包含接頭是為了避免對(duì)尾絲蛋白同三聚體的形成產(chǎn)生空間干擾。
國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 96/26281公開(kāi)了一種重組腺病毒，其含有(a)在天然尾絲序列之外或替代天然尾絲序列含有非天然氨基酸序列的嵌合尾絲蛋白，(b)治療基因，和可選擇的(c)替代天然尾絲氨基酸三聚體化結(jié)構(gòu)域的非天然三聚體化結(jié)構(gòu)域。非天然氨基酸序列可以是蛋白結(jié)合序列，并可位于C端。
國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 97/20051公開(kāi)了一種含有非天然氨基酸序列的嵌合腺病毒外殼蛋白，該非天然氨基酸序列能指導(dǎo)載體比具有野生型外殼蛋白的載體更有效地進(jìn)入細(xì)胞。非天然序列可在外殼蛋白C端或其附近或外殼蛋白暴露的環(huán)中插入或替代內(nèi)部外殼蛋白序列。外殼蛋白可以是尾絲蛋白、五鄰體基座或六鄰體蛋白?？砂ㄩg隔序列。
其它導(dǎo)向技術(shù)依賴于病毒外殼蛋白的表達(dá)后修飾，例如通過(guò)橋連導(dǎo)向基團(tuán)或?qū)蚧鶊F(tuán)的共價(jià)或非共價(jià)連接來(lái)進(jìn)行(見(jiàn)例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 97/05266；國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 97/23608；國(guó)際專(zhuān)利出版物WO97/32026)。
盡管進(jìn)行了這些努力，然而本領(lǐng)域仍需要鑒定結(jié)合肽插入的合適模式，以便該結(jié)合肽在衣殼表面準(zhǔn)確顯示，以允許病毒生長(zhǎng)和對(duì)其相關(guān)受體的特異結(jié)合。
還需要限定允許這些序列識(shí)別的關(guān)鍵參數(shù)。本領(lǐng)域再另一個(gè)需要是提供適于指導(dǎo)腺病毒載體進(jìn)入體內(nèi)靶細(xì)胞的特異導(dǎo)向肽序列。本發(fā)明將滿足本領(lǐng)域的這些需要和其它需要。
本文引用的任何參考文獻(xiàn)均不應(yīng)理解為這些文獻(xiàn)對(duì)于本申請(qǐng)而言是“現(xiàn)有技術(shù)”。本文公開(kāi)的所有文獻(xiàn)均以完整的形式并入本申請(qǐng)作為參考。
本發(fā)明概述本發(fā)明有利地提供有效的定向腺病毒載體。本發(fā)明的定向載體的特征是從六鄰體蛋白或尾絲蛋白的有效位點(diǎn)適當(dāng)缺失若干氨基酸。
因此，在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種腺病毒，其中六鄰體HRV5環(huán)的至少一部分用結(jié)合肽或?qū)蛐蛄刑娲瑑蓚?cè)為連接氨基酸間隔，使得其在衣殼表面功能性顯示其結(jié)合特異性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該腺病毒包括從六鄰體HVR5環(huán)上缺失約6到17個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過(guò)14個(gè)氨基酸。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種腺病毒，其中尾絲HI環(huán)的至少一部分用結(jié)合肽或?qū)蛐蛄刑娲瑑蓚?cè)為連接氨基酸間隔，使得可在衣殼表面功能性顯示其結(jié)合特異性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該腺病毒包括從尾絲HI環(huán)上缺失約6到17個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過(guò)11個(gè)氨基酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組腺病毒載體，其中一結(jié)合肽或?qū)蛐蛄型ㄟ^(guò)連接間隔或接頭與尾絲的C端連接，以在衣殼表面功能性表現(xiàn)其結(jié)合特異性。
在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，從相應(yīng)于腺病毒血清型5(Ad5)約第269個(gè)氨基酸殘基到約第281個(gè)氨基酸殘基的六鄰體HVR5環(huán)上缺失約13個(gè)氨基酸。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，從相應(yīng)于腺病毒血清型5(Ad5)約第538個(gè)氨基酸殘基到約第548個(gè)氨基酸殘基的尾絲蛋白HI環(huán)上缺失約11個(gè)氨基酸。導(dǎo)向肽在缺失位點(diǎn)插入。本發(fā)明的一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向肽序列應(yīng)通過(guò)導(dǎo)向序列N端的第一間隔和C端的第二間隔連接，其中這些間隔包含一個(gè)柔性氨基酸殘基。優(yōu)選地，第一或第二間隔或兩者均含有選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸。
在一個(gè)具體方面，六鄰體蛋白經(jīng)過(guò)修飾的定向腺病毒有利地采用了含有柔性氨基酸殘基的二肽間隔。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一和第二間隔是Gly-Ser二肽。在該方面的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一間隔是甘氨酸殘基。
在修飾尾絲蛋白HI環(huán)的本發(fā)明方面中，有利的第一和第二間隔是由柔性氨基酸殘基組成的三肽。在本發(fā)明該方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一和第二間隔是三肽Gly-Ser-Ser。
優(yōu)選地，導(dǎo)向序列是尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的配體表位。具體地，導(dǎo)向序列可選自如下序列:LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
在修飾六鄰體蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括間隔的導(dǎo)向序列選自如下序列:gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:7)；gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:8)；gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser(SEQ ID NO:9)；gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser(SEQ ID NO:10)；gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:11)；gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:12)；gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser(SEQ ID NO:13)；gly-ser-DCRGDCF-gly-ser(SEQ ID NO:14)；和gly-ser-KKKKKKK-gly-ser(SEQ ID NO:15)。
在修飾尾絲蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括間隔的導(dǎo)向序列選自如下序列:gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:16)；gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:17)；gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:18)；gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:19)；gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser(SEQ ID NO:20)；gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser(SEQ ID NO:21)；gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser(SEQ ID NO:22)；gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser(SEQ ID NO:23)；gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser(SEQ ID NO:24)；ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:143)；tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:144)；tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:145)；ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:146)；和ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-gly(SEQ ID NO:147)。
優(yōu)選地，連接間隔或接頭包含選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該間隔的第一個(gè)氨基酸是脯氨酸。
重組腺病毒可來(lái)自人腺病毒血清型，特別是人腺病毒C亞型，如人腺病毒血清型5。尾絲蛋白可修飾成具有比野生型尾絲軸更短的尾絲軸，特別是通過(guò)符合讀框的缺失或通過(guò)用其它血清型的軸替代它來(lái)實(shí)現(xiàn)。尾絲軸可來(lái)自C亞型并含有包括第4到16個(gè)重復(fù)或第4到19個(gè)重復(fù)的符合讀框的缺失，或者來(lái)自C亞型并通過(guò)用血清型3(Ad3)的軸替代它來(lái)縮短。
根據(jù)本發(fā)明的任何一個(gè)方面(修飾六鄰體或尾絲)，尾絲蛋白可修飾成比野生型序列更短。例如，可修飾尾絲蛋白以僅包含Ad5的第1到3個(gè)和第17到22個(gè)重復(fù)；Ad5的第1到3和第20到22個(gè)重復(fù)；或用腺病毒血清型3(Ad3)軸替代內(nèi)源Ad5軸。
在以下舉例說(shuō)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，腺病毒是血清型5腺病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在尾絲蛋白C端包含接頭肽和導(dǎo)向肽的特異定向腺病毒載體。優(yōu)選地，導(dǎo)向序列是UPAR的配體，例如FGF-1結(jié)合肝素的包含7到15個(gè)氨基酸的肽片段CD87，導(dǎo)向序列由5到10個(gè)賴氨酸殘基組成，優(yōu)選差不多7個(gè)賴氨酸殘基，或由5到10個(gè)Arg-Arg和Leu-Leu基序組成。
優(yōu)選地，導(dǎo)向序列選自LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ IDNO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)；RRLLRRLLRR(SEQ ID NO:133)；和KRGPRTHYGQK(SEQ ID NO:134)。優(yōu)選地，接頭肽包含序列PKRARPGS(SEQ ID NO:149)，而包含接頭肽的導(dǎo)向序列包含序列PKRARPGSKKKKKKK(SEQ ID NO:132)、PKRARPGSRRLLRRLLRR(SEQ ID NO:141)或PKRARPGSKRGPRTHYGQK(SEQ ID NO:140)。
很自然地，根據(jù)本文上面描述和下面更詳細(xì)公開(kāi)的導(dǎo)向腺病毒，本發(fā)明提供改變腺病毒載體的細(xì)胞趨性的方法，包括從腺病毒衣殼蛋白的一個(gè)位點(diǎn)缺失一段天然氨基酸序列；并插入導(dǎo)向肽序列，該導(dǎo)向肽序列在N端通過(guò)第一間隔連接，在C端通過(guò)第二間隔連接，其中這些間隔由柔性氨基酸殘基組成。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，導(dǎo)向序列在如下缺失位點(diǎn)插入與腺病毒Ad5約第269位氨基酸殘基至約第281位氨基酸殘基相應(yīng)的六鄰體HVR5環(huán)約13個(gè)氨基酸；或與腺病毒Ad5約第538位氨基酸殘基至約第548位氨基酸殘基相應(yīng)的尾絲蛋白HI環(huán)約11個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一間隔包含選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二間隔包含選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸。
本發(fā)明還包括●包含與腺病毒血清型5(Ad5)約第269位氨基酸殘基至約第281位氨基酸殘基相應(yīng)的HVR5環(huán)約13個(gè)氨基酸缺失、并在缺失位點(diǎn)包含導(dǎo)向肽序列插入的腺病毒六鄰體，其中，導(dǎo)向序列在N端通過(guò)第一間隔連接，在C端通過(guò)第二間隔連接，而且第一和第二間隔由柔性氨基酸殘基組成?！癜c腺病毒血清型5(Ad5)約第538位氨基酸殘基至約第548位氨基酸殘基相應(yīng)的HI環(huán)約11個(gè)氨基酸缺失、并在缺失位點(diǎn)包含導(dǎo)向肽序列插入的腺病毒尾絲蛋白，其中，導(dǎo)向序列在N端通過(guò)第一間隔連接，在C端通過(guò)第二間隔連接，而且第一和第二間隔由柔性氨基酸殘基組成。●在其C端包含接頭肽和導(dǎo)向肽的腺病毒尾絲蛋白。
更具體地，本發(fā)明提供用于導(dǎo)向表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的細(xì)胞的方法。具體地，該方法包括使用修飾成在衣殼表面暴露上面公開(kāi)的特異UPAR導(dǎo)向肽的腺病毒。另外，本發(fā)明提供通過(guò)插入以上定義的特異序列(包括間隔基團(tuán))修飾六鄰體HVR5環(huán)或尾絲蛋白HI環(huán)的方法。
根據(jù)本發(fā)明導(dǎo)向特定細(xì)胞類(lèi)型的方法可通過(guò)縮短尾絲蛋白軸來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)，例如尾絲軸縮短至僅包含Ad5的第1到3和第17到22個(gè)重復(fù)；Ad5的第1到3和第20到22個(gè)重復(fù)；或Ad3軸。Chroboczek等描述了所述重復(fù)(1995，微生物學(xué)和免疫學(xué)的當(dāng)前熱點(diǎn)(CurrentTopics in Microbiology and Immunology),Springer Verlag,199:163-200)。
本發(fā)明還提供在靶細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)基因的方法，包括用本發(fā)明的定向腺病毒載體接觸含有靶細(xì)胞的細(xì)胞群體，其中導(dǎo)向序列是靶細(xì)胞上受體的配體表位。特別地，本發(fā)明提供在表達(dá)UPAR的靶細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)基因的方法，包括用修飾成表現(xiàn)UPAR結(jié)合肽的本發(fā)明定向腺病毒載體接觸含有靶細(xì)胞的細(xì)胞群體。在該實(shí)施方案中，定向腺病毒載體優(yōu)選包含用于轉(zhuǎn)導(dǎo)活躍分裂的和/或游動(dòng)的細(xì)胞的異源治療基因或核酸，所述細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞、腫瘤脈管系統(tǒng)、活化內(nèi)皮細(xì)胞、活化平滑肌細(xì)胞等。然而，UPAR定向載體也可被認(rèn)為是轉(zhuǎn)導(dǎo)其它組織如肌肉、腦、心臟等的候選載體。更具體地，所述核酸編碼充當(dāng)血管發(fā)生抑制物、血管生成因子、條件自殺效應(yīng)基因、腫瘤抑制基因、生長(zhǎng)抑制蛋白(GAX)或任何分泌多肽的治療多肽。
特別地，本發(fā)明提供在表達(dá)整聯(lián)蛋白的靶細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)基因的方法，其包括用修飾成表現(xiàn)整聯(lián)蛋白結(jié)合肽的本發(fā)明定向腺病毒載體接觸含有靶細(xì)胞的細(xì)胞群體。在該實(shí)施方案中，定向腺病毒載體優(yōu)選包含用于轉(zhuǎn)導(dǎo)活躍分裂的和/或游動(dòng)的細(xì)胞的異源治療基因或核酸，所述細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞、腫瘤脈管系統(tǒng)、活化內(nèi)皮細(xì)胞、活化平滑肌細(xì)胞等。然而，整聯(lián)蛋白定向載體也可被認(rèn)為是轉(zhuǎn)導(dǎo)其它組織如骨骼肌、腦、心臟、造血細(xì)胞、局部缺血組織等的候選載體。更具體地，所述核酸編碼充當(dāng)血管發(fā)生抑制物、血管生成因子、條件自殺效應(yīng)基因、腫瘤抑制基因、生長(zhǎng)抑制蛋白(GAX)、細(xì)胞存活促進(jìn)因子(特別是Akt/PKB家族的成員)或任何分泌多肽的治療多肽。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)基因治療治療疾病的方法，其包括施用上文公開(kāi)的或根據(jù)上文公開(kāi)方法獲得的定向腺病毒載體的步驟。
本發(fā)明再一個(gè)目的是包含上文公開(kāi)的或根據(jù)上文公開(kāi)方法獲得的定向腺病毒載體的藥品，以及這種定向腺病毒載體在生產(chǎn)用于通過(guò)基因治療治療疾病的藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有這種定向腺病毒載體和有效量的藥物活性賦形劑的藥物組合物。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改變了趨性的腺病毒載體而不對(duì)載體的繁殖力產(chǎn)生不利影響。
本發(fā)明另一個(gè)目的是鑒定合適的插入模式，以便結(jié)合肽可及和有效識(shí)別其特異受體。
本發(fā)明再另一個(gè)目的是鑒定可從天然腺病毒衣殼蛋白缺失的氨基酸殘基的數(shù)目，以便導(dǎo)向肽序列可被有效地插入。
本發(fā)明的再另一個(gè)目的是提供將要包括在插入的導(dǎo)向肽末端處的間隔序列的有效大小和特征，以使該導(dǎo)向肽采取容許有效結(jié)合靶受體的可及構(gòu)象。
本發(fā)明的這些目的和其它目的通過(guò)附圖和下列“本發(fā)明詳細(xì)描述”進(jìn)一步闡述。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1用修飾了六鄰體HVR5區(qū)的病毒對(duì)W162細(xì)胞進(jìn)行中和測(cè)定。圖2縮短尾絲構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)，其中插入了腺病毒血清型3(Ad3)軸以替代Ad5軸。
圖2A雜合Ad3/5尾絲的一般描述；圖2B雜合Ad3/5尾絲的詳細(xì)描述圖3293細(xì)胞中的頭部競(jìng)爭(zhēng)。圖4在遞增劑量的可溶性肝素存在時(shí)用各種病毒感染hSMC。圖5用與遞增劑量的可溶性u(píng)PAR預(yù)先溫育過(guò)的病毒感染hSMC。圖6和7在感染了定向腺病毒的人SMC中Gax的表達(dá)。圖8A至8C和9用不同定向病毒感染Hs578T。圖10用與遞增劑量的可溶性u(píng)PAR預(yù)先溫育過(guò)的病毒AE43感染Hs578T。圖11用與遞增劑量的可溶性u(píng)PAR或可溶性頭部預(yù)先溫育過(guò)的病毒AE43感染Hs578T。圖12用含有Vn4的病毒感染Hs578T。圖13用多種導(dǎo)向病毒感染NIH-3T3。圖14A和14B用與遞增劑量的可溶性u(píng)PAR預(yù)先溫育過(guò)的病毒BC15X(A)和AE43(B)感染Hs578T。
本發(fā)明詳細(xì)描述如上所述，本領(lǐng)域一直迫切需要改變腺病毒的趨性以便允許將腺病毒載體導(dǎo)向特定靶細(xì)胞，包括那些腺病毒不能有效感染的細(xì)胞。盡管在該目的的實(shí)現(xiàn)中取得了一些成功，但本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到還沒(méi)有獲得該問(wèn)題切實(shí)可行的解決方法，即，既對(duì)病毒繁殖力沒(méi)有不利影響又使得細(xì)胞特異性令人滿意的增加的解決方法。特別地，在現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有描述導(dǎo)向肽摻入病毒衣殼蛋白的最佳位點(diǎn)、從天然衣殼蛋白缺失的大小(如果有的話)、插入的導(dǎo)向序列的大小、和任何連接導(dǎo)向序列與衣殼蛋白的接頭序列的存在和性質(zhì)。本發(fā)明有利地解決了這些問(wèn)題，并通過(guò)如下方式提供了高效的導(dǎo)向提供插入導(dǎo)向序列的最佳位點(diǎn)，包括待缺失以給該導(dǎo)向肽空出位置的天然序列的大小；鑒定導(dǎo)向序列的適當(dāng)大小；揭示允許實(shí)現(xiàn)導(dǎo)向肽的可及性和特異識(shí)別的接頭的大小和特性；并鑒定作為靶受體的感興趣細(xì)胞標(biāo)志。
特別地，本發(fā)明人試圖在腺病毒衣殼表面導(dǎo)入可及外源肽，由此改變?cè)摬《镜奶烊悔呅?。根?jù)該設(shè)想，設(shè)計(jì)了一系列具有修飾的六鄰體或尾絲的結(jié)構(gòu)，所述六鄰體或尾絲整合了Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的中和表位。因?yàn)榭奢p易獲得同源中和抗體來(lái)詳細(xì)闡明其可及性和功能性，所以選擇了脊髓灰質(zhì)炎病毒序列。
修飾六鄰體和尾絲以限制其感染特異靶細(xì)胞要求腺病毒尾絲不能與其天然細(xì)胞受體有效地相互作用。對(duì)于六鄰體修飾的衣殼，還需要結(jié)合肽可與其細(xì)胞表面上的同源受體直接相互作用，而沒(méi)有尾絲的空間障礙。為此，探索了縮短尾絲軸的可能性。
本發(fā)明部分地基于鑒定適于功能性導(dǎo)向序列在六鄰體蛋白和尾絲蛋白中插入的位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)六鄰體HVR5環(huán)和尾絲HI環(huán)的部分替代允許導(dǎo)向序列插入，而不對(duì)病毒的繁殖力產(chǎn)生不利影響。而且，數(shù)據(jù)顯示在插入序列末端柔性接頭肽的摻入對(duì)于導(dǎo)向序列的可及性或識(shí)別是關(guān)鍵性的。而且，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)uPAR或?qū)σ恍┱?lián)蛋白特異的配體的摻入在配體的可及性、修飾病毒的繁殖力、靶細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率上均獲得了成功。最后，還顯示尾絲的縮短有效降低了天然宿主細(xì)胞的病毒親合力，這使得該策略對(duì)Ad5天然趨性的終止很有吸引力。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聯(lián)合了各種不同方法。優(yōu)選地，在含有修飾的六鄰體HVR5環(huán)或尾絲HI環(huán)的病毒中縮短尾絲蛋白。在另一個(gè)例子中，具有縮短尾絲的病毒可(分別)在HVR5或HI中包含插入片段以在感染的第一步導(dǎo)向UPAR，在HI環(huán)或HVR5中包含插入以導(dǎo)向有助于病毒在內(nèi)體中內(nèi)化的整聯(lián)蛋白。也可使用相同策略導(dǎo)向任何適當(dāng)膜受體，即在六鄰體和/或尾絲中摻入高親合配體并聯(lián)合縮短尾絲。
