專利名稱：用聚合酶鏈式反應檢測小麥和大麥的真菌病原體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及引物在聚合酶鏈式反應測定法中的用途，用以檢測小麥和大麥真菌病原體。使用這些引物能夠檢測真菌病原體的特定分離株，并監(jiān)測植物種群的疾病發(fā)生。
每年植物病害所造成的農(nóng)作物大量減產(chǎn)，不僅使農(nóng)場主遭受經(jīng)濟損失，而且，在世界許多地方也會造成當?shù)厝丝诘臓I養(yǎng)供應不足。殺真菌劑的廣泛使用為抵抗植物病原體的侵襲提供了相當?shù)陌踩??？墒牵M管在殺真菌劑上的花費達一百萬美元，1981年，世界范圍內農(nóng)作物減產(chǎn)量仍達到農(nóng)作物產(chǎn)值的大約10％(James，1981；種子科學和技術(Seed Sci．& Technol9679-685)。
疾病破壞過程的嚴重性依賴于病原體的進攻性和宿主的反應。大多數(shù)植物培育計劃的目的之一是增強宿主植物對疾病的抵抗力。一般地，不同品種的病原體與同種作物的不同品種之相互作用不同，許多來源的宿主抵抗力僅對抗特殊的病原體品種。此外，一些病原體品種表現(xiàn)出疾病癥狀的早期征象，但對農(nóng)作物幾乎不造成危害。Jones和Clifford(1983；谷類病害(Cereal Disease)，John Wiley)報道，預期病原體的毒性形式應答引入到宿主栽培品種中的抵抗力在病原體種群中出現(xiàn)，因此有必要監(jiān)測病原體種群。另外，有幾例報道抵抗特定殺真菌劑的真菌菌株的進化。早在1981年，F(xiàn)letcher和Wolfe(1981；Proc，1981 Brit．Crop Prot．Conf．)提出，24％的春大麥禾白粉種群和53％的冬大麥白粉病種群在應答殺真菌劑三唑醇上顯示出很大的差異，這些種群在不同品種中分布不同，在大多數(shù)易感的品種中也產(chǎn)生高發(fā)生率的不易感類型。類似的真菌對殺真菌劑的敏感性有變異的情況也有報道，僅舉幾個例子小麥白粉病菌(對抗三唑醇)，葡萄孢屬(Botrytis)(對抗苯菌靈)，核腔菌屬(Pyrenophora)(對抗organomercury)，Pseudocercosporella(對抗MBC-型的殺真菌劑)以及針對三唑的Mycosphaerella fijiensis(Jones和Clifford谷類疾病，John Wiley，1983)。
小麥是當前國際市場最重要的農(nóng)業(yè)商品，占世界可耕地的大約20％(1977；小麥疾病概略(Compendium of Wheat Diseases)，Amer．Phytopath．Soc．第1頁)。世界小麥供給的80％生長在北美洲、歐洲、中國和蘇聯(lián)。每年由于疾病全世界小麥產(chǎn)量損失大約20％。
偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis (Died．)Drechs．)(syn．毛嘴核腔菌(P．trichostoma(Fr．)Fckl))、無性型的偃麥草德氏霉菌(Drechslera tritici-repentis，(Died．) Shoem)(syn．偃麥草長蠕孢菌(Helminthosporium tritici-repentis Died．))造成全世界的小麥黃褐斑(也稱黃斑)(1977；小麥疾病概略，Amer．Phytopath．Soc，42頁)。在澳大利亞、南美洲和北美洲，此病害造成的小麥減產(chǎn)量達3％-50％，目前被認為是北達科他州最重要的小麥葉子疾病(Zhang等，1997，植物病理學(Phytopathology)，87卷154-160)。它還可造成葉斑與其它葉子病原體的混合感染。當前的疾病控制措施包括使用殺真菌劑，以及如下栽培實踐破壞小麥茬、用無病原體的種子和寬行播種植物以減少葉子密度和小麥株冠的相對濕度。
圓核腔菌(Pyrenophora teres Drechs．)、無性型Drechslerateres(Sacc．)Shoem．(syn．大麥網(wǎng)斑長蠕孢(Hilminthosporium teresSacc．))主要在大麥中引起大麥網(wǎng)斑?。蝗欢?，小麥中也有散發(fā)的感染發(fā)生(Jones和Clifford；谷類病害，John Wiley，1983)。由于大麥網(wǎng)斑病造成的產(chǎn)量降低一般在10-40％之間。在含有易感栽培品種的農(nóng)田中產(chǎn)量降低可達100％。(1982；大麥疾病概略(Compendium of BarleyDiseases)，Amer．Phytopath．Soc，22頁)。除了影響谷物的全面產(chǎn)量和重量外，此疾病還降低糖含量，這就減少了麥芽浸膏產(chǎn)量，并由此降低谷類的釀造品質。
由上述看來，真正有必要開發(fā)一項能在感染過程早期鑒別特殊的病原體真菌品種的技術。在疾病癥狀變得明顯之前，通過鑒定農(nóng)作物種群地段的病原體的特異品種，農(nóng)業(yè)學家就可以評估已鑒別過的農(nóng)作物品種中病原體進一步發(fā)育可能帶來的后果，如果認為有必要使用的話，可選擇一種合適的殺真菌劑。
基于上述，本發(fā)明的主要目的是提供一種在感染過程早期鑒別病原體真菌特異品種的方法。因此，本發(fā)明提供了在不同的真菌致病型中有變異的內部轉錄間隔(ITS)DNA序列，此DNA序列在發(fā)明的方法中是有用的，可以用它們獲得基于聚合酶鏈式反應(PCR)的診斷方法的引物。這些引物在PCR反應后產(chǎn)生獨特條帶，其中DNA模板來自特定真菌致病型，并由此用來鑒別在疾病癥狀出現(xiàn)之前宿主植物中特定真菌致病型是否存在。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于真菌病原體偃麥草核腔菌的新的ITS1和ITS2 DNA序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測偃麥草核腔菌的衍生于ITS的診斷引物。在另外的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了新的衍生于ITS的診斷引物，其不僅可用于偃麥草核腔菌的診斷，而且令人驚訝的是，還可診斷圓核腔菌和Drechslera sorokiniana。因此本發(fā)明是針對鑒別植物病原體真菌，尤其是那些引起小麥黃褐斑的真菌的不同致病型，這樣一種長期以來始終需求但未能滿足的需求。
