專利名稱：灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置，它是由供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)及保護(hù)盒(F)組成的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置。
如何正確篩選出對某一腫瘤具有化療敏感性的藥物來進(jìn)行針對性較強的個體化治療，以期提高化療效果并降低化療藥物的毒副作用，已成為近年來改善腫瘤化療方法所追求的目標(biāo)。自七十年代以來，化療藥物敏感性試驗在探索中不斷發(fā)展，目前已有體內(nèi)和體外兩大類試驗方法。但是這兩類方法均不能反映藥物在體內(nèi)對腫瘤的實際殺傷情況，主要問題有(1)動物體內(nèi)藥敏試驗雖然模擬了人體內(nèi)的生理環(huán)境，但與人體內(nèi)的復(fù)雜的免疫環(huán)境相比差異仍很大，而且實驗周期長、費用高昂、用藥量大，這些因素限制了它的應(yīng)用；(2)以往應(yīng)用的體外單層細(xì)胞或單細(xì)胞懸液培養(yǎng)藥物敏感性試驗，腫瘤細(xì)胞在加入化療藥物的培養(yǎng)液中生長，往往使所測得的藥物敏感性明顯高于體內(nèi)實際情況，不能反應(yīng)體內(nèi)可能參與作用的其它因素。
由于實體瘤在體內(nèi)占據(jù)一定的空間立體結(jié)構(gòu)，其表層及不同深度層的血管分布、氧及營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)均不相同，處于不同增殖狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)及比例亦不相同，從而導(dǎo)致了對化療藥物敏感性的差異。探索能夠模擬實體瘤內(nèi)部血運不豐富、藥物不易到達(dá)深部、細(xì)胞增殖周期不同步以及有相應(yīng)的細(xì)胞生長微環(huán)境等因素的體外細(xì)胞培養(yǎng)法日益受到重視。細(xì)胞團(tuán)或組織塊培養(yǎng)法有類組織的特點，但腫瘤細(xì)胞團(tuán)仍浸于培養(yǎng)液中生長，不能建立適于細(xì)胞生長的微環(huán)境，另外，由于各細(xì)胞團(tuán)或組織塊的取材部位的不同，各細(xì)胞團(tuán)或組織塊間的均一性和可比性存在差異，以及在培養(yǎng)過程中細(xì)胞團(tuán)或組織塊內(nèi)部可出現(xiàn)自發(fā)性壞死等因素，均不利于對藥物敏感性試驗結(jié)果的判定。
由德國學(xué)者Petra Kpf-maier于1991年報道的人體腫瘤的類器官培養(yǎng)法(1.Petra Kpf-Maier and B.Zimermann.Organoid reorganizationof human tumors under in vitro conditions.Cell and Tissue Research.1991，264563-576；2.Petra Kpf-Maier.A new approach for realizingthe″antioncogram″.Life Sciences.1992，50(22)1711-1718；3.P.Kpf-Maier and B.Kolon.An organoid culture assay(OCA) for deter-mining the drug sensitivity of human tumors.Int J Cancer.1992，5199-107)，即將由腫瘤組織制備的高濃度的含有多種細(xì)胞的懸液滴在置于培養(yǎng)液表面的濾紙上的細(xì)胞生長介質(zhì)濾膜(如硝酸纖維膜)上進(jìn)行培養(yǎng)，幾天后可形成緊密的細(xì)胞團(tuán)，由此建立了一個類似人體內(nèi)腫瘤生長環(huán)境的腫瘤模型。這種類器官培養(yǎng)法具有以下特點(1)經(jīng)培養(yǎng)生長成由成纖維細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞以及上皮來源的癌細(xì)胞等異源細(xì)胞組成的癌細(xì)胞團(tuán)；(2)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)具有腺腔、微絨毛、細(xì)胞間連接灌流體等類似來源組織的立體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征；(3)保持了腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性，建立了細(xì)胞間的相互作用關(guān)系；(4)培養(yǎng)基中的藥物須透過濾膜的孔接觸癌細(xì)胞，生長微環(huán)境以及與藥物的作用方式近似于體內(nèi)的情況。但是此方法在生理代謝與藥代動力學(xué)方面尚存在一些問題，如體內(nèi)血供不斷給腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時帶走組織代謝排泄物，使局部微環(huán)境保持穩(wěn)定等，而這種類器官培養(yǎng)法僅依靠滲透作用局部交換，細(xì)胞生長微環(huán)境中的代謝產(chǎn)物將會在局部逐漸積累增多，而提供的氧和營養(yǎng)物質(zhì)卻逐漸減少，同時加入培養(yǎng)基中的藥物透過細(xì)胞生長介質(zhì)濾膜的量和速度也受到影響。