“本發(fā)明詳細(xì)描述”將在有關(guān)具體定義、腺病毒載體、導(dǎo)向肽序列和定向腺病毒載體的應(yīng)用的章節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述。各章節(jié)的各種標(biāo)題和編排是為了清楚和方便，不應(yīng)以任何方式視為限制。
定義在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用了各種術(shù)語(yǔ)。如果沒(méi)有特別定義，這些術(shù)語(yǔ)適應(yīng)下列定義正如本領(lǐng)域所使用的，“載體”是任何轉(zhuǎn)移根據(jù)本發(fā)明的核酸至宿主細(xì)胞中的工具。對(duì)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)載體用來(lái)修飾“腺病毒”以反映腺病毒經(jīng)過(guò)遺傳改造轉(zhuǎn)移目的基因(處于表達(dá)控制序列的控制之下或與表達(dá)控制序列可操作連接的基因)至靶細(xì)胞中的情況。本發(fā)明的腺病毒載體將在下面做更為詳細(xì)的描述。
當(dāng)病毒DNA被導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，則該細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明的腺病毒載體“轉(zhuǎn)染”或“感染”。當(dāng)轉(zhuǎn)染DNA影響表型改變時(shí)，則該細(xì)胞已經(jīng)被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”。
本文所用術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)于”是指類(lèi)似或同源序列，無(wú)論確切位置和與之測(cè)量類(lèi)似性或同源性的分子相同還是不同。核酸或氨基酸序列對(duì)比可包含空格。因此，術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)于”是指序列類(lèi)似性，而不是氨基酸殘基或核苷酸堿基的數(shù)目。例子包括除本文列舉的5型腺病毒(Ad5)外的其它腺病毒血清型(2,3，等)的六鄰體蛋白或尾絲蛋白。同源腺病毒衣殼蛋白是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的。
換句話說(shuō)，本發(fā)明為采用本文定義的對(duì)Ad5優(yōu)化的參數(shù)修飾其它腺病毒種的同源衣殼蛋白作了準(zhǔn)備。本文所用術(shù)語(yǔ)“同源”的所有各種語(yǔ)法形式和拼寫(xiě)變體均指具有“共同進(jìn)化起源”的蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性，這些蛋白質(zhì)包括超家族(如免疫球蛋白超家族)的蛋白質(zhì)和不同種的同源蛋白質(zhì)(如肌球蛋白輕鏈等)(Reeck等，1987，細(xì)胞(Cell)50:667)。這些蛋白質(zhì)(和它們的編碼基因)具有序列同源性，正如其高度的序列類(lèi)似性所反映的一樣。
術(shù)語(yǔ)“缺失”是指從腺病毒衣殼蛋白即六鄰體或尾絲蛋白的一定區(qū)域除去天然氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明，這種缺失的優(yōu)選大小是約10個(gè)到約20個(gè)氨基酸之間。更優(yōu)選地，缺失的大小在約10個(gè)到約15個(gè)氨基酸之間。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，缺失11和13個(gè)氨基酸序列。
本文所用術(shù)語(yǔ)“間隔”或“間隔肽”或“接頭”或“接頭肽”是指包含用來(lái)連接結(jié)合肽和其衣殼載體蛋白的長(zhǎng)約1到約3個(gè)氨基酸的序列。間隔或接頭優(yōu)選由具有高旋轉(zhuǎn)自由度的氨基酸殘基組成，以允許導(dǎo)向肽采取可被其結(jié)合配偶體(如受體)識(shí)別的構(gòu)象。優(yōu)選地，間隔中不超過(guò)3個(gè)氨基酸；更優(yōu)選地，間隔由兩個(gè)氨基酸組成。間隔優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸和絲氨酸。在具體實(shí)施方案中，間隔是具有序列Gly-Ser或Gly-Ser-Ser的肽。
本文所用術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”是指給定值或范圍的20％以內(nèi)，優(yōu)選10％以內(nèi)，更優(yōu)選5％以內(nèi)。
腺病毒載體腺病毒是可修飾成有效遞送本發(fā)明核酸至多種細(xì)胞類(lèi)型的真核DNA病毒。腺病毒存在多種血清型。在這些血清型中，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選使用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或動(dòng)物來(lái)源的腺病毒(見(jiàn)WO 94/26914)?？捎糜诒景l(fā)明的動(dòng)物來(lái)源的那些腺病毒包括狗、牛、鼠、(例子Mav1,Beard等，病毒學(xué)75(1990)81)、羊、豬、鳥(niǎo)和猴(例子SAV)來(lái)源的腺病毒。優(yōu)選地，動(dòng)物來(lái)源的腺病毒是狗腺病毒，更優(yōu)選CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
腺病毒載體常用于體外、體內(nèi)轉(zhuǎn)染和基因治療程序。優(yōu)選地，腺病毒載體是復(fù)制缺陷的，即它們不能在靶細(xì)胞中自主復(fù)制。通常，本發(fā)明范圍內(nèi)復(fù)制缺陷的病毒載體的基因組缺乏至少一個(gè)病毒在感染細(xì)胞中復(fù)制所必需的區(qū)域。這些區(qū)域可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)進(jìn)行(全部或部分)剔除或使其失去功能。這些技術(shù)包括病毒增殖必需區(qū)域的全部刪除、(通過(guò)其它序列，特別是插入的核酸)替代、一或多個(gè)堿基的部分缺失或插入。這些技術(shù)可采用遺傳學(xué)操作或通過(guò)誘變劑處理以體外(對(duì)分離的DNA)或原位方式進(jìn)行。對(duì)于本發(fā)明，復(fù)制缺陷病毒保留了殼體化病毒顆粒所必需的基因組序列。也可使用完全或幾乎完全缺乏病毒基因的缺陷病毒。
本發(fā)明的復(fù)制缺陷腺病毒載體至少包括ITRs、殼體化序列和目的核酸。優(yōu)選地，至少造成腺病毒載體的E1區(qū)沒(méi)有功能。E1區(qū)的缺失優(yōu)選包括Ad5腺病毒序列的第455至3329位核苷酸(PvuⅡ-BglⅡ片段)，或第382至3446位核苷酸(HinfⅡ-Sau3A片段)，或第382至3512位核苷酸(HinfⅠ-RsaⅠ片段)。也可修飾其它區(qū)域，特別是E3區(qū)(WO 95/02697)、E2區(qū)(WO 94/28938)、E4區(qū)(WO 94/28152、WO 94/12649和WO95/02697)、Ⅳa2區(qū)(WO 96/10088)或晚期基因L1-L5的任一個(gè)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)含有缺失(Ad1.0)。E1缺失腺病毒的例子公開(kāi)于EP 185,573和1997年11月11日提交的FR 97/14383，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容以參考文獻(xiàn)的形式并入本文。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1和E4區(qū)含有缺失(Ad3.0)。E1/E4缺失的腺病毒的例子公開(kāi)于WO 95/02697和WO 96/22378，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容以參考文獻(xiàn)的形式并入本文。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)含有缺失，同時(shí)E4功能區(qū)和核酸序列在此缺失處插入(見(jiàn)FR 94/13355，其內(nèi)容以參考文獻(xiàn)的形式并入本文)。本發(fā)明使用的另一個(gè)腺病毒載體見(jiàn)WO 96/10088。
根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制缺陷重組腺病毒可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來(lái)制備(Levrero等，基因(Gene)101:195；EP 185 573；Graham,1984,EMBO J.3:2917)。特別地，它們可通過(guò)腺病毒和其中攜帶目的DNA序列的質(zhì)粒之間的同源重組來(lái)制備。同源重組在所述腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至適合細(xì)胞系之后發(fā)生。采用的細(xì)胞系應(yīng)優(yōu)選(ⅰ)可被所述元件轉(zhuǎn)化，和(ⅱ)含有能與復(fù)制缺陷腺病毒基因組的一部分互補(bǔ)的序列，其優(yōu)選以整合形式存在以避免重組的危險(xiǎn)。可采用的細(xì)胞系的例子是包含整合在其基因組中的Ad5腺病毒基因組左邊部分(12％)的人胚胎腎細(xì)胞系293(Graham等，1977，普通病毒學(xué)雜志36:59)、PER.C6(Bout等，1997，癌癥基因治療(Cancer Gene Therapy)4:324；Fallaux等，1998,Hum Gen Ther 9:1909-1917)、和能與E1和E4的功能互補(bǔ)的細(xì)胞系(見(jiàn)申請(qǐng)WO 94/26914和WO 95/02697)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用大腸桿菌(E.coli)載體系統(tǒng)產(chǎn)生腺病毒主鏈(國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 96/25506；Crouzet等，1997，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)94:1414-1419)。
的確，制備本發(fā)明腺病毒的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。見(jiàn)例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular Cloning:A laboratory Manual)，第二版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本文稱(chēng)為“Sambrook等，1989”)；DNA克隆實(shí)用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)，第Ⅰ和Ⅱ卷(D.N.Glover編，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編，1984)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hames和S.J.EHiggins編(1985)]；轉(zhuǎn)錄和翻譯(Transcription And Translation)[B.D.Hames和S.J.Higgins編，(1984)]；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(Animal Cell Culture)[R.I.Freshney編，(1986)]；固定化細(xì)胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)[IRL出版社，(1986)]；B.EPerbal，分子克隆實(shí)用指南(APractical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(編者)，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(Current Protocols in Mocelular Biology),JohnWiley & Sons公司(1994)。
盒式插入位點(diǎn)的摻入，無(wú)論是對(duì)異源基因的插入還是對(duì)導(dǎo)向序列在六鄰體或尾絲蛋白中插入(如下文所舉例說(shuō)明)，均有助于這種遺傳操作?！昂小笔侵改茉谳d體的特定限制性位點(diǎn)插入載體的DNA片段。該DNA片段編碼目的多肽，而且盒和限制性位點(diǎn)的設(shè)計(jì)要確保該盒以轉(zhuǎn)錄和翻譯正確的讀框插入。
采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)(見(jiàn)例如國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 98/00524、國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 96/27677、和國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 97/08298)回收和純化重組腺病毒。
采用本發(fā)明的腺病毒載體表達(dá)異源基因。本發(fā)明的腺病毒載體優(yōu)選含有異源基因的DNA編碼序列。DNA“編碼序列”是當(dāng)置于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列控制之下時(shí)可在體外或體內(nèi)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子來(lái)確定。一個(gè)編碼序列可包括但不限于原核序列、真核mRNA的cDNA、真核(如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列、甚至合成DNA序列。如果編碼序列將要在真核細(xì)胞中表達(dá)，則通常在該編碼序列的3’端包含多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄該編碼序列成mRNA、后者又被反式RNA剪接并翻譯成該編碼序列編碼的蛋白質(zhì)時(shí)，則編碼序列在細(xì)胞中處于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制之下”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目的核酸不翻譯成多肽，而充當(dāng)特異反義治療分子，或充當(dāng)治療誘餌。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是為編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)作準(zhǔn)備的DNA調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等。在真核細(xì)胞中，多腺苷酸化信號(hào)是控制序列?！皢?dòng)子序列”是能在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶并引發(fā)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了定義本發(fā)明，啟動(dòng)子序列在3’端以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為界，向上游(5’方向)延伸至包括以高于背景的可檢測(cè)水平引發(fā)轉(zhuǎn)錄所必需的最少數(shù)目的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列中將包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(可通過(guò)例如用核酸酶S1作圖方便地限定)、以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合域(共有序列)。
異源蛋白質(zhì)的表達(dá)可由本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件控制，但這些調(diào)節(jié)元件必須在選擇用來(lái)表達(dá)的靶細(xì)胞中有功能?？捎糜诳刂苹虮磉_(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV-IE或CMV)啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Benoist和Chambon,1980,自然290:304-310)、勞斯肉瘤病毒3’長(zhǎng)末端重復(fù)中包含的啟動(dòng)子(Yamamoto，等，1980，細(xì)胞22:787-797)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)78:1441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，自然296:39-42)；和顯示組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶Ⅰ基因控制區(qū)(Swift等，1984，細(xì)胞38:639-646；Ornitz等，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987，肝臟病學(xué)(Hepatology)7:425-515)、在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan,1985，自然315:115-122)、在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，1984，細(xì)胞38:647-658；Adames等，1985，自然318:533-538；Alexander等，1987，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)7:1436-1444)、在睪丸細(xì)胞、乳房細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有活性的鼠乳癌病毒控制區(qū)(Leder等，1986，細(xì)胞45:485-495)、在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，基因和發(fā)育(Genes and Devel.)1:268-276)、在胚胎肝臟和肝癌中有活性的α-胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，分子細(xì)胞生物學(xué)5:1639-1648；Hammer等，1987，科學(xué)235:53-58)、在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，基因和發(fā)育1:161-171)、在骨髓細(xì)胞中有活性的β-珠蛋白基因控制區(qū)(Megram等，1985，自然315:338-340；Kellias等，1986，細(xì)胞46:89-94)、在腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，細(xì)胞48:703-712)，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani,1985，自然314:283-286)和在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，科學(xué)234:1372-1378)。
在待轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面或分泌的蛋白質(zhì)的編碼序列開(kāi)始處應(yīng)包括“信號(hào)序列”。該序列編碼位于成熟多肽N端的信號(hào)肽，信號(hào)肽可指導(dǎo)宿主細(xì)胞將該多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至分泌途徑/區(qū)室中。本文采用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列”來(lái)指這種信號(hào)序列。可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列與多種真核和原核生物天然蛋白質(zhì)相關(guān)，并常在這兩種類(lèi)型生物中有功能。
具體異源基因?qū)⒃谙旅嫔婕氨景l(fā)明載體的部分討論。
導(dǎo)向肽序列根據(jù)本發(fā)明，可在六鄰體HVR5環(huán)或尾絲蛋白中摻入任何已知的導(dǎo)向序列。導(dǎo)向肽的例子在文獻(xiàn)中很多。通常，任何肽配體均可提供基于該配體之受體結(jié)合序列的導(dǎo)向序列。在免疫學(xué)中，這種序列稱(chēng)為表位，而且在本文中術(shù)語(yǔ)表位可用來(lái)指受體識(shí)別的配體的序列。具體地，術(shù)語(yǔ)“受體的配體表位”是指可被靶細(xì)胞表面的結(jié)合配偶體識(shí)別的蛋白質(zhì)或肽的序列，為方便起見(jiàn)稱(chēng)為受體。但是，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“受體”包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體(如激素、類(lèi)固醇、細(xì)胞因子、胰島素和其它生長(zhǎng)因子的受體)、識(shí)別分子(如MHC分子、B-或T-細(xì)胞受體)、營(yíng)養(yǎng)攝取受體(如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)、凝集素、離子通道、粘著分子、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白和位于靶細(xì)胞表面并可及的類(lèi)似分子。本發(fā)明的導(dǎo)向肽可結(jié)合這些受體上的多肽或糖部分。
導(dǎo)向肽的大小可在某些參數(shù)內(nèi)變化。正如實(shí)施例中所示，長(zhǎng)于缺失序列的插入肽并不對(duì)病毒繁殖力產(chǎn)生不利影響。因此，本發(fā)明打算使用比缺失片段長(zhǎng)若干倍的導(dǎo)向序列；優(yōu)選地，插入肽僅僅長(zhǎng)于缺失片段的200％，更優(yōu)選插入肽與缺失片段大小大致相同。
由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，在本發(fā)明的實(shí)施中可使用其它編碼與導(dǎo)向肽序列基本相同的氨基酸序列的DNA序列。這些序列包括但不限于等位基因變體、其它物種的同源變體、進(jìn)行了保守氨基酸替代的變體、改變了(假定對(duì)于結(jié)合特異性不重要的)高度多態(tài)的氨基酸殘基的變體。例如，可用充當(dāng)功能性等同物的其它類(lèi)似極性的氨基酸替代序列中的一或多個(gè)氨基酸殘基，導(dǎo)致沉默改變。序列中氨基酸的替代物可選自該氨基酸所屬類(lèi)別的其它成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。這種改變可望不顯著影響由聚丙烯酰胺凝膠電泳所測(cè)定的表觀分子量或等電點(diǎn)。
特別優(yōu)選的替代是-以Lys替代Arg或相反，以便可維持正電荷；-以Glu替代Asp或相反，以便可維持負(fù)電荷；-以Ser替代Thr，以便可維持游離的-OH；-以Gln替代Asn，以便可維持游離的CONH2。
這些變體可用高度相似的核酸編碼。通常，這些核酸可與編碼天然氨基酸序列的核酸(包括寡核苷酸探針)雜交。正如下面的實(shí)施例中所示，可通過(guò)不影響(PCR引物)雜交但可產(chǎn)生內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)或改變的氨基酸殘基的單堿基變換來(lái)導(dǎo)入各種修飾。
