專(zhuān)利名稱(chēng)：從纖維素織物中除去或漂白污斑或色斑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于清潔織物或紡織品，主要是纖維素織物或紡織品，尤其是用于除去或漂白存在于纖維素織物上的色斑的改善的酶促方法。
背景技術(shù)：
許多年來(lái)就已知用于洗滌衣服(洗衣房洗滌)和其它類(lèi)型的織物或紡織品的酶促主法。
常常發(fā)現(xiàn)一些類(lèi)型的污斑或色斑的去除是這些洗滌過(guò)程中的一個(gè)難點(diǎn)。這些通常是來(lái)自淀粉，蛋白質(zhì)，脂肪，紅酒，水果(如茶藨子，櫻桃，草莓或西紅柿)，蔬菜(如胡蘿卜或甜菜根)，茶，咖啡，調(diào)味品(如咖喱或胡椒粉)，體液，草或墨水(如來(lái)自圓珠筆或自來(lái)水筆)的污漬。
本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)修飾梅以改變(增加)酶對(duì)纖維素織物的親和性，從而該被修飾的酶能與討論的污斑或污漬更為緊密地接觸，和/或接觸時(shí)間更長(zhǎng)而提高洗滌酶在常規(guī)洗滌條件下的效率。
發(fā)明概述目前已驚奇地發(fā)現(xiàn)通過(guò)一種酶促方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素織物或紡織品的改善的洗滌，尤其是可實(shí)現(xiàn)對(duì)存在于其上的色斑的有改進(jìn)的除去或漂白，其中在該酶促方法中織物或紡織品與已被修飾而具有增加的與纖維素織物或紡織品的結(jié)合親和性(相對(duì)于未修飾的酶)的酶接觸。
發(fā)明詳述因此本發(fā)明尤其涉及一種用于除去或漂白存在于纖維素織物或紡織品上的污斑或色斑的方法，其中在水介質(zhì)中織物或紡織品與一種被修飾的酶(酶雜合體)接觸，該被修飾的酶包含與含纖維素結(jié)合區(qū)的氨基酸序列連接的非纖維素分解酶的催化(酶促)活性氨基酸序列。
污漬根據(jù)本發(fā)明可被除去的污斑或色斑包括上面已提及的那些，即來(lái)自例如淀粉，蛋白質(zhì)，脂肪，紅酒，水果〔如茶藨子，櫻桃，草莓或西紅柿(尤其是蕃茄醬或空心粉中的西紅柿)〕，蔬菜(如胡蘿卜或甜菜根)，茶，咖啡，調(diào)味品(如咖喱或胡椒粉)，體液，草，或墨水(如來(lái)自圓珠筆或自來(lái)水筆)的污斑或色斑。作為根據(jù)本發(fā)明可被除去或漂白的適宜目標(biāo)物的其它類(lèi)型的污斑或色斑包括皮脂，土壤(即泥土)，粘土，油和涂料。
纖維素織物術(shù)語(yǔ)“纖維素織物”意指從含纖維素的材料，如棉花，或從纖維素衍生材料制備(如從木漿或從棉花制備)的任何類(lèi)型的織物，尤其是機(jī)織織物。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“織物”指包括衣服和其它類(lèi)型被加工的織物，并與術(shù)語(yǔ)“紡織品”可互換使用。
從天然產(chǎn)生的纖維素纖維生產(chǎn)的纖維素織物的實(shí)例為棉布，苧麻，黃麻和亞麻(亞麻)織物。從人造纖維素纖維生產(chǎn)的纖維素織物的實(shí)例為粘膠纖維(人造絲)和lyocell(如TencelTM)織物，在本發(fā)明上下文中還相關(guān)的是纖維素纖維(如粘膠，lyocell，棉花，苧麻，黃麻或亞麻)與其它纖維如與動(dòng)物毛發(fā)纖維，如羊毛，羊駝毛或駱駝毛，或與聚合物纖維，如聚酯，聚丙烯酸酯，聚酰胺或聚乙酸酯纖維的所有混紡品。