本發(fā)明的目的是為了解決Petra Kpf-maier的類器官培養(yǎng)法中存在的上述問題和缺點，研制一種適用于藥物敏感性試驗的組織培養(yǎng)裝置。參照1964年陳瑞銘和朱德厚報道的利用濾紙虹吸原理培養(yǎng)器官的方法(實驗生物學(xué)報.1964，9(2)163-171)以及鮑家駒報道的網(wǎng)格法器官培養(yǎng)(章靜波主編.細(xì)胞生物學(xué)實用方法與技術(shù).北京北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社.1995，847-49)和章靜波等報道的灌流式器官培養(yǎng)法(實驗生物學(xué)報.1979，12299-300)，在Petra Kpf-maier類器官培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)和發(fā)展，從生理學(xué)、組織學(xué)、腫瘤生物學(xué)及藥理學(xué)等方面出發(fā)，在多重試驗的基礎(chǔ)上，發(fā)明了本項灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置。
本發(fā)明的目的可采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)由供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)及保護(hù)盒(F)組成的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置，此裝置的各組成部分的基本結(jié)構(gòu)特點及作用原理如下

圖1是供液槽(A)供液槽(A)是用于儲存培養(yǎng)液(G)并供應(yīng)組織生長需要的，在其一端的底部有一個滴管(a1)，在工作狀態(tài)時供液槽(A)中的培養(yǎng)液自滴管(a1)流出，在供液槽(A)的底部有兩處有突出的支腳(a2)，以使供液槽(A)平穩(wěn)地置于支持方盤(D)上。
圖2是過濾管(B)過濾管(B)由外套管(b1)、內(nèi)套管(b2)和過濾物(b3)組成，過濾物(b3)置于內(nèi)套管(b2)中，內(nèi)套管(b2)和過濾物(b3)占外套管(b1)的下半部分，過濾管(B)以其外套管(b1)連接于供液槽(A)的滴管(a1)上，通過選擇不同內(nèi)徑的內(nèi)套管(b2)和過濾物(b3)來控制培養(yǎng)液的滴速。
圖3是灌流培養(yǎng)層(C)灌流培養(yǎng)層(C)由上層濾紙(c1)、上層帶孔隔離膜(c2)、上層細(xì)胞生長介質(zhì)(c3)，中層帶孔隔離膜(c4)和下層細(xì)胞生長介質(zhì)(c5)、下層帶孔隔離膜(c6)、下層濾紙(c7)由上至下排列組成，下層濾紙(c7)有一端較長并折向下方，其主體部分位于支持方盤(D)上。上、中、下三層帶孔隔離膜上有孔處上下相互對應(yīng)，兩層細(xì)胞生長介質(zhì)之間對應(yīng)于上、中、下三層隔離膜上有孔處(一處以上)為種植組織(細(xì)胞)區(qū)(c8)，每處可種植一株組織(細(xì)胞)。灌流培養(yǎng)層是本發(fā)明裝置的核心結(jié)構(gòu)，其作用原理是在工作狀態(tài)時培養(yǎng)液(G)加入供液槽中，培養(yǎng)液通過滴管(a1)經(jīng)過濾管(B)連續(xù)緩慢地滴在上層濾紙(c1)上，沿濾紙橫向漫延并向下方滲透，再依次經(jīng)上、中、下三層隔離膜上有孔處，由上向下穿過上、下兩層細(xì)胞生長介質(zhì)(c3，c5)到達(dá)下層濾紙(c7)上，在下層濾紙(c7)漫延，經(jīng)其較長并折向下方的一端滴入收液槽(E)中。通過上述過程，培養(yǎng)液由位于高處的供液槽中流向低處的收液槽中，在灌流培養(yǎng)層的種植組織(細(xì)胞)區(qū)形成了一種柱狀培養(yǎng)液灌流區(qū)域，類似于體內(nèi)組織的微循環(huán)血液供應(yīng)。
圖4是支持方盤(D)置于收液槽(E)上方的支持方盤(D)是用來放置灌流培養(yǎng)層(C)的。支持方盤的底面為長條形平面(d1)與灌流培養(yǎng)層(C)的主體部分相適應(yīng)，在其中一端有一個橫形的開口(d2)，灌流培養(yǎng)層的下層濾紙(c7)較長并折向下方的一端插入此處，支持方盤的四周為向上凸起的棱邊(d3)，起固定灌流培養(yǎng)層(C)以及防止培養(yǎng)液流失的作用。
圖5是收液槽(E)收液槽(E)位于支持方盤(D)的下方，是用于收集組織代謝廢液(H)的。
圖6是保護(hù)盒(F)保護(hù)盒(F)由盒底(f1)和盒蓋(f2)組成，收液槽(E)、支持方盤(D)、灌流培養(yǎng)層(C)、過濾管(B)、供液槽(A)分別置于保護(hù)盒中，構(gòu)成一個整體。
