專利名稱：一種重組人白細(xì)胞介素－11的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人白細(xì)胞介素-11本身或含有IL-11的制劑作為治療癌癥化療引起的血小板減少癥的藥物。
白細(xì)胞介素-11是1990年S.R.Paul等在研究骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)體系中對(duì)造血干細(xì)胞重建的支持作用時(shí)發(fā)現(xiàn)并分離出的一種新的細(xì)胞因子，該因子在體外可以刺激IL-6依賴的鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系T11 65的增殖。IL-11對(duì)骨髓造血組織有著多種效應(yīng)，IL-11與其它一些在細(xì)胞增殖分化不同階段先后發(fā)生作用的細(xì)胞因子協(xié)同作用，可以刺激原始干細(xì)胞及不同來源的多潛能和定向祖細(xì)胞在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖；IL-11單獨(dú)使用或與其它細(xì)胞因子協(xié)同，對(duì)紅細(xì)胞生成的多個(gè)階段均有刺激作用；對(duì)髓系祖細(xì)胞的分化成熟及B淋巴細(xì)胞的發(fā)育也有促進(jìn)作用；但其對(duì)造血組織的最為顯著的影響是促進(jìn)巨核細(xì)胞和血小板的生成，這一效應(yīng)在包括鼠、非人靈長目動(dòng)物及人在內(nèi)的影響包括體外、體內(nèi)試驗(yàn)中均得到證實(shí)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL-11對(duì)許多非造血組織也具有顯著的生物學(xué)效應(yīng)，在腦、脊索神經(jīng)元、腸道及睪丸組織中均檢測到IL-11的表達(dá)和活性。
白介素-11體內(nèi)單獨(dú)使用在小鼠、大鼠、狗和靈長類動(dòng)物中均表現(xiàn)出特定的生物效應(yīng)。在正常小鼠中主要作用于巨核細(xì)胞系細(xì)胞，可以增加巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的數(shù)量、刺激巨核細(xì)胞胞內(nèi)復(fù)制及劑量依賴性地升高外周血小板計(jì)數(shù)。在非人靈長類動(dòng)物中也表現(xiàn)出相似的活性，給藥動(dòng)物外周血小板計(jì)數(shù)升高達(dá)300％。在幾個(gè)化療、放療引起的重度骨髓抑制模型和骨髓移植模型中，使用rhIL-11可刺激多系造血作用。在這些模型中均觀察到血小板恢復(fù)加快，其中一些模型中還觀察到中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞恢復(fù)的增強(qiáng)。這些臨床前研究結(jié)果再次證實(shí)了體外實(shí)驗(yàn)中IL-11所表現(xiàn)出的廣泛生物學(xué)活性，提示IL-11可能是一種有效的治療癌癥化療及骨髓移植后骨髓抑制及血小板減少的藥物。
國外思路是通過融合蛋白的形式，在N末端帶上一個(gè)有或無功能的蛋白或多肽，提高雜交蛋白的表達(dá)量，再利用特異的蛋白酶將N末端前附加的蛋白或多肽切除即可獲得天然序列的目標(biāo)蛋白IL-11(Du et alBlood,893897-3908，1997)。美國Genetic Institute生產(chǎn)的rhIL-11即采用上述思路設(shè)計(jì)，其表達(dá)產(chǎn)物為一種硫氧化還原蛋白的融合蛋白，需要經(jīng)腸激肽酶切割才能獲得終產(chǎn)品，最大問題是須用大量的價(jià)格昂貴的腸激肽酶。
我們采用的是改變5′端核苷酸序列的第一種思路，經(jīng)過實(shí)施取得了良好的效果。游離表達(dá)的一個(gè)缺陷是N端經(jīng)常會(huì)有多余的甲硫氨酸，而N末端Met可以被E.coli內(nèi)的甲硫氨酸氨肽酶切除，Sherman等(Bio Essays,19853,27-31)曾報(bào)導(dǎo)在原核和真核細(xì)胞中，表達(dá)蛋白若第一位氨基酸殘基的旋轉(zhuǎn)半徑在1.22?；蚋?如Gly或Ala)時(shí)，則N末端Met可被甲硫氨酸酶有效的切除。以Gly起始。由于N末端不含甲硫氨酸，因而IL-11大劑量使用時(shí)不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生抗體，影響療效。
本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)鑒于遺傳密碼有兼并性和大腸桿菌對(duì)氨基酸密碼子的偏愛與人體細(xì)胞的差異，本發(fā)明專門設(shè)計(jì)合成了人IL-11基因5′端含大腸桿菌偏愛密碼子的DNA片段，它可以在不改變產(chǎn)物人IL-11的氨基酸組成與排列順序的基礎(chǔ)上，提高IL-11基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。其步驟首先在5′和3′端引物引導(dǎo)下，自人骨髓基質(zhì)細(xì)胞KW102細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出特異的人IL-11 cDNA片段。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入國內(nèi)已廣泛采用的高效表達(dá)載體pBV220中，構(gòu)建成IL-11表達(dá)質(zhì)粒pIL-11。它能在大腸桿菌HB101和DH5α中高表達(dá)，使IL-11占菌體總蛋白的20％左右，表達(dá)率經(jīng)100次以上傳代不降低。