當(dāng)核酸分子的單鏈形式可在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件下與另一個(gè)核酸分子如cDNA、基因組DNA或RNA退火(見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上)時(shí)，則該核酸分子與該另一個(gè)分子“可雜交”。溫度和離子強(qiáng)度條件決定了雜交的“嚴(yán)格性”。對(duì)于同源核酸的初步篩選，可使用低嚴(yán)格雜交條件，相應(yīng)于55℃的Tm，例如5×SSC,0.1％SDS,0.25％脫脂奶粉，不加甲酰胺；或30％甲酰胺，5×SSC,0.5％SDS。中等嚴(yán)格雜交條件相應(yīng)于更高的Tm，例如40％甲酰胺，5×或6×SSC。高嚴(yán)格雜交條件相應(yīng)于最高的Tm，例如50％甲酰胺，5×或6×SSC。雜交要求這兩個(gè)核酸含有互補(bǔ)序列，盡管取決于雜交的嚴(yán)格性，堿基之間的錯(cuò)配是可能的。雜交核酸適當(dāng)?shù)膰?yán)格性取決于核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度，這些變量是本領(lǐng)域熟知的。兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，則含有這些序列的核酸雜交體的Tm值越大。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(相應(yīng)于更高的Tm)按下列順序降低RNA:RNA,DNA:RNA,DNA:DNA。對(duì)于長(zhǎng)度超過(guò)100個(gè)核苷酸的雜交體，已獲得了計(jì)算Tm的公式(見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上，9.50-9.51)。對(duì)于更短核酸如寡核苷酸的雜交，錯(cuò)配的位置變得更加重要，而且，寡核苷酸的長(zhǎng)度決定其特異性(見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上，11.7-11.8)。優(yōu)選地，可雜交核酸的最小長(zhǎng)度是至少10個(gè)核苷酸；優(yōu)選至少約15個(gè)核苷酸；更優(yōu)選該長(zhǎng)度為至少約20個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”是指Tm值55℃，并采用上文所示的條件。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Tm是60℃；在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Tm是65℃。
整聯(lián)蛋白結(jié)合肽。導(dǎo)向肽序列包括人們熟知的整聯(lián)蛋白結(jié)合肽(見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利4,517,686；美國(guó)專(zhuān)利4,589,881；美國(guó)專(zhuān)利4,661,111；美國(guó)專(zhuān)利4,578,079；美國(guó)專(zhuān)利4,614,517；美國(guó)專(zhuān)利5,453,489；美國(guó)專(zhuān)利5,627,263)。其它有用的導(dǎo)向肽見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 98/17242和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 773 441。
關(guān)于整聯(lián)蛋白的導(dǎo)向，如上所述，許多出版物描述了結(jié)合特異整聯(lián)蛋白的肽，其中一些肽在不同腫瘤或細(xì)胞類(lèi)型中超表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，αv-整聯(lián)蛋白(因此也包括活躍分裂的和/或游動(dòng)的細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞、腫瘤脈管系統(tǒng)、活化內(nèi)皮細(xì)胞、活化平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等)通過(guò)例如用噬菌體展示篩選的肽來(lái)導(dǎo)向。當(dāng)然，任何整聯(lián)蛋白特異的肽例如文獻(xiàn)中所描述的肽都可用于本發(fā)明。整聯(lián)蛋白的導(dǎo)向還可有利于病毒的內(nèi)化，并可能是一種恢復(fù)縮短了尾絲的Ad的感染性的手段。
導(dǎo)向尿激酶受體的肽。在一個(gè)下文列舉的具體實(shí)施方案中，導(dǎo)向尿激酶型溶酶原激活物受體(UPAR；例如CD87)的肽選自許多出版物。當(dāng)然，結(jié)合UPAR的肽有更詳盡的名單?？墒褂萌魏谓Y(jié)合UPAR的肽。
堿性導(dǎo)向肽。本發(fā)明的具體實(shí)施方案以及具體導(dǎo)向肽詳見(jiàn)下文實(shí)施例4-6。例如，下文實(shí)施例中使用了主要由堿性氨基酸殘基如賴氨酸和組氨酸，更優(yōu)選賴氨酸或精氨酸或兩者一起(見(jiàn)例如WO 97/20051)組成的導(dǎo)向肽。在另一個(gè)例子中，使用了結(jié)合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的配體如精氨酸-亮氨酸重復(fù)基序RRLLRRLLRR(見(jiàn)RPR專(zhuān)利申請(qǐng)WO 95/21931)和FGF-1的肝素結(jié)合域的肽片段KRGPRTHYGQK(Digabriele等，1998，科學(xué)，393:812-817)。
而且，結(jié)合肝素或糖胺聚糖的序列可參與結(jié)合肝素樣受體(Sawitzky等，1993，Med.Microbiol.Immunol.,182:285-92)。同樣，所謂的“肝素結(jié)合序列”可介導(dǎo)含有這些序列的肽或蛋白質(zhì)與其它細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)如細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖之間的相互作用(Thompson等，1994,J.Biol.Chem.,269:2541-9)。
作為替代，導(dǎo)向氨基酸序列由距α-螺旋約20埃并朝向其相反方向的兩個(gè)堿性氨基酸(常常是Arg)組成(Margalit等，1993,J.Biol.Chem.,268:19228-31；Ma等，1994，脂質(zhì)研究雜志(J.Lipid Res.),35:2049-2059)。其它堿性氨基酸可分散在這兩個(gè)殘基之間，朝向一側(cè)，而非極性殘基朝向另一側(cè)，形成堿性殘基被分離/隔離至一側(cè)的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。
另外，導(dǎo)向序列可包含纖連蛋白和熱休克蛋白中存在的共有肝素結(jié)合基序(Hansen等，1995,Biochim.Biophys.Acta,1252:135-45)；由Lys或Arg或Lys和Arg的混合物組成的7殘基插入片段(Fromm等，1995,Arch.Biochem.Biophys.,323:279-87)；IGFBP-3和IGFBP-5的共同堿性C-末端區(qū)域，該區(qū)域含大約18個(gè)氨基酸并含有肝素結(jié)合序列(Booth等，1995,Growth Regul.,5:1-17)；位于hyaluronan(HA)受體RHAMM的C末端的35個(gè)氨基酸區(qū)域內(nèi)的兩個(gè)HA結(jié)合基序中的一個(gè)或兩個(gè)(Yang等，1994,J.Cell Biochem.,56:455-68)；仿效金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)玻連蛋白的肝素結(jié)合形式、含有肝素結(jié)合共有序列的合成肽(Ala347-Arg361)(Liang等，1994,J.Biochem.,116:457-63)；位于牛單純皰疹病毒Ⅰ糖蛋白gⅢ的第129至310位氨基酸之間的5個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)中的任一個(gè)或多個(gè)，或位于假狂犬病病毒糖蛋白gⅢ的第90至275位氨基酸之間的4個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)中的任一個(gè)(Liang等，1993，病毒學(xué)，194:233-43)；假狂犬病病毒糖蛋白gⅢ的第134至141位氨基酸(Sawitzky等，1993,Med.Microbiol.Immunol.,182:285-92)；相應(yīng)于人脂蛋白脂肪酶第279-282位和292-304位的帶電荷殘基的肝素結(jié)合區(qū)域(Ma等，見(jiàn)上)；具有纖連蛋白類(lèi)似的序列并表現(xiàn)出肝素結(jié)合性質(zhì)的合成22殘基肽N22W(Ingham等，1994,Arch.Biochem.Biophys.,314:242-246)；存在于阿爾茨海默氏病β-淀粉樣前體蛋白(APP)以及多種其它APP樣蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域鋅結(jié)合位點(diǎn)中的基序，其調(diào)節(jié)肝素親合性(Bush等，1994,J.Biol.Chem.,229:26618-21)；來(lái)源于層粘連蛋白A鏈交叉區(qū)域的8個(gè)氨基酸殘基肽(Tashiro等，1994,Biochem.J.,302:73-9)；基于絲氨酸蛋白酶抑制劑抗凝血酶Ⅲ的肝素結(jié)合區(qū)域的肽，包括肽F123-G148和K121-A134(Tyler-Cross等，1994，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sci.)3:620-7)；推測(cè)是肝素結(jié)合區(qū)域的APP的14KN端片段和緊靠該N末端的區(qū)域(即第96-110位殘基)(Small等，1994，神經(jīng)科學(xué)雜志，14:2117-27)；肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)的一段21個(gè)氨基酸序列，其特征是具有高含量的賴氨酸和精氨酸殘基(Thompson等，1994,J.Biol.Chem.,269:2541-9)；含有鈣結(jié)合糖蛋白的肝素結(jié)合區(qū)并相應(yīng)于hep1合成肽的17個(gè)氨基酸區(qū)域(Murphy-Ullrich等，1993,J.Biol.Chem.,268:26784-9)；結(jié)合肝素的人vonWillebrand因子的23個(gè)氨基酸序列(Y565-A587)(Tyler-Cross等，1993,Arch.Biochem.Biophys.,306:528-33)；結(jié)合肝素的纖連蛋白衍生肽PRARI，以及含有該基序的更大的肽(Woods等，1993,Mol.Biol.Cell.,4:605-613)；血小板因子4的肝素結(jié)合區(qū)(Sato等，Jpn.J.CancerRes.,84:485-8)；以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶跨膜糖蛋白中的K18K序列(Kan等，1993，科學(xué)259:1918-21)。
導(dǎo)向肽序列的鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從各種類(lèi)型的組合文庫(kù)采用熟知的配體鑒定策略獲得導(dǎo)向肽(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,622,699和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US96/14600)。一種方法是使用重組噬菌體產(chǎn)生大文庫(kù)。采用“噬菌體方法”(Scott和Smith,1990，科學(xué)，249:386-390；Cwirla等，1990，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，87:6378-6382；Devlin等，1990，科學(xué)，249:404-406)，可以構(gòu)建很大的文庫(kù)(106-108個(gè)化學(xué)個(gè)體)。第二種方法主要使用化學(xué)方法，例如Geysen法(Geysen等，1986，分子免疫學(xué)(Molecular Immunology)23:709-715；Geysen等，1987，免疫學(xué)方法雜志(J.Immumologic Method)102:259-274)和Fodor等的方法(1991，科學(xué)251:767-773)。Furka等(1988，第14屆生物化學(xué)國(guó)際會(huì)議(14thInternational Congress of Biochemistry)，第5卷，摘要FR:013；Furka,1991,Int.J.Peptide Protein Res.37:487-493)、Houghton(美國(guó)專(zhuān)利4,631,211,1986年12月出版)和Rutter等(美國(guó)專(zhuān)利5,010,174,1991年4月23日出版)描述了制備可作為導(dǎo)向序列測(cè)試的肽混合物的方法。在另一方面，合成文庫(kù)(Needels等，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90:10700-4；Ohlmeyer等，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90:10922-10926；Lam等，國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 92/00252；Kocis等，國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 9428028)及類(lèi)似物可用于篩選導(dǎo)向肽。
本發(fā)明載體的應(yīng)用以上提供的關(guān)于腺病毒載體制備的參考文獻(xiàn)描述了這些載體的各種用途。
治療基因向體內(nèi)惡性細(xì)胞的定向?qū)肟商峁┠[瘤的有效治療方法。已嘗試過(guò)幾種治療形式。例如，一種治療方法涉及將正常腫瘤抑制基因(如p53、視網(wǎng)膜成纖維瘤蛋白、p16等)和/或激活的癌基因的抑制劑遞送至腫瘤細(xì)胞中。第二種治療方法涉及通過(guò)導(dǎo)入細(xì)胞因子基因增強(qiáng)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。第三種治療方法涉及導(dǎo)入編碼可賦予腫瘤細(xì)胞對(duì)化療劑的敏感性的酶的基因。單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tK)基因可特異地將核苷類(lèi)似物(9-[1,3-二羥-2-丙氧甲基]鳥(niǎo)嘌呤)轉(zhuǎn)化成毒性中間體并引起正在分裂的細(xì)胞死亡。最近Culver等(科學(xué)，1992，256:1550-1552)報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)遞送HSV-tK基因后，接下來(lái)的9-[1,3-二羥-2-丙氧甲基]鳥(niǎo)嘌呤治療可有效地引起腦腫瘤的退化。Woo等的美國(guó)專(zhuān)利5,631,236描述了用編碼HSV-tK或VZV-tK的腺病毒載體對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行的基因治療。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可用于使目的核酸導(dǎo)向腫瘤本身、腫瘤的轉(zhuǎn)移部分或腫瘤的脈管系統(tǒng)，例如通過(guò)采用結(jié)合于UPAR的肽來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該載體編碼血管生成抑制劑或抗血管生成因子的基因。“抗血管生成因子”是一種抑制血管生成的分子，特別是通過(guò)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞遷移來(lái)抑制。這種因子包括抑制性的血管生成蛋白片段(例如尿激酶的氨基末端片段)、血管生成抑制因子如制管張素和內(nèi)抑制素(endostatin)；血管生成因子的可溶性受體，例如尿激酶型受體或FGF/VEGF受體；阻斷內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的分子[O’Reilly等，細(xì)胞(Cell)88:277-285(1997)；O’Reilly,Nat.Med.2:689-692(1996)]，和Tie-1或Tie-2抑制劑。一般地，在本發(fā)明中使用的抗血管生成因子是蛋白質(zhì)或多肽，其可被采用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染至腫瘤中的基因編碼。例如，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的載體可用于將編碼抗血管生成蛋白質(zhì)的基因遞送至腫瘤、腫瘤的轉(zhuǎn)移部分或腫瘤的脈管系統(tǒng)中?？寡苌梢蜃拥睦影ǖ幌抻诤蠩GF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶的氨基末端片段(ATF)(例如ATF約第1位至約第135位氨基酸)；以融合蛋白形式提供的ATF，例如與免疫球蛋白或人血清白蛋白形成融合蛋白[WO 93/15199]；制管張素[O’Reilly等，細(xì)胞79:315-328(1994)]；金屬蛋白酶的組織抑制劑[Johnson等，J.Cell.Physiol.160:194-202(1994)]；或FGF或VEGF的抑制劑，如血管生成因子受體的可溶性形式，包括但不限于可溶性VGF/VEGF受體和可溶性尿激酶受體[wilhem等，F(xiàn)EBS Letters 337:131-134(1994)]。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可用于導(dǎo)向遷移的平滑肌細(xì)胞以抑制血管生成后的再狹窄。腺病毒通過(guò)遞送自殺基因用于抑制再狹窄的例子公開(kāi)在WO 96/05321中。WO 96/30385中公開(kāi)了編碼GAX蛋白(生長(zhǎng)抑制蛋白)的腺病毒在抑制血管平滑肌細(xì)胞增生和再狹窄中的應(yīng)用。其它基因可以是細(xì)胞毒性基因(HSV胸苷激酶)、金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)、內(nèi)皮NOS或動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)因子(例如ApoE)。
其中包含了肌肉或腦特異性肽的本發(fā)明載體也可用于選擇性地遞送保護(hù)或再生生長(zhǎng)因子以治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病。腺病毒用于向CNS遞送基因的例子公開(kāi)于WO 94/08026、WO 95/25804和WO95/26408中。
其中包含了骨骼肌或心臟特異性肽的本發(fā)明載體也可用于選擇性地遞送對(duì)外周動(dòng)脈疾病或冠狀動(dòng)脈疾病的治療有用的物質(zhì)血管生成因子(例如VEGF、FGF、angiopoietin家族的成員)、細(xì)胞生存促進(jìn)因子(例如akt/PKB家族的成員)、參與能量代謝的基因(例如磷酸蛋白受體或腺苷酸環(huán)化酶)、細(xì)胞因子和其受體(例如IL-6、IL-10、CXCR4、CXCR1、sdf1、MCP1、GM-CSF)以及防止細(xì)胞程序死亡的基因(akt)。
在一種更為普通的方式中，本發(fā)明載體可向靶細(xì)胞遞送各種基因，其包括酶；血液衍生物；激素例如胰島素或生長(zhǎng)激素；淋巴因子白細(xì)胞介素、干擾素、TNF等(法國(guó)專(zhuān)利9203120)；生長(zhǎng)因子例如血管生成因子如VEGF或FGF；神經(jīng)遞質(zhì)或其前體，或合成酶；營(yíng)養(yǎng)因子，尤其是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，用于治療神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的中風(fēng)或視網(wǎng)膜退化的因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、IFGF、NT3、NT5、HARP/超營(yíng)養(yǎng)因子，或骨骼生長(zhǎng)因子、造血因子等；肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或最小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(minidystrophim)(法國(guó)專(zhuān)利9111947)；編碼參與凝血的因子例如，因子Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ的基因；自殺基因(例如胸苷激酶和胞嘧啶脫氨酶)；血紅蛋白或其它蛋白載體的基因；相應(yīng)于參與脂代謝的蛋白的基因選自載脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、B、C-Ⅰ、C-Ⅱ、C-Ⅲ、D、E、F、G、H、J和apo(a)的載脂蛋白類(lèi)型，代謝酶例如脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶、7-α-膽固醇羥化酶、磷脂酰酸性磷酸酶，或脂轉(zhuǎn)移蛋白如膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白，HDL結(jié)合蛋白，或以下受體例如LDL受體、殘余乳糜微粒受體和清除受體，等等。此外，可以添加用于治療肥胖癥的leptin。
在其它可被定向載體的基因編碼的蛋白質(zhì)或肽中，重要的是強(qiáng)調(diào)抗體、單鏈抗體的可變片段(ScFv)或任何其它具有識(shí)別能力的抗體片段，因?yàn)樗鼈兛捎糜诿庖咧委煟缰委煾腥拘约膊?、腫瘤、自身免疫病如多發(fā)性硬化(可涉及抗獨(dú)特型抗體的使用)。非限制性地，其它目的蛋白質(zhì)是可溶性受體，如可用于例如抗HSV治療的可溶性CD4受體或TNF的可溶性受體，可用于例如治療肌無(wú)力的乙酰膽堿的可溶性受體；用于例如治療哮喘、血栓和再狹窄的底物肽或酶抑制劑，或作為受體或粘著蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑的肽；人工、嵌合或截?cái)嗟鞍住Ｔ诟信d趣的激素中，可提及的是治療糖尿病的胰島素、生長(zhǎng)激素和降鈣素。
還可將所述基因替換為反義序列或具有如下性質(zhì)的基因，即其在靶細(xì)胞中的表達(dá)可控制基因的表達(dá)或細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄。例如，根據(jù)歐洲專(zhuān)利140 308中所描述的技術(shù)，可將這些序列在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成與細(xì)胞mRNA互補(bǔ)的RNA并由此阻斷細(xì)胞mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。治療基因還可含有編碼能選擇性破壞靶RNA的核酶的序列(歐洲專(zhuān)利321 201)。
