專利名稱：載體固相培養(yǎng)固定化酶方法
現(xiàn)有技術(shù)中利用多孔惰性載體顆粒支持菌體的固定化細胞技術(shù)均為液體深層培養(yǎng)法(Atkinson，B.，Black，G.M.et al.Biologicalparticles of Given size，shape，and Density for use in Biological Reactors，Biotechnol，Bioeng.Vol.21，193-200，1979)。其過程是多孔惰性載體—液體深層培養(yǎng)—固定化細胞。這種方法也可用于固定化酶(Nakashima，T.，F(xiàn)ukuda，H.et al.Culture conditions for IntracellularLipase production by Rhizopus Chinenis and Its Immobiolizationwithin Biomass support particles，J.Ferment，Technol.，Vol.66，No.4.441-448，1988)。其過程是多孔惰性載體—液體深層培養(yǎng)—后處理—固定化胞內(nèi)酶。
以制備固定化胞內(nèi)酶為目的采用上述深層培養(yǎng)法，雖然避免了酶的提取過程，但其缺點是(1) 深層培養(yǎng)物中，除載體與生長細胞外，還有大量的游離細胞；(2) 由細胞產(chǎn)生的胞外酶分泌到培養(yǎng)液中，隨發(fā)酵液被排放丟棄；(3) 排放大量廢水污染環(huán)境。
本發(fā)明目的在于提供一種多孔載體固相培養(yǎng)固定化酶方法，即多孔惰性載體—固態(tài)培養(yǎng)—固定化酶的過程。該方法利用固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)點，使微生物以自然方式生長后，經(jīng)簡易處理即可得到載體支持的細胞結(jié)合酶(固定化酶)，無廢水排放，方法簡易。
本發(fā)明實現(xiàn)發(fā)明目的的方法是以一定的配比將接種孢子或細胞的液體培養(yǎng)基注入已滅菌的惰性載體中，固態(tài)培養(yǎng)后進行后處理，從而制備出固定化酶。
以下為本發(fā)明的詳細說明在固定化細胞技術(shù)中，利用載體支持細胞的固定化酶的優(yōu)點是目標酶不必經(jīng)過分離提取即可實現(xiàn)固定化。本發(fā)明對已有固定化方法加以改進，利用載體固相培養(yǎng)法制備載體支持的細胞固定化酶和胞外酶在內(nèi)的固定化酶。
本發(fā)明的方法中不采用液體深層培養(yǎng)法，也不采用傳統(tǒng)的固態(tài)底物的固態(tài)培養(yǎng)法，而是利用惰性多孔載體，其中飽含液體培養(yǎng)基的載體固相培養(yǎng)方法。這樣，可使菌體在載體孔隙和表面上充分生長而產(chǎn)生大量的酶(胞內(nèi)酶和胞外酶)，不必經(jīng)過固液分離，使工藝簡單易行。
本發(fā)明首先將滅菌載體裝入容器內(nèi)，按載體吸水量，加入一定比例的液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基內(nèi)事先接種適量的細胞或孢子)經(jīng)一定時間的通氣搖瓶或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，即可在載體孔隙與表面長滿細胞，并得到一定的目標酶酶活性。這種工藝不僅實現(xiàn)了細胞生長和酶的合成，而且避免了菌體分離和廢水排放。
本發(fā)明的主要工藝過程如下1.選取多孔載體，吸水率在50％～97％，孔隙大小(每英寸線性長度的孔隙數(shù)目)40ppi～90ppi作為固定化載體；2.裝所用容器1/5～1/3量的已滅菌上述多孔載體；3.按所培養(yǎng)絲狀真菌的需要配制液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，接種適量細胞或孢子，成為“液體—種子液”；4.向上述容器中加入“液體—種子液”，成為“載體—液體培養(yǎng)基—種子”體系，液體培養(yǎng)基加入量以載體吸飽液體而無可見液相為限度；5.將上述體系置于恒溫搖床中搖蕩培養(yǎng)或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，或通風培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為酶源微生物最適生長溫度，一般為28℃～40℃，培養(yǎng)時間視酶活性高峰而定，一般為24～96小時，達到酶活性高峰時停止培養(yǎng)，取出載體培養(yǎng)物；6.取出載體培養(yǎng)物后，先用無菌水洗滌，再用丙酮洗滌，真空干燥，即得到固定化酶。
