專利名稱：以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；讣爸品ǖ闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酶生物技術(shù)，特別是涉及一種以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；浮?br> 天然酶在食品、化工和醫(yī)藥工業(yè)中廣泛應用。但由于酶是一種可溶性的蛋白質(zhì)，不易回收，造成了浪費，此外還會污染產(chǎn)物。將酶人工固定，制成固定化酶，不僅使酶可以回收，重復使用，還提高了酶的穩(wěn)定性，簡化了后處理。酶的固定化方法可分為載體結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法三大類。載體結(jié)合法是將酶結(jié)合在水不溶性載體上的一類固定化方法，又可分為物理吸附法、離子結(jié)合法和共價結(jié)合法等。其中共價結(jié)合法是將酶以共價鍵結(jié)合于載體上，因而酶結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，是載體結(jié)合法中應用最多的一種，也是工業(yè)上應用最廣泛的方法。
青霉素類抗生素是目前臨床使用最廣泛的抗生素，它具有抗菌力強，療效高，毒性低等優(yōu)點，是重要的抗感染藥物。它的抗菌作用機制是抑制細菌細胞壁的合成。其分子內(nèi)的β-內(nèi)酰胺環(huán)的完整性是其抗菌作用的前提。天然青霉素有青霉素G(PenG)和青霉素V(PenV)兩種，天然青霉素的長期使用，產(chǎn)生了抗性細菌?？剐跃僧a(chǎn)生青霉素酶，水解青霉素分子內(nèi)的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使之失活。若人工改變天然青霉素分子內(nèi)β-內(nèi)酰胺環(huán)上所聯(lián)的側(cè)鏈基團，即得到半合成青霉素，側(cè)鏈基團的改變可增加β-內(nèi)酰胺環(huán)的穩(wěn)定性；各種半合成青霉素具有殺菌譜廣，穩(wěn)定性好，可口服等優(yōu)點，因而在臨床上迅速取代了天然青霉素，目前，世界范圍內(nèi)80％以上的天然青霉素都是用于半合成青霉素的生產(chǎn)。
6-氨基青霉烷酸(6-Aminopenicillani Acid，簡稱6-APA)是生產(chǎn)半合成青霉素的關(guān)鍵性中間物，目前，臨床上使用的半合成青霉素全部來自6-APA。
6-APA是通過切割PenG或PenV的側(cè)鏈獲得的。以天然PenG或PenV為起始物，用化學法或酶法水解掉其側(cè)鏈，其中酶法采用的是青霉素?；??；瘜W法和酶法是同時起步發(fā)展的，都已用于工業(yè)生產(chǎn)。二者各有優(yōu)點。但是，隨著固定化酶技術(shù)的迅速發(fā)展應用及石化產(chǎn)品和能源價格的不斷上漲，酶法顯現(xiàn)出較好的經(jīng)濟性；另外，酶法不污染環(huán)境，操作也較方便。因此，現(xiàn)在6-APA的工業(yè)生產(chǎn)主要是通過采用青霉素?；杆釶enG或PenV實現(xiàn)的。
工業(yè)上用酶法水解青霉素生產(chǎn)6-APA是在1960年左右開始起步的。最初采用的是活性菌種的細胞懸液，僅能使用一次，生產(chǎn)力非常低，大約為0．5-1kg6-APA／kg E．coli懸液，后來，通過固定化E．coli細胞，可將生產(chǎn)率提高至50kg 6-APA／kg固定化催化劑。目前，主要用固定化酶，生產(chǎn)率一般為100-1000kg 6-APA／kg固定化催化劑。已報道的青霉素酰化酶的載體有瓊脂糖、明膠、幾丁質(zhì)和絲素膜等天然聚合物和大孔吸附樹脂、苯乙烯-二乙烯基苯離子交換樹脂(在文獻1JP5959191中進行了介紹)以及在文獻2微生物學報，38(3)，204-207，1998中介紹的聚丙烯腈纖維等合成聚合物。
國內(nèi)的6-APA生產(chǎn)廠家多使用纖維狀固定化青霉素?；?，由于反應器中液相混合不好，不利于反應過程中酸度的調(diào)控，而且需要人工將載體裝填入反應器，勞動強度大，反應過程不穩(wěn)定，已逐漸被顆粒狀固定化酶取代。而上述顆粒狀載體往往不是專用于固定化酶的，影響酶活性的發(fā)揮，如離子交換樹脂原用于水處理和其它分離過程，幾丁質(zhì)則是經(jīng)過化學處理的天然聚合物，批次質(zhì)量難以穩(wěn)定，在文獻3中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，24(3)，100-103，1993中有介紹。另外國內(nèi)雖然已有顆粒狀固定化青霉素酰化酶生產(chǎn)，但所用的載體為進口載體(Eupergit C)，使固定化酶的成本很高。