混合纖維素織物的具體實(shí)例為粘膠纖維/棉花混紡品，lyocell/棉花混紡品(如TencelTM/棉花混紡品)，粘膠纖維/羊毛混紡品，lyocell/羊毛混紡品，棉花/羊毛混紡品，棉花/聚酯混紡品，粘膠纖維/棉花/聚酯混紡品，羊毛/棉花/聚酯混紡品和亞麻/棉花混紡品。
纖維素結(jié)合區(qū)雖然在專(zhuān)利和科技文獻(xiàn)中已描述了許多類(lèi)型的碳水化合物結(jié)合區(qū)，但其中大多數(shù)-許多來(lái)自纖維素分解酶(纖維素酶)-通常被稱(chēng)為“纖維素結(jié)構(gòu)區(qū)”；因此通常的纖維素結(jié)合區(qū)(CBD)將是在纖維素酶中存在并優(yōu)選與纖維素和/或與其多糖或寡糖片段結(jié)合的那些。
纖維素結(jié)合區(qū)(和其它碳水化合物結(jié)合區(qū))是作為由兩個(gè)或多個(gè)多肽氨基酸序列區(qū)域組成的大的多肽或蛋白的組成部分，尤其是在水解酶中出現(xiàn)的多肽氨基酸序列，其中水解酶通常包括含有底物水解的活性部位的催化區(qū)和用于與討論的碳水化合物底物結(jié)合的碳水化合物結(jié)合區(qū)。這些酶可包括多于一個(gè)的催化區(qū)和一，二或三個(gè)碳水化合物結(jié)合區(qū)，并且它們可進(jìn)一步包括將碳水化合物結(jié)合區(qū)與催化區(qū)連接的一個(gè)或多個(gè)多肽氨基酸序列區(qū)，后一種類(lèi)型的區(qū)域通常被稱(chēng)為“接頭”。
包含纖維素結(jié)合區(qū)的水解酶的實(shí)例為纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙?；ッ负蜌ざ嗵敲?。還在藻類(lèi)，如紅藻紫菜(Porphyra purpurea)中發(fā)現(xiàn)了非水解性多糖結(jié)合蛋白形式的“纖維素結(jié)合區(qū)”〔參見(jiàn)P.Tomme等，纖維素結(jié)合區(qū)-分類(lèi)和在對(duì)不溶性碳水化合物的酶促降解中的性質(zhì)，John N.Saddler和Michael H.Penner(編)，ACS Symposium Series,No.618(1996)〕。然而，大多數(shù)已知的CBD〔P.Tomme等(同上)分類(lèi)并稱(chēng)為“纖維素結(jié)合區(qū)”〕來(lái)自纖維素酶和木聚糖酶。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“纖維素結(jié)合區(qū)”應(yīng)按如上述文獻(xiàn)(P.Tomme等，見(jiàn)上)相同的方式來(lái)理解。P.Tomme等的參考文獻(xiàn)將多于120種的“纖維素結(jié)合區(qū)”分類(lèi)成在底物結(jié)合機(jī)理方面可能具有不同功能或作用的10個(gè)家族(Ⅰ-Ⅹ)。然而，預(yù)期在未來(lái)將出現(xiàn)新的家族代表和另外的家族，在本發(fā)明這一方面事實(shí)上已鑒定出了一個(gè)這種新的CBD家族的代表(參見(jiàn)本文實(shí)施例2)。
在其中出現(xiàn)CBD的蛋白/多肽(如酶，通常為水解酶，如纖維素酶)中，CBD可位于N或C末端或位于中間的位置。
構(gòu)成CBD本身的多肽或蛋白(如水解酶)的那部分通常由多于約30個(gè)少于約250個(gè)氨基酸殘基組成。例如根據(jù)P.Tomme等(見(jiàn)上)列出的并分類(lèi)在家族Ⅰ的那些CBD由33-37個(gè)氨基酸殘基組成，列出并分類(lèi)在家族Ⅱa的那些由95-108個(gè)氨基酸殘基組成，列出并分類(lèi)在家族Ⅵ的那些由85-92個(gè)氨基酸殘基組成，同時(shí)列出并分類(lèi)在家族Ⅶ的一個(gè)CBD(來(lái)自熱纖梭菌的纖維素酶)由240個(gè)氨基酸殘基組成。因此，構(gòu)成CBD本身的氨基酸序列的分子量通常在約4kD-約40kD的范圍內(nèi)，并通常低于約35kD。