實(shí)施例可通過(guò)參考如下非限制性實(shí)施例更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例是作為本發(fā)明的典型實(shí)例提供的。如果沒(méi)有特別指出，這些實(shí)施例中存在的所有修改均可組合在一起。實(shí)施例1Ad5六鄰體HVR5環(huán)的操作本實(shí)施例說(shuō)明，如果保持該環(huán)頂端最保守殘基(第268位的絲氨酸和第282位的脯氨酸)的完整，對(duì)Ad5六鄰體HVR5環(huán)第269-281氨基酸(aa)的操作將意想不到地為有效的腺病毒趨性改造提供條件。從Ad5六鄰體除去的序列是TTEAAAGNGDNLT(SEQ ID NO:25)(即，與已發(fā)表的Ad5參考序列相比，我們的構(gòu)建體在六鄰體第273位氨基酸處顯示蘇氨酸到丙氨酸的替代)，保守的側(cè)翼序列是FFS(上游)和PKVV(下游)。
材料和方法為操作六鄰體HVR5環(huán)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒。使用下列兩對(duì)引物制備含有HVR5環(huán)側(cè)翼區(qū)并且其中HVR5環(huán)被惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的xylE標(biāo)志基因(Zukowski等，1983，PNAS 80:1101-1105)替代的第一個(gè)中間質(zhì)粒IE28:hex-19243G(5’-ATGGGATGAAGCTGCTACTG-3’)(SEQ ID NO:26)和hex-19623D(5’-tcgcgaGAAAAATTGCATTTCCACTT-3’)(SEQ IDON:27)，和hex-19685G(5’-CCTAAGGTGGTATTGTACAG-3’)(SEQ ID NO:28)和hex-20065D(5’-AGCAGTAATTTGGAAGTTCA-3’)(SEQ ID NO:29)。
按照標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)，使用這些引物擴(kuò)增分別相當(dāng)于Ad5基因組(Genbank登記號(hào)M73260)第19245-19639位和第19685-20084位核苷酸的六鄰體基因的一部分。引物hex-19623D含有限制性位點(diǎn)NruⅠ，引物hex-19685G與Ad5序列相比作了稍稍修飾，以產(chǎn)生Bsu36Ⅰ位點(diǎn)而不改變六鄰體的蛋白質(zhì)序列(第19690位核苷酸A到G)。將每個(gè)PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pCRⅡ(Invitrogen)中，分別產(chǎn)生質(zhì)粒IE21和IE22。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)克隆的正確性。
將含有xylE基因表達(dá)盒的質(zhì)粒pαxylEΩ(Frey等，1988，基因(Gene)62:237-247)用EcoRⅠ限制酶消化，T4 DNA聚合酶平端化，再用HindⅢ消化。該DNA片段克隆至平端化的BamHⅠ-HindⅢ IE21質(zhì)粒中，獲得質(zhì)粒IE26。最后，將IE26的HindⅢ-XbaⅠ片段和IE22的XhoⅠ-HindⅢ片段克隆至SalⅠ-XbaⅠ切割的已報(bào)道質(zhì)粒pXL2756(Crouzet等，1997,PNAS 94:1414-1419)中，產(chǎn)生穿梭質(zhì)粒IE28。
所有HVR5環(huán)被修飾的質(zhì)粒均通過(guò)用雙鏈寡核苷酸替代xylE基因從質(zhì)粒IE28獲得。簡(jiǎn)而言之，將互補(bǔ)單鏈寡核苷酸退火形成雙鏈，并克隆至NruⅠ-Bsu36Ⅰ消化的IE28中，只有質(zhì)粒IE31除外，該質(zhì)粒通過(guò)連接雙鏈寡核苷酸和BsrGⅠ-NruⅠ切割的IE28獲得。采用表型篩選，其基于表達(dá)xylE的細(xì)菌在噴灑了0.5M兒茶酚后顯黃色(Zukowski等，1983，見(jiàn)上)。下表列出了所用的寡核苷酸和相應(yīng)的穿梭質(zhì)粒的名稱(chēng)表1.用于產(chǎn)生具有特定六鄰體插入的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。
*Crompton等，1994 J.Gen.Vir.75:133-139。
構(gòu)建相關(guān)的質(zhì)粒主鏈和病毒。構(gòu)建含有xylE基因而不是六鄰體基因HVR5環(huán)的中間質(zhì)粒主鏈，以便于隨后對(duì)HVR5環(huán)操作。為此，根據(jù)Crouzet等(1997，見(jiàn)上)所述的方法，將穿梭質(zhì)粒IE28與質(zhì)粒主鏈pXL3006(該質(zhì)粒含有可被PacⅠ切割的缺失了E1E3的腺病毒基因組，其中CMV-lacZ表達(dá)盒替代了E1區(qū))在G4977細(xì)菌菌株中重組，獲得質(zhì)粒主鏈IE28c，后者與質(zhì)粒主鏈pXL3006不同在于含有xylE的HVR5序列。
然后，采用“xylE篩選”將IE30-IE47所有穿梭質(zhì)粒與質(zhì)粒主鏈IE28c重組，獲得質(zhì)粒主鏈IE30c-IE47c。在用PacⅠ酶切割后，使用Lipofectamine(Gibco BRL)將2μg(或5μg)這些消化主鏈轉(zhuǎn)染911細(xì)胞(或293細(xì)胞)，產(chǎn)生相應(yīng)的病毒AdIE30-AdIE47。這些HVR5修飾的E1E3缺失的腺病毒因此表達(dá)相同的CMV-lacZ表達(dá)盒。
所有其它HVR5修飾的腺病毒(如表現(xiàn)uPAR結(jié)合肽或整聯(lián)蛋白結(jié)合肽；見(jiàn)后面的實(shí)施例)均采用相同策略構(gòu)建。
細(xì)胞和抗體。293和W162細(xì)胞在添加了10％胎牛血清的MEM(Gibco BRL)中維持。911細(xì)胞(Fallaux等，1996,Hum.Gene Ther.7:215)在添加了10％胎牛血清的DMEM中生長(zhǎng)?？笲londel等(Blondel等，1983，病毒學(xué)126:707)所述的1型脊髓灰質(zhì)炎病毒的C3單克隆抗體(C3 mAb)由R.Crainic博士(Pasteur研究所，巴黎，法國(guó))提供?？谷獳d5衣殼的L5兔多克隆抗體由RPR-Gencell’sfacilities(RPR SA,Vitry，法國(guó))生產(chǎn)。
病毒。所有病毒均按照經(jīng)典方法在E1反向互補(bǔ)細(xì)胞(如293細(xì)胞)中擴(kuò)增。病毒的模式/特性通過(guò)對(duì)用Hirt程序獲得的病毒DNA進(jìn)行插入片段的限制分析和測(cè)序來(lái)控制。病毒原種在293細(xì)胞中制備，通過(guò)CsCl梯度純化，用PD10柱(Pharmacia)脫鹽并于補(bǔ)充了10％甘油的PBS中保存在-80℃。生物學(xué)定量通過(guò)在感染W(wǎng)162細(xì)胞2天后用X-Gal染色(Dedieu等，1997，病毒學(xué)雜志71:4626)計(jì)數(shù)911細(xì)胞上的噬斑形成單位(PFU)和/或計(jì)數(shù)lacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TDU)來(lái)進(jìn)行。物理學(xué)定量通過(guò)陰離子交換計(jì)數(shù)病毒顆粒(VP)來(lái)進(jìn)行。
中和測(cè)試。將0.5μg抗脊髓灰質(zhì)炎病毒C3單克隆抗體與105TDU純化病毒在PBS中于37℃溫育1小時(shí)，然后將該混合物并入到6孔板中的W162細(xì)胞上，37℃再溫育1小時(shí)。之后用PBS洗滌細(xì)胞，向該細(xì)胞中加入新鮮培養(yǎng)基，再將細(xì)胞在37℃溫育2小時(shí)。細(xì)胞單層用甲醛(0.37％)-戊二醛(0.2％)固定，X-Gal染色，計(jì)數(shù)藍(lán)色細(xì)胞。
免疫沉淀程序。將CsCl純化病毒的病毒顆粒(1010)重懸于400μg非變性溫育緩沖液(50mM Tris pH7.5,150mM NaCl,0.05％NP40)中，然后與0.1μg抗脊髓灰質(zhì)炎病毒C3單克隆抗體在4℃溫育1小時(shí)。然后加入400μg預(yù)先用溫育緩沖液平衡過(guò)的蛋白A-Sepharose，再在4℃溫育1小時(shí)。溫育后，在微量離心機(jī)中短暫離心沉淀該混合物。沉淀塊用1ml溫育緩沖液洗滌兩次，用1ml 10mM Tris pH7.5和0.1％NP40在4℃20分鐘洗滌一次。含有蛋白A-抗體-病毒復(fù)合物的沉淀塊重懸在50μg 1×Laemmli緩沖液中，煮沸2分鐘，經(jīng)過(guò)短暫離心收集上清液。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Novex)分析10μg上清液。根據(jù)ECL程序(Amersham)使用抗全Ad5衣殼的L5兔多克隆血清進(jìn)行Western印跡。
結(jié)果修飾HVR5環(huán)的構(gòu)建策略。制備兩個(gè)系列的構(gòu)建體。第一個(gè)系列設(shè)計(jì)成通過(guò)用大小相差很大的其它Ad血清型的HVR5環(huán)替代Ad5 HVR5環(huán)來(lái)評(píng)價(jià)Ad5 HVR5環(huán)接受外源序列的“能力”。
表2．基于Ad5的具有異種特異性(heterospecific)HVR5環(huán)的腺病毒。
作為生存力對(duì)照，我們導(dǎo)入了Crompton等人(1994,J.Gen.Virol.75:133-139)發(fā)表的修飾，其中導(dǎo)入了3型脊髓灰質(zhì)炎病毒表位替代包含更大的缺失的HVR5。重要的是，Crompton病毒最初通過(guò)含有Ad2修飾六鄰體的質(zhì)粒和基于Ad5的腺病毒基因組之間的同源重組來(lái)構(gòu)建。因此，該病毒顯示Ad2和Ad5之間的嵌合六鄰體蛋白，其中多4個(gè)殘基的HVR5缺失已被外源肽替代。為了復(fù)制盡可能接近的Crompton等人的構(gòu)建體，通過(guò)EDRAG技術(shù)構(gòu)建了基于Ad5的病毒(Ad IE31)，其中導(dǎo)入了Crompton等人的外源肽以替代Ad5六鄰體第269-285位殘基(TTEAAAGNGDNLTPKVV；SEQ ID NO:59)而不是TTEAAAGNGDNLT(SEQ ID NO:60)。
表3．對(duì)照病毒AdIE31的插入片段。
在第二系列的構(gòu)建體中，用1型脊髓灰質(zhì)炎病毒的中和線性表位(DNPASTTNKDK；SEQ ID NO:62)替代了HVR5環(huán)(第269至281位aa)。該模型結(jié)合肽插入各種相鄰環(huán)境中(即使用各種由亮氨酸和/或甘氨酸和/或絲氨酸殘基組成的接頭)，以評(píng)價(jià)它們對(duì)病毒生存力和肽可及性的重要性。
表4.1型脊髓灰質(zhì)炎表位在HVR5環(huán)中的插入片段。
病毒的生存力。含有Ad2、Ad19或Ad30的HVR5環(huán)而不是Ad5HVR5環(huán)的3個(gè)病毒和含有1型脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的9個(gè)嵌合病毒是能生存的。沒(méi)有觀察到繁殖力喪失。出乎意料地，盡管進(jìn)行了巨大的努力，對(duì)照病毒Ad IE31仍不能回收。
通過(guò)免疫沉淀測(cè)定評(píng)價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的可及性。在非變性條件下使用同源抗脊髓灰質(zhì)炎病毒單克隆抗體(C3 mAb)對(duì)攜帶脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的病毒進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。下表5總結(jié)了獲得的數(shù)據(jù)表5．
由此發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒表位下游接頭的存在對(duì)于C3 mAb結(jié)合修飾的病毒衣殼是關(guān)鍵的，這很可能因?yàn)樗试S結(jié)合肽在六鄰體表面正確的呈遞和/或可及性。當(dāng)免疫沉淀前將修飾的病毒變性時(shí)，所有這些病毒均被C3 mAb有效地免疫沉淀(未顯示)。
通過(guò)中和測(cè)定評(píng)價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的功能性。因?yàn)镃3 mAb中和脊髓灰質(zhì)炎病毒感染，所以我們期望它也能中和攜帶脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的Ad的感染性。在PBS中(即在天然條件下)將C3 mAb與整個(gè)系列的Ad IE病毒溫育，然后感染W(wǎng)162猴細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示在圖1中。這些數(shù)據(jù)與免疫沉淀結(jié)果很好地關(guān)聯(lián)起來(lái)，也就是說(shuō)，所有能在非變性條件下結(jié)合C3 mAb的病毒也被該抗體中和。
討論數(shù)據(jù)顯示，腺病毒HVR5環(huán)的修飾可允許修飾的六鄰體與特異結(jié)合蛋白功能性和特異性地相互作用。然而，需要特定的插入模型，因?yàn)閿?shù)據(jù)顯示，結(jié)合肽表位的可及性(免疫沉淀測(cè)定)和功能性(中和測(cè)定)依賴于最小間隔/相鄰序列。
與Crompton等人的結(jié)論相比，我們的結(jié)果也顯示Ad5六鄰體第269-285位aa的缺失對(duì)于病毒的生長(zhǎng)和/或生存力有害。這可通過(guò)如下事實(shí)解釋第282-285位殘基位于HVR5環(huán)下游的β-鏈中，它可能對(duì)于六鄰體作為單體或三聚體的結(jié)構(gòu)是必需的。因此，比Crompton等人所述方法更精確和嚴(yán)格的本方法出乎意料地克服了該文獻(xiàn)的缺點(diǎn)，并提供具有修飾趨性的可存活病毒(見(jiàn)下文)。
實(shí)施例2尾絲HI環(huán)的操作對(duì)Ad5尾絲的HI環(huán)進(jìn)行缺失從尾絲頭部除去的序列包括第538-548位殘基(即序列GTQETGDTTPS)(SEQ ID NO:72)。因此其側(cè)翼序列是TLN(上游)和AYS(下游)。
材料和方法為操作尾絲HI環(huán)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒。使用下列兩對(duì)引物制備含有HI環(huán)側(cè)翼區(qū)并且其中HI環(huán)被xylE基因替代的第一個(gè)中間質(zhì)粒pJD3:HIgu1(5’-CAGCTCCATCTCCTAACTGTAGACTAAATG-3’)(SEQ IDNO:73)和HIgd1(5’-GGTTACCGGTTTAGTTTTGTTCCGTTTAA-3’)(SEQ IDON:74)，和HIdu1(5’-AGCGCTTACTCTATGTCATTTTCATGGGAC-3’)(SEQ IDNO:75)和HIdd1(5’-GAGTTTATTAATATCACTGATGAGCGTTTG-3’)(SEQ IDNO:76)。
按照標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)，使用這些引物對(duì)擴(kuò)增分別相當(dāng)于Ad5基因組(Genbank登記號(hào)M73260)第32255-32634位和第32712-33090位核苷酸的尾絲和E4orf7基因的一部分。引物HIgd1和HIdu1的設(shè)計(jì)使其分別產(chǎn)生限制性位點(diǎn)BstEⅡ和Eco47Ⅲ，而不修飾HI環(huán)緊鄰的尾絲蛋白序列。這些位點(diǎn)將用于外源肽直接亞克隆至HI中(見(jiàn)下文和表5)。將每個(gè)PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pCR2.1(Invitrogen)中，分別產(chǎn)生質(zhì)粒PCR2.1-H4和PCR2.1-I2，然后測(cè)序。
將含有xylE基因表達(dá)盒的質(zhì)粒pαxylEΩ用EcoRⅠ限制酶消化，T4 DNA聚合酶平端化，再用HindⅢ消化。該DNA片段亞克隆至HindⅢ消化的PCRⅡ(Invitrogen)中，產(chǎn)生質(zhì)粒IE23。將IE23的NsiⅠ-XhoⅠ片段導(dǎo)入NsiⅠ-XhoⅠ消化的PCR2.1-H4質(zhì)粒中，產(chǎn)生質(zhì)粒pJD2。最后，將pJD2的SacⅠ-XbaⅠ片段和PCR2.1-I2的SpeⅠ-XhoⅠ片段克隆至SacⅠ-SalⅠ切割的已報(bào)道質(zhì)粒pXL2756(Crouzet等人，見(jiàn)上)中，產(chǎn)生穿梭質(zhì)粒pJD3。
所有HI環(huán)被修飾的質(zhì)粒均通過(guò)用雙鏈寡核苷酸替代xylE基因從質(zhì)粒pJD3獲得。簡(jiǎn)而言之，將互補(bǔ)單鏈寡核苷酸退火形成雙鏈，并克隆至BstEⅡ-Eco47Ⅲ消化的pJD3中。使用表型篩選，其基于表達(dá)xylE的細(xì)菌在噴灑了0.5M兒茶酚后顯黃色。下表列出了所用的寡核苷酸和相應(yīng)的穿梭質(zhì)粒的名稱(chēng)
表5．用于替代HI環(huán)的寡核苷酸的例子。
構(gòu)建相關(guān)的質(zhì)粒主鏈和病毒。首先構(gòu)建含有xylE基因而不是尾絲基因HI環(huán)的中間質(zhì)粒主鏈，以便于隨后篩選顯示修飾HI環(huán)的任何質(zhì)粒主鏈。為此，根據(jù)Crouzet等人(見(jiàn)上)所述的方法，將穿梭質(zhì)粒pJD3與質(zhì)粒主鏈pXL3006在G4977細(xì)菌菌株中重組，獲得質(zhì)粒主鏈pBX，因而后者顯示可被PacⅠ切割的缺失了E1E3的腺病毒基因組，它含有替代E1的CMV-LacZ表達(dá)盒以及位于HI環(huán)中的xylE標(biāo)志。
然后，采用“xylE篩選”將穿梭質(zhì)粒pJD5、7、6和pCF-pCF8與質(zhì)粒主鏈pBX重組，獲得質(zhì)粒主鏈pBV2、5、9和pBC1-pBC8。在用PacⅠ酶切割后，使用Lipofectamine(Gibco BRL)將2μg(或5μg)DNA轉(zhuǎn)染911細(xì)胞(或293細(xì)胞)，產(chǎn)生相應(yīng)的病毒vBV2、5、9和vBC1-vBC8。
其它方法。細(xì)胞、抗體、病毒、免疫沉淀測(cè)定和中和測(cè)定見(jiàn)上文結(jié)果HI環(huán)插入載體的構(gòu)建策略。制備兩個(gè)系列的構(gòu)建體。第一個(gè)系列設(shè)計(jì)成通過(guò)用大小有些不同的其它Ad血清型的HI環(huán)替代Ad5 HI環(huán)來(lái)評(píng)價(jià)Ad5 HI環(huán)接受外源序列的“能力”。
表6．尾絲蛋白HI環(huán)中容納插入片段的能力。
在第二系列的構(gòu)建體中，用1型脊髓灰質(zhì)炎病毒的中和表位(DNPASTTNKDK；SEQ ID NO:62)替代HI環(huán)。由于處于其天然環(huán)境/蛋白質(zhì)中的Ad5 HI環(huán)和脊髓灰質(zhì)炎病毒序列的N端一側(cè)具有非常接近的3D結(jié)構(gòu)，因而在表位上游加入一個(gè)最小單殘基接頭(甘氨酸)。插入位點(diǎn)的下游則不是這樣，其包括不同長(zhǎng)度和組成的間隔，以評(píng)價(jià)它們對(duì)病毒生長(zhǎng)和肽可及性的影響。
表7.1型脊髓灰質(zhì)炎病毒表位在HI環(huán)中的插入片段。
病毒生存力。含有Ad2、Ad5或Ad9的HI環(huán)而不是Ad5 HI環(huán)的3個(gè)病毒和含有脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的9個(gè)嵌合病毒是能生存的。沒(méi)有觀察到繁殖力喪失。
通過(guò)免疫沉淀測(cè)定評(píng)價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的可及性。在非變性條件下使用同源抗脊髓灰質(zhì)炎病毒C3 mAb對(duì)攜帶脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的病毒進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。下表總結(jié)了這些數(shù)據(jù)表8．通過(guò)C3 mAb的免疫沉淀檢測(cè)到的導(dǎo)向序列的識(shí)別
這些數(shù)據(jù)顯示，C3 mAb抗體與修飾衣殼的結(jié)合關(guān)鍵取決于最小長(zhǎng)度間隔序列的存在。特別是，下游的3殘基接頭賦予了最有效的結(jié)合。當(dāng)免疫沉淀前將這些病毒變性時(shí)，所有這些病毒均能結(jié)合C3 mAb抗體(未顯示)。
通過(guò)中和測(cè)定評(píng)價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒表位的功能性。然后評(píng)價(jià)C3mAb中和尾絲修飾病毒的感染性的能力，以確定它是否與實(shí)施例1中所舉例說(shuō)明的六鄰體修飾衣殼的免疫沉淀數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。但是，與六鄰體修飾的結(jié)果不同，任何尾絲修飾病毒與C3 mAb溫育后均沒(méi)有感染性抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。特別是，在病毒體表面只有12個(gè)尾絲三聚體，而六鄰體三聚體有240個(gè)。因此，抗體結(jié)合六鄰體修飾衣殼的密度可直接降低病毒感染性，或者導(dǎo)致五鄰體基座的RGD基序的空間障礙，因而影響整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化作用。無(wú)論何種情況，C3 mAb對(duì)HI修飾衣殼的特異結(jié)合不妨礙該病毒與其靶細(xì)胞之間的天然相互作用。
討論數(shù)據(jù)說(shuō)明腺病毒HI環(huán)可被外源肽替代，而且相應(yīng)的病毒是ⅰ)可存活的，和ⅱ)對(duì)病毒的繁殖力沒(méi)有劇烈影響。數(shù)據(jù)還說(shuō)明導(dǎo)入肽的特異性識(shí)別需要適合的鄰近接頭(如最小尺寸的柔性接頭)。
實(shí)施例3尾絲蛋白長(zhǎng)度的修飾--短尾絲考慮到Ad5(長(zhǎng)尾絲血清型)與其它血清型如Ad9(短尾絲血清型)的細(xì)胞結(jié)合途徑之間的差異，可通過(guò)設(shè)計(jì)雜合尾絲(用另一種短尾絲血清型Ad3的軸替換Ad5的軸)或縮短的Ad5軸(僅保留天然蛋白質(zhì)中的6或9個(gè)重復(fù)而不是22個(gè)重復(fù))，修飾尾絲軸的長(zhǎng)度。
材料和方法構(gòu)建具有縮短尾絲的穿梭質(zhì)粒。構(gòu)建了三個(gè)含有縮短尾絲的穿梭質(zhì)粒。其中兩個(gè)質(zhì)粒(pSF1和pSF2)表現(xiàn)出在尾絲軸中有大的缺失，而第三個(gè)質(zhì)粒(pIF1)包含Ad3的軸而不是Ad5的軸。因此所有的構(gòu)建體均保留了Ad5的尾和頭部結(jié)構(gòu)域。
為構(gòu)建pSF1，使用了兩對(duì)引物5M3g(5’-ATTTCTGTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3’)(SEQ IDNO:110)和5M3d(5’-GTTTGACTTGGTTTTTTTGAGAGGTGGGCT-3’)(SEQID NO:111)，以及5M17g(5’-TTGGATATTAACTACAACAAAGGCCTTTAC-3’)(SEQID NO:112)和5M17d(5’-GAAACTGGAGCTCGTATTTGACTGCCACAT-3’)(SEQID NO:113)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)，使用這些引物擴(kuò)增部分尾絲基因，即分別相應(yīng)于Ad5基因組(Genbank登記號(hào)M73260)的第30885-31329位核苷酸和第31936-32351位核苷酸的部分。由于分別含有限制性位點(diǎn)SalⅠ和SacⅠ，引物5M3g和5M17d與Ad5的序列稍有不同。通過(guò)SalⅠ或SacⅠ消化后，這些PCR產(chǎn)物被連接并克隆至SalⅠ-SacⅠ切割的pXL2756中，獲得質(zhì)粒pSF1，其表現(xiàn)出一個(gè)包含了第4-16個(gè)軸重復(fù)的符合讀框的缺失。