目前，我國生產(chǎn)半合成青霉素所用的6-APA大部分依靠進口，也有廠家進口固定化青霉素?；负团涮准夹g(shù)生產(chǎn)6-APA，不僅花費大量外匯，也嚴重影響和制約著我國醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展。
本發(fā)明的目的為了克服上述某些固定化酶載體使用會影響酶活性的發(fā)揮，為了克服使用纖維狀固定化青霉素酰化酶時，反應器中液相混合不好而影響反應過程中酸度的調(diào)控，而且生產(chǎn)過程中需要人工將載體裝填入反應器，勞動強度大，反應過程不穩(wěn)定等缺點；為了制備一種性能優(yōu)良、成本較低的、質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品；和為了促進固定化酶技術(shù)的發(fā)展，以及實現(xiàn)我國半合成抗生素原料的國產(chǎn)化，從而提供一種用于6-APA的工業(yè)生產(chǎn)，以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；讣爸品ā?br> 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種利用懸浮聚合技術(shù)制備出多元共聚多孔微珠載體，經(jīng)過表面改性和活化，將青霉素?；附Y(jié)合上去，制備成固定化青霉素?；福w粒直徑為80-400μm，濕密度為1．02-1．109／cm3的以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?。
由于該固定化青霉素?；甘褂昧艘环N利用懸浮聚合技術(shù)制備出的多元共聚多孔微珠載體，載體表面的可活化基團(-OH)多，可以結(jié)合更多的酶，因而所得的固定化青霉素?；赋杀镜?，比活力更高。
本發(fā)明提供了一種制備以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素酰化酶的方法，利用與本發(fā)明相關(guān)的專利申請(申請?zhí)枮?9109836．0)的懸浮聚合技術(shù)制備出多元共聚多孔微珠載體，經(jīng)過表面改性和活化，將青霉素?；附Y(jié)合上去，制備成固定化青霉素?；??；驹?以對苯醌活化為例)為 以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；傅闹品ㄒ老铝胁襟E進行(1)多元共聚多孔微珠的制備共聚單體有四類(A、B、C、D)，其配料比例如下單體A 5-30重量份；單體B 5-30重量份；單體C 40-90重量份；單體D 0-10重量份；其中單體A包括苯乙烯、對乙烯基甲苯和間乙烯基甲苯中的一種或多種，單體B包括二乙烯基苯和異氰尿酸三烯丙酯中的一種或兩種，單體C包括乙酸乙烯酯，單體D包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和甲基丙烯酸中的一種或多種；
將A、B、C、D四類單體按上述比例充分混合。按照每100g上述混合好的單體計，加入引發(fā)劑0．8-1．3g，致孔劑6-30ml和200#汽油0-20ml。其中引發(fā)劑采用如偶氮二異丁腈(AIBN)，或過氧化苯甲酰(BPO)等本行業(yè)通用的引發(fā)劑，制孔劑采用如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯或丁酸丁酯等本行業(yè)通用的制孔劑；在單體總體積3-4倍的含有1-4％wt的明膠及1％wt Mg(OH)2的懸浮體系中進行聚合反應。40℃開始緩慢升溫，升溫速率為0．45-0．65℃／min，65-70℃聚合5小時，70℃以上固化6-10小時，過篩，用大量的水洗滌，然后用丙酮浸泡，洗去致孔劑，得到多孔微珠。
(2)表面改性采用醇解工藝進行表面改性，將上述步驟得到多孔微珠風干，加入過量的含3-5％wtNaOH的甲醇溶液，18-25℃反應24-48小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
(3)載體活化活化試劑包括對苯醌、環(huán)氧氯丙烷、三氯三嗪、SESA、SESA+戊二醛、對甲苯磺酰氯、溴化氰和雙縮水甘油醚，采用常規(guī)活化工藝進行載體活化，其具體活化條件由每種活化劑決定。