酶雜合體本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中涉及的酶的分類(lèi)號(hào)(EC號(hào))與生物化學(xué)和分子生物學(xué)國(guó)際聯(lián)盟命名委員會(huì)的推薦(1992),AcademicPress Inc.1992一致。
本發(fā)明所使用的被修飾的酶(酶雜合體)包括可用于清洗織物或紡織品(通常為在洗滌過(guò)程中從織物或紡織品中除去或漂白污斑或色斑)的非纖維素分解酶的具催化活性(酶促活性)的氨基酸序列(通常為多肽氨基酸序列)(即為非纖維素酶的酶的具催化活性的氨基酸序列)，尤其是與包含纖維素結(jié)合區(qū)的氨基酸序列融合(連接)的選自下面各種的酶淀粉酶(如α-淀粉酶，EC3.2.1.1)，蛋白酶(即肽酶EC 3.4)，脂酶(如甘油三酯脂酶，EC3.1.1.3)和氧化還原酶(如過(guò)氧化物酶，EC1.11.1，如分類(lèi)在EC1.11.1.7的那些；或苯酚氧化氧化酶，如漆酶，EC1.10.3.2，或分類(lèi)在EC1.10.3的其它酶)。討論的具催化活性的氨基酸序列可包含或全部或基本上全部由討論的成熟酶的全部氨基酸序列組成，或可由基本上保留了與全序列相同的催化(酶促)性質(zhì)的全序列的一部分組成。
所述類(lèi)型的被修飾的酶(酶雜合體)以及其制備和純化的詳細(xì)描述在本領(lǐng)域中是已知的〔參見(jiàn)例如WO90/00609,WO94/24158和WO95/16782，以及Greenwood等生物技術(shù)和生物工程44(994)1295-1305頁(yè)〕?？赏ㄟ^(guò)將包含至少一個(gè)編碼通過(guò)或不通過(guò)接頭與編碼感興趣的酶的DNA序列相連的纖維素結(jié)合區(qū)的DNA片段的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基因來(lái)制備它們。以這種方式可獲得的一個(gè)相關(guān)(但非限制性的)類(lèi)型的重組產(chǎn)物(酶雜合體)，其在本領(lǐng)域中通常被稱(chēng)為“融合蛋白”，可通過(guò)一個(gè)下面的通式來(lái)描述A-CBD-MR-X-BA-X-MR-CBD-B在這些通式中，CBD是一個(gè)至少包含該纖維素結(jié)合區(qū)(CBD)本身的氨基酸序列。
MR(中間區(qū)；接頭)可為一個(gè)鍵或包含1至約100個(gè)氨基酸殘基，尤其是2-40個(gè)氨基酸殘基，如2-15個(gè)氨基酸殘基的連接基團(tuán)。MR原則上可換為非氨基酸接頭。
X為包含上述的由編碼感興趣的非纖維素水解酶的DNA序列所編碼的多肽氨基酸序列的催化(酶促)活性序列的氨基酸序列。
A和B部分獨(dú)立地任選存在或不存在。當(dāng)其存在時(shí)，A或B部分構(gòu)成了CBD或X部分的末端延伸，并且通常包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
因此從上面尤其可清楚地看出所述類(lèi)型的酶雜合體中的CBD可定位于酶雜合體中的C-末端，N-末端或中間。相應(yīng)地，要討論類(lèi)型的酶雜合體中的X部分可定位于酶雜合體的N-末端，C-末端或中間。
本發(fā)明中感興趣的酶雜合體包括1個(gè)以上的CBD，如兩個(gè)或多個(gè)CBD直接互相連接，或通過(guò)間隔區(qū)或接頭序列(通常由適宜長(zhǎng)度的氨基酸殘基序列組成)互相分離。所討論類(lèi)型的酶雜合體中的兩個(gè)CBD還可例如通過(guò)如上定義的-MR-X-部分互相分開(kāi)。