為構(gòu)建pSF2，使用了兩對(duì)引物5M3g(5’-ATTTCTGTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3’)(SEQ IDNO:114)和5M3d(5’-GTTTGACTTGGTTTTTTTGAGAGGTGGGCT-3’)(SEQID NO:115)，以及5M20g(5’-CTCAAAACAAAAATTGGCCATGGCCTAGAA-3’)(SEQID NO:116)和5M20d (5’-ATCCAAGAGCTCTTGTATAGGCTGTGCCTT-3’)(SEQID NO:117)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)，使用這些引物擴(kuò)增部分尾絲基因，即分別相應(yīng)于Ad5基因組的第30885-31329位核苷酸和第32110-32530位核苷酸的部分。由于分別含有限制性位點(diǎn)SalⅠ和SacⅠ，引物5M3g和5M20d與Ad5的序列稍有不同。通過(guò)SalⅠ或SacⅠ消化后，這些PCR產(chǎn)物被連接并克隆至SalⅠ-SacⅠ切割的pXL2756中，獲得質(zhì)粒pSF2，其表現(xiàn)出一個(gè)包含了第4-19個(gè)軸重復(fù)的符合讀框缺失。
采用Horton等人(4)描述的基因SOEing法構(gòu)建pIF1質(zhì)粒，其中該方法包括在不依賴限制性位點(diǎn)的情況下通過(guò)PCR重組DNA序列。為構(gòu)建含有雜合尾絲基因，即由Ad5的尾和頭部以及Ad3的軸所組成的pIF1質(zhì)粒，必需5個(gè)連續(xù)步驟。含有Ad5尾絲尾的第一PCR產(chǎn)物通過(guò)使用以下引物從Ad5基因組擴(kuò)增獲得SOE35Tg(5’-TACAAGTCGACAACCAAGCGTCAGAAATTG-3’)(SEQ ID NO:118)和SOE35Td(5’-AAGACTTAAAACCCCAGGGGGACTCTCTTG-3’)(SEQ ID NO:119)。
除了引入SalⅠ位點(diǎn)而稍有修飾外，引物SOE35Tg與Ad5第30660-30689位核苷酸基本匹配。SOE35Td引物中的15個(gè)有下劃線的堿基與Ad3尾絲軸第一個(gè)重復(fù)的序列相匹配，而剩余的15個(gè)堿基相應(yīng)于Ad5尾絲尾末端的序列。
含有Ad3尾絲軸的第二PCR產(chǎn)物通過(guò)使用以下引物從Ad3尾絲基因擴(kuò)增獲得SOE35Sg(5’-GAGAGTCCCCCTGGGGTTTTAAGTCTTAAA-3’)(SEQ ID NO:120)和SOE35Sd(5’-GGTCCACAAAGTGTTATTTTTCAGTGCAAT-3’)(SEQ ID NO:121)。
兩個(gè)引物中有下劃線的堿基包含在Ad5的尾絲基因中(分別在尾和頭部亞結(jié)構(gòu)域中)，而剩余堿基來(lái)自Ad3的軸。
含有Ad5尾絲頭部的一部分的第三PCR產(chǎn)物通過(guò)使用以下引物從Ad5尾絲基因擴(kuò)增獲得SOE35Kg(5’-CTGAAAAATAACACTTTGTGGACCACACCA-3’)(SEQ ID NO:122)和SOE35Kd(5’-TCCTGAGCTCCGTTTAGTGTAATGGTTAGT-3’)(SEQ ID NO:123)。
SOE35Kg引物中有下劃線的堿基與Ad3尾絲軸的最后一個(gè)重復(fù)的序列相符，而剩余序列相應(yīng)于Ad5尾絲頭部的開(kāi)頭核苷酸。引物SOE35Kd與Ad5第32634-32663位核苷酸基本匹配，其僅有的修飾導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)SalⅠ位點(diǎn)。在PCR條件下將兩個(gè)第一PCR產(chǎn)物混合，變性并再退火，以便第一個(gè)產(chǎn)物的上鏈和第二個(gè)產(chǎn)物的下鏈重疊并相互充當(dāng)引物。該重疊物經(jīng)聚合酶延伸后形成雜種產(chǎn)物。在SOE反應(yīng)中包含引物SOE35Tg和SOE35Sd可使重組產(chǎn)物在形成后立即被PCR擴(kuò)增(見(jiàn)Horton等人的圖，見(jiàn)上)。這樣產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物含有后接Ad3軸的Ad5尾。最后，采用引物SOE35Tg和SOE35Kd對(duì)上一個(gè)PCR產(chǎn)物和第三PCR產(chǎn)物進(jìn)行同樣的SOE操作，產(chǎn)生的DAN片段含有由Ad5尾、Ad3軸和Ad5頭部的一部分組成的雜合尾絲，而且片段的兩側(cè)具有獨(dú)特的限制性位點(diǎn)SalⅠ和SacⅠ(圖2)。該最終PCR產(chǎn)物經(jīng)這些酶消化后，被克隆至SalⅠ-SacⅠ切割的pXL2756質(zhì)粒中，獲得pIF1穿梭質(zhì)粒。
對(duì)質(zhì)粒pSF1、pSF2和pIF1均進(jìn)行了測(cè)序。
構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒主鏈和病毒。根據(jù)Crouzet等人(見(jiàn)上)所描述的方法，在G4977細(xì)菌菌株中用質(zhì)粒主鏈pXL3006(含有一個(gè)替代E1區(qū)的CMV-lacZ表達(dá)盒的PacⅠ可切割的缺失E1E3的重組腺病毒基因組)重組三個(gè)穿梭質(zhì)粒pSF1、pSF2和pIF1，分別獲得質(zhì)粒主鏈pBS1、pBS2和pBI1。PacⅠ切割后，使用Lipofectamine(Gibco BRL)向911細(xì)胞(或293或PER.6細(xì)胞)轉(zhuǎn)染2μg(或5μg)DNA，產(chǎn)生相應(yīng)的病毒vBS1、vBS2和vBI1。此外，通過(guò)穿梭質(zhì)粒IE28與質(zhì)粒主鏈pBI1、pBS1和pBS2之間的同源重組構(gòu)建了中間質(zhì)粒主鏈AE31、AE32和AE33。含有替代HVR5六鄰體環(huán)的xylE表達(dá)盒并具有短軸尾絲的這些質(zhì)粒主鏈可再用于促進(jìn)回收同時(shí)含有短軸尾絲和HVR5修飾的六鄰體(例如，具有UPAR-或整聯(lián)蛋白結(jié)合肽的插入片段；見(jiàn)實(shí)施例10)的質(zhì)粒主鏈。
同時(shí)，通過(guò)穿梭質(zhì)粒pJD3和pBI1、pBS1和pBS2質(zhì)粒主鏈之間的重組構(gòu)建了中間質(zhì)粒主鏈AE34、AE35和AE36。這些質(zhì)粒主鏈再用于促進(jìn)回收同時(shí)含有短軸尾絲和HI修飾的尾絲(例如，具有UPAR-或整聯(lián)蛋白結(jié)合肽的插入片段)的質(zhì)粒主鏈。
其它方法。細(xì)胞、抗體、病毒、免疫沉淀測(cè)定、和中和測(cè)定均與實(shí)施例1中所描述的相同，見(jiàn)上。
結(jié)果和討論預(yù)測(cè)具有縮短尾絲蛋白的病毒將增加暴露在六鄰體表面的結(jié)合肽的可及性和/或降低野生型(即天然)病毒/細(xì)胞的相互作用。這些構(gòu)建體總結(jié)在表9中。
表9．具有縮短的尾絲蛋白的腺病毒
在所有的三種情況中病毒的繁殖力均極大地降低(盡管程度不同)，這極有可能是因?yàn)樾揎椀奈步z與其細(xì)胞受體不能有效地發(fā)生相互作用。實(shí)際上，293感染細(xì)胞中的正常病毒DNA復(fù)制參數(shù)(即Xgal陽(yáng)性)和病毒晚期蛋白的正常積累均支持該缺陷發(fā)生在這樣的早期階段。此外，非變性情況下的Western印跡說(shuō)明在所有三種情況中均出現(xiàn)了修飾尾絲的正確三聚體化。
盡管vBS1與CAR(柯薩奇病毒(Coxsackie)和腺病毒受體)陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合的效率較低，然而可在PER.C6中將其擴(kuò)增至實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的量。正如圖3所顯示，還觀察到，與具有天然Ad5尾絲的對(duì)照病毒相比，用vBS1感染293細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)降低10倍，這表明Ad受體結(jié)合的大量喪失。在此實(shí)驗(yàn)中，將293細(xì)胞與PBS或純化的尾絲頭部(100μg/ml)一起于室溫溫育30分鐘，之后以50moi(VP/細(xì)胞)于室溫進(jìn)行30分鐘感染。然后細(xì)胞用PBS洗滌兩次后，再次于37℃在培養(yǎng)基中溫育24小時(shí)，之后制備蛋白提取物。然后定量特異lacZ表達(dá)(單位/蛋白提取物)。
基于這些數(shù)據(jù)，給C57/B16小鼠靜脈內(nèi)注射vBS1構(gòu)建體或其對(duì)照病毒(具有未修飾軸)，以確定主要器官中l(wèi)acZ表達(dá)的分布。通過(guò)組織化學(xué)分析了肝、心臟、和肺中的β-半乳糖苷酶表達(dá)。結(jié)果在下面的表10中給出(XGal陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)平均值和數(shù)值范圍)。
表10．主要器官中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分布
這些數(shù)據(jù)顯示，在肝中對(duì)于兩個(gè)腺病毒均有劑量-反應(yīng)效應(yīng)，而任何處理組的心臟和肺組織中均沒(méi)能發(fā)現(xiàn)XGal陽(yáng)性細(xì)胞。最有趣的是，尾絲軸的縮短導(dǎo)致了肝轉(zhuǎn)導(dǎo)降低10倍，這強(qiáng)調(diào)了操作尾絲軸以使感染主要指向體內(nèi)目的器官/細(xì)胞的有用性，條件是重組腺病毒已裝備了其它不依賴CAR的進(jìn)入途徑。
實(shí)施例4表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活物受體的細(xì)胞的特異導(dǎo)向在六鄰體HVR5和尾絲HI環(huán)中包含，或是在尾絲蛋白的C末端添加各種高親合性u(píng)PAR結(jié)合肽。這些肽可來(lái)自野生型ATF(Rettenberg等，1995,Biol.Chem.Hoppe-Seyler 376:587-594)和突變ATF(Magdolen等人，1996,Eur.J.Biochem.237:743-751)、噬菌體文庫(kù)(Goodson等，1994，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91:7129-7133)、和相關(guān)突變體、或人的玻連蛋白(Waltz等人，1997，J.Clin.Invest.100:58-67)。所有病毒均含有插入替代E1基因的基因表達(dá)盒(lacZ或Gax)。
在六鄰體HVR5環(huán)和尾絲蛋白HI環(huán)中插入這些肽的方法與上述實(shí)施例1和2中就脊髓灰質(zhì)炎病毒表位所述相同。尾絲蛋白的縮短可按實(shí)施例3所述方法進(jìn)行。其它材料和方法描述如下。
PER.C6細(xì)胞前培養(yǎng)在含有10％FCA和10mM MgCl2的Dulbecco改良培養(yǎng)基(DMEM)中37℃于10％CO2氣氛中培養(yǎng)PER.C6細(xì)胞(Fallaux等人，1998,Hum Gene Ther,9:1909-1917)。
重組腺病毒基因組按法國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)F(tuán)R 2 730 504所述方法采用EDRAG技術(shù)，在大腸桿菌中通過(guò)同源重組將重組腺病毒基因組克隆至RK2衍生質(zhì)粒中。按WO 97/10343中所述方法，通過(guò)在自殺穿梭質(zhì)粒中用R6K的復(fù)制起點(diǎn)替換ColE1復(fù)制起點(diǎn)簡(jiǎn)化該技術(shù)，因?yàn)檫@種替換使得可在任何recA+大腸桿菌菌株中進(jìn)行重組。通過(guò)在合適的限制性位點(diǎn)插入Ad5序列以及采用順序PCR對(duì)序列進(jìn)行修飾，來(lái)構(gòu)建自殺質(zhì)粒(也稱(chēng)為穿梭質(zhì)粒)。通過(guò)限制性酶作圖和Southern分析評(píng)價(jià)EDRAG構(gòu)建體的完整性。涉及PCR擴(kuò)增或同源重組的區(qū)域通過(guò)序列分析來(lái)證實(shí)。
質(zhì)粒主鏈pXL3215是一長(zhǎng)57.8kb的RK2衍生質(zhì)粒，含有一個(gè)基于Ad5的可被PacⅠ切割的E1和E3缺失的基因組(法國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)F(tuán)R2 730 504)，其中在該基因組中替代E1區(qū)有一個(gè)處于Rous肉瘤病毒啟動(dòng)子控制下的大腸桿菌lacZ基因。通過(guò)利用自殺穿梭質(zhì)粒pXL3521將大腸桿菌lacZ表達(dá)盒更換成人的GAX表達(dá)盒，從pXL3215衍生出質(zhì)粒pXL3527；這樣就導(dǎo)致了AV1.0CMV.Gax腺病毒的產(chǎn)生。質(zhì)粒pXL3497來(lái)源于質(zhì)粒pXL2689(Crouzet等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，1997,94:1414-1419)，并在尾絲蛋白的C端表現(xiàn)出一個(gè)(Gly-Ser)5-(Lys)7肽。經(jīng)PacⅠ限制酶切并轉(zhuǎn)染El反式互補(bǔ)細(xì)胞后，該主鏈用于產(chǎn)生病毒AV1.kCMV.lacZ，該病毒與Wickham等人(1997，病毒學(xué)雜志(J.Virol.),71:8221-8229)所描述的AdZ.F(pK7)bgal一致。
腺病毒的生產(chǎn)和定量在T25cm2搖瓶中存在LipofectAMINE時(shí)用腺病毒基因組轉(zhuǎn)染PER.C6細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將在水中稀釋的5μg PacⅠ消化的DNA質(zhì)粒與23μg Lipofectamine混合。輕柔混勻后，懸浮液在室溫溫育30分鐘。同時(shí)，用磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌50-60％匯合的細(xì)胞兩次，之后將磷酸鹽緩沖的鹽水替換成加入了3.8ml無(wú)血清DMEM的LipofectAMINE/DNA混合物。細(xì)胞在37℃溫育5-8小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成含有10％胎牛血清和10mM MgCl2的DMEM。轉(zhuǎn)染后三天，分離細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至一個(gè)T75cm2搖瓶中。(第10-14天)在完全CPE時(shí)收獲細(xì)胞和上清液，并凍融三個(gè)循環(huán)，之后離心收集上清液。EDRAG技術(shù)產(chǎn)生同源(即克隆)群體；因此不需要進(jìn)行噬斑純化。
通過(guò)在瓊脂糖凝膠型支持物上進(jìn)行層析，精確定量腺病毒顆粒。
在T150cm2搖瓶中，用重組腺病毒以每細(xì)胞10-100個(gè)病毒顆粒的MOI感染大約70％匯合的PER.C6細(xì)胞。當(dāng)致細(xì)胞病變效應(yīng)完全時(shí)，收獲細(xì)胞和上清液，凍融3個(gè)循環(huán)，離心并收集上清液。在某些情況下，必需采用回收程序(見(jiàn)下文)。
在各種來(lái)源(尤其是人的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源)的原代細(xì)胞，以及由于其細(xì)胞表面表達(dá)有限水平的腺病毒受體而對(duì)感染耐受的一組人和非人腫瘤細(xì)胞系中，體外評(píng)價(jià)修飾病毒的感染性(見(jiàn)實(shí)施例8和10)。當(dāng)使用易于受到Ad5感染的細(xì)胞時(shí)，將重組頭部用作競(jìng)爭(zhēng)劑。
通過(guò)在HI環(huán)中插入導(dǎo)向uPAR的肽修飾的病毒缺失Ad5尾絲的第538-548位殘基(GTQETGDTTPS)(SEQ IDNO:72)，并將其替換成6種具有GAS接頭側(cè)翼的不同肽。相應(yīng)的穿梭質(zhì)粒、質(zhì)粒主鏈和病毒的構(gòu)建按實(shí)施例2所述進(jìn)行。所有的病毒均可存活，但一些(尤其是病毒AE43、AE44和AE45)與其未修飾對(duì)照病毒相比表現(xiàn)出改變的穩(wěn)定性。然而，可通過(guò)采用如下程序獲得與對(duì)照病毒可比的產(chǎn)量(即10000-20000VP/細(xì)胞)感染后3天收獲PER.C6細(xì)胞，并用溫和緩沖液(pH7.5 10mM Tris,1mM MgCl2,1％Tween 20,0.25M NaCl)替代連續(xù)的凍融循環(huán)進(jìn)行細(xì)胞裂解；然后通過(guò)CsCl梯度超離心純化病毒。
表11uPAR導(dǎo)向肽插入HI環(huán)
通過(guò)在HVR5環(huán)中插入導(dǎo)向uPAR的肽修飾的病毒用兩側(cè)均具有合適接頭(gly-ser)的上述6種uPAR結(jié)合肽替換Ad5六鄰體的第269-281位殘基(TTEATAGNGDNLT)(SEQ ID NO:125)。相應(yīng)的質(zhì)粒主鏈和腺病毒的構(gòu)建按實(shí)施例1所述進(jìn)行。所有的病毒均可存活。一些構(gòu)建體(例如AE27、AE28)表現(xiàn)出某種不穩(wěn)定性，故對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的純化(見(jiàn)上)。
表12:uPAR導(dǎo)向肽插入HVR5環(huán)
通過(guò)在HI環(huán)中插入導(dǎo)向uPAR的肽修飾的并含有縮短尾絲的病毒按如上所述，缺失Ad5尾絲的第538-548位殘基(GTQETGDTTPS)(SEQ ID NO:72)，并將其替換成兩側(cè)具有適合接頭(gly-ser-ser)的6種uPAR結(jié)合肽。按下表中的總結(jié)，將這些修飾與縮短的尾絲軸(見(jiàn)實(shí)施例3)相結(jié)合。
表13通過(guò)插入uPAR導(dǎo)向肽修飾了HI環(huán)的短尾絲病毒的類(lèi)型
通過(guò)在HVR5環(huán)中插入導(dǎo)向uPAR的肽修飾的并含有縮短尾絲的病毒按如上所述，用6種具有適合接頭(gly-ser)側(cè)翼的不同肽替換Ad5六鄰體的第269-281位殘基。如上所述，這些修飾再與尾絲軸的縮短相結(jié)合。
例如，病毒AE65含有一個(gè)替代了六鄰體HVR5并具有g(shù)ly-ser接頭側(cè)翼的NQNSRRPSRA肽(SEQ ID NO:6)，并表現(xiàn)出縮短的尾絲(包含第4-16個(gè)重復(fù)的軸缺失)。另一個(gè)例子是病毒AE63，其與AE65基本一致，只是該病毒所包含的肽是DCRGDCF肽而不是Vn3肽(見(jiàn)通過(guò)在C端添加一個(gè)8氨基酸的接頭和之后的導(dǎo)向uPAR的肽使導(dǎo)向受到修飾的病毒用接頭的脯氨酸密碼子替換尾絲的終止密碼子。在所有構(gòu)建體中使用的接頭序列均是PKRARPGS。
通過(guò)修飾向尾絲蛋白編碼序列的3’末端引入一個(gè)FspⅠ位點(diǎn)。使用PCR誘變產(chǎn)生一個(gè)單堿基替換(第32778位核苷酸)，該替換產(chǎn)生一個(gè)引入新的FspⅠ識(shí)別位點(diǎn)的沉默突變。采用引物MOL1(5’-ggaactttagaaatggagatcttactgaagg-3’)(SEQ ID NO:126)和引物MOL3(5’-cgattctttattcttgcgcaatgtatgaaaaag-3’)(SEQ ID NO:127)，從Ad5基因組擴(kuò)增Ad5尾絲頭部。除了引入FspⅠ限制性位點(diǎn)而稍有修飾外，引物MOL3與Ad5的第32762-32794位核苷酸基本匹配。將該擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入pCR2.1(Invitrogen)中產(chǎn)生pMA51。
采用寡核苷酸MOL2(5’-cttaagtgagctgcccggggag-3’)(SEQ IDNO:128)和MOL4(5’-ggatccaatgaacttcatcaagt-3’)(SEQ ID NO:129)，通過(guò)PCR誘變修飾尾絲蛋白編碼序列終止密碼子下游的區(qū)域，以在polyA區(qū)上游引入AatⅡ、NruⅠ、SpeⅠ限制性位點(diǎn)，然后將該區(qū)域克隆至pCR2.1(Invitrogen)中產(chǎn)生pMA52。
編碼接頭肽的序列通過(guò)如下兩個(gè)單鏈寡核苷酸的退火產(chǎn)生MOL7(5’-aattctgcgcaagaaccaaagagggccaggcccggatcctaagacgtct-3’)(SEQ ID NO:130)和MOL8(5’-ctagagacgtcttaggatccgggcctggccctctttggttcttgcgcag-3’)(SEQ ID NO:131)。將該雙鏈體克隆在pBSSK+(Stratagene)的EcoRⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)中，產(chǎn)生pMA53。
最后，通過(guò)把pMA51的BglⅡ-FspⅠ片段和pMA52的FspⅠ-XbaⅠ片段克隆至pXL2756的BamHⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)中，將該接頭序列引入尾絲蛋白編碼序列的3’末端，產(chǎn)生載體pMA55。
通過(guò)把pMA52的SmaⅠ-AatⅠ片段克隆至pMA55的SmaⅠ-AatⅠ限制性位點(diǎn)中構(gòu)建穿梭載體pMA56。根據(jù)Crouzet等人(見(jiàn)上)所述的方法，在G4977細(xì)菌菌株中用質(zhì)粒主鏈pXL3006重組穿梭質(zhì)粒pMA55，獲得含有PacⅠ可切割的E1E3缺失的CMV/lacZ重組病毒基因組的質(zhì)粒主鏈22.3，其中該基因組編碼具有C端修飾的尾絲。
進(jìn)行進(jìn)一步克隆，以通過(guò)使用PKRARPGS接頭在尾絲C端添加uPAR導(dǎo)向配體。簡(jiǎn)而言之，構(gòu)建編碼這些修飾的穿梭質(zhì)粒，并根據(jù)EDRAG方法在G4977細(xì)菌菌株中使其與腺病毒質(zhì)粒主鏈pXL3091(E1區(qū)替換為RSV-lacZ)、pXL3006(E1區(qū)替換為CMV-lacZ)或pXL3527(E1區(qū)替換為hGax表達(dá)盒)重組，產(chǎn)生具有l(wèi)acZ或Gax表達(dá)盒和C端修飾尾絲蛋白的腺病毒主鏈。
除了bC12x外，在PacⅠ限制性酶切主鏈轉(zhuǎn)染911、293或PER.C6細(xì)胞后，回收到所有預(yù)期的病毒。它們的繁殖力(VP/細(xì)胞)可與其未修飾的對(duì)照病毒相比。
表14通過(guò)C-端添加一個(gè)緊接UPAR導(dǎo)向肽的8氨基酸接頭修飾的病毒
在其它實(shí)驗(yàn)中，這些修飾按以上示例與尾絲軸的縮短相結(jié)合。實(shí)施例5表達(dá)αv整聯(lián)蛋白受體的細(xì)胞的特異導(dǎo)向在尾絲HI六鄰體和HVR5環(huán)中包含，或是在尾絲蛋白的C末端添加高親合性αv整聯(lián)蛋白結(jié)合肽(CDCRGDCFC，稱(chēng)為RGD-4C；也見(jiàn)Pasqualini等人，1997，自然生物技術(shù)(Nature Biotech.)15:542)和其變體(DCRGDCF，稱(chēng)為RGD-2C)。這些病毒含有插在E1區(qū)中的異源基因(lacZ)，所述E1區(qū)已從病毒中缺失。
在六鄰體HVR5環(huán)和尾絲蛋白HI環(huán)中插入這些肽的方法在上述實(shí)施例1和2中就脊髓灰質(zhì)炎病毒的表位已作過(guò)描述。
通過(guò)在HI環(huán)中插入導(dǎo)向αv整聯(lián)蛋白的肽修飾的，具有或不具有縮短尾絲的病毒缺失Ad5尾絲的第538-548位殘基，并用具有GSS接頭側(cè)翼的肽替換。用含有CMVlacZ表達(dá)盒的腺病毒質(zhì)粒主鏈轉(zhuǎn)染PER.C6細(xì)胞；病毒AE60具有生存力并能在PER.C6細(xì)胞中以相應(yīng)于對(duì)照病毒的繁殖力進(jìn)行擴(kuò)增，而PacⅠ消化的pAE59 DNA的反復(fù)轉(zhuǎn)染沒(méi)有產(chǎn)生相應(yīng)的病毒，這暗示該特定構(gòu)建體并不能有效生長(zhǎng)。
表15通過(guò)在HI環(huán)中插入導(dǎo)向αv整聯(lián)蛋白的肽而被修飾的病毒
還可獲得通過(guò)在HI環(huán)中插入導(dǎo)向αv整聯(lián)蛋白的肽而被修飾的、具有縮短尾絲的病毒。
