專利名稱：具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白和編碼該蛋白的基因dna的制作方法
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白、編碼該蛋白的基因DNA、包括該基因DNA的重組質(zhì)粒、該重組質(zhì)粒被導(dǎo)入其中的轉(zhuǎn)化子和用該轉(zhuǎn)化子制備L-天冬氨酸的方法。
L-天冬氨酸用作藥品、食物添加劑等。最近，L-天冬氨酸也作為表面活性劑和生物可降解的螯合劑的原材料而受到重視。
2、背景技術(shù)的描述L-天冬氨酸主要通過酶學(xué)方法從延胡索酸和氨用天冬氨酸酶制備，作為編碼天冬氨酸酶的基因，已知的有源自大腸桿菌的基因[普通微生物學(xué)雜志，130,1271-1278(1984)]和源自黃色短桿菌MJ-233的基因(日本未審查的專利公報(bào)NO.5-30977)。
尋找除了上述那些基因外的編碼天冬氨酸酶的基因以更為有效地制備L-天冬氨酸是本發(fā)明的目的。
由于為了完成上述目的而進(jìn)行深入廣泛地研究，本發(fā)明者從紅球菌屬細(xì)菌中分離出一種具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白和編碼該蛋白的基因。這樣，本發(fā)明得以完成。
本發(fā)明涉及:
(1)一種具有天冬氨酸酶活性的蛋白，其具有顯示于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列或具有顯示于SED ID NO:1中氨基酸序列但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的缺失、替代或添加；(2)編碼該蛋白的基因DNA；(3)通過連接該基因DNA與載體質(zhì)粒而獲得的重組質(zhì)粒；(4)通過將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物而獲得的轉(zhuǎn)化子；
(5)用于通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子而制備上面(1)中蛋白的方法；和(6)在上面(4)中的轉(zhuǎn)化子或(1)中的蛋白存在下通過將延胡索酸或其鹽與氨或其鹽起反應(yīng)而制備L-天冬氨酸的方法。
圖．1為重組質(zhì)粒PAR002的限制性圖譜。雙線代表載體PUC118，且單線代表EA4菌株的DNA區(qū)域。EA4菌株DNA區(qū)域中的黑體箭頭表示由本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的天冬氨酸酶基因的位置和方向。
圖．2為重組質(zhì)粒PAR016的限制性圖譜。雙線代表源自質(zhì)粒PSJ034的區(qū)域，且單線代表EA4菌株的DNA區(qū)域。EA4菌株DNA區(qū)域中的黑體箭頭顯示由本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的天冬氨酸酶基因的位置和方向。
圖．3為解釋質(zhì)粒PSJ034的圖。
圖．4顯示構(gòu)建質(zhì)粒PSJ034的步驟。
作為產(chǎn)生具有天冬氨酸酶活性本發(fā)明蛋白及編碼該蛋白基因DNA的微生物的具體實(shí)例，可給出紅球菌SP·EA4(FERM BP-6231)。
用于本發(fā)明的宿主微生物沒有特別的限制。具體地，可列舉上述的EA4菌株及胭脂紅分枝桿菌ATCC12674、ATCC17041、ATCC17895、ATCC19140及ATCC33258。
這些菌株中，EA4菌株以上述的許可號(hào)保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，且其細(xì)菌學(xué)特征在日本未審查的專利公報(bào)NO·4-304892中加以描述。菌株ATCC12674、ATCC17041、ATCC17895、ATCC19140及ATCC33258可容易地從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。
下面，將參照下面的實(shí)施例對本發(fā)明加以更為詳細(xì)的描述，這決不意味著限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1(1)從EA4菌株中制備染色體DNA將EA4菌株在30℃于100ml MY培養(yǎng)(0.5％聚胨，0.3％bacto-酵母提取物，0.3％bacto-malt提取物，1％葡萄糖)中振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。然后，收獲細(xì)胞并懸浮于4ml含鹽的EDTA溶液中(0.1M EDTA,0.15M Nacl(PH8.0))。向懸液中加入8mg溶菌酶并于37℃振蕩1-2小時(shí)。然后，將得到的懸液冷凍。隨后，向其中加入10ml Tris-SDS溶液(1％SDS,0.1M Nacl,0.1M Tris-Hcl(PH9.0))并同時(shí)輕輕振蕩。此外向其中加入蛋白酶K(Merck)(終濃度0.1mg/ml)并于37℃振蕩1小時(shí)。向得到的懸液中加入等體積TE-飽和的酚(TE:10mMTris-Hcl,1mM EDTA(PH8.0))，搖勻并離心。收集上層物并向其中加入2體積的乙醇。然后，用玻棒纏繞DNA。用90％、80％及70％的乙醇以該順序去除酚。隨后，將DNA溶解于3ml TE緩沖液中。向此溶液中加入核糖核酸酶A溶液(100℃預(yù)處理15分鐘)以得到10μg/ml的濃度并且于37℃振蕩30分鐘。