在構(gòu)建所討論類(lèi)型的酶雜合體中非常重要的一點(diǎn)是對(duì)蛋白酶解降解的穩(wěn)定性。兩區(qū)和多區(qū)蛋白尤其在連接這些區(qū)的接頭區(qū)對(duì)蛋白水解裂解敏感。導(dǎo)致這種裂解的蛋白酶可例如為枯草桿菌蛋白酶，已知它通常顯示出寬的底物特異性〔參見(jiàn)例如Grφn等，生物化學(xué)31(1992),pp.6011-6018；Teplyakov等，蛋白質(zhì)工程5(1992),pp.413-420〕。
真核生物中接頭殘基的糖基化為防止蛋白酶降解的一種自然方法。另一種方法是采用更不利于周?chē)鞍酌傅陌被帷＝宇^的長(zhǎng)度在蛋白酶接近性方面也起作用。哪種“方案”最佳取決于酶雜合體在其中起作用的環(huán)境。
當(dāng)構(gòu)建新的酶雜合體分子時(shí)，接頭穩(wěn)定性因而變?yōu)橐粋€(gè)具重要意義的一點(diǎn)。本發(fā)明給出的實(shí)施例中描述的各種接頭(參見(jiàn)下文)都考慮了這一方面。
可用于制備CBD的纖維素酶(纖維素酶基因)本領(lǐng)域已熟知適用于分離纖維素酶基因的技術(shù)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“纖維素酶”和“纖維素分解酶”指催化纖維素降解為葡萄糖，纖維二糖，三糖和/或其它纖維寡糖的酶。
本文中優(yōu)選的纖維素酶(即包含優(yōu)選的CBD的纖維素酶)為微生物纖維素酶，尤其是細(xì)菌或真菌纖維素酶。內(nèi)切葡聚糖酶，主要是內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，尤其是單組分(重組)內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶是優(yōu)選的一類(lèi)纖維素酶。
有用的細(xì)菌纖維素酶的實(shí)例為來(lái)自或可由選自下面的細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶假單孢菌屬，芽孢桿菌屬，纖維單孢菌屬，梭狀芽孢桿菌屬，微孢菌屬，棲熱袍菌屬，Caldocellum和放線(xiàn)菌綱，如鏈霉菌屬，高溫單孢菌屬和熱酸菌屬，尤其是來(lái)自解纖維假單孢菌，燦爛芽孢桿菌，類(lèi)肥纖維單孢菌，熱纖維梭狀芽孢桿菌，雙孢微孢菌，褐色高溫單孢菌，解纖維高溫單孢菌和解纖維熱酸菌。
該纖維素酶可為酸性，中性或堿性纖維素酶，即分別在酸性，中性或堿性范圍內(nèi)顯示出最大的纖維素分解活性。
有用的纖維素酶為酸性纖維素酶，優(yōu)選真菌酸性纖維素酶，它來(lái)自或可由選自木霉屬，漆斑菌屬，曲霉屬，Phanaerochaete，脈孢菌菌，Neocallimastix和葡萄孢屬的真菌產(chǎn)生。
優(yōu)選的有用的酸性纖維素酶為來(lái)自或可由選自綠色木霉，木霉T.reesei，木霉T.longibrachiatum，疣孢漆斑霉，黑曲霉，米曲霉，Phanaerochaete chrysosporium，粗糙脈孢霉、Neocallimastix partriciarum和灰色葡萄孢霉的真菌產(chǎn)生。
另外有用的纖維素酶為中性或堿性纖維素酶，優(yōu)選為真菌中性或堿性纖維素酶，它來(lái)自或可由選自曲霉屬，青霉屬，毀絲霉屬，腐質(zhì)霉屬、耙霉屬、鐮孢霉屬、葡萄穗霉屬、帚霉屬、毛殼菌屬、疣孢霉屬、輪枝孢菌屬、漆斑菌屬、絲葚霉屬，粘帚霉屬，頭孢屬和枝頂孢屬的真菌產(chǎn)生。