(2)通過發(fā)酵工程菌，用ZYT作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適當(dāng)增加碳源和氮源，通過優(yōu)化溶氧、攪拌速度、發(fā)酵pH值等工藝參數(shù)，最終培養(yǎng)物OD600值可達(dá)20左右，生物量為每升培養(yǎng)物20-25g，產(chǎn)物表達(dá)率在20-25％之間。產(chǎn)物表達(dá)量可達(dá)每升培養(yǎng)物200mg以上。
(3)在此基礎(chǔ)上建立了純化工藝，其中包括菌體的破碎和包涵體抽提、凝膠排阻層析、復(fù)性和陽離子交換層析精制等。
所建立的工藝穩(wěn)定、回收率高、活性好。本工藝具有以下特點(diǎn)①通過包涵體的洗滌去除了大部分雜質(zhì)，這對(duì)以后的進(jìn)一步純化非常有利，抽提液中白介素-11含量及濃度高，有利于在第一步使用凝膠排阻層析純化；②第一步層析純化由于抽提物中白介素-11占總蛋白量的50％左右，而且雜質(zhì)大多為分子量＞30kd的蛋白，經(jīng)本步純化后蛋白純度可達(dá)90％以上；③在第一步凝膠排阻層析后復(fù)性，復(fù)性濃度為1mg/ml，復(fù)性中保持一定濃度的NaCl或甘氨酸，以防白介素-11蛋白聚合及沉淀，同時(shí)保持較高的活性水平；④最后一步離子交換層析采用常壓填料，處理量大，活性回收率高，同時(shí)去除了熱原及核酸、磷脂、脂多糖，該步的要點(diǎn)是要在整個(gè)純化過程中應(yīng)加一定濃度的甘氨酸(我們工藝中甘氨酸的濃度為0.15M)。本工藝對(duì)三批各22.5L發(fā)酵產(chǎn)物純化后每批可得純品2.9-3.3g，0.75mg規(guī)格成品可分裝300支以上。
(4)純品加入藥用甘氨酸以及磷酸鹽緩沖液等穩(wěn)定劑和助溶劑后，用微孔濾膜過濾除菌，冷凍干燥成粉狀成品。注射用水溶解后應(yīng)用，可用于癌癥化療等原因引起的血小板減少癥的治療。
本品在體外能刺激IL-11和IL-6依賴株7TD-1和B9-11細(xì)胞增殖，據(jù)此可以測定IL-11的生物活性。
效力實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容包括rhIL-11體外對(duì)人正常骨髓造血祖細(xì)胞集落形成的影響；皮下注射對(duì)正常Balb/C雄性小鼠外周血小板及造血祖細(xì)胞集落形成的影響；對(duì)60Co全身照射及卡鉑腹腔注射所致血小板減少癥的治療作用；對(duì)卡鉑靜脈滴注所致獼猴血小板減少癥的治療作用；血小板功能指標(biāo)及其動(dòng)態(tài)變化。
結(jié)果表明皮下注射rhIL-11可明顯地減輕照射及卡鉑注射所導(dǎo)致的外周血小板計(jì)數(shù)的下降程度，促進(jìn)血小板計(jì)數(shù)的恢復(fù)。100-400μg/kg/天注射小鼠，50-100μg/kg/天注射猴都有良好的療效，療后13-15天血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)到照射前水平，恢復(fù)時(shí)間較模型對(duì)照組明顯提前，延長治療可使血小板計(jì)數(shù)超過正常水平，劑量加大恢復(fù)時(shí)間提前，rhIL-11效力的強(qiáng)弱與血小板減少程度有關(guān)，血小板減少明顯時(shí)療效更顯著；rhIL-11對(duì)正常小鼠也能明顯提高血小板計(jì)數(shù)，體外對(duì)人和小鼠骨髓粒系、紅系、巨核系祖細(xì)胞形成均有明顯作用，但體內(nèi)注射對(duì)外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞無明顯影響。新產(chǎn)生的血小板功能正常。
本發(fā)明運(yùn)用重組DNA技術(shù)，在不改變編碼氨基酸的前提下，改變基因5′端部分核苷酸，從而提高了產(chǎn)物的表達(dá)，且產(chǎn)物以疏松的包涵體形式存在，分子易于變性復(fù)性。下游純化方式簡便，收率高，達(dá)到臨床用藥的質(zhì)量要求。本產(chǎn)品用于實(shí)驗(yàn)性血小板減少癥的治療，能得到顯著的療效。
本發(fā)明用下述實(shí)例進(jìn)行說明實(shí)施例1、PCR引物設(shè)計(jì)及人IL-11基因擴(kuò)增人IL-11蛋白質(zhì)分子由178個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其中N末端Pro缺失后以Gly起始，N末端個(gè)氨基酸列是Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg，由于原基因5′端序列GC含量太高，不利于在原核系統(tǒng)中表達(dá)，因此本設(shè)計(jì)首要思想是降低5′端GC含量，設(shè)計(jì)后的5′端引物序列是EcoRⅠ5′-CG GAATTC ATG GGT CCA CCA CCT GGT GGT CCA CCT3′端引物序列為SmaⅠ5′-CCC GGG TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG-3′
采用固相亞磷酸三酯法合成上述兩條寡聚脫氧核糖核苷酸，制備膠電泳分離純化。