本發(fā)明為評估特定農(nóng)作物品種和病原體株之間關系的潛在危害，以及對正確判斷使用多種可利用的殺真菌劑武器提供了可能性。另外，本發(fā)明可用于對擴大的地理區(qū)域中特定病原體品種的發(fā)生和傳播提供詳細信息。本發(fā)明提供一種尤其適用于長潛伏期疾病的檢測方法。
也提供了可用于實施本發(fā)明的試劑盒。此試劑盒對鑒定真菌病原體偃麥草核腔菌尤其有用。
特別是，本發(fā)明提供了分離自真菌病原體核糖體RNA基因區(qū)域的DNA分子，其中該DNA分子是偃麥草核腔菌的IST1或IST2。本發(fā)明還提供了檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)確定偃麥草核腔菌的ITS1或ITS2的核苷酸序列；(b)設計至少一種PCR引物，其與(a)中確定的核苷酸序列的至少10個核苷酸有序列相同性；
(c)從感染偃麥草核腔菌的植物組織中分離DNA；(d)用(b)的一種或多種引物將(c)中的DNA進行聚合酶鏈式反應擴增；及(e)通過觀察(d)中聚合酶鏈式反應的擴增產(chǎn)物檢測偃麥草核腔菌。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了分離自偃麥草核腔菌核糖體RNA基因區(qū)域的內部轉錄間隔序列，其中該內部轉錄間隔序列選自SEQ ID NO29的31-208核苷酸；SEQ ID NO29的366-526核苷酸；SEQ ID NO30的31-208核苷酸；SEQ ID NO30的366-526核苷酸；SEQ ID NO31的31-208核苷酸；SEQ ID NO31的366-526核苷酸；SEQ ID NO32的31-208核苷酸；SEQ ID NO32的366-526核苷酸；SEQ ID NO33的31-208核苷酸；SEQ ID NO33的366-526核苷酸；SEQ ID NO34的31-208核苷酸；SEQ ID NO34的366-526核苷酸；SEQ ID NO35的31-208核苷酸；SEQ ID NO35的366-527核苷酸；SEQ ID NO36的31-208核苷酸；SEQ ID NO36的366-526核苷酸；SEQ ID NO37的31-209核苷酸；SEQ ID NO37的367-527核苷酸；SEQ ID NO38的31-208核苷酸；SEQ ID NO38的366-526核苷酸；SEQ ID NO39的31-208核苷酸；SEQ ID NO39的368-534核苷酸；SEQ ID NO40的31-208核苷酸；SEQ ID NO40的366-527核苷酸。
本發(fā)明還提供了一種用于基于擴增檢測真菌內部轉錄間隔DNA序列的寡核苷酸引物，其中該引物與發(fā)明中的內部轉錄間隔序列至少10個連續(xù)的核苷酸有序列相同性。本發(fā)明還提供了用于基于擴增檢測真菌內部轉錄間隔DNA序列的一對寡核苷酸引物，其中至少一種所述引物是與本發(fā)明中的內部轉錄間隔序列至少10個連續(xù)的核苷酸有序列相同性的寡核苷酸引物。本發(fā)明另外還提供了一種用于檢測真菌病原體的診斷試劑盒，包含至少一種與本發(fā)明中的內部轉錄間隔序列至少10個連續(xù)的核苷酸有序列相同性的引物。
依照另外的實施方案，本發(fā)明提供了一種用于檢測真菌病原體的方法，包括(a)從感染真菌病原體的植物葉子中分離DNA；(b)用至少一種本發(fā)明的引物將所述DNA進行聚合酶鏈式反應擴增；及(c)通過觀察所述聚合酶鏈式反應擴增的產(chǎn)物檢測所述的真菌病原體。
在發(fā)明這種方法的一個實施方案中，真菌病原體是偃麥草核腔菌。在本發(fā)明這種方法的另一個實施方案中，真菌病原體是圓核腔菌。在本發(fā)明這種方法的另外一個實施方案中，真菌病原體是Drechslerasorokiniana。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)設計至少一種PCR引物，其與本發(fā)明所述的內部轉錄間隔序列的至少10個連續(xù)的核苷酸序列有序列相同性。(b)從感染偃麥草核腔菌的植物組織中分離DNA；(c)用(a)中的一種或多種引物將(b)中的DNA進行聚合酶鏈式反應擴增；及(d)通過觀察(c)中聚合酶鏈式反應的擴增產(chǎn)物檢測偃麥草核腔菌。
本發(fā)明還另外提供了一種用于檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)設計至少一種多聚核苷酸標記探針，包括(ⅰ)一種具有與本發(fā)明內部轉錄間隔區(qū)的至少10個連續(xù)的核苷酸序列互補的序列之核酸區(qū)域，及(ⅱ)一種標記部分，其包含當該探針與另外的核酸分子雜交時提供信號的一種標記，或是該標記的一種結合位點；(b)從感染偃麥草核腔菌的植物組織中分離DNA；(c)將(b)中的DNA與(a)中的探針進行雜交；以及(d)通過檢測標記來檢測偃麥草核腔菌，其中檢測到標記表明(c)中所述的雜交已發(fā)生。
在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及用于基于擴增檢測真菌內部轉錄間隔區(qū)DNA序列的寡核苷酸引物，其中該引物選自SEQ ID No7-28。優(yōu)選的，本發(fā)明提供了一對用于基于擴增檢測真菌內部轉錄間隔區(qū)DNA序列的寡核苷酸引物，其中至少一種所述引物選自SEQ IDNo7-28。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，引物對選自如下引物SEQID NO7和SEQ ID NO9；SEQ ID NO11和SEQ ID NO15；SEQ ID NO7和SEQ ID NO14；SEQ ID NO1和SEQ ID NO9；SEQ ID NO8和SEQ ID NO4；SEQ ID NO17和SEQ ID NO20；SEQ ID NO18和SEQ ID NO19；SEQ ID NO1和SEQ IDNO19；SEQ ID NO7和SEQ ID NO19；SEQ ID NO8和SEQID NO19；SEQ ID NO10和SEQ ID NO19；SEQ ID NO13和SEQ ID NO19；SEQ ID NO23和SEQ ID NO26；SEQ ID NO23和SEQ ID NO19；SEQ ID NO24和SEQ ID NO19；SEQ IDNO27和SEQ ID NO28。在一個優(yōu)選實施的方案中，寡核苷酸引物對是SEQ ID NO1和SEQ ID NO9或者SEQ ID NO1和SEQ ID NO19。在另一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸引物對是SEQID NO8和SEQ ID NO4。