此外，向其中加入蛋白酶K并于37℃振蕩30分鐘，然后加入TE-飽和的酚。將得到的溶液離心以分成上層和下層。對上層重復(fù)兩次相同的操作。然后，向其中加入等體積氯仿和異戊醇的混合液(24∶1)，并且重復(fù)相同的提取操作(之后，此操作稱為“酚處理”)。隨后，向得到的上層物中加入2體積的乙醇，并且將DNA纏繞到玻棒上以獲得染色體DNA樣品。(2)探針的制備將10μl在步驟(1)中獲得的染色體DNA(1/20稀釋液)，10μl10×反應(yīng)緩沖液，3μl 50mM MgCl2,2μl 10mM DNTP,1μl(相當(dāng)于100pmol)每種顯示于SEQ ID NO:4中的寡核昔酸作為引物#1及顯示于SEQ ID NO:5中的寡核昔酸作為引物#2以及1μ1 Tag DNA聚合酶(GIBCO BRL)混合在一起以制備100μl的溶液。上面的每種引物根據(jù)在各種已知天冬氨酸酶中高度保守的區(qū)域加以設(shè)計(jì)。得到的溶液進(jìn)行30輪孵育，每個(gè)循環(huán)由93℃變性30秒，55℃退火30秒及72℃延伸2分鐘所組成。反應(yīng)完成后，用氯仿抽提3次，接著通過乙醇沉淀回收擴(kuò)增的DNA。用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離該DNA以獲得約600bp的DNA片段，該片段被認(rèn)為是編碼EA4菌株天冬氨酸酶基因的一部分。這樣獲得的DNA片段以DIG DNA標(biāo)記試劑盒(寶靈曼)標(biāo)記以制備探針。(3)DNA文庫的制備向200mlEA4菌株染色體DNA中加入40μ110×限制酶緩沖液，145μl無菌水及15μl限制酶并于37℃反應(yīng)6小時(shí)。然后，乙醇沉淀以回收DNA,并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切下約8kb的DNA片段并且DNA PREP(DIAIATRON)進(jìn)行回收。用連接試劑盒(Takara Shuzo)將此DNA片段插入到大腸桿菌載體PUC118的BamHI位點(diǎn)以制備重組DNA文庫。
用于連接中的PUC118片段按如下制備。向10μl PUC118中，加入10μ110×限制酶溶液，77μl無菌水及2μl限制酶Bam HI并于37℃反應(yīng)2小時(shí)。之后，進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀。將得到的DNA干燥且然后溶解于50μl無菌水中。向該溶液中加入1μl堿性磷酸酶，10μ110×緩沖液及39μl無菌水并于65℃反應(yīng)。之后，進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀。將得到的DNA干燥并溶于無菌水中。(4)轉(zhuǎn)化子的制備和重組DNA的篩選將大腸桿菌JM109菌株接種于1mlLB培養(yǎng)基(1％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，0.5％NoCl)并于37℃培養(yǎng)5小時(shí)。向100μl得到的培養(yǎng)物中加入50mlSOB培養(yǎng)基(2％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，10mM Nacl,2.5mM Kcl,1mM MgSO4lmM MgCl2)并于18℃培養(yǎng)20小時(shí)。然后，離心收獲細(xì)胞。向該細(xì)胞中加入13ml冰涼的TF溶液(20mM PIPES-KOH(PH6.0),200mMKcl,10mM CaCl2,40mM MnCl2)，讓其于0℃置10分鐘并重新離心。去上清后，將沉淀的大腸桿菌懸于3-2ml的冰涼TF溶液中。向得到的懸液中加入0.22ml二甲基亞砜并讓其于0℃放置10分鐘。向200μl這樣制備的感受總細(xì)胞中加入10μl含有上面步驟(3)中制備的重組質(zhì)粒(即，DNA文庫)溶液。然后，42℃熱休克30秒，并將混合物于0℃冰涼2分鐘。之后，向其中加入0.8ml SOC培養(yǎng)基(2％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，20mM葡萄糖，10MM NaCl,2.5MM KCl,1MM MgSO4,1MM MgCl2)。細(xì)胞于37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。將得到的培養(yǎng)物鋪板于200μl等份的LB瓊脂培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有100μl/ml氨芐青霉素。通過菌落雜交從生長于瓊脂培養(yǎng)基一的轉(zhuǎn)化子菌落中篩選具有天冬氨酸酶基因的轉(zhuǎn)化子。簡言之，將瓊脂培養(yǎng)基上生長出的轉(zhuǎn)化子菌落轉(zhuǎn)移至尼龍膜(BIODYNEA；Nihm Pall有限公司)，接著裂解細(xì)胞并固定DNA。然后，以上面步驟(2)中制備的探針(約600kb片段)-處理膜。DIG發(fā)光檢測試劑盒(寶靈曼)篩選含有感興趣重組DNA的菌落。(5)重組質(zhì)粒的制備將上面步驟(4)中篩選出的轉(zhuǎn)化子于100ml LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜。收獲細(xì)胞并以無菌水洗。向該細(xì)胞中加入5ml溶液Ⅰ(2mM葡萄糖，10mMEDTA,25mM Tris-Hcl(PH8.0))及25mg溶菌酶并讓其于0℃放置30分鐘。