(4)掛酶按每0．2-0．4g載體(濕重)加入800單位的青霉素酰化酶酶液的比例，于19-22℃反應36小時后再加入等量的青霉素酰化酶，繼續(xù)反應12-24小時后停止。產(chǎn)物依次以24％wt的(NH4)2SO4或0．5M的NaCl溶液和pH8．0的磷酸緩沖液洗滌，得到以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?。
本發(fā)明的效果1、本發(fā)明制備的以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；福漕w粒直徑為80-400μm，濕密度為1．02-1．10g／cm3，適合于反應器操作；不易染菌，強度優(yōu)于國外通常采用的瓊脂糖6B微珠。
2、本發(fā)明制備的固定化青霉素?；副扔铆傊?B微珠和Eupergit C制備的固定化酶活性要高(比用瓊脂糖6B微珠制備的固定化酶活性高5-10倍，比用EupergitC制備的固定化酶活性高2-3倍)。本發(fā)明制備的固定化青霉素?；概c用其它方法制備的固定化青霉素?；富钚缘谋容^見表1。
3．本發(fā)明的產(chǎn)品價格便宜，穩(wěn)定性好。本發(fā)明制備的固定化青霉素?；傅姆€(wěn)定性如

圖1所示。
4、解決我國半合成青霉素的原料國產(chǎn)化。
5、本發(fā)明提供的制備方法簡單，反應過程穩(wěn)定，適于工業(yè)批量生產(chǎn)。表1固定化青霉素?；富钚缘谋容^
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
圖1是本發(fā)明制備的以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；傅姆€(wěn)定性圖。
實施例11 將苯乙烯5g、二乙烯基苯5g、乙酸乙烯酯90g充分混合，加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)1．1g，致孔劑乙酸丁酯10ml和200#汽油10ml，在400ml含有2．5％明膠及1％Mg(OH)2的懸浮體系中進行聚合反應。40℃開始緩慢升溫，升溫速率為0．56℃／min，65℃聚合5小時，70℃固化2小時，75℃固化3．5小時，80℃繼續(xù)固化1小時后，停止反應，過篩，用大量的水洗滌，然后用丙酮浸泡，洗去致孔劑，制成微珠。
2 將上述微珠風干，加入過量的含3％NaOH的甲醇溶液，18℃反應24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的多元共聚多孔微珠載體。
3 按活化1g濕載體加入10ml活化液的比例添加活化液。活化液的配比為0．6g對苯醌溶解于pH7．5、含20％乙醇的0．1M的磷酸緩沖溶液100ml中。28℃反應5小時，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去離子水洗滌載體至洗滌液無色。
4 按每0．2g載體(濕重)加入800單位的青霉素?；该敢旱谋壤?，于19℃反應36小時后再加入等量的青霉素?；?，繼續(xù)反應12小時后停止。產(chǎn)物依次以24％的(NH4)2SO4和pH8．0的磷酸緩沖液洗滌，得到以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；浮?br> 3 按活化1g濕載體加入10ml活化液的比例添加活化液?；罨旱呐浔葹?.8g對苯醌溶解于pH7．5、含20％乙醇的0．1M的磷酸緩沖溶液100ml中。27℃反應5小時，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去離子水洗滌載體至洗滌液無色。
4 按每0．3g載體(濕重)加入800單位的青霉素?；该敢旱谋壤?0℃反應36小時后再加入等量的青霉素?；?，繼續(xù)反應18小時后停止。產(chǎn)物依次以0．5M的NaCl溶液和pH 8．0的磷酸緩沖液洗滌，得到以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?。
3 按活化1g濕載體加入10ml活化液的比例添加活化液?；罨旱呐浔葹?．0g對苯醌溶解于pH7．5、含20％乙醇的0．1M的磷酸緩沖溶液100ml中。25℃反應5小時，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去離子水洗滌載體至洗滌液無色。