本發(fā)明也提供了一種用于檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)從感染偃麥草核腔菌的植物葉子中分離DNA；(b)用上述的DNA作為模板用聚合酶鏈式反應擴增偃麥草核腔菌的內部轉錄間隔序列的一部分，所用的一對寡核苷酸引物對選自SEQ IDNO7和SEQ ID NO9；SEQ ID NO11和SEQ ID NO15；SEQID NO7和SEQ ID NO14；SEQ ID NO1和SEQ ID NO9；SEQID NO8和SEQ ID NO4；SEQ ID NO17和SEQ ID NO20；SEQ ID NO18和SEQ ID NO19；SEQ ID NO1和SEQ ID NO19；SEQ ID NO7和SEQ ID NO19；SEQ ID NO8和SEQ ID NO19；SEQ ID NO10和SEQ ID NO19；SEQ ID NO13和SEQ IDNO19；SEQ ID NO23和SEQ ID NO26；SEQ ID NO23和SEQID NO19；SEQ ID NO24和SEQ ID NO19；以及SEQ ID NO27和SEQ ID NO28；以及(c)通過觀察擴增的內部轉錄間隔序列的一部分檢測偃麥草核腔菌。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測圓核腔菌的方法，包括(a)從感染圓核腔菌的植物葉子中分離DNA；(b)用該DNA作為模板，用聚合酶鏈式反應擴增圓核腔菌的內部轉錄間隔序列的一部分，使用的一對寡核苷酸引物是SEQ ID NO1和SEQID NO9或者SEQ ID NO1和SEQ ID NO19；及(c)通過觀察擴增的內部轉錄間隔區(qū)的一部分檢測圓核腔菌。在另外的一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測Drechslerasorokiniana的方法，包括(a)從感染Drechslera sorokiniana的植物葉子中分離DNA；(b)用上述DNA作為模板，用聚合酶鏈式反應擴增Drechslerasorokiniana的內部轉錄間隔序列的一部分，使用的一對寡核苷酸引物是SEQ ID NO8和SEQ ID NO4；及(c)通過觀察擴增的內部轉錄間隔區(qū)的一部分檢測Drechslerasorokiniana。
下面是序列表中所列序列的簡要說明(“nt’s”=序列中的核苷酸編號)SEQ ID NO1-寡核苷酸引物ITS1。
SEQ ID NO2-寡核苷酸引物ITS2。
SEQ ID NO3-寡核苷酸引物ITS3。
SEQ ID NO4-寡核苷酸引物ITS4。
SEQ ID NO5-M13通用20-引物。
SEQ ID NO6-在實施例2中使用的反向引物。
SEQ ID NO7-寡核苷酸引物JB629。
SEQ ID NO8-寡核苷酸引物JB630。
SEQ ID NO9-寡核苷酸引物JB631。
SEQ ID NO10-寡核苷酸引物JB632。
SEQ ID NO11-寡核苷酸引物JB633。
SEQ ID NO12-寡核苷酸引物JB634。
SEQ ID NO13-寡核苷酸引物JB635。
SEQ ID NO14-寡核苷酸引物JB636。
SEQ ID NO15-寡核苷酸引物JB637。
SEQ ID NO16-寡核苷酸引物JB638。
SEQ ID NO17-寡核苷酸引物JB651。
SEQ ID NO18-寡核苷酸引物JB652。
SEQ ID NO19-寡核苷酸引物JB653。
SEQ ID NO20-寡核苷酸引物JB654。
SEQ ID NO21-寡核苷酸引物JB655。
SEQ ID NO22-寡核苷酸引物JB656。
SEQ ID NO23-寡核苷酸引物JB657。
SEQ ID NO24-寡核苷酸引物JB658。
SEQ ID NO25-寡核苷酸引物JB659。
SEQ ID NO26-寡核苷酸引物JB660。
SEQ ID NO27-寡核苷酸引物JB675。
SEQ ID NO28-寡核苷酸引物JB676。
SEQ ID NO29-偃麥草核腔菌分離株6715、119-2-3、DL22、PTR4A、44184、205、403、109、407、1316、和223的ITS區(qū)域的共同DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO30-偃麥草核腔菌分離株6715的第2和4號克隆的ITS區(qū)的共同DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8S rRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO31-偃麥草核腔菌分離株119-2-3的第2-2號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8S rRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO32-偃麥草核腔菌分離株DL22的第1-1號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO33-偃麥草核腔菌分離株PTR4A的第2-3號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8Sr RNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO34-偃麥草核腔菌分離株44184的第3-1號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO35-偃麥草核腔菌分離株205的第4-2號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-527核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(528-580核苷酸)。
SEQ ID NO36-偃麥草核腔菌分離株403的第5-2號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO37-偃麥草核腔菌分離株109的第6-2號克隆的ITS區(qū)的共同DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-209核苷酸)、5．8S rRNA基因(210-366核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(367-527核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(528-580核苷酸)。