此外，加入10ml溶液Ⅱ(IN NaOH,5％SDS)并讓其于0℃放置5分鐘。之后，加入7.5ml溶液Ⅲ(3M醋酸鈉(PH4.8))并讓其于0℃放置30分鐘。將得到的混合物離心。向上清中，加入50ml乙醇并再離心。然后，去上清。向沉淀中加入5ml溶液Ⅳ(10mM醋酸鈉，50mMTris-Hcl(PH8.0))及2.5μl核糖核酸酶A溶液(10mg/ml)并讓其于室溫放置20分鐘。向得到的混合物中，加入12ml乙醇。然后，離心回收質(zhì)粒，以70％乙醇沖洗，干燥并溶解于0.4ml無菌水中。酚處理后，通過乙醇沉淀回收質(zhì)粒，干燥并溶于0.4ml無菌水中。這樣獲得的重組質(zhì)粒命名為PAR002。該重組質(zhì)粒PAR002，已作為轉(zhuǎn)化于大腸桿菌JM109/PAR002，以許可號(hào)FERM BP-6233保藏于日本通商產(chǎn)生省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所。(6)限制性圖譜的制備和探針雜交區(qū)域的測定通過以幾種限制酶消化在上面步驟(5)中獲得的質(zhì)粒PAR002而制備限制性圖譜(

圖1)。此外，PAR002以限制酶KpnⅠ、BgⅠⅡ、PstⅠ、SalⅠ等消化并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。然后，進(jìn)行Southern雜交以確定探針雜交的片段。(7)核苷酸序列的測定在上面步驟(6)中確定區(qū)域的側(cè)翼區(qū)核昔酸序列及確定區(qū)域本身的核昔酸序列用發(fā)碼西亞熒光測序議ALFⅡ加以測定。結(jié)果，獲得如SEQ ID NO:3中顯示的核昔酸序列。其中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)開放閱讀框，其具有顯示于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列。與氨基酸序列數(shù)據(jù)庫NBRF(國立生物醫(yī)學(xué)研究基地)比較，發(fā)現(xiàn)目的基因與已知的天冬氨酸酶在氨基酸序列水平有50-60％的同源性；并且目的多肽也在已知天冬氨酸酶高度同源區(qū)具有高度同源性。因此，認(rèn)為此多肽可能為一種新的天冬氨酸酶。此開放閱讀框的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:2中。實(shí)施例2(1)質(zhì)粒PAR016的制備將10μl PAR002(1/20稀釋液)，10μl 10×反應(yīng)緩沖液，3μ1 50mMMgCl2,2μl 10mM 4NTP,1μl(相當(dāng)于100pmol)顯示于SEQ ID NO:6中的每種寡核昔酸作為引物#3和顯示于SEQ ID NO:7中的寡核昔酸作為引物#4以及1μl Tag DNA聚合酶(GIBCO BRL)混合到一起以制備100μl溶液。設(shè)計(jì)引物是為了擴(kuò)增出含有EA4天冬氨酸酶ORF的片段。將這樣制備的溶液進(jìn)行30輪PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由93℃變性30秒，55℃退火30秒及72℃延伸2分鐘所組成。反應(yīng)完成后，氯仿抽提3次，接著通過乙醇沉淀以回收擴(kuò)增的DNA，隨后，將回收的DNA以限制酶×baI和Sse838I消化，且然后通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離。從凝膠中回收1.2kb的條帶并插入到紅球?qū)偌?xì)菌具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性質(zhì)粒pSJ034的×baI-Sse8387I位點(diǎn)(圖3)中以制備重組質(zhì)粒PAR016(圖·2)．根據(jù)圖4顯示的步驟根據(jù)質(zhì)粒pSJ023(在日本專利申請說明書NO.9-65616中描述過)制備質(zhì)粒pSJ034。質(zhì)粒pSJ023作為轉(zhuǎn)化子紫紅紅球菌ATCC12674/pSJ023以許可號(hào)FERM BP-6232保藏于日本通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所。(2)紅球菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化及在得到轉(zhuǎn)化子中的天冬氨酸酶活性離心收集對數(shù)生長期的紫紅紅球菌ATCC12674菌株的細(xì)胞，以冰涼的無菌水洗3次并懸于無菌水中。將10μl該細(xì)胞懸液與1μl質(zhì)粒pAR016混合且使之冰涼。將該DNA和細(xì)胞的混合物置于小杯中。然后，且基因脈沖儀(伯樂)，向其中應(yīng)用2.0kv及200Ω的電脈沖。將這樣處理的液體冰涼靜置10分鐘，且然后37℃熱休克10分鐘。之后，加入500ml MYK培養(yǎng)基(0.5％聚胨，0.3％bacto-酵母提取物，0.3％bacto-malt提取物，0.2％K2HPO4,0.2％KH2PO4)并于30℃靜置5小時(shí)。然后，將得到的混合物鋪板于含有50μg/ml卡那霉素的MYK瓊脂培養(yǎng)基上并于30℃培養(yǎng)3天。