下面通過三個實施例對本發(fā)明進一步說明，下面的實施例只是用于說明本發(fā)明，而不對本發(fā)明起限定作用。實施例1制備培養(yǎng)基蛋白胨7％，硝酸鈉0.1％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，滅菌并冷卻后，接入中華根酶(Rhizopus chinenis，AS3.817誘變菌株)的孢子一環(huán)。另取500毫升三角瓶，裝入滅菌的聚氨酯塑料小塊(6×6×6mm孔隙度0.97，密度44.32Kg/m3)裝入量為200個小塊，加入上述培養(yǎng)基一種子液100毫升，恒溫搖床200轉(zhuǎn)/分，30℃振蕩培養(yǎng)36小時。取出載體培養(yǎng)物，用無菌水洗滌，淋干水后，浸泡于200毫升丙酮中，30秒后取出，真空干燥，即得固定化酶，其脂肪酶酶活性為274.8U/g。實施例2少根根霉，誘變菌株，采用如實施例1同樣的方法進行載體固相培養(yǎng)，只是液體培養(yǎng)基采用土豆汁培養(yǎng)基，脂肪酶活力為415.7U/g。實施例3100毫升土豆汁培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，接種米曲霉3042孢子一環(huán)，另取500毫升三角瓶，裝入滅菌的絲瓜瓤200塊(6×6×6mm)，加入上述液體—種子培養(yǎng)基后，32℃下恒溫搖床培養(yǎng)30小時。取出載體培養(yǎng)物，用無菌水洗滌，淋干后，250毫升丙酮淋洗，然后真空干燥，得到固定化蛋白酶，活力為960單位/克。
權(quán)利要求
1.一種載體固相培養(yǎng)固定化方法的特征在于，多孔載體吸納微生物生長所需的液體培養(yǎng)基后，進行固相培養(yǎng)，再經(jīng)后處理得到固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔載體其特征在于，吸水率在30％以上，以60％～90％為最佳；孔隙率為50％～98％，以80％～97％為最佳；孔隙大小(每英寸線性長度的孔隙數(shù)目)為40ppi～90ppi以80ppi～90ppi為最佳。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物是指絲狀真菌，諸如米曲霉、根霉、黑曲霉等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體培養(yǎng)基組成是指權(quán)利要求2所述的微生物實際要求配制組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相培養(yǎng)是多孔載體吸納了液體培養(yǎng)基后，在通風條件下或震蕩旋轉(zhuǎn)條件下恒溫培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和根據(jù)權(quán)利要求5所述的固相培養(yǎng)是指體系沒有可見的水相的培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述和根據(jù)權(quán)利要求5所述以及權(quán)利要求6所述的液體培養(yǎng)基中含有一定比例的細胞和孢子，一般為液體培養(yǎng)基的2～10％(重量/體積)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)溫度采用培養(yǎng)微生物的最適溫度，一般為28～40℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述后處理是指載體固相培養(yǎng)物用水洗滌后再用丙酮洗滌，然后真空下干燥，得到固定化酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及載體固相培養(yǎng)固定化酶的制備方法。本發(fā)明的特征是:以人工合成或天然的無機多孔材料或有機高分子材料為載體,在吸納液體培養(yǎng)基后,經(jīng)固態(tài)培養(yǎng),使微生物細胞在載體孔隙和表面生長。然后,經(jīng)水洗和丙酮處理、真空干燥,制得固定化酶。本發(fā)明免除了酶的分離提取的繁瑣過程,避免了酶提取和細胞培養(yǎng)過程中的廢水排放。
文檔編號C12N11/04GK1256311SQ9812105
公開日2000年6月14日 申請日期1998年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月8日
發(fā)明者王運吉, 張苓花, 田兵 申請人:大連輕工業(yè)學(xué)院