SEQ ID NO38-偃麥草核腔菌分離株407的第7-3-2號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-526核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(527-579核苷酸)。
SEQ ID NO39-偃麥草核腔菌分離株1316的第8-1號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-367核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(368-534核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(535-587核苷酸)。
SEQ ID NO40-偃麥草核腔菌分離株223的第9-2號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-208核苷酸)、5．8SrRNA基因(209-365核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(366-527核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(528-580核苷酸)。
SEQ ID NO41-圓核腔菌分離株36570的第10-1號克隆的ITS區(qū)的DNA序列。其包括按照5’-3’的方向依次是rRNA基因小亞基的3’-末端(1-30核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)1(31-209核苷酸)、5．8Sr RNA基因(210-366核苷酸)、內部轉錄間隔區(qū)2(367-536核苷酸)和rRNA基因大亞基的5’-端(537-590核苷酸)。
本發(fā)明提供了用于鑒定植物致病真菌的不同致病型的獨特DNA序列。特別是，此DNA序列可用作基于PCR的方法鑒定真菌致病型的引物。本發(fā)明中的DNA序列，包括特定真菌致病型的核糖體RNA基因區(qū)域的內部轉錄間隔序列，以及來自這些區(qū)域可鑒定特定致病型的引物。這些來自病原體種或屬內的不同致病型的ITS DNA序列，在種或屬的不同成員間有變化，可用于鑒定那些特定成員。
生物醫(yī)學研究人員使用基于PCR的技術已經(jīng)有一些時間，并且比較成功地用于檢測受感染的動物組織中的病原體。但直到最近，這項技術才用于檢測植物病原體。用對病原體線粒體基因組序列特異的PCR方法已經(jīng)檢測到受感染小麥中Gaumannomyces graminis的存在(Schlesser等，1991；應用和環(huán)境微生物學(Appliedand Environ．Microbiol)，57553-556)，隨機擴增的多態(tài)性DNA(即RAPD)標記物能夠區(qū)分Gremmeniella abietina的多種品種，它是造成針葉樹scleroderris潰瘍的因素。美國專利No．5，585，238(在此處全文引用作為參考)描述了衍生于Septoria、Pseudocercosporella、以及Mycosphaerell的株的核糖體RNA基因區(qū)域ITS序列之引物，及它們在利用基于PCR的技術鑒定這些真菌分離株中的應用。另外，WO 95／29260(在此處全文引用作為參考)描述了衍生于鐮孢菌屬(Fusarium)的株的核糖體RNA基因區(qū)域ITS序列之引物，及它們在利用基于PCR的技術鑒定這些真菌分離株中的應用。另外，美國專利No．5，800，997(在此處全文引用作為參考)描述了衍生于尾孢菌屬、長蠕孢屬、球梭孢屬和柄銹菌株的核糖體RNA基因區(qū)域ITS序列的引物，及它們在利用基于PCR的技術鑒定這些真菌分離株中的應用。
因為核糖體基因的拷貝數(shù)較高，所以適宜用作分子探針的靶序列，盡管成熟的rRNA序列之間高度保守，但非轉錄和轉錄間隔序列通常很少保守，因此適于作為靶序列用于檢測近來演化的多樣性。真菌rRNA基因是以單位形式組成的，其中每個單位編碼18S(小亞基)、5．8S和28S(大亞基)三個成熟的亞單位。這些亞單位被兩個約300bp的內部轉錄間隔序列ITS1和ITS2分開(White，等，1990；在PCR實驗步驟；Innes等編315-322)。另外，轉錄單位被非轉錄間隔序列(NTS)所分開。ITS和NTS序列尤其適宜檢測不同真菌病原體的特定致病型。
本發(fā)明中的DNA序列來自不同植物病原體的核糖體RNA基因區(qū)域的內部轉錄間隔序列。來自病原體種或屬內的不同致病型的ITS DNA序列在種或屬不同的成員中有變化。病原體的ITS序列被確定后，這些序列可以和其它的ITS序列一起排列起來，然后就可根據(jù)ITS序列得獲引物。就是說，可以根據(jù)真菌致病型中在序列上有最大差異的ITS序列之間的區(qū)域設計引物。基于上述的序列和引物可用于鑒別特定病原體。
具體的目的DNA序列包括來自偃麥草核腔菌和圓核腔菌的ITSDNA基因序列。這樣的ITS DNA序列公布于SEQ ID NO29-41。衍生于這些ITS序列的典型的寡核苷酸引物序列公布于SEQ ID NO7-28。這些序列可用在基于PCR的方法中鑒定目的病原體。因此，根據(jù)本發(fā)明申請人公開的內容，可首次用基于PCR的診斷方法對引起小麥黃褐斑的真菌病原體進行檢測。
在PCR分析中使用本發(fā)明引物序列的方法是本領域所熟知的。例如，見美國專利No．4，683，195和4，683，202，還有Schlesser等(1991)應用和環(huán)境微生物學，57553-556。還有Nazar等人(1991；生理學和分子植物病理學(Physiol．a(chǎn)nd Molec．Plant Pathol．)，391-11)，其用PCR擴增揭示了黑白輪枝孢(Verticillium albo-atrum)和大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)的ITS區(qū)域的差異，并因此將兩個種區(qū)分開；Johanson和Jeger(1993；Mycol．Res．97670-674)，其用類似的技術區(qū)分了香蕉病原體Mycosphaerella fijiensis和Mycospharellamusicola。