將這樣制備的紅球菌屬細(xì)菌轉(zhuǎn)化子接種到10ml MYK培養(yǎng)基上(含有50μg/ml卡那霉素)并于30℃培養(yǎng)72小時(shí)作為預(yù)培養(yǎng)物。將1％的預(yù)培養(yǎng)物接種到10ml MYK培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)上并于30℃培養(yǎng)96小時(shí)。然后，離心收獲細(xì)胞，以100mM磷酸緩沖液(PH8.0)洗并懸浮于少量的緩沖液中。將該細(xì)胞懸液在冰涼條件下超聲粉碎并離心以獲得粗酶溶液，檢測其中的天科氨酸酶活性。作為對照，使用沒有添加卡那霉素培養(yǎng)而獲得的ATCC12674菌株。
按下述檢測天冬氨酸酶活性。簡言之，將1.0M的延胡索酸銨(ammoniumfumrate)/1mM氯化鎂(PH8.8)與該粗酶溶液接觸。然后，用ODS柱通過HPLC定量檢測于30℃ 60分鐘產(chǎn)生的天冬氨酸。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)天冬氨酸活性在導(dǎo)入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子中增加。
產(chǎn)生的L-天冬氨酸(mM)ATCC 12674/PAR 016322ATCC 126740.1實(shí)施例3(1)按實(shí)施例2中相同的方式將質(zhì)粒PAR016導(dǎo)入ATCC17895和ATCC19140以制備紅球菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化子。這些轉(zhuǎn)化子中的每種接種至10ml MYK培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)于30℃培養(yǎng)72小時(shí)作為預(yù)培養(yǎng)物。將1％的該預(yù)培養(yǎng)物接種至100ml GGPK培養(yǎng)基(1.5％葡萄糖，1％谷氨酸鈉，0.1％bacto-酵母提取物，0.5％K2HPO4,0.5％KH2PO4,0.5％MgSO4.7H2O,PH7.2)(含有50％μg/ml卡那霉素)并于30℃培養(yǎng)96小時(shí)。離心收獲細(xì)胞，以100mM磷酸緩沖液(PH8.0)洗并懸浮于少量的緩沖液中。用得到的細(xì)胞懸液，進(jìn)行天冬氨酸制備反應(yīng)。簡言之，將該細(xì)胞懸液添加到100ml 1.0M延胡索酸銨/1mM氯化鎂(PH8.8)中并于30℃攪拌20小時(shí)。作為對照，使用沒有添加卡那霉素而培養(yǎng)的ATCC12674菌株。用ODS柱通過HPLC定量測定上面反應(yīng)(30℃20小時(shí))中產(chǎn)生的天冬氨酸而測定天冬氨酸酶活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)天冬氨酸酶活性在導(dǎo)入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子中增加。
產(chǎn)生的L-天冬氨酸(mM)ATCC 17895/pAR016990ATCC 17895 5ATCC 19140/pARO16985ATCC 19140 8根據(jù)本發(fā)明，提供了一種編碼具有天冬氨酸酶活性新蛋白的基因。通過用具有多拷貝該基因的轉(zhuǎn)化子生物，可從延胡索酸和氨有效地制備L-天冬氨酸。
序列表(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度477個(gè)氨基酸(8)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)體紅球菌屬(B)菌株EA4(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro1 5 10 15Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe20 25 30Pro Ile Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala35 40 45Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly50 55 60Ile Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu Gln Ala Cys Lys Glu65 70 75 80Ile Arg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val Ile Gln85 90 95Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala100 105 110Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe115 120 125Leu His Pro Leu Glu His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val130 135 140Tyr Pro Thr Ala Ile Lys Ile Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu145 150 155 160Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala165 170 175Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala180 185 190Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile195 200 