通過(guò)在HVR5環(huán)中插入導(dǎo)向αv整聯(lián)蛋白的肽而被修飾的、具有或不具有縮短尾絲的病毒缺失Ad5六鄰體的第269-281位氨基酸，并用具有GSS接頭側(cè)翼的肽(使用與上表中所述相同的序列)替換。用含有l(wèi)acZ或hGax表達(dá)盒的腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PER.C6或911細(xì)胞，從而獲得所有3種病毒的回收。觀察到293細(xì)胞中AE58和AE63病毒繁殖力的喪失，而AE57表現(xiàn)正常；這可能是由于AE58的六鄰體的非正確折疊/穩(wěn)定性、和AE63縮短的尾絲的Ad受體結(jié)合降低所致。
表16通過(guò)在HVR5環(huán)中插入導(dǎo)向αv整聯(lián)蛋白的肽而被修飾的，具有或不具有縮短尾絲的病毒
六鄰體中包含RGD-2C肽也可與在尾絲的C端添加接頭序列PKRARPGS-K7(SEQ ID NO 132)相結(jié)合。
實(shí)施例6硫酸乙酰肝素蛋白聚糖定向病毒的構(gòu)建通過(guò)在大腸桿菌中采用EDRAG技術(shù)遺傳修飾腺病毒基因組，構(gòu)建含有l(wèi)acZ或Gax表達(dá)盒的尾絲修飾腺病毒，并在911或PER.C6細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)(見(jiàn)實(shí)施例4的材料和方法)。
鑒定預(yù)期可結(jié)合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的三個(gè)配體Wickham等人(1997，病毒學(xué)雜志，71:8221-8229)描述的七賴氨酸鏈(K7)，專(zhuān)利申請(qǐng)WO 95/21931中描述的精氨酸-亮氨酸重復(fù)基序RRLLRRLLRR(SEQ ID NO 133)，以及Digabriele等人(1998，科學(xué)，393:812-817)描述的與肝素KRGPRTHYGQK(SEQ ID NO 134)相結(jié)合的FGF-1的肽片段。
其中，5個(gè)病毒在尾絲的C端具有七賴氨酸K7鏈，并在轉(zhuǎn)基因(lacZ或Gax)和/或連接(無(wú)接頭，(GS)5或PKRARPGS)的特性上不同。包括病毒3497作為參考(Wickham等人，1997，病毒學(xué)雜志，71:8221-8229)。然后根據(jù)體外和體內(nèi)病毒的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，評(píng)價(jià)接頭和/或肽的重要性。
E1區(qū)中插入了異源基因(lacZ)的病毒還在其六鄰體HVR5或尾絲HI環(huán)中包含多聚賴氨酸鏈。
表17硫酸乙酰肝素蛋白聚糖定向病毒
所有這些病毒均可存活并能在E1反式互補(bǔ)細(xì)胞中擴(kuò)增。下表18總結(jié)了在進(jìn)行的一次實(shí)驗(yàn)中以10-100VP/細(xì)胞moi感染PER.C6細(xì)胞后在該細(xì)胞中所獲得的病毒產(chǎn)量。
表18PER.C6細(xì)胞中病毒的擴(kuò)增
這些C端尾絲延伸不同程度地影響繁殖力。整體來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)和其它數(shù)據(jù)均顯示，添加在尾絲C端的連接接頭序列的存在和特性極大地影響著腺病毒的感染周期/行為。
對(duì)于給定的接頭序列，發(fā)現(xiàn)外來(lái)肽本身的特性/性質(zhì)也是一個(gè)重要參數(shù)。例如，含有RRLLRRLLRR肽的構(gòu)建體(AV1.rCMV.lacZ或Ad3663)產(chǎn)生非常低的滴度，而通過(guò)KRGPRTHYGQK肽的替換(AV1.fCMV.lacZ或Ad3662)可恢復(fù)繁殖力。
對(duì)于這些病毒的大多數(shù)而言，還必需優(yōu)化回收程序。例如，按以上所述，總共5.1012VP的Ad3497可通過(guò)兩步層析方法成功地純化，并最終重懸在pH8.4 20mM Tris-10％甘油中，整個(gè)顆?；厥章蔬_(dá)到68％。
實(shí)施例7在HI環(huán)中具有Vn4肽的病毒的構(gòu)建正如實(shí)施例4中提及的，AE43病毒因某些原因表現(xiàn)出某種程度的不穩(wěn)定性，故需要優(yōu)化回收過(guò)程。為拯救其穩(wěn)定性而同時(shí)又不失去其有利的結(jié)合特性，將Vn4肽引入HI環(huán)的各種鄰近的環(huán)境中(見(jiàn)下表19)。按實(shí)施例4所述，通過(guò)在大腸桿菌中重組克隆構(gòu)建相應(yīng)病毒(含有替代E1的lacZ或Gax表達(dá)盒)，并在911或PER.C6細(xì)胞中擴(kuò)增該病毒。
表19在HI環(huán)中具有Vn4肽的病毒
*Vn4+Vn3=人玻連蛋白來(lái)源的RGHSRGRNQNSRRPSRA幾乎所有的構(gòu)建體均表現(xiàn)出與其未修飾對(duì)照病毒可比的繁殖力(見(jiàn)下表20)表20
病毒的穩(wěn)定性也受到這些修飾的不同程度影響。具體地，其中一些病毒(如AE43、GL11、GL14和GL16)對(duì)于連續(xù)凍融循環(huán)敏感，因此為了回收病毒，感染細(xì)胞必需在溫和條件(pH7.5 10mM Tris,1mM MgCl2,1％Tween 20,0.25M NaCl)下進(jìn)行裂解，這再次突出了接頭序列對(duì)病毒行為的影響(也見(jiàn)實(shí)施例9，圖12)。
實(shí)施例8在人原代細(xì)胞中評(píng)價(jià)定向病毒材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)Mader等(1992,J Gerontol.Biol.Sci.47:b32-b36)的方法，從成年雄性Spraggue-Dawley大鼠或成年新西蘭白兔的胸主動(dòng)脈制備大鼠和兔平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。在含有10％胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，于37℃增殖細(xì)胞。人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和HUVEC均購(gòu)自Clonetics，并按廠家說(shuō)明進(jìn)行培養(yǎng)。腺病毒介導(dǎo)的體外基因轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)測(cè)定實(shí)驗(yàn)前1-2天將細(xì)胞接種在24孔或12孔平板上。通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中于37℃與腺病毒載體溫育一小時(shí)，以moi 100或1000(VP/細(xì)胞)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染。然后洗滌細(xì)胞，并加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基48小時(shí)，以允許β-半乳糖苷酶表達(dá)。然后裂解細(xì)胞，并通過(guò)使用發(fā)光β-半乳糖苷酶遺傳報(bào)告系統(tǒng)Ⅱ(Luminescentβ-galactosidase genetic reportersystem Ⅱ)(Clontech)或Xgal染色，測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。
結(jié)果編碼β-半乳糖苷酶報(bào)告基因的構(gòu)建體以下兩個(gè)表21和22中給出的數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)病毒能比對(duì)照病毒更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)hSMC，而且對(duì)于進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究，病毒AE30、AE42、AE43、AE44、AE45、AE57、AE58、AE61、AE62、BC15X和3497均是良好的選擇對(duì)象。在以不同途徑按1000VP/細(xì)胞的moi感染的原代SMC上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)于幾種修飾病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)有極為顯著的增加(例子提供在表21和22中)。感染后48小時(shí)制備提取物，并定量此時(shí)蛋白質(zhì)和β-半乳糖苷酶的活性。然后通過(guò)比較lacZ比活性(RLU/蛋白質(zhì)提取物)的水平評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
表21實(shí)驗(yàn)#1
表22實(shí)驗(yàn)#2
下表23總結(jié)了在不同物種的SMC中獲得的數(shù)據(jù)大多數(shù)病毒能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)非人類(lèi)細(xì)胞，說(shuō)明在其進(jìn)入途徑中沒(méi)有種間障礙。
表23不同物種的SMC的感染
n=實(shí)驗(yàn)次數(shù)為證明在衣殼修飾后觀察到的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加的原因至少部分是感染性的增加，從以1000VP/細(xì)胞的moi感染的人SMC提取病毒DNA，對(duì)其進(jìn)行定量PCR。同時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行RLU測(cè)量。
表24表明，在所有的情況下(盡管程度不同)，人平滑肌細(xì)胞中表征最佳候選病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增加均與DNA進(jìn)入的增加相關(guān)。這種相關(guān)性對(duì)于病毒AE43和BC15X尤其明顯。
表24基因組遞送和轉(zhuǎn)基因表達(dá)
a基因組/細(xì)胞是通過(guò)PCR定量的病毒基因組量與感染細(xì)胞數(shù)之比。
bRLU的比所示病毒的RLU水平與對(duì)照病毒的RLU水平之比。
c基因組的比所示病毒基因組的量與對(duì)照病毒基因組的量之比。
正如圖4和5所示，通過(guò)用可溶性肝素或可溶性u(píng)PAR競(jìng)爭(zhēng)還分析了SMC中的進(jìn)入途徑。
圖4中，在存在遞增劑量的可溶性肝素時(shí)，以1000(VP/細(xì)胞)的moi感染hSMC。細(xì)胞在PBS中洗滌后再次于37℃溫育。感染后48小時(shí)制備提取物，對(duì)此時(shí)的總蛋白質(zhì)和β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行定量。該數(shù)據(jù)顯示，含有多聚賴氨酸的病毒對(duì)hSMC的感染可被可溶性肝素特異地抑制，說(shuō)明這些病毒可能結(jié)合細(xì)胞表面的細(xì)胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。相反，正如預(yù)期的一樣，AE43并不使用這種特定進(jìn)入途徑。
圖5中，病毒與遞增劑量的可溶性u(píng)PAR(0-9.4μg/ml)進(jìn)行預(yù)溫育，之后按1000(VP/細(xì)胞)moi溫育hSMC。細(xì)胞在PBS中洗滌后再次于37℃溫育。感染后48小時(shí)制備提取物，對(duì)此時(shí)的總蛋白質(zhì)和β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)顯示，一些uPAR導(dǎo)向病毒(例如AE43)對(duì)hSMC的感染可被重組可溶性u(píng)PAR特異地抑制。hSMC在其細(xì)胞表面表達(dá)uPAR(數(shù)據(jù)未顯示)這一事實(shí)強(qiáng)烈地暗示了該特定受體在病毒進(jìn)入細(xì)胞中的作用。編碼定向腺病毒的Gax通過(guò)Western印跡分析感染的hSMC中Gax的表達(dá)水平(下圖)。在用病毒3528(在尾絲C端有K7序列)感染后，獲得Gax表達(dá)的最大增加。以3000VP/細(xì)胞moi使用所有修飾病毒均在感染細(xì)胞中檢測(cè)到Gax蛋白，而以相同moi使用對(duì)照病毒卻未能檢測(cè)到Gax的表達(dá)。
圖6顯示了定向腺病毒感染的人SMC中Gax的表達(dá)。在以所示的moi(VP/細(xì)胞)進(jìn)行感染后24小時(shí)，制備蛋白提取物。(1)3×104moi的AV1.0CMVrGax,(2)104moi的AV1.0CMVrGax,(3)104moi的3528,(4)3×103moi的3528,(5)300 moi的3528,(6)3×103moi的3569,(7)300moi的3569,(8)104moi的3570和(9)3×103moi的3570。
圖7顯示用定向腺病毒感染人SMC后Gax的表達(dá)。在以所示的moi(VP/細(xì)胞)進(jìn)行感染后24小時(shí)，制備蛋白提取物。
左邊組(1)3×104moi的AV1.0CMVrGax,(2)3×104moi的AV1.0CMVhGax,(3)3×103moi的AV1.0CMVhGax,(4)3000moi的3528,(5)300moi的3528,(6)30moi的3528,(7)3000moi的3569,(8)300moi的3569和(9)30moi的3569。
右邊組(1)3×104moi的AV1.0CMVrGax,(2)3×104moi的AV1.0CMVhGax,(3)3×103moi的AV1.0CMVhGax,(4)3000moi的3570,(5)300moi的3570,(6)30moi的3570,(7)3000moi的3629,(8)300moi的3629和(9)30moi的3629。
在以不同moi感染hSMC后，進(jìn)一步通過(guò)FACS分析驗(yàn)證了Gax表達(dá)。正如下表25所闡明的，即使該技術(shù)的靈敏性高于Western印跡，結(jié)果還是與Western實(shí)驗(yàn)相關(guān)，并顯示了病毒3528和3569比3570和3629具有相對(duì)高的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)hSMC的能力。
表25人SMC感染后Gax表達(dá)的FACS分析(Gax表達(dá)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是在感染后24小時(shí)測(cè)定的)
實(shí)施例9定向病毒在人腫瘤細(xì)胞中的體外評(píng)價(jià)Hs578T細(xì)胞(人乳房瘤細(xì)胞)對(duì)Ad5感染十分耐受，很可能因?yàn)樗鼈冊(cè)谄浼?xì)胞表面上表達(dá)的病毒受體量有限。實(shí)際上，感染50％的細(xì)胞必需高達(dá)105VP/細(xì)胞的moi。對(duì)該細(xì)胞被一組衣殼修飾載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力進(jìn)行了試驗(yàn)。
圖8A、8B、8C和9說(shuō)明不同定向病毒對(duì)Hs578T的感染。在感染后48小時(shí)制備細(xì)胞提取物。數(shù)據(jù)顯示AE43、AE44、AE45或3497對(duì)該細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)導(dǎo)非常有效。
通過(guò)可溶性尾絲頭部或可溶性u(píng)PAR競(jìng)爭(zhēng)來(lái)分析AE43感染的途徑(圖10和11)。在圖10中，在Hs578T感染前用可溶性u(píng)PAR預(yù)先溫育AE43。感染后48小時(shí)制備細(xì)胞提取物。
在圖11中，在Hs578T感染前用可溶性u(píng)PAR(10μg/2×108VP)或可溶性頭部(100μg/ml)預(yù)先溫育AE43。感染后48小時(shí)制備細(xì)胞提取物。
結(jié)果表明，AE43沒(méi)有通過(guò)經(jīng)典的頭部-CAR途徑進(jìn)入細(xì)胞，而是使用uPAR依賴性途徑進(jìn)入細(xì)胞。
最后，比較含有Vn4的病毒3630、GL12、GL14或GL17和AE43轉(zhuǎn)導(dǎo)Hs578T細(xì)胞的能力。如圖12所示，在感染后48小時(shí)，連接接頭的性質(zhì)的確能夠極大地影響插入HI環(huán)中的結(jié)合肽與其在細(xì)胞表面上的特異受體相互作用的效率。
實(shí)施例10定向病毒在鼠腫瘤細(xì)胞中的體外評(píng)價(jià)鼠NIH-3T3細(xì)胞對(duì)Ad5感染十分耐受，因?yàn)楦腥?0％的細(xì)胞必需105VP/細(xì)胞。對(duì)該細(xì)胞被一組衣殼修飾載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力進(jìn)行了試驗(yàn)。在感染后48小時(shí)制備細(xì)胞提取物。圖13包括代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，它說(shuō)明AE28、AE43、AE44、AE58、AE57或AE62特別有效。
而且，重要的是，AE63(短尾絲，六鄰體中為RGD-2C)顯示能部分拯救與其短軸對(duì)照病毒(vBS1；在六鄰體中無(wú)插入)相關(guān)的缺陷。因此，削弱天然進(jìn)入途徑的衣殼修飾(如顯示短軸的尾絲)可與提供其它不依賴CAR的感染途徑的衣殼修飾相結(jié)合。
通過(guò)可溶性u(píng)PAR競(jìng)爭(zhēng)來(lái)分析AE43和BC15X的感染途徑(圖14A和14B)。在圖14A和14B中，病毒BC15X(A)和AE43(B)在與細(xì)胞溫育前與遞增劑量的可溶性u(píng)PAR預(yù)先溫育(moi分別為1000和200VP/細(xì)胞)。然后洗滌細(xì)胞，并再在37℃溫育48小時(shí)，之后制備細(xì)胞提取物。
實(shí)施例11定向病毒在再狹窄兔模型中的體內(nèi)評(píng)價(jià)在動(dòng)脈粥樣化雙重?fù)p傷兔模型中進(jìn)行一些導(dǎo)向病毒的體內(nèi)評(píng)價(jià)，該模型是一個(gè)良好的再狹窄模型轉(zhuǎn)移在動(dòng)脈粥樣化的髂動(dòng)脈中發(fā)生；每天給兔子飼喂120g含1％膽固醇的食物，在第3周用直徑2.5mm的Nycomed氣囊導(dǎo)管進(jìn)行首次氣脹血管成形術(shù)(balloon angioplasty)損傷。1周以后，進(jìn)行腺病毒基因轉(zhuǎn)移。
采用檢測(cè)β-半乳糖苷酶的SMC染色顯微定量，確定基因轉(zhuǎn)移的效率(組織化學(xué)分析)。簡(jiǎn)而言之，檢查32個(gè)切片/動(dòng)脈，并對(duì)X-Gal陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表示為一個(gè)動(dòng)脈32個(gè)切片中的最高得分。結(jié)果見(jiàn)下表26。
表26定向病毒在再狹窄兔模型中的體內(nèi)評(píng)價(jià)
這些數(shù)據(jù)表明，與未修飾的對(duì)照相比，腺病毒AE43和BC15X轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)脈壁的效率顯著增加。
本文中所描述的具體實(shí)施方案并不限制本發(fā)明的范圍。的確，根據(jù)以上的描述和附圖，本文描述之外的本發(fā)明各種修改將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了。這些修改均包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
還應(yīng)理解，本文給出的各種核酸或多肽的所有堿基大小或氨基酸大小和所有分子量值均是大致的，提供用于說(shuō)明。
本文引用的各種出版物的公開(kāi)均以參考文獻(xiàn)完整地并入本文。
序列表<110>RHONE-POULENC RORER S.A.<120>遞送異源基因的定向腺病毒載體<130>定向腺病毒<140><141><150>US SN 60 09828<151>1998-08-27<160>150<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>1Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His1 5 10 15Trp Cys Asn<210>2<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>2Leu Asn Gly Gly Thr Ala Vel Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His1 5 10 15Trp Cys Asn<210>3<211>16<212>PRT<213>腺病毒<400>3Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Thr1 5 10 15<210>4<211>17<212>PRT<213>腺病毒<400>4Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Tyr1 5 10 15Thr<210>5<211>12<212>PRT<213>腺病毒<400>5Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>腺病毒<400>6Asn Gln Asn Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala1 5 10<210>7<211>23<212>PRT<213>腺病毒<400>7Gly Ser Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn1 5 10 15Ile His Trp Cys Asn Gly Ser20<210>8<211>23<212>PRT<213>腺病毒<400>8Gly Ser Leu Asn Gly Gly Thr Ala Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn1 5 10 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Phe Ser1 5 10 15Asn Ile His Trp Cys Asn Gly Ser Ser20 25<210>18<211>22<212>PRT<213>腺病毒<400>18Gly Ser Ser Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr1 5 10 15Leu Trp Thr Gly Ser Ser20<210>19<211>23<212>PRT<213>腺病毒<400>19Gly Ser Ser Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr1 5 10 15Leu Trp Tyr Thr Gly Ser Ser20<210>20<211>18<212>PRT<213>腺病毒<400>20Gly Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Gly1 5 10 15Ser Ser<210>21<211>16<212>pRT<213>腺病毒<400>21Gly Ser Ser Asn Gln Asn Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala Gly Ser Ser1 5 10 15<210>22<211>15<212>PRT<213>腺病毒<400>22Gly Ser Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Ser Ser1 5 10 15<210>23<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>23Gly Ser Ser Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Gly Ser Ser1 5 