采用微量異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法自人骨髓來源的基質(zhì)傳代細(xì)胞系KW102細(xì)胞中純化總RNA，使A260/A280比值＞1.8，取10μl(約5μg)總RNA，加50pmol 3′端引物，70℃熱變性5min，室溫冷卻使其自然降溫，待降至室溫后，42℃水浴中依次加入下列樣品反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液5μlRNA酶抑制劑20U40nM焦磷酸鈉 3μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶15U(1μl)dNTP(各2.5mM) 2μl加無RNA酶水至 25μl上述混合物42℃水浴反應(yīng)60min，加H2O 75μl 70℃作用5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，該反應(yīng)物可作為PCR擴(kuò)增的起始模板，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物20μl，加入下列成分10×PCR緩沖液 10μldNTP(各2.5mM) 16μl5′和3′兩側(cè)引物各40pmol加H2O至 99.5μl上述混合物95℃，2min后加入0.5μl Tap DNA聚合酶2.5U，混勻，95℃變性61℃退火、72℃延伸反應(yīng)各60秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)后延伸8min，取反應(yīng)物進(jìn)行電泳鑒定觀察到0.55kb的單一條帶，符合完整的人IL-1l基因的長度，并且能與標(biāo)記的5′端引物雜交。
實(shí)施例2、人IL-11基因在大腸桿菌中的表達(dá)及序列分析用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切0.55kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體質(zhì)粒pBV220，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收0.55kb和3.66kd的DNA片段。兩片段等摩爾混合，T4DNA連接酶12～16℃連接反應(yīng)過夜，連接物轉(zhuǎn)化入CaCl2處理的E.coli大腸桿菌DH5α中，經(jīng)氨芐青霉素篩選培養(yǎng)。挑選單個(gè)菌落，制備質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，含有人IL-11基因片段并且插入方向正確者，命名為pIL-11，相應(yīng)的工程菌命名為pIL-11/DH5α。
含有以上表達(dá)質(zhì)粒的工程菌經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)、溫度誘導(dǎo)，在19kd左右多出一條蛋白條帶。該蛋白能與人IL-11單克隆抗體呈顯特異反應(yīng)。
在測序引物引導(dǎo)下，分別自兩測對(duì)插入的人IL-11基因片段進(jìn)行DNA序列分析，肯定了所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物符合設(shè)計(jì)構(gòu)想，其編碼的氨基酸序列與人IL-11序列相同(測得的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列見表1)。
實(shí)施例3、人IL-11的發(fā)酵生產(chǎn)工程菌30℃過夜培養(yǎng)后，按5％比例接種于2YT培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD600為2.0時(shí)，將溫度升至42℃，此時(shí)IL-11即誘導(dǎo)產(chǎn)生，4h后收集菌體。在表達(dá)的不同時(shí)機(jī)加氮源、碳源等營養(yǎng)素。最終發(fā)酵產(chǎn)物密度可達(dá)20，生物量為每升培養(yǎng)物20-25g。電泳鑒定IL-11表達(dá)水平，薄層掃描顯示IL-11占菌體總蛋白的20％之間。
實(shí)施例4、工程菌的保存及穩(wěn)定性工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌種可用軟瓊脂LB平板。為檢查工程菌的穩(wěn)定性，將原始菌種、50代和100代菌分別抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果三者相同。同時(shí)三個(gè)菌擴(kuò)增培養(yǎng)物的產(chǎn)物表達(dá)水平相當(dāng)，證明本發(fā)明中的工程菌是十分穩(wěn)定的。
實(shí)施例5、IL-11的分離純化人IL-11在菌體內(nèi)以疏松的包涵體形式存在，菌體破碎后回收、純化包涵體，5M尿素抽提后上清首先經(jīng)過凝膠排阻層析初步純化，復(fù)性后IL-11再經(jīng)陽離子交換層析精制，可以較快速地得到IL-11純品。
凝膠排阻層析柱Sephacryl S-200經(jīng)50mM PB,pH7.0,1mM EDTA-Na2,5M尿素平衡后上樣，上樣后分步收集19kd的IL-11，初步純化后的IL-11用分步透析法去除尿素，完成復(fù)性過程，復(fù)性后樣品再經(jīng)過CM-Sepharase Fast Flow進(jìn)一步精制，收集分子量為19kd的IL-11純品。
實(shí)施例6、IL-11產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE和HPLC檢定純度均在98％以上，7TD1和B9-11細(xì)胞株MTT法測定其生物活性，比活性在8×106U/mg以上。N末端蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果除N端缺失Pro外，其余與體內(nèi)天然蛋白相同，順序是G.P.P.P.G.P.P.R.V.S.P.D.P.R.A。
實(shí)施例7、無菌過濾、分裝、凍干根據(jù)蛋白含量和活性，按以下比例加輔料和穩(wěn)定劑rhIL-11每支含0.75、1.5和3.0mg，緩沖體系為10mM PB,pH7.0,0.3M甘氨酸以上輔料必須符合注射用藥的要求。
無菌過濾在潔凈度達(dá)到100級(jí)的條件下，用0.22μM微孔濾膜過濾，分裝、凍干、封口、貼簽、裝箱。保存于2～8℃的冷藏環(huán)境中。