本發(fā)明中的ITS DNA序列可用本領域熟知的方法從真菌病原體中克隆。一般地，從真菌隔離菌群中分離DNA的方法是周知的。見，Raeder& Broda(1985)應用微生物學通訊(Letters in Applied Microbiology)217-20；Lee等(1990)真菌遺傳學時事傳報(Fungal GeneticsNewsletter)3523-24；以及Lee和Taylor(1990)在PCR方法方法和應用指南(A Guide to Methods and Applications)，Innes等。(編)；282-287頁。
另外，可用PCR擴增確定目的ITS序列。在另一實施方案中，擴增整個ITS區(qū)域的引物是根據(jù)White等人(1990；在PCR方法；Innes等編。315-322頁)的報道設計的，將擴增的ITS序列亞克隆到pCRII克隆載體上。亞克隆的序列既包含左臂ITS(ITS1)和右臂ITS(ITS2)，又包含定位在其中間的5．8s rRNA基因。對偃麥草核腔菌的幾種分離株和來自圓核腔菌的一種分離株進行了這樣的工作。
已確定的ITS序列與每一種病原體類群相比較，以找出這在用PCR區(qū)分不同的種和／或株的實驗中有用的差異。確定的ITS DNA序列示于SEQ ID NO29-41。通過差異性的鑒定，可以合成多種引物，并通過PCR擴增進行測試。用作PCR擴增測試的模板首先是純化的病原體DNA，接著是分離自受感染的宿主植物組織的DNA。這樣，就有可能鑒別成對的診斷性引物，即鑒定一種特定病原體種或株，但并非此病原體的另一個種或株。引物也設計在種群序列中有最大保守性的區(qū)域，以開發(fā)種屬特異性引物，以及鑒定引起某種疾病的幾種真菌病原體中任一個的引物。例如，也設計引物以檢測偃麥草核腔菌和圓核腔菌。
優(yōu)選的引物組合能夠區(qū)分感染的宿主組織(即曾感染過一種特異的病原體種或株的宿主組織)中不同的種或株。本發(fā)明提供能實現(xiàn)檢測圓核腔菌和偃麥草核腔菌的多種引物。本發(fā)明中的引物是根據(jù)真菌ITS區(qū)域的序列差異而設計的。序列間最小一個堿基對的差異可允許設計一種區(qū)別性的引物。設計針對真菌DNA特定的ITS區(qū)域的引物可以和設計針對核糖體DNA編碼區(qū)域中的保守序列區(qū)域的引物組合，用于擴增種特異的PCR片段。一般，為達到好的靈敏度，引物應該有一個介乎約60～70℃的理論上的變性溫度，應避免明顯的二級結構和引物組合之間3’端的重疊。引物一般要與ITS1或ITS2的至少連續(xù)5-10個核苷酸有序列相同性。在一個優(yōu)選的實施方案中，引物大約是5-30核苷酸堿基的任何長度，優(yōu)選的長度是至少10個核苷酸堿基。
作為上述PCR診斷技術的一種替代技術，一種特異的真菌DNAITS區(qū)域可用來設計多聚核苷酸標記探針，每種探針包括一種標記部分和與ITS1或ITS2至少5-10個連續(xù)的核苷酸互補的序列的核酸區(qū)域。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些探針的互補核酸區(qū)域約是5-30個核苷酸堿基長度，優(yōu)選是至少10個核苷酸堿基長。探針的標記部分可包括提供信號的標記或是此標記的一種結合位點。這些多核苷酸標記探針可用于真菌的檢測方法，包括如下(a)設計至少一種多聚核苷酸標記探針，其包括具有與真菌病原體(如偃麥草核腔菌)的ITS1和ITS2的至少5-10個連續(xù)核苷酸堿基互補的序列的一種核酸區(qū)域，以及標記部分，其中包含當該探針與其它核酸分子雜交時可提供信號的標記，或該標記的一種結合位點；(b)從感染真菌病原體的植物組織中分離DNA；(c)將上述(b)中的DNA和(a)中的探針雜交；及(d)通過檢測標記檢測真菌病原體，其中檢測到標記說明(c)中的雜交已發(fā)生，真菌病原體是存在的?？筛鶕?jù)本領域已知的任何方法來設計和檢測標記，通過諸如放射性同位素、熒光、或平面光波導的應用。例如，美國專利No．4，868，105、WO 95／33198、和WO 95／33198，所有這些在此處引用作為參考。
本發(fā)明導致了包含進行該方法的各種必要成分的試劑盒。這樣的試劑盒可包含一個已分隔好的載體以緊湊地放置一個或多個容器，比如試管或小試劑瓶。其中的一個容器可包含未標記的或是可檢測的標記DNA引物或探針，其可以為冷凍干燥形式存在或必要時在合適的緩沖液中。一個或多個容器可包含一種或多種用于PCR反應的酶或試劑。這些酶可能單獨存在，或是以冷凍干燥形式或在合適的緩沖液中混合存在。最后，試劑盒還可含有其它施行本發(fā)明技術中所需的成分，比如緩沖液、提取試劑、酶、吸管、板、核酸、核苷三磷酸、濾紙、膠體物質、轉移物、放射自顯影設備等等。
下面是大塊浸解法的實驗步驟(1)將適量的小麥葉子置于Bioreba(Reinach，瑞士)的耐高強度塑料袋(cat#490100)中。稱取植物組織重量，盛葉子的塑料袋要去皮(塑料袋重)。(2)每個重量(克)的小麥組織加入等體積(ml)的Muller提取緩沖液(0．1％W／V的吐溫-80；0．04MTris-CL，pH7．7；0．15M NaCl；0．1％W／V牛血清白蛋白-Pentex第五組分；0．1％W／V疊氮鈉；200mM EDTA)。將Bioreba Homex 6勻漿器置于70以浸軟組織。研磨葉子直至組織呈纖維狀。(3)匯集若干袋子的提取液，使用時充分震蕩混勻。將提取液等份分裝到置于冰上的微量離心管中。(a)將100μl濃縮提取物煮沸5分鐘。(b)將煮沸的提取物置于冰上。(c)將煮沸濃縮的提取物10μl加入到90μl無菌的蒸餾水中做1∶10稀釋。(d)將稀釋的提取物于冰上保存?zhèn)溆?。實施?聚合酶鏈式反應擴增用Perkin Elmer／Cetus(Norwalk，CT；part noN808-0009)的GeneAMP試劑盒進行聚合酶鏈式反應擴增，在50μl的反應終體積含50mM KCl，2．5mM MgCl2，10mM Tris-HCL，pH8．3，含有dTTP、dATP、dCTP和dGTP各200uM，每種引物50pmol，2．5個單位的Taq聚合酶，和10ng基因組DNA或1μ11∶10稀釋的植物提取物。在PerkinElmer／Cetus Model 9600熱循環(huán)儀上反應30-40個循環(huán)94℃，15秒；50℃-70℃，15秒；72℃，45秒。每種PCR樣品取10μl上樣于1．0％的瓊脂糖凝膠上電泳，分析引物。實施例5寡核苷酸的合成和純化通過諸如整合DNA技術(Coralville，IA)或Midland Certified試劑公司(Midland，Texas)合成寡核苷酸(引物)。實施例6種特異性引物的選擇將來自偃麥草核腔菌的多種分離株和圓核腔菌的一個分離株的ITS序列排列比較。下面的表2中所示的寡核苷酸引物是基于對排列序列的分析根據(jù)實施例5合成的。引物設計在真菌種之間的序列中有最大差異的區(qū)域。引物還設計為針對在種間高度保守的區(qū)域以形成屬特異性引物。另外，也合成了已發(fā)表的核糖體基因特異性引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等，1990；在PCR實驗步驟；Innes等編，315-322頁)，并與ITS區(qū)域特異的引物結合用于測試。表2設計用于真菌檢測的引物
