專利名稱：無指盤臭蛙抗菌肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無指盤臭蛙(Rana grahami)抗菌肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青霉素的發(fā)現(xiàn)使人們對由病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病不再束手無策，并由此發(fā)展了大量的β-內(nèi)酰胺類抗生素，對保護人類健康作出了巨大貢獻。但隨著上述“傳統(tǒng)抗生素”的廣泛使用，不斷產(chǎn)生出諸多新問題。如β-內(nèi)酰胺類抗生素的過敏反應(yīng)以及長期使用導(dǎo)致抗藥菌株的產(chǎn)生。于是人們開始尋找新一代抗菌劑。近期的研究發(fā)現(xiàn)，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性如在最小作用濃度時，快速而廣譜地殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)；對真菌也有抑制作用；不會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生；對于局部感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗菌劑，其研制目前受到廣泛重視。
很多兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點。據(jù)國內(nèi)外文獻報道，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進入臨床治療。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國已獲準作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已進入三期臨床；Intrabiotics公司生產(chǎn)的活性多肽IB-367已獲準用于治療癌癥病人因多種細菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗；Applied Microbiology公司與Astra公司合作用活性多肽nisin治療胃潰瘍的臨床試驗也取得良好的療效。
我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機小分子，對其皮膚活性肽類物質(zhì)研究不多。無指盤臭蛙(Rana grahami)在國內(nèi)主要分布于廣西、四川、貴州和云南等地。
發(fā)明人將本發(fā)明的無指盤臭蛙抗菌肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽性細菌、真菌)的無指盤臭蛙抗菌肽及其應(yīng)用。
本發(fā)明的無指盤臭蛙抗菌肽采用常規(guī)方法制備，即乙醚刺激無指盤臭蛙，收集的皮膚分泌液離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)一系列的生物化學(xué)手段分離純化得到該多肽，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)，根據(jù)所得到的氨基酸序列合成該多肽。采用飛行時間質(zhì)譜法測定分子量，等電聚焦測定等電點，自動氨基酸測序儀確認氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的無指盤臭蛙抗菌肽是從兩棲類無指盤臭蛙分泌液中分離得到的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點為9.39，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為Leu Lys Gly Cys Trp The Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
本發(fā)明的無指盤臭蛙抗菌肽作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的無指盤臭蛙抗菌肽是從天然生物資源得到的產(chǎn)物，具有對細菌、真菌、病毒有強烈活性抑制作用，及無溶血活性的優(yōu)點，可作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明無指盤臭蛙抗菌肽的Sephadex G-50凝膠過濾柱層析圖。
圖2為本發(fā)明無指盤臭蛙抗菌肽反相高壓液相色譜圖。
圖3為本發(fā)明無指盤臭蛙抗菌肽的飛行時間質(zhì)譜圖。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
無指盤臭蛙抗菌肽的制備將活體無指盤臭蛙用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從無指盤臭蛙皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥后保存。
第一步，Sephadex G-50凝膠過濾柱層析，按上述方法獲得的原材料無指盤臭蛙皮膚分泌液凍干粉300mg溶解于5ml純凈水，10000rpm 4℃離心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝膠過濾柱(長1000mm，直徑26mm)用0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液平衡，充分后將樣品上于該柱。用同樣緩沖液洗脫，收集活性峰。
第二步，反相高壓液相色譜為Sephadex G-50凝膠過濾得到的活性成分的峰上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(長300mm，直徑5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴緩沖液從0％至80％的梯度洗脫。收集具有抑菌作用的活性峰。
第三步，純化的無指盤臭蛙抗菌肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用飛行時間質(zhì)譜法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過上述方法制備的無指盤臭蛙抗菌肽是中國兩棲類無指盤臭蛙抗菌肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點為9.39，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為Leu Lys Gly Cys Trp The Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
無指盤臭蛙抗菌肽的藥理實驗1.無指盤臭蛙抗菌肽抑制細菌生長的作用抗菌活性檢測采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯6個。第一個鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h后測量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimalinhibitory concentration，MIC)。細菌菌株來源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此實驗做四個平行，取幾何平均值，結(jié)果如表1。
表1.無指盤臭蛙抗菌肽抑制細菌生長的作用

由表1可見，無指盤臭蛙抗菌肽有顯著的抑制細菌生長作用。
2.無指盤臭蛙抗菌肽抑制真菌生長的作用抗真菌活性檢測采用杯碟法，培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯5個。第一個鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h-48h后測量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細菌菌株來源于云南大學(xué)微生物研究所，此實驗做三個平行，取幾何平均值，結(jié)果如表2。
表2.無指盤臭蛙抗菌肽抑制真菌生長的作用

由表2可見，無指盤臭蛙抗菌肽具有顯著的抑制真菌生長作用。
權(quán)利要求
1.一種無指盤臭蛙抗菌肽，其特征在于該無指盤臭蛙抗菌肽是從兩棲類無指盤臭蛀分泌液中分離得到的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點為9.39，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為Leu Lus Gly Cys Trp The Lys Ser Ile Pro Pro LysPro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
2.權(quán)利要求1所述無指盤臭蛙抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于該無指盤臭蛙抗菌肽作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無指盤臭蛙抗菌肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。無指盤臭蛙抗菌肽是從兩棲類無指盤臭蛙分泌液中分離得到的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點為9.39，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為Leu Lys Gly Cys Trp TheLys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。其制備方法是乙醚刺激無指盤臭蛙收集的分泌液離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)凝膠過濾柱層析和反相高壓液相色譜后分離純化后得到。本發(fā)明的無指盤臭蛙抗菌肽具有對細菌、真菌、病毒有強烈活性抑制作用，及無溶血活性的優(yōu)點，可作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/10GK1927880SQ200610010928
公開日2007年3月14日 申請日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者賴仞, 李建許, 徐學(xué)清, 徐春花, 李東升, 呂毅 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所