4 按每0．4g載體(濕重)加入800單位的青霉素?；该敢旱谋壤?，于22℃反應36小時后再加入等量的青霉素?；?，繼續(xù)反應24小時后停止。產(chǎn)物依次以24％的(NH4)2SO4和pH8．0的磷酸緩沖液洗滌，得到以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?。
2 將上述微珠風干，加入過量的含5％NaOH的甲醇溶液，22℃反應36小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 按活化1g濕載體加入10ml活化液的比例添加活化液?；罨旱呐浔葹?g環(huán)氧氯丙烷溶解于pH8．5的0．1M的磷酸緩沖溶液100ml中。30℃反應10小時，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去離子水洗滌載體至洗滌液無色。
4同實施例1。
2 將上述微珠風干，加入過量的含4％NaOH的甲醇溶液，25℃反應24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 活化液的配比為將0．01g三氯三嗪以少量丙酮溶解后，以蒸餾水稀釋1倍。將載體顆粒與等體積的丙酮混合，攪動0．5小時，加入活化液，攪動5分鐘，加入0．1體積的2M Na2CO3，再攪動5分鐘，依次用50％的丙酮、去離子水洗滌載體。
4 同實施例2。
2 將上述微珠風干，加入過量的含3％NaOH的甲醇溶液，18℃反應48小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 活化液的配比為向1．25g SESA中加入3．8ml水和11．2ml 2％的Na2CO3(溶于0．1M的NaOH中)溶液，pH為6．4-6．7，過濾棄去濾渣。將1克載體(濕重)加入到上述活化液中，攪勻，78℃反應10分鐘，加入0．75gNaCl，13分鐘后加入0．6克Na2CO3，升溫至83℃，攪拌30分鐘，冷卻抽干，用蒸餾水洗5次(每次約60ml)，抽干。
4 將上述載體在0-5℃下加2．4ml水、5．6ml 1M的HCl，混勻，緩慢滴加4ml 5％的NaNO2，攪勻，20分鐘后抽干，用0.05M的冷HCl洗3次(每次約60ml)，最后用冷水洗1-2次，使pH約4．5，抽干，立刻在0-5℃下滴加用0．5M的Na2CO3調(diào)pH至8．0的酶液1ml，攪拌均勻(此時pH降至約5．8)，再滴加0．5M的Na2CO3至pH約5．0，0．5-3小時后，用冷蒸餾水洗4次(每次約50ml)。產(chǎn)物依次以24％的(NH4)2SO4和pH8．0的磷酸緩沖液洗滌，得到以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?。
2 將上述微珠風干，加入過量的含5％NaOH的甲醇溶液，22℃反應36小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 活化液的配比為1g對甲苯磺酰氯溶解于2ml干丙酮(含水量低于0．01％的丙酮)中。將1g濕載體依次用20倍于顆粒沉積體積的蒸餾水、蒸餾水一丙酮混合液(體積比3∶1)、蒸餾水一丙酮混合液(體積比1∶3)、丙酮、干丙酮洗滌載體，洗滌時間為1．5小時。將載體轉(zhuǎn)入2ml活化液中，搖勻，振蕩中緩慢加入1ml吡啶，室溫反應1小時，按與上述洗滌順序相反的順序洗滌。
4 同實施例1。
2 將上述微珠風干，加入過量的含4％NaOH的甲醇溶液，25℃反應24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 按活化1g濕載體加入10ml活化液的比例添加活化液?；罨旱呐浔葹?．8g溴化氰溶解于pH7．5、含20％乙醇的0．1M的磷酸緩沖溶液100ml中。27℃反應5小時，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去離子水洗滌載體至洗滌液無色。
4 同實施例2。
2 將上述微珠風干，加入過量的含3％NaOH的甲醇溶液，18℃反應48小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 按活化1g濕載體加入10ml活化液的比例添加活化液?；罨旱呐浔葹?g雙縮水甘油醚溶解于pH8．5的0．1 M的磷酸緩沖溶液100ml中。25℃反應5小時，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去離子水洗滌載體至洗滌液無色。
4 同實施例3。
2 將上述微珠風干，加入過量的含5％NaOH的甲醇溶液，22℃反應36小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 先按實施例6用SESA活化。將SESA活化過的載體與等體積的2．5％(v／v)的戊二醛溶液混合，室溫下?lián)u動4小時，過濾除去戊二醛，以蒸餾水洗滌，洗滌時不能將顆粒暴露于空氣，以免氧化。