實施例7對純化的真菌基因組DNA之引物特異性的確定用不同的引物組合(表3)根據(jù)實施例4進行PCR，以擴增單一特異性片段。特異的PCR擴增產(chǎn)物是根據(jù)每種目的真菌株18S和25S核糖體DNA亞單位之間的ITS區(qū)域設計的引物而獲得的。
表3來自ITS的診斷性PCR引物 實施例8針對感染真菌的植物組織之引物特異性和與其它谷類真菌病原體交叉反應性的確定如實施例3所述從健康小麥葉子和感染偃麥草核腔菌的小麥葉子中提取總基因組DNA。如實施例4所述的方法進行PCR，檢測列于表3的針對來自小麥組織的DNA之引物組合。依據(jù)實施例1所述獲得純化的真菌基因組DNA，并用診斷性引物依據(jù)實施例4所述進行PCR分析。也檢測了其它的真菌DNA種和分離株的診斷性引物與之交叉反應的能力。這些實驗結果如下從所有列于表1的偃麥草核腔菌分離株的DNA和感染偃麥草核腔菌的小麥組織中，偃麥草核腔菌特異性引物組合JB675(SEQ IDNO27)和JB676(SEQ ID NO28)擴增出一條392bp的片段。此引物組合不能從健康小麥組織和列于表1的下述一般的谷類病原體純化的基因組DNA擴增出診斷片段，如圓核腔菌、R．cerealis、D．sorokiniana、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、M．nivale、P．herpotrichoides R-致病型和P．herpotrichoides W致病型、穎枯殼針孢、草本枝孢、小麥殼針孢、落花生針孢和麥根腐長蠕孢。用下述偃麥草核腔菌特異性引物組合JB658(SEQ ID NO24)和JB653(SEQ ID NO19)；JB657(SEQID NO23)和JB653(SEQ ID NO19)；JB657(SEQ ID NO23)和JB660(SEQ ID NO26)；JB652(SEQ ID NO18)和JB653(SEQ ID NO19)；JB629(SEQ ID NO7)和JB631(SEQ ID NO9)也得到類似的診斷結果。偃麥草核腔菌特異性引物JB633(SEQ IDNO11)和JB637(SEQ ID NO15)也產(chǎn)生類似結果。
引物JB651(SEQ ID NO17)和JB654(SEQ ID NO20)從偃麥草核腔菌分離株#6715和#DL22的DNA中擴增出一條473bp的片段。這些引物從健康小麥的DNA中擴增出一條稍小的片段，大約400bp。這些引物不能從列于表1的下述普通谷類病原體如圓核腔菌、R．cerealis、D．sorokiniana、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、M．nivale、P．herpotrichoides R-致病型和P．herpotrichoides W致病型、穎枯殼針孢、草本枝孢、小麥殼針孢、落花生針孢和麥根腐長蠕孢擴增純化的基因組DNA。
從偃麥草核腔菌分離株#6715和DL22的DNA中，引物組合JB635(SEQ ID NO13)和JB653(SEQ ID NO19)擴增了一條482bp的片段；引物組合JB632(SEQ ID NO10)和JB653(SEQ ID NO19)擴增了一條512bp的片段；引物組合JB630(SEQ ID NO8)和JB653(SEQ IDNO19)擴增了一條357bp的片段；引物組合JB629(SEQ ID NO7)和JB653(SEQ ID NO19)擴增了一條438bp的片段。這些引物組合不能從D．sorokiniana分離株#11404和圓核腔菌分離株#36570的DNA擴增出任何片段。引物組合JB629(SEQ ID NO7)和JB636(SEQ IDNO14)從偃麥草核腔菌分離株#6715DNA擴出一條411bp的片段，但不能從D．sorokiniana分離株#11404和穎枯殼針孢分離株#24425的DNA中擴增出片段。引物JB630(SEQ ID NO8)和ITS4(SEQ ID NO4)從偃麥草核腔菌分離株#6715的DNA和D．sorokiniana分離株#11404的DNA中擴出一條433bp的片段，但從穎枯殼針孢分離株#24425和小麥殼針孢分離株#26517的DNA中不能擴增出片段。
引物組合ITS1(SEQ ID NO1)和JB653(SEQ ID NO19)從分離自偃麥草核腔菌和圓核腔菌的DNA中擴增了一條448bp的片段。這種引物組合不能從健康小麥組織和下述列于表1的一般的谷類病原體如R．cerealis D．sorokiniana、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、M．nivale、P．herpotrichoides R-致病型和P．herpotrichoides W致病型、穎枯殼針孢、草本枝孢、小麥殼針孢、落花生針孢的純化的基因組DNA擴增出診斷片段。用引物組合ITS1(SEQ ID NO1)和JB631(SEQ ID NO9)得到類似診斷的結果。
盡管本發(fā)明關于其特定實施方案做了闡述，應當理解多種變化、修飾和更多的實施方案是可能存在的，因此，所有這變化、修飾、和更多的實施方案都應看作屬于本發(fā)明的范圍。序列表<110>Novartis AG<120>用聚合酶鏈式反應檢測小麥和大麥的真菌病原體<130>PF／5-30426／A／CGC1984<140><141><150>US 09／026，601<151>1998-02-20<160>41<170>PatentIn Ver．2．