205Lys Glu Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu210 215 220Ile Asn Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro225 230 235 240Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly Leu245 250 255Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp Val Gly260 265 270Ala Phe Val Gln Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu275 280 285Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala290 295 300Gly Leu Gly Glu Ile Asn Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Ser Ser Ile305 310 315 320Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu Val Val Asn Gln Ile
325 330 335Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu340 345 350Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser355 360 365Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg370 375 380Glu Arg Cys Val Ile Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg385 390 395 400Thr Val Ala Ala Ser Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Ile405 410 415Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly420 425 430Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu435 440 445Asp Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile450 455 460Val Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr465 470 475(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度1434個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)體紅球菌屬(B)菌株EA4(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵CDS(B)位置1…1431(ⅹⅰ)序列描述SED ID NO:2ATG ACG ATG CGC ATC GAG CAC GAC CTG CTC GGT GAT CGC GAA GTG CCT 48Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro1 5 10 15GCG GAG GCC TAC TAC GGC ATC CAC ACG CTG AGA GCA CTG GAG AAC TTC 96Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe20 25 30CCG ATC ACC GGT ATT CCT CTC TCG GTC CAC CCG GAC ATG GTA TCG GCG 144Pro Ile Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala35 40 45TTG GCT GCG GTC AAG CAG GCC GCT GCT CGG GCG AAC GCC GAC CTC GGA 192Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly50 55 60ATC CTC TCG CCC GAG CAT GCA GCG GCG ATC GAG CAA GCT TGC AAG GAG 240Ile Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu Gln Ala Cys Lys Glu65 70 75 80ATT CGT GCG GGC AGG TTC ACC GAC CAG TTC GTC GTC GAC GTC ATT CAG 288Ile Arg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val Ile Gln85 90 95GGT GGT GCC GGC ACG TCA TCG AAC ATG AAC GCC AAC GAA GTG GTC GCG 336Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala100 105 110AAC CGC GCG CTC GAA ATT CTC GGC GGC GAA CGG GGG CAG TAC CAA TTC 384Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe115 120 125CTC CAT CCG CTC GAA CAC GTC AAC ATG AGT CAG AGC ACC AAC GAC GTC 432Leu His Pro Leu Glu His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val130 135 140TAC CCC ACC GCG ATC AAA ATC GGC TTG CAA GGT GCC GTC ACC AGG CTT 480Tyr Pro Thr Ala Ile Lys Ile Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu145 150 155 160CGA GGT GCG ATG GAC GAA CTT GCA GGC GCA TTC GCG GAG AAA GCA GCC 528Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala165 170 175GAG TTC TCC CAC GTG CTC AAG GTC GGG CGG ACT CAG TTG CAA GAC GCG 576Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala180 185 190GTC CCG ATG ACT CTC GGT CAA GAG ATT GTC ACG TTC GCC GTG ATG ATC 624Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile195 200 205AAG GAG GAC TCT CAG AGA CTG GAA GAG GCC GCT CGG TTG ATC TCG GAG 672Lys Glu Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu210 215 220ATC AAC CTG GGA GGG ACG GCG ATA GGT ACC GGT CTC AAT GCG CAC CCG 720Ile Asn Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro225 230 235 240GAG TAC GCC AGA CGT GTG CGT GAG CAT CTG GTG TCG ATC ACC GGT CTC 768Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly Leu245 250 255GAC ATC TCG ACG GCA TCG GAT CTC ATC GAA GCA ACC CAG GAC GTC GGG 816Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp Val Gly260 265 270GCC TTC GTT CAG CTG TCG GGA GTG CTC AAG CGT ACC GCG GTC AAA CTG 864Ala Phe Val Gln Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu275280 285TCC AAG ATC TGC AAC GAT CTG AGA TTG CTG TCC TCA GGC CCA CGA GCA 912Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala290 295 300GGT CTG GGT GAG ATC AAT TTA CCT GCG GTG CAG GCA GGT TCG TCG ATC 960Gly Leu Gly Glu Ile Asn Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Ser Ser Ile305 310 315 320ATG CCC GGA AAG GTC AAT CCG GTC ATT CCG GAA GTG GTC AAT CAG ATT 1008Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu Val Val Asn Gln Ile325 330 335GCC TAC CGG GTG GTG GGA AAC GAT CTG ACC ATC ACC ATG GCT GCC GAG 1056Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu340 345 350GCG GGT CAA CTG CAG CTC AAC GCA TTC GAA CCG GTC ATT GCA CAC AGC 1104Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser355 360 365TTG TTC GAG ACT GCA GAA CTC CTC ACG CGG GGC TGC ACT GTG TTG CGC 1152Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg370 375 380GAG CGA TGC GTG ATC GGC ATT ACC GCC AAC GTC GAG CAT CTC GAA CGA 1200Glu Arg Cys Val Ile Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg385 390 395 400ACG