優(yōu)選的堿性纖維素酶為來(lái)自或可用選自鞋墊腐質(zhì)霉(Humicola insolens)，尖鐮孢、嗜熱毀絲霉，微紫青霉和頭孢菌的真菌種，優(yōu)選來(lái)自鞋墊腐質(zhì)霉DSM 1800、尖鐮孢DSM2672、嗜熱毀絲霉CBS1176.65，和頭孢菌RYM-202的真菌菌種產(chǎn)生。
一種優(yōu)選的纖維素酶為與針對(duì)來(lái)自鞋墊腐質(zhì)霉DSM1800的高度純化的約43kD內(nèi)切葡聚糖酶的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的堿性?xún)?nèi)切葡聚糖酶，或?yàn)樗?3kD內(nèi)切葡聚糖酶的衍生物并顯示纖維素酶活性。
其它有用的纖維素酶的實(shí)例為真菌或細(xì)菌來(lái)源的親代纖維素酶的變異體，如可來(lái)自于腐質(zhì)霉屬，木霉屬或鐮孢霉屬真菌中的一個(gè)種的菌株的親代纖維素酶的變異體。
纖維素結(jié)合區(qū)的分離為了分離例如纖維素酶的纖維素結(jié)合區(qū)，可使用一些遺傳工程方法。一種方法使用限制性酶以除去基因的一部分，接著框內(nèi)融合剩余基因-載體片段以獲得編碼(對(duì)于特定基因片段)截短的蛋白質(zhì)的突變基因。另一種方法包括使用外切核酸酶，如Bal31以系統(tǒng)性地在外部從DNA的5′和3′末端或在內(nèi)部從基因內(nèi)的限制性缺口除去核苷酸。這些除去基因的方法產(chǎn)生編碼縮短的基因分子的突變基因，然后可評(píng)價(jià)其表達(dá)產(chǎn)物的底物結(jié)合(如纖維素結(jié)合)能力。用于評(píng)價(jià)結(jié)合能力的適宜的底物包括纖維素材料，如AvicelTM和棉花纖維。其它方法包括使用能從所討論的蛋白質(zhì)的多肽鏈的剩余部分裂解CBD(如末端CBD)的選擇性或特異性的蛋白酶。
如已說(shuō)明的(參見(jiàn)上文)，一旦確定了編碼底物結(jié)合(碳水化合物)區(qū)的核苷酸序列，作為DNA或雜色體DNA，它可被以各種方式操作以將其融合在編碼感興趣的酶或具酶活性的氨基酸序列的DNA序列中。接著使用或不使用接頭將編碼碳水化合物結(jié)合性氨基酸序列的DNA片段與編碼感興趣的酶或具酶活性的氨基酸序列的DNA連接起來(lái)。接著可將得到的連接DNA以各種方式進(jìn)行操作以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。優(yōu)選的微生物表達(dá)宿主包括一些曲霉屬的種(如黑曲霉或米曲霉)，芽孢桿菌屬的種，以及微生物如大腸桿菌或釀酒酵母。
淀粉水解酶適宜作為在本發(fā)明中采用的酶雜合體類(lèi)型基礎(chǔ)的淀粉酶(如α-或β-淀粉酶)包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。本文中包括這些淀粉酶的化學(xué)或遺傳修飾的突變體。相關(guān)的α-淀粉酶包括如可從芽孢桿菌屬的種獲得的α-淀粉酶，尤其是詳細(xì)描述在GB1296839中的地衣芽孢桿菌的一個(gè)特殊菌株。相關(guān)的可購(gòu)買(mǎi)到的淀粉酶包括DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(均可得自Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd，丹麥)，和RapidaseTM和MaxamylTMP(可得自GistBrocades，荷蘭)。
其它有用的淀粉水解酶為CGT酶(環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.19)，如可從芽