0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 ITS1<400>1tccgtaggtg aacctgcgg19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 ITS2<400>2gctgcgttct tcatcgatgc 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 ITS3<400>3gcatcgatga agaacgcagc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 ITS4<400>4tcctccgctt attgatatgc 20<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述M13通用20引物<400>5gtaaaacgac ggccagt17<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述實施例2中使用的反向引物<400>6aacagctatg accatg 16<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB629<400>7gtactacttg tttccttggc g 21<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB630<400>8tcagttgcaa tcagcgtcag 20<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB631<400>9tggacaagag cgcaaataat g 21<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB632<400>10atgaagccgg actgggata 19<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB633<400>11atgaagccgg actgggatag gg 22<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB634<400>12cgctgccttg cccgtctggc 20<210>13<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB635<400>1317cgctgccttg cccgtct 17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB636<400>1417catggacgcg cgaccgc 17<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB637<400>15cgtggacg cgacgcggc 20<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<20>人工序列的描述引物 JB638<400>16ctccgaaacc agtaggcc 18<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB651<400>17gatagggcct cgctgcctcg c 21<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB652<400>18gatagggcct cgctgcct 18<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB653<400>19aaggttgaaa gaagcttcat gg22<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB654<400>20caaaaggttg aaagaagctt catgg 25<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB655<400>21aagccggact gggatagg 18<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物JB656<400>22caaaaggttg aaagaagc 18<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB657<400>23gccggactgg gatagggc 18<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB658<400>24ggactgggat agggcctc 18<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB659<400>25gaagcttcat ggacgcgcg 19<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB660<400>26ggcgagtctc gggagaga 18<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB675<400>27gccggactgg gatagggcct c 21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 JB676<400>28ggcgagtctc gggagagaga c21<210>29<211>579<212>DNA<213>偃麥草核腔菌<400>29tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta cacaaatatg aagccggact gggatagggc 60ctcgctgcct tgcccgtctg gcgccatatt cacccatgtc tttttgcgta ctacttgttt 120ccttggcggg tccgcccgcc aattggacct tattcaaacc tttttttcag ttgcaatcag 180cgtcagcaaa acaaatgtaa tcaattacaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca 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權利要求
1．一種分離自真菌病原體核糖體RNA基因區(qū)域的DNA分子，其中該DNA分子是偃麥草核腔菌的IST1或IST2。
2．一種檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)確定權利要求1中DNA分子的核苷酸序列；(b)設計至少一種PCR引物，其與(a)中確定的核苷酸序列的至少10個核苷酸有序列相同性；(c)從感染偃麥草核腔菌的植物組織中分離DNA；(d)用(b)中的一種或多種引物將(c)中的DNA進行聚合酶鏈式反應擴增；以及(e)通過觀察(d)中聚合酶鏈式反應擴增的產(chǎn)物檢測偃麥草核腔菌。