上述供液槽、收液槽、支持方盤和保護(hù)盒可由無細(xì)胞毒性作用的玻璃或硬質(zhì)塑料等材料制成，采用透明材料制成便于在培養(yǎng)中進(jìn)行觀察，灌流培養(yǎng)層中的細(xì)胞生長介質(zhì)可采用適于組織生長的微孔濾膜(如硝酸纖維膜等)制成，帶孔隔離膜可由無細(xì)胞毒性的塑料薄膜制成，過濾管的外套管可由乳膠或硅膠制成、內(nèi)套管由玻璃或硬質(zhì)塑料制成、過濾物由具有過濾性能的材料制成。
本發(fā)明的具體使用方法及步驟為在具備進(jìn)行普通組織培養(yǎng)的條件下，如溫度37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱等(鄂征主編.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù).北京北京出版社.1995)，按圖7所示將供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)及保護(hù)盒(F)分別組裝，即組成了灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置。
灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置的組裝及細(xì)胞種植順序在無菌條件下在無菌平臺上進(jìn)行操作，先將保護(hù)盒(F)的盒底(f1)置于無菌平臺上，將收液槽(E)置于盒底(f1)中，其上放置支持方盤(D)，將灌流培養(yǎng)層(C)的下層濾紙(c7)、下層帶孔隔離膜(c6)、下層細(xì)胞生長介質(zhì)(c5)、中層帶孔隔離膜(c4)依次排列于支持方盤(D)上，將要培養(yǎng)的組織如高濃度的細(xì)胞懸液滴在種植組織(細(xì)胞)區(qū)(c8)，再依次放置上層細(xì)胞生長介質(zhì)(c3)、上層帶孔隔離膜(c2)和上層濾紙(c1)，將過濾管(B)接于供液槽(A)并置于灌流培養(yǎng)層(C)上方，即完成上了組裝及細(xì)胞種植。
組織培養(yǎng)方法如圖8所示，將適量培養(yǎng)液(G)加入供液槽(A)中，蓋上保護(hù)盒(F)，將整個培養(yǎng)裝置放置于(37℃/5％二氧化碳)培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液通過滴管(a1)經(jīng)過濾管(B)連續(xù)緩慢地滴在上層濾紙(c1)上，沿濾紙橫向漫延并向下方滲透，再依次經(jīng)上、中、下三層隔離膜上有孔處，由上向下穿過上、下兩層細(xì)胞生長介質(zhì)(c3，c5)到達(dá)下層濾紙(c7)上，在下層濾紙(c7)上漫延，經(jīng)其較長并折向下方的一端流入收液槽中。通過上述過程，培養(yǎng)液由位于高處的供液槽中滴入低處的收液槽(E)中，在復(fù)合培養(yǎng)層的種植組織(細(xì)胞)區(qū)形成了一種柱狀培養(yǎng)液灌流區(qū)域，類似于體內(nèi)組織的微循環(huán)血液供應(yīng)。滴在種植組織(細(xì)胞)區(qū)的組織則開始生長，培養(yǎng)液的灌流供給方式是持續(xù)流動的，在培養(yǎng)過程中可間斷向供液槽中加入培養(yǎng)液，取出收液槽中的組織代謝廢液(H)，在幾天后可逐漸形成緊密的細(xì)胞團(tuán)(c9)，類似于Petra Kopf-maier的類器官培養(yǎng)法。
藥物敏感性試驗方法先將由腫瘤組織制備的高濃度的細(xì)胞懸液按上述組織培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，選擇一定時期將抗腫瘤藥物加入供液槽中的培養(yǎng)液中，繼續(xù)加以培養(yǎng)，可從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝等方面測定抗腫瘤藥物對細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)而判斷腫瘤組織對藥物的敏感性。此法適用于對實體腫瘤進(jìn)行藥物敏感性試驗。
與現(xiàn)有組織培養(yǎng)裝置比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果(1)建立了類似于體內(nèi)血液流動的微環(huán)境；(2)使腫瘤生長出的細(xì)胞團(tuán)類似于人體內(nèi)腫瘤的立體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征；(3)保持了腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及其相互間的作用關(guān)系；(4)在進(jìn)行藥物敏感性試驗時對培養(yǎng)組織供藥方式類似于體內(nèi)血供通路；(5)實驗方法簡便易行，藥物敏感性試驗結(jié)果更接近于體內(nèi)實際情況。
本灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置在國內(nèi)、外尚無先例，該發(fā)明雖然是對類器官培養(yǎng)法的改進(jìn)，不僅適用于進(jìn)行類器官培養(yǎng)，也可應(yīng)用于廣義的體外組織培養(yǎng)，包括對細(xì)胞、組織塊或器官進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明為腫瘤生物學(xué)特性的研究、抗癌新藥篩選、藥物作用機(jī)制的探討以及耐藥性的研究、抗癌新藥臨床前期實驗及體外化療藥物和放療敏感性試驗等的研究開辟了一條新途徑。