GTC GCG GCT TCG ATC GGT GTC GTG ACC GCG CTC AAT CCC TAC ATC 1248Thr Val Ala Ala Ser Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Ile405 410 415GGC TAC ACA GCC GCG ACG GAA TTG GCG GCG GAC GCG CTT GCT TCC GGT 1296Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly420 425 430CGT ACC GTC GTG GAG TTG GTG CTC GAA CGC GGG TTG TTG GGC AAG GAG 1344Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu435 440 445GAT TTG GAC GCG ATC ATG GAG CCT GCG AAT TTG GCA CGA ACT GCG ATC 1392Asp Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile450 455 460GTG TCG GCT CCC GAT TTC GAT CCA CTC GTC CCG TCG ACC TGA1434Val Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr465 470 475(2)SED ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長度1912個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)體紅球菌屬(B)菌株EA4(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TTCGAAGCCA CGCCCGTTCA GGTGACCTGC GTGCGGCGAA GTTCGGTGGA GCCGAACTAC 60CGTGGGGCGA GATCCCGGTG GCGGCAAACC TCAAATGACG ATGCGCATCG AGCACGACCT120GCTCGGTGAT CGCGAAGTGC CTGCGGAGGC CTACTACGGC ATCCACACGC TGAGAGCACT180GGAGAACTTC CCGATCACCG GTATTCCTCT CTCGGTCCAC CCGGACATGG TATCGGCGTT240GGCTGCGGTC AAGCAGGCCG CTGCTCGGGC GAACGCCGAC CTCGGAATCC TCTCGCCCGA300GCATGCAGCG GCGATCGAGC AAGCTTGCAA GGAGATTCGT GCGGGCAGGT TCACCGACCA360GTTCGTCGTC GACGTCATTC AGGGTGGTGC CGGCACGTCA TCGAACATGA ACGCCAACGA420AGTGGTCGCG AACCGCGCGC TCGAAATTCT CGGCGGCGAA CGGGGGCAGT ACCAATTCCT480CGATCCGCTC GAACACGTCA ACATGAGTCA GAGCACCAAC GACGTCTACC CCACCGCGAT540CAAAATCGGC TTGCAAGGTG CCGTCACCAG GCTTCGAGGT GCGATGGACG AACTTGCAGG600CGCATTCGCG GAGAAAGCAG CCGAGTTCTC CCACGTGCTC AAGGTCGGGC GGACTCAGTT660GCAAGACGCG GTCCCGATGA CTCTCGGTCA AGAGATTGTC ACGTTCGCCG TGATGATCAA720GGAGGACTCT CAGAGACTGG AAGAGGCCGC TCGGTTGATC TCGGAGATCA ACCTGGGAGG780GACGGCGATA GGTACCGGTC TCAATGCGCA CCCGGAGTAC GCCAGACGTG TGCGTGAGCA840TCTGGTGTCG ATCACCGGTC TCGACATCTC GACGGCATCG GATCTCATCG AAGCAACCCA900GGACGTCGGG GCCTTCGTTC AGCTGTCGGG AGTGCTCAAG CGTACCGCGG TCAAACTGTC960CAAGATCTGC AACGATCTGA GATTGCTGTC CTCAGGCCCA CGAGCAGGTC TGGGTGAGAT 1020CAATTTACCT GCGGTGCAGG CAGGTTCGTC GATCATGCCC GGAAAGGTCA ATCCGGTCAT 1080TCCGGAAGTG GTCAATCAGA TTGCCTACCG GGTGGTGGGA AACGATCTGA CCATCACCAT 1140GGCTGCCGAG GCGGGTCAAC TGCAGCTCAA CGCATTCGAA CCGGTCATTG CACACAGCTT 1200GTTCGAGACT GCAGAACTCC TCACGCGGGG CTGCACTGTG TTGCGCGAGC GATGCGTGAT 1260CGGCATTACC GCCAACGTCG AGCATCTCGA ACGAACGGTC GCGGCTTCGA TCGGTGTCGT 1320GACCGCGCTC AATCCCTACA TCGGCTACAC AGCCGCGACG GAATTGGCGG CGGACGCGCT 1380TGCTTCCGGT CGTACCGTCG TGGAGTTGGT GCTCGAACGC GGGTTGTTGG GCAAGGAGGA 