10<210>24<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>24Gly Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Ser Ser1 5 10<210>25<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>25Thr Thr Glu Ala Ala Ala Gly Asn Gly Asp Asn Leu Thr1 5 10<210>26<211>20<212>DNA<213>腺病毒<400>26atgggatgaa gctgctactg 20<210>27<211>26<212>DNA<213>腺病毒<400>27tcgcgagaaa aattgcattt ccactt 26<210>28<211>20<212>DNA<213>腺病毒<400>28cctaaggtgg tattgtacag 20<210>29<211>20<212>DNA<213>腺病毒<400>29agcagtaatt tggaagttca 20<210>30<211>44<212>DNA<213>腺病毒<400>30aatactacct ctttgaacga ccggcaaggc aatgctacta aacc 44<210>31<211>47<212>DNA<213>腺病毒<400>31ttaggtttag tagcattgcc ttgccggtcg ttcaaagagg tagtatt47<210>32<211>56<212>DNA<213>腺病毒<400>32aatctagact ctttggaaca acctactact cgcgctcaaa aaccacgtct agattt 56<210>33<211>60<212>DNA<213>腺病毒<400>33gtacaaatct agacgtggtt tttgagcgcg agtagtaggt tgttccaaag agtctagatt60<210>34<211>20<212>DNA<213>腺病毒<400>34tcaaccacta taaacattcc 20<210>35<211>23<212>DNA<213>腺病毒<400>35ttaggaatgt ttatagtggt tga 23<210>36<211>53<212>DNA<213>腺病毒<400>36actcctggcg caaatcctcc agcaggcggt agtggaaacg aagaatacaa acc53<210>37<211>56<212>DNA<213>腺病毒<400>37ttaggtttgt attcttcgtt tccactaccg cctgctggag gatttgcgcc aggagt 56<210>38<211>38<212>DNA<213>腺病毒<400>38gataacccag cgtcgaccac gaataaggat aagctacc 38<210>39<211>41<212>DNA<213>腺病毒<400>39ttaggtagct tatccttatt cgtggtcgac gctgggttat c 41<210>40<211>38<212>DNA<213>腺病毒<400>40ggagataacc cagcgtcgac cacgaataag gataagcc 38<210>41<211>41<212>DNA<213>腺病毒<400>41ttaggcttat ccttattcgt ggtcgacgct gggttatctc c 41<210>42<211>38<212>DNA<213>腺病毒<400>42tctgataacc cagcgtcgac cacgaataag gataagcc 38<210>43<211>41<212>DNA<213>腺病毒<400>43ttaggcttat ccttattcgt ggtcgacgct gggttatcag a 41<210>44<211>41<212>DNA<213>腺病毒<400>44ggatctgata acccagcgtc gaccacgaat aaggataagc c 41<210>45<211>44<212>DNA<213>腺病毒<400>45ttaggcttat ccttattcgt ggtcgacgct gggttatcag atcc 44<210>46<211>47<212>DNA<213>腺病毒<400>46ggagataacc cagcgtcgac cacgaataag gataagctag gtggccc 47<210>47<211>50<212>DNA<213>腺病毒<400>47ttagggccac ctagcttatc cttattcgtg gtcgacgctg ggttatctcc50<210>48<211>47<212>DNA<213>腺病毒<400>48ggagataacc cagcgtcgac cacgaataag gataagctag gttctcc 47<210>49<211>50<212>DNA<213>腺病毒<400>49ttaggagaac ctagcttatc cttattcgtg gtcgacgctg ggttatctcc 50<210>50<211>44<212>DNA<213>腺病毒<400>50ggagataacc cagcgtcgac cacgaataag gataagctat ctcc 44<210>51<211>47<212>DNA<213>腺病毒<400>51ttaggagata gcttatcctt attcgtggtc gacgctgggt tatctcc 47<210>52<211>47<212>DNA<213>腺病毒<400>52ggagataacc cagcgtcgac cacgaataag gataagctat ctggtcc 47<210>53<211>50<212>DNA<213>腺病毒<400>53ttaggaccag atagcttatc cttattcgtg gtcgacgctg ggttatctcc 50<210>54<211>47<212>DNA<213>腺病毒<400>54ggagataacc cagcgtcgac cacgaataag gataagctat ctagtcc 47<210>55<211>50<212>DNA<213>腺病毒<400>55ttaggactag atagcttatc cttattcgtg gtcgacgctg ggttatctcc 50<210>56<211>14<212>PRT<213>腺病毒<400>56Asn Thr Thr Ser Leu Asn Asp Arg Gln Gly Asn Ala Thr Lys1 5 10<210>57<211>6<212>PRT<213>腺病毒<400>57Ser Thr Thr Ile Asn Ile1 5<210>58<211>17<212>PRT<213>腺病毒<400>58Thr Pro Gly Ala Asn Pro Pro Ala Gly Gly Ser Gly Asn Glu Glu Tyr1 5 10 15Lys<210>59<211>17<212>PRT<213>腺病毒<400>59Thr Thr Glu Ala Thr Ala Gly Asn Gly Asp Asn Leu Thr Pro Lys Val1 5 10 15Val<210>60<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>60Thr Thr Glu Ala Thr Ala Gly Asn Gly Asp Asn Leu Thr1 5 10<210>61<211>18<212>PRT<213>腺病毒<400>61Asn Leu Asp Ser Leu Glu Gln Pro Thr Thr Arg Ala Gln Lys Pro Arg1 5 10 15Leu Asp<210>62<211>11<212>PRT<213>腺病毒<400>62Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys1 5 10<210>63<211>12<212>PRT<213>腺病毒<400>63Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu1 5 10<210>64<211>12<212>PRT<213>腺病毒<400>64Gly Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys1 5 10<210>65<211>12<212>PRT<213>腺病毒<400>65Ser Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys1 5 10<210>66<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>66Gly Ser Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys1 5 10<210>67<211>15<212>PRT<213>腺病毒<400>67Gly Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Gly Gly1 5 10 15<210>68<211>15<212>PRT<213>腺病毒<400>68Gly Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Gly Ser1 5 10 15<210>69<211>14<212>PRT<213>腺病毒<400>69Gly Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Ser1 5 10<210>70<211>15<212>PRT<213>腺病毒<400>70Gly Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Ser Gly1 5 10 15<210>71<211>15<212>PRT<213>腺病毒<400>71Gly Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Ser Ser1 5 10 15<210>72<211>11<212>PRT<213>腺病毒<400>72Gly Thr Gln Glu Thr Gly Asp Thr Thr Pro Ser1 5 10<210>73<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>73cagctccatc tcctaactgt agactaaatg30<210>74<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>74ggttaccggt ttagttttgt ctccgtttaa30<210>75<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>75agcgcttact ctatgtcatt ttcatgggac30<210>76<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>76gagtttatta atatcactga tgagcgtttg30<210>77<211>57<212>DNA<213>腺病毒<400>77gtaacactaa ccattacact aaacggtacc caggaaacag gagacacaac tccaagt 57<210>78<211>52<212>DNA<213>腺病毒<400>78acttggagtt gtgtctcctg tttcctgggt accgtttagt gtaatggtta gt 52<210>79<211>60<212>DNA<213>腺病毒<400>79gtaacactaa ccattacact aaacggtacc agtgaatcca cagaaactag cgaggtaagc 60<210>80<211>55<212>DNA<213>腺病毒<400>80gcttacctcg ctagtttctg tggattcact ggtaccgttt agtgtaatgg ttagt 55<210>81<211>42<212>DNA<213>腺病毒<400>81gtaacactaa ccattacact aaaccaagaa acacaatgtg 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64<210>91<211>69<212>DNA<213>腺病毒<400>91gtaaccctaa ccattacact aaacggtgat aacccagcgt cgaccacgaa taaggataag 60tcatctagc 69<210>92<211>64<212>DNA<213>腺病毒<400>92gctagatgac ttatccttat tcgtggtcga cgctgggtta tcaccgttta gtgtaatggt 60tagg 64<210>93<211>69<212>DNA<213>腺病毒<400>93gtaaccctaa ccattacact aaacggtgat aacccagcgt cgaccacgaa taaggataag 60ggatccagc 69<210>94<211>64<212>DNA<213>腺病毒<400>94gctggatccc ttatccttat tcgtggtcga cgctgggtta tcaccgttta gtgtaatggt 60tagg 64<210>95<211>69<212>DNA<213>腺病毒<400>95gtaaccctaa ccattacact aaacggtgat aacccagcgt cgaccacgaa taaggataag 60tcaggaagc 69<210>96<211>64<212>DNA<213>腺病毒<400>96gcttcctgac ttatccttat tcgtggtcga cgctgggtta tcaccgttta gtgtaatggt 60tagg 64<210>97<211>60<212>DNA<213>腺病毒<400>97gtaaccctaa ccattacact aaacggtgat aacccagcgt cgaccacgaa taaggataag 60<210>98<211>55<212>DNA<213>腺病毒<400>98cttatcctta ttcgtggtcg acgctgggtt atcaccgttt agtgtaatgg ttagg 55<210>99<211>12<212>PRT<213>腺病毒<400>99Gly Thr Ser Glu Ser Thr Glu Thr Ser Glu Val Ser1 5 10<210>100<211>11<212>PRT<213>腺病毒<400>100Gly Thr Gln Glu Thr Gly Asp Thr Thr Pro Ser1 5 10<210>101<211>6<212>PRT<213>腺病毒<400>101Gln Glu Thr Gln Cys Glu1 5<210>102<211>12<212>PRT<213>腺病毒<400>102Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Ser1 5 10<210>103<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>103Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Gly Ser1 5 10<210>104<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>104Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Ser Ser1 5 10<210>105<211>14<212>PRT<213>腺病毒<400>105Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Gly Gly Ser1 5 10<210>106<211>14<212>PRT<213>腺病毒<400>106Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Ser Ser Ser1 5 10<210>107<211>14<212>PRT<213>腺病毒<400>107Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Gly Ser Ser1 5 10<210>108<211>14<212>PRT<213>腺病毒<400>108Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Ser Gly Ser1 5 10<210>109<211>11<212>PRT<213>腺病毒<400>109Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys1 5 10<210>110<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>110atttctgtcg actttattca gcagcacctc 30<210>111<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>111gtttgacttg gtttttttga gaggtgggct 30<210>112<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>112ttggatatta actacaacaa aggcctttac 30<210>113<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>113gaaactggag ctcgtatttg actgccacat 30<210>114<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>114atttctgtcg actttattca gcagcacctc 30<210>115<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>115gtttgacttg gtttttttga gaggtgggct 30<210>116<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>116ctcaaaacaa aaattggcca tggcctagaa 30<210>117<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>117atccaagagc tcttgtatag gctgtgcctt 30<210>118<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>118tacaagtcga caaccaagcg tcagaaattg 30<210>119<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>119aagacttaaa accccagggg gactctcttg 30<210>120<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>120gagagtcccc ctggggtttt aagtcttaaa30<210>121<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>121ggtccacaaa gtgttattttt cagtgcaat30<210>122<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>122ctgaaaaata acactttgtg gaccacacca30<210>123<211>30<212>DNA<213>腺病毒<400>123tcctgagctc cgtttagtgt 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Lys Gly Ser1 5<210>136<211>13<212>PRT<213>腺病毒<400>136Gly Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Ser Ser1 5 10<210>137<211>17<212>PRT<213>腺病毒<400>137Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys1 5 10 15Lys<210>138<211>15<212>PRT<213>腺病毒<400>138Pro Lys Arg Ala Arg Pro Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys1 5 10 15<210>139<211>8<212>PRT<213>腺病毒<400>139Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys1 5<210>140<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>140Pro Lys Arg Ala Arg Pro Gly Ser Lys Arg Gly pro Arg Thr His Tyr1 5 10 15Gly Gln Lys<210>141<211>18<212>PRT<213>腺病毒<400>141Pro Lys Arg Ala Arg Pro Gly Ser Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu1 5 10 15Arg Arg<210>142<211>17<212>PRT<213>腺病毒<400>142Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Gly Ser1 5 10 15Ser<210>143<211>23<212>PRT<213>腺病毒<400>143Gly Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Arg1 5 10 15Pro Ser Arg Ala Gly Ser Ser20<210>144<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>144Gly Thr Ser Glu Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1 5 10 15Gly Ser Ser<210>145<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>145Gly Thr Gln Glu Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1 5 10 15Gly Ser Ser<210>146<211>19<212>PRT<213>腺病毒<400>146Gly Ser Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg1 5 10 15Gly Ser Ser<210>147<211>18<212>PRT<213>腺病毒<400>147Gly Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Gly1 5 10 15Gly Ser<210>148<211>7<212>PRT<213>腺病毒<400>148Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe1 5<210>149<211>8<212>PRT<213>腺病毒<400>149Pro Lys Arg Ala Arg Pro Gly Ser1 5<210>150<211>16<212>PRT<213>腺病毒<400>150Ser Ser Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Gly Ser1 5 10 1權(quán)利要求
1．至少一部分六鄰體HRV5環(huán)被結(jié)合肽或?qū)蛐蛄刑娲?，兩?cè)為連接氨基酸間隔，使得可在衣殼表面功能性地表現(xiàn)其結(jié)合特異性的腺病毒。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的腺病毒，其包含六鄰體HVR5環(huán)約6-17個(gè)氨基酸的缺失。