4 同實施例1。
2 將上述微珠風干，加入過量的含4％NaOH的甲醇溶液，25℃反應24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
3 同實施例10。
4 同實施例2。本發(fā)明的配方中使用的是重量百分比。
利用產(chǎn)自巨大芽孢桿菌(中科院微生物研究所篩選)的青霉素?；?，制備固定化青霉素?；?，酶活收率平均為37％。在37℃重復使用時，酶活力批損失為0．26-0．5％，如圖1所示。
權(quán)利要求
1．一種以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?，其特征在于利用懸浮聚合法制備出多元共聚多孔微珠，經(jīng)過下述表面改性、載體活化和將青霉素?；附Y(jié)合上去的掛酶工藝制成顆粒直徑為80-400μm，濕密度為1．02-1．10g／cm3的以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?。
2．一種制備權(quán)利要求1所述的以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；傅闹品?，其特征在于依下列步驟進行(1)微珠制備將單體A、單體B、單體C、單體D充分混合；每100g上述混合單體，加入引發(fā)劑0．8-1．3g，致孔劑6-30ml和200#汽油0-20ml；在單體總體積3-4倍的含有1-4％wt的明膠及1％wt Mg(OH)2的懸浮體系中進行聚合反應，40℃開始緩慢升溫，升溫速率為0．45-0．65℃／min，65-70℃聚合5小時，70℃以上固化6-10小時，過篩，用大量的水洗滌，然后用丙酮浸泡，洗去致孔劑，得到多孔型微珠；(2)表面改性將上述微珠風干，加入過量的含3-5％wt NaOH的甲醇溶液，18-25℃反應24-48小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體；(3)載體活化根據(jù)活化試劑的種類采用不同的活化工藝條件(4)掛酶按每0．2-0．4g載體，以載體濕重計算，加入800單位的青霉素?；该敢旱谋壤?，于19-22℃反應36小時后再加入等量的青霉素?；福^續(xù)反應12-24小時后停止；產(chǎn)物依次以24％wt的(NH4)2SO4或0．5M的NaCl溶液和pH8．0的磷酸緩沖液洗滌，得到以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；?。
3．按照權(quán)利要求2所述的一種以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素酰化酶的制法，其特征在于所述的單體A包括苯乙烯、對乙烯基甲苯和間乙烯基甲苯中的一種或多種；單體B包括二乙烯基苯和異氰尿酸三烯丙酯中的一種或兩種；單體C包括乙酸乙烯酯；單體D包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和甲基丙烯酸中的一種或多種。
4．按照權(quán)利要求3所述的一種以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；傅闹品ǎ涮卣髟谟谒龅膯误w混合配比為單體A 5-30重量份；單體B 5-30重量份；單體C 40-90重量份；單體D 0-10重量份。
5．按照權(quán)利要求2所述的一種以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；傅闹品?，其特征在于所述的活化劑包括對苯醌、環(huán)氧氯丙烷、三氯三嗪、SESA、SESA+戊二醛、對甲苯磺酰氯、溴化氰和雙縮水甘油醚。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以多元共聚多孔微珠為載體的固定化青霉素?；讣爸品?。本發(fā)明用懸浮聚合法制出多元共聚多孔微珠,經(jīng)過表面改性和活化,將青霉素?；附Y(jié)合上去而制成。本發(fā)明制備的固定化青霉素?；割w粒直徑為80—400μm,濕密度為1.02—1.10g/cm
文檔編號C12N11/00GK1279287SQ9911151
公開日2001年1月10日 申請日期1999年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月18日
發(fā)明者叢威, 劉建國, 歐陽藩 申請人:中國科學院化工冶金研究所