1440TTTGGACGCG ATCATGGAGC CTGCGAATTT GGCACGAACT GCGATCGTGT CGGCTCCCGA 1500TTTCGATCCA CTCGTCCCGT CGACCTGACC AGGTCTTCAG GGCGGTTGAC ACCGCACATG 1560TGGGCGGTAT CGTTTAGTGA TACGTATAAC TACTTGCAGT CCTGTTGTGT CAGGATTGAC 1620AGAAGCTGAG TCGGCACGGT TCAAGGACGT ACCGCGCCAA GCCAGCCAGG AGACGGAAAC 1680CATGTTCGAA AAGACACGAA TGGACAGTCA TCCCCCCTGT AAGAGCAACT ACGACGTCAT 1740CGTCGTGGGA AGCGGAATGG GGGGTGGAAC GATGGCATAC GCTCTCAAGG ATTCCGGCCT 1800CGATGTGCTC TTGATCGAGA GGGGAGACTT CCTTCCACAG GAACGTCAGA ATTGGGACCC 1860CCGAGCGGTG TTCGAGAAAG ATCGGTACAA GAACGCCGAA AAATGGGTCG AC 1912(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc“合成DNA”(ⅹⅰ)序列描述SED ID NO:4:AACATGAACA CTAACGAGGT20(2)SED ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“合成DNA”(ⅹⅰ)序列描述SED ID NO:5:AGGTCGTTGC AGATCTTGGA20(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征；(A)長度33個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/des=“合成DNA”(ⅹⅰ)序列描述SED ID NO:6:AATCTAGAAT GACGATGCGC ATCGAGCACGACC33(2)SED ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“合成DNA”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:(B)名字/關(guān)鍵CDSCTCTAGACCT GCGTACGGCG AAGTTCG 2權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，它具有天冬氨酸酶活性且具有顯示于SED ID NO:1中的氨基酸序列或具有顯示于SED ID NO:1中的，具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的基因DNA。
3.權(quán)利要求2的基因DNA，其中的DNA具有顯示于SED ID NO:2中的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求2的基因DNA，其中的DNA源自紅球菌屬細(xì)菌。
5.權(quán)利要求4的基因DNA，其中的紅球菌屬細(xì)菌為紅球菌EA4菌株。
6.約600bp大小的DNA片段，其可用由SEQ ID NO:4和5分別代表的合成DNA擴(kuò)增。
7.通過將權(quán)利要求2的基因DNA與載體質(zhì)粒連接而獲得的重組質(zhì)粒。
8.通過將權(quán)利要求2的基因DNA和能在紅球菌屬細(xì)菌中復(fù)制和擴(kuò)增的DNA區(qū)域連接到載體質(zhì)粒而獲得的重組質(zhì)粒。
9.通過將重組質(zhì)粒導(dǎo)入權(quán)利要求7和8的宿主微生物中而獲得的轉(zhuǎn)化子。
10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主微生物為紅球菌屬細(xì)菌。
11.通過培養(yǎng)權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化子而制備權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的方法。
12.用于通過在權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化子或權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)存在下將延胡索酸或其鹽與氨或其鹽反應(yīng)而制備L-天冬氨酸的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有天冬氨酸酶活性的新蛋白、編碼該蛋白的基因DNA、包括該基因DNA的重組質(zhì)粒、導(dǎo)入有該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子、及用該轉(zhuǎn)化子制備L－天冬氨酸的方法。通過使用具有多拷貝上述基因的本發(fā)明轉(zhuǎn)化子微生物,可從延胡索酸和氨有效地制備L－天冬氨酸。
文檔編號(hào)C12R1/01GK1211619SQ98102480
公開日1999年3月24日 申請日期1998年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月6日
發(fā)明者渡辺文昭, 湯不二夫 申請人:日東化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社