3．根據(jù)權(quán)利要求1和2之一的腺病毒，其包含的六鄰體HVR5環(huán)缺失不超過(guò)14個(gè)氨基酸。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的腺病毒，其包含相應(yīng)于腺病毒血清型5(Ad5)約第269位氨基酸殘基至約第281位氨基酸殘基的六鄰體HVR5環(huán)約13個(gè)氨基酸的缺失。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的腺病毒，其中所述間隔包含選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的腺病毒，其中間隔包含選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的腺病毒，其中在至少一個(gè)間隔中第一個(gè)氨基酸是一個(gè)選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的腺病毒，其中在所述間隔中第一個(gè)氨基酸是一個(gè)選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的腺病毒，其中在至少一個(gè)間隔中第一個(gè)氨基酸是甘氨酸殘基。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的腺病毒，其中在所述間隔中第一個(gè)氨基酸是甘氨酸殘基。
11．根據(jù)權(quán)利要求1-10之一的腺病毒，其中至少一個(gè)間隔是二肽。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-11之一的腺病毒，其中至少一個(gè)間隔是二肽Gly-Ser。
13．根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列是尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的配體表位。
14．根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列選自LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
15．根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的腺病毒，其中包括間隔的導(dǎo)向序列選自A．gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:7)；B．gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:8)；C．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser(SEQ ID NO:9)；D．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser(SEQ ID NO:10)；E．gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:11)；F．gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:12)；G．gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser(SEQ ID NO:13)；H．gly-ser-DCRGDCF-gly-ser(SEQ ID NO:14)；和I．gly-ser-KKKKKKK-gly-ser(SEQ ID NO:15)。
16．根據(jù)權(quán)利要求1-15之一的腺病毒，其來(lái)自人腺病毒血清型。
17．根據(jù)權(quán)利要求1-16之一的腺病毒，其來(lái)自人腺病毒C亞型。
18．根據(jù)權(quán)利要求1-17之一的腺病毒，其來(lái)自人腺病毒血清型5。
19．根據(jù)權(quán)利要求1-18之一的腺病毒，其中尾絲蛋白被修飾成具有比野生型尾絲軸短的尾絲軸。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的重組腺病毒，其中尾絲軸通過(guò)符合讀框的缺失來(lái)縮短。
21．根據(jù)權(quán)利要求19的重組腺病毒，其中尾絲軸通過(guò)用另一種血清型的軸替代它來(lái)縮短。
22．根據(jù)權(quán)利要求19的重組腺病毒，其中尾絲軸來(lái)自人C亞型(Ad2或Ad5)，并通過(guò)用血清型3(Ad3)的軸替代它來(lái)縮短。
23．根據(jù)權(quán)利要求1-22之一的重組腺病毒，其中尾絲軸含有Ad5的第1-3和17-22個(gè)重復(fù)；Ad5的第1-3和20-22個(gè)重復(fù)；或腺病毒血清型3(Ad3)的軸。
24．至少一部分六鄰體HI環(huán)被結(jié)合肽或?qū)蛐蛄刑娲覂蓚?cè)為連接氨基酸間隔，使得可在衣殼表面功能性地表現(xiàn)其結(jié)合特異性的腺病毒。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的腺病毒，其包含六鄰體HI環(huán)約6-17個(gè)氨基酸的缺失。
26．根據(jù)權(quán)利要求24和25之一的腺病毒，其包含的六鄰體HI環(huán)缺失不超過(guò)11個(gè)氨基酸。
27．根據(jù)權(quán)利要求24-26之一的腺病毒，其包含相應(yīng)于腺病毒血清型5(Ad5)約第538位氨基酸殘基至約第548位氨基酸殘基的六鄰體HI環(huán)約11個(gè)氨基酸的缺失。
28．根據(jù)權(quán)利要求24-27之一的腺病毒，其中所述間隔包含一個(gè)選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
29．根據(jù)權(quán)利要求24-28之一的腺病毒，其中所述間隔包含一個(gè)選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸。
30．根據(jù)權(quán)利要求24-29之一的腺病毒，其中在至少一個(gè)間隔中第一個(gè)氨基酸是一個(gè)選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
31．根據(jù)權(quán)利要求24-30之一的腺病毒，其中在所述間隔中第一個(gè)氨基酸是一個(gè)選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
32．根據(jù)權(quán)利要求24-31之一的腺病毒，其中在至少一個(gè)間隔中第一個(gè)氨基酸是甘氨酸殘基。
33．根據(jù)權(quán)利要求24-32之一的腺病毒，其中在所述間隔中第一個(gè)氨基酸是甘氨酸殘基。
34．根據(jù)權(quán)利要求24-32之一的腺病毒，其中至少一個(gè)間隔是三肽。
35．根據(jù)權(quán)利要求24-32之一的腺病毒，其中至少一個(gè)間隔是三肽Gly-Ser-Ser。
36．根據(jù)權(quán)利要求24-32之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列是尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的配體表位。
37．根據(jù)權(quán)利要求24-32之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列選自LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
38．根據(jù)權(quán)利要求24-32之一的腺病毒，其中包括間隔的導(dǎo)向序列選自A．gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:16)；B．gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:17)；C．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:18)；D．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:19)；E．gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser(SEQ ID NO:20)；F．gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser(SEQ ID NO:21)；G．gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser(SEQ ID NO:22)；H．gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser(SEQ ID NO:23)；I．gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser(SEQ ID NO:24)；J．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:143)；K．tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:144)；L．tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:145)；M．ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:146)；N．ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly(SEQ ID NO:147)。
39．根據(jù)權(quán)利要求24-38之一的腺病毒，其來(lái)自人腺病毒血清型。
40．根據(jù)權(quán)利要求24-39之一的腺病毒，其來(lái)自人腺病毒C亞型。
41．根據(jù)權(quán)利要求24-40之一的腺病毒，其來(lái)自人腺病毒血清型5。
42．根據(jù)權(quán)利要求24-41之一的腺病毒，其中尾絲蛋白被修飾成具有比野生型尾絲軸短的尾絲軸。
43．根據(jù)權(quán)利要求42的重組腺病毒，其中尾絲軸通過(guò)符合讀框的缺失來(lái)縮短。
44．根據(jù)權(quán)利要求42的重組腺病毒，其中尾絲軸通過(guò)用另一種血清型的軸替代它來(lái)縮短。
45．根據(jù)權(quán)利要求42的重組腺病毒，其中尾絲軸來(lái)自人C亞型(Ad2或Ad5)，并通過(guò)用血清型3(Ad3)的軸替代它來(lái)縮短。
46．根據(jù)權(quán)利要求24-45之一的重組腺病毒，其中尾絲軸含有Ad5的第1-3和17-22個(gè)重復(fù)；Ad5的第1-3和20-22個(gè)重復(fù)；或腺病毒血清型3(Ad3)的軸。
47．一種重組腺病毒載體，其中結(jié)合肽或?qū)蛐蛄型ㄟ^(guò)一個(gè)連接間隔或接頭與尾絲的C端連接，使得可在衣殼表面功能性地表現(xiàn)其結(jié)合特異性。
48．根據(jù)權(quán)利要求47的重組腺病毒，其中結(jié)合間隔包含選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸和脯氨酸的氨基酸。
49．根據(jù)權(quán)利要求47和48之一的重組腺病毒，其中間隔中的第一個(gè)氨基酸是脯氨酸。
50．根據(jù)權(quán)利要求47-49之一的重組腺病毒，其來(lái)自人腺病毒血清型。
51．根據(jù)權(quán)利要求50的重組腺病毒，其來(lái)自人腺病毒C亞型。
52．根據(jù)權(quán)利要求50的重組腺病毒，其來(lái)自人腺病毒血清型5。
53．根據(jù)權(quán)利要求47-52之一的腺病毒，其中尾絲蛋白被修飾成具有比野生型尾絲軸短的尾絲軸。
54．根據(jù)權(quán)利要求53的重組腺病毒，其中尾絲軸通過(guò)符合讀框的缺失來(lái)縮短。
55．根據(jù)權(quán)利要求53的重組腺病毒，其中尾絲軸通過(guò)用另一種血清型的軸替代它來(lái)縮短。
56．根據(jù)權(quán)利要求47-54之一的重組腺病毒，其中其尾絲軸來(lái)自C亞型，并含有包括第4-16或4-19個(gè)重復(fù)的符合讀框的缺失。
57．根據(jù)權(quán)利要求47-53之一的重組腺病毒，其中其尾絲軸來(lái)自C亞型，并通過(guò)用血清型3(Ad3)的軸替代它來(lái)縮短。
58．根據(jù)權(quán)利要求47-57之一的腺病毒，其包含含有5-30個(gè)氨基酸的間隔或接頭肽。
59．根據(jù)權(quán)利要求47-58之一的腺病毒，其中間隔或接頭肽包含序列PKRARPGS(SEQ ID NO:149)。
60．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列是尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的配體表位。
61．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列是FGF-1的結(jié)合肝素的肽片段，其包含7-15個(gè)氨基酸。
62．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列是由5-10個(gè)賴氨酸殘基組成。
63．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列是由差不多7個(gè)賴氨酸殘基組成。
64．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列是由5-10個(gè)Arg-Arg和Leu-Leu基序組成。
65．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中導(dǎo)向序列選自LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)；RRLLRRLLRR(SEQ IDNO:133)；和KRGPRTHYGQK(SEQID NO:134)。
66．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中包含接頭肽的導(dǎo)向序列含有序列PKRARPGSKKKKKKK(SEQ ID NO:132)。
67．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中包含接頭肽的導(dǎo)向序列含有序列PKRARPGSRRLLRRLLRR(SEQ ID NO:141)。
68．根據(jù)權(quán)利要求47-59之一的腺病毒，其中包含接頭肽的導(dǎo)向序列含有序列PKRARPGSKRGPRTHYGQK(SEQ ID NO:140)。
69．修飾腺病毒載體的細(xì)胞趨性的方法，包括A．從該腺病毒的衣殼蛋白的一個(gè)位點(diǎn)缺失天然氨基酸序列；和B．插入通過(guò)導(dǎo)向肽序列N端的第一間隔和C端的第二間隔連接的導(dǎo)向肽序列；而且，其中導(dǎo)向肽在選自如下序列的缺失位點(diǎn)插入與腺病毒Ad5約第269位氨基酸殘基至約第281位氨基酸殘基相應(yīng)的六鄰體HVR5環(huán)約13個(gè)氨基酸；和與腺病毒Ad5約第538位氨基酸殘基至約第548位氨基酸殘基相應(yīng)的尾絲蛋白HI環(huán)約11個(gè)氨基酸。
70．根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中第一間隔包含選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸。
71．根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中第二間隔包含選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸。
72．根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中導(dǎo)向序列是尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的配體表位。
73．根據(jù)權(quán)利要求72的方法，其中導(dǎo)向序列選自LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:1)；LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(SEQ ID NO:2)；AEPMPHSLNFSQYLWT(SEQ ID NO:3)；AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:4)；RGHSRGRNQNSR(SEQ ID NO:5)；和NQNSRRPSRA(SEQ ID NO:6)。
74．根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中包括間隔的導(dǎo)向序列插入至HVR5環(huán)中，并選自如下序列A．gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:7)；B．gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser(SEQ ID NO:8)；C．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser(SEQ ID NO:9)；D．gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser(SEQ ID NO:10)；E．gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:11)；F．gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:12)；G．gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser(SEQ ID NO:13)；H．gly-ser-DCRGDCF-gly-ser(SEQ ID NO:14)；和I．gly-ser-KKKKKKK-gly-ser(SEQ ID NO:15)。
75．根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中包括間隔的導(dǎo)向序列插入至尾絲蛋白HI環(huán)中，并選自如下序列A．gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:16)；B．gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser(SEQ ID NO:17)；C．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:18)；D．gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser(SEQ ID NO:19)；E．gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser(SEQ ID NO:20)；F．gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser(SEQ ID NO:21)；G．gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser(SEQ ID NO:22)；H．gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser(SEQ ID NO:23)；I．gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser(SEQ ID NO:24)；J．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser(SEQ ID NO:143)；K．tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:144)；L．tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:145)；M．ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser(SEQ ID NO:146)；N．ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-gly(SEQ ID NO:147)。
76．根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其還包括縮短尾絲蛋白軸。
77．根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中尾絲軸包含Ad5的第1-3和17-22個(gè)重復(fù)；Ad5的第1-3和20-22個(gè)重復(fù)；或一個(gè)Ad3軸。
78．包含與腺病毒血清型5(Ad5)約第269位氨基酸殘基至約第281位氨基酸殘基相應(yīng)的HVRS環(huán)約13個(gè)氨基酸缺失、并在缺失位點(diǎn)包含導(dǎo)向肽序列插入的腺病毒六鄰體，其中，導(dǎo)向肽序列在N端通過(guò)第一間隔連接，在C端通過(guò)第二間隔連接。
79．包含與腺病毒血清型5(Ad5)約第538位氨基酸殘基至約第548位氨基酸殘基相應(yīng)的HI環(huán)約11個(gè)氨基酸缺失、并在缺失位點(diǎn)包含導(dǎo)向肽序列插入的腺病毒尾絲蛋白，其中導(dǎo)向肽序列在N端通過(guò)第一間隔連接，在C端通過(guò)第二間隔連接。
80．在其C端包含接頭肽和導(dǎo)向肽的腺病毒尾絲蛋白。
81．在靶細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)基因的方法，其包括用權(quán)利要求1-68之一的腺病毒或根據(jù)權(quán)利要求69-77的方法獲得的腺病毒接觸含有該靶細(xì)胞的細(xì)胞群體，其中導(dǎo)向序列是該靶細(xì)胞上的受體的配體表位。
82．在表達(dá)UPAR的靶細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)基因的方法，其包括用權(quán)利要求13、60或72之一的定向腺病毒載體接觸含有該靶細(xì)胞的細(xì)胞群體。
83．根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中定向腺病毒載體包含一個(gè)編碼用于治療腫瘤的基因的異源基因。
84．根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中腺病毒包含用于治療再狹窄的基因。
85．通過(guò)基因治療治療疾病的方法，其包括施用根據(jù)權(quán)利要求1-68的定向腺病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求69-77的方法獲得的定向腺病毒載體。
86．權(quán)利要求1-68的或根據(jù)權(quán)利要求69-77的方法獲得的定向腺病毒載體在生產(chǎn)用于通過(guò)基因治療治療疾病的藥品中的應(yīng)用。
87．含有權(quán)利要求1-68的或根據(jù)權(quán)利要求69-77的方法獲得的定向腺病毒載體的藥品。
88．含有權(quán)利要求1-68的或根據(jù)權(quán)利要求69-77的方法獲得的定向腺病毒載體和有效量的藥物學(xué)上有活性的賦形劑的藥物組合物。
全文摘要
腺病毒尾絲蛋白和六鄰體蛋白的內(nèi)部位點(diǎn)的修飾允許腺病毒載體的有效導(dǎo)向。鑒定了重新定向腺病毒導(dǎo)向的可及位點(diǎn)。六鄰體蛋白的HVR5環(huán)和尾絲蛋白的HI環(huán)(頭部)十分有利于插入外源蛋白序列,這種插入不顯著影響相應(yīng)病毒的生存力和繁殖力。表位的可及性和功能性強(qiáng)烈依賴于相鄰間隔的大小。其它結(jié)果提示短導(dǎo)向肽可與尾絲蛋白的C端有效融合。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,制備了一系列在HVR5位點(diǎn)、尾絲蛋白HI環(huán)或尾絲蛋白C端進(jìn)行了修飾以導(dǎo)向含有尿激酶型纖溶酶原激活物受體的細(xì)胞的腺病毒載體。這些載體對(duì)導(dǎo)向脈管系統(tǒng)如癌癥或心血管疾病的基因治療是特別有用的。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1314948SQ99810205
公開(kāi)日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1999年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月27日
發(fā)明者E·維格尼, J·F·戴迪, M·拉塔, P·耶, M·佩里卡德特 申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物股份有限公司