附圖的圖面說明如下圖1供液槽(A)；圖2過濾管(B)；圖3；灌流培養(yǎng)層(C)圖4支持方盤(D)；圖5收液槽(E)；圖6是保護(hù)盒(F)圖7灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置立體圖8圖7的剖視圖，為圖7中的0-0剖面；圖9灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置的實施例。
在圖7和圖9中只標(biāo)出了盒底和盒蓋的一部分。
A.供液槽 a1.滴管 a2.支腳 B.過濾管 b1.外套管 b2.內(nèi)套管 b3.過濾物 C.灌流培養(yǎng)層 c1.上層濾紙 c2.上層帶孔隔離膜 c3.上層細(xì)胞生長介質(zhì) c4.中層帶孔隔離膜 c5.下層細(xì)胞生長介質(zhì) c6.下層帶孔隔離膜 c7.下層濾紙 c8.種植組織(細(xì)胞)區(qū) c9.細(xì)胞團(tuán) D.支持方盤 d1.長條形平面 d2.開口 d3.棱邊 E.收液槽 F.保護(hù)盒 f1.盒底 f2.盒蓋 G.培養(yǎng)液 H.代謝廢液 ↓培養(yǎng)液流動方向本發(fā)明的實施方式如下，下面結(jié)合附圖作進(jìn)一步詳述實施例本實施例是由M組(M≥2)供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)及保護(hù)盒(F)分別并列組合成一體而成的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置。各組供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)均分別相同，其中多組保護(hù)盒(F)并列組合成了一個共用的保護(hù)盒。每條灌流培養(yǎng)層上有N個種植組織(細(xì)胞)區(qū)，則本實施例適于種植X株(X＝M×N)組織。
如圖9本實施例由3組供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)和一個保護(hù)盒(F)組成。在3條灌流培養(yǎng)層上，每個灌流培養(yǎng)層上有3個種植組織(細(xì)胞)區(qū)，這種灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置可一次同時培養(yǎng)3組共9株組織。
權(quán)利要求
1.一種組織培養(yǎng)裝置，其特征在于它是由供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)及保護(hù)盒(F)組成的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置，其特征在于其中的支持方盤(D)的底面為長條形平面(d1)，在其中一端有一個橫形的開口(d2)，四周為向上凸起的棱邊(d3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置，其特征在于其中的灌流培養(yǎng)層(C)是由上層濾紙(c1)、上層帶孔隔離膜(c2)、上層細(xì)胞生長介質(zhì)(c3)，中層帶孔隔離膜(c4)和下層細(xì)胞生長介質(zhì)(c5)、下層帶孔隔離膜(c6)、下層濾紙(c7)由上至下排列組成，其中下層濾紙(c7)有一端較長并折向下方，其主體部分位于支持方盤(D)上，上、中、下三層帶孔隔離膜上有孔處上下相互對應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置，其特征在于它是由多組(2組以上)供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)及保護(hù)盒(F)分別并列組合成一體而組成的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置，各組供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持平臺(D)、收液槽(E)均分別相同，其中多組保護(hù)盒(F)并列組合成了一個共用的保護(hù)盒。
全文摘要
本發(fā)明是涉及一種組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置,它是由供液槽(A)、過濾管(B)、灌流培養(yǎng)層(C)、支持方盤(D)、收液槽(E)及保護(hù)盒(F)組成的灌流式組織培養(yǎng)及藥物敏感性試驗裝置。本發(fā)明建立了具有類似于體內(nèi)血液流動特點的組織培養(yǎng)微環(huán)境,藥物敏感性試驗的供藥方式類似于體內(nèi)血供通路。本發(fā)明適用于類器官培養(yǎng)和細(xì)胞、組織塊或器官培養(yǎng),并適用于對新鮮實體腫瘤進(jìn)行藥物敏感性試驗以及腫瘤生物學(xué)特性的研究。
文檔編號C12M3/04GK1245830SQ9811815
公開日2000年3月1日 申請日期1998年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月26日
發(fā)明者王悅?cè)A 申請人:王悅?cè)A