GGT CCA CCA CCT GGT CCA CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GACGly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Ary Ala Glu Leu Asp101 AGC ACC GTG CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG2 Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu20 301 AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG2 Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met40 501 AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC2 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 701 CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG2 Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys80 901 ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG2 Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu100 1101 CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG2 Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro120 1301 CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG2 Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly140 150CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGALeu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu160 170表1．IL-11 cDNA及氨基酸序列(1．核苷酸序列2．氨基酸序列)
權(quán)利要求
1.一種重組人白細(xì)胞介系-11(IL-11)的制備方法，包括PCR引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增的基因、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)產(chǎn)物的純化工藝，其特性在于(1)5′端PCR引物及擴(kuò)增cDNA5′端序列為EcoRⅠ5′-CG GAATTC ATG GGT CCA CCA CCT GGT CCA CCT(2)上述IL-11 cDNA與含有PL、PR啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pBV220組裝成高效表達(dá)質(zhì)粒pIL-11；(3)pIL-11轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用溫度誘導(dǎo)IL-11基因的表達(dá)，產(chǎn)物以包涵體形式存在工程菌內(nèi)；(4)通過發(fā)酵技術(shù)擴(kuò)增工程菌，用2YT作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在表達(dá)不同時(shí)機(jī)加氮源、碳源等營養(yǎng)素；(5)發(fā)酵后破碎菌體，純化包涵體并用尿素溶解變性，隨后采用凝膠排阻層析和陽離子交換層析二步法純化產(chǎn)品，兩步之間進(jìn)行分子復(fù)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1制備的人IL-11純品加入甘氮酸等穩(wěn)定劑和助溶劑后，無菌過濾、分裝、凍干后制成成品，保存于2∽8℃的冷藏環(huán)境中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的藥物制劑，可以用于治療癌癥化療等原因引起的血小板減少癥，減少出血等并發(fā)癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人白細(xì)胞介素－11(IL一11)的制備方法。本發(fā)明利用遺傳密碼具有兼并性的原理,設(shè)計(jì)了大腸桿菌偏愛密碼子,PCR擴(kuò)增的人IL－11cDNA片段與原核表達(dá)載體如pBV220 組裝成高效表達(dá)質(zhì)粒pIL－11, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用溫度誘導(dǎo)IL－11基因表達(dá),表達(dá)量達(dá)菌體總量蛋白的20%。工程菌經(jīng)發(fā)酵擴(kuò)增,破碎后提取包涵體,包涵體經(jīng)純化后用尿素溶解變性并采用凝膠排阻層析和陽離于交換層析二步法純化產(chǎn)品,兩步之間進(jìn)行分子復(fù)性,加保護(hù)劑后制成藥用凍干制劑。該制劑可治療癌癥化療等原因引起的血小板減少癥,減少出血等并發(fā)癥。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1298883SQ99125600
公開日2001年6月13日 申請(qǐng)日期1999年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月7日
發(fā)明者徐明波, 王勇波, 黃向東, 趙冰, 盧安京 申請(qǐng)人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限責(zé)任公司