3．一種分離自偃麥草核腔菌核糖體RNA基因區(qū)域的內部轉錄間隔序列，其中該內部轉錄間隔序列選自SEQ ID NO29的31-208核苷酸；SEQ ID NO29的366-526核苷酸；SEQ ID NO30的31-208核苷酸；SEQ ID NO30的366-526核苷酸；SEQ ID NO31的31-208核苷酸；SEQ ID NO31的366-526核苷酸；SEQ ID NO32的31-208核苷酸；SEQ ID NO32的366-526核苷酸；SEQ ID NO33的31-208核苷酸；SEQ ID NO33的366-527核苷酸；SEQ ID NO34的31-208核苷酸；SEQ ID NO34的366-526核苷酸；SEQ ID NO35的31-208核苷酸；SEQ ID NO35的366-527核苷酸；SEQ ID NO36的31-208核苷酸；SEQ ID NO36的366-526核苷酸；SEQ ID NO37的31-209核苷酸；SEQ ID NO37的367-527核苷酸；SEQ ID NO38的31-208核苷酸；SEQ ID NO38的366-526核苷酸；SEQ ID NO39的31-208核苷酸；SEQ ID NO39的368-534核苷酸；SEQ ID NO40的31-208核苷酸；SEQ ID NO40的366-527核苷酸。
4．一種用于真菌內部轉錄間隔DNA序列的基于擴增的檢測之寡核苷酸引物，其中該引物與權利要求3的序列中的至少10個連續(xù)的核苷酸有序列相同性。
5．一對用于真菌內部轉錄間隔DNA序列的基于擴增的檢測之寡核苷酸引物，其中至少一個該引物是權利要求4的寡核苷酸引物。
6．一種用于檢測真菌病原體的診斷試劑盒，包含至少一種依照權利要求4的引物。
7．一種檢測真菌病原體的方法，包括(a)從感染真菌病原體的植物葉子中分離DNA；(b)用依照權利要求4中的至少一種引物將所述DNA進行聚合酶鏈式反應擴增；以及(c)通過觀察該聚合酶鏈式反應擴增的產(chǎn)物，檢測所述真菌病原體。
8．權利要求7的方法，其中所述真菌病原體是偃麥草核腔菌。
9．權利要求7的方法，其中所述真菌病原體是圓核腔菌。
10．權利要求7的方法，其中所述真菌病原體是Drechslerasorokiniana。
11．一種檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)設計至少一種PCR引物，其與權利要求3的內部轉錄間隔序列的至少10個連續(xù)的核苷酸有序列相同性；(b)從感染偃麥草核腔菌的植物組織中分離DNA；(c)用(a)中的一種或多種引物將(b)中的DNA進行聚合酶鏈式反應擴增；以及(d)通過觀察(c)中聚合酶鏈式反應擴增的產(chǎn)物檢測偃麥草核腔菌。
12．一種檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)設計至少一種多聚核苷酸標記探針，其包括(ⅰ)一種核酸區(qū)域，其序列與權利要求3的內部轉錄間隔序列的至少10個連續(xù)的核苷酸互補，及(ⅱ)一種標記部分，包含當所述探針與另一核酸分子雜交時提供信號的一種標記，或是該標記的一種結合位點；(b)從感染偃麥草核腔菌的植物組織中分離DNA；(c)將(b)中的DNA與(a)中的一種或多種探針進行雜交；以及(d)通過檢測標記檢測偃麥草核腔菌，其中檢測到標記表明(c)中的雜交已發(fā)生。
13．一種用于真菌內部轉錄間隔DNA序列的基于擴增的檢測之寡核苷酸引物，其中該引物選自SEQ ID No7-28。
14．一對用于真菌內部轉錄間隔DNA序列的基于擴增的檢測之寡核苷酸引物，其中至少一種所述引物是權利要求13中的寡核苷酸引物。
15．依照權利要求14的一對寡核苷酸引物，其中該引物對選自如下引物對SEQ ID NO7 和SEQ ID NO9；SEQ ID NO11和SEQ ID NO15；SEQ ID NO7 和SEQ ID NO14；SEQ ID NO1 和SEQ ID NO9；SEQ ID NO8 和SEQ ID NO4；SEQ ID NO17和SEQ ID NO20；SEQ ID NO18和SEQ ID NO19；SEQ ID NO1 和SEQ ID NO19；SEQ ID NO7 和SEQ ID NO19；SEQ ID NO8 和SEQ ID NO19；SEQ ID NO10和SEQ ID NO19；SEQ ID NO13和SEQ ID NO19；SEQ ID NO23和SEQ ID NO26；SEQ ID NO23和SEQ ID NO19；SEQ ID NO24和SEQ ID NO19；及SEQ ID NO27和SEQ ID NO28。
16．一種檢測偃麥草核腔菌的方法，包括(a)從感染偃麥草核腔菌的植物葉子中分離DNA；(b)用所述DNA作為聚合酶鏈式反應的模板，用依照權利要求15中的一對寡核苷酸引物擴增偃麥草核腔菌的內部轉錄間隔序列的一部分；及(c)通過觀察擴增的內部轉錄間隔序列的一部分，檢測偃麥草核腔菌。
17．依據(jù)權利要求15的一對寡核苷酸引物，其中該引物對是SEQID NO1和SEQ ID NO9或SEQ ID NO1和SEQ ID NO19。
18．一種檢測圓核腔菌的方法，包括(a)從感染圓核腔菌的植物葉子中分離DNA；(b)用所述DNA作為聚合酶鏈式反應的模板，用依照權利要求17中的一對寡核苷酸引物擴增圓核腔菌的內部轉錄間隔序列的一部分；及(c)通過觀察擴增的內部轉錄間隔序列的一部分，檢測圓核腔菌。
19．依照權利要求15的一對寡核苷酸引物，其中該引物對是SEQID NO8和SEQ ID NO4。
20．一種檢測Drechslera sorokiniana的方法，包括(a)從感染Drechslera sorokiniana的植物葉子中分離DNA；(b)用所述DNA作為聚合酶鏈式反應的模板，用依照權利要求19中的一對寡核苷酸引物擴增Drechslera sorokiniana內部轉錄間隔序列的一部分；及(c)通過觀察擴增的內部轉錄間隔序列的一部分，檢測Drechslerasorokiniana。
全文摘要
本發(fā)明描述了來自小麥真菌病原體(包括偃麥草核腔菌和圓核腔菌)的種和株的核糖體RNA基因區(qū)域的內部轉錄間隔(ITS)DNA序列。鑒定了來自這些序列之中的在利用基于PCR的技術檢測真菌分離株中有用的特異性引物。
文檔編號C12N15/09GK1289374SQ99802627
公開日2001年3月28日 申請日期1999年2月18日 優(yōu)先權日1998年2月20日
發(fā)明者J·J·貝克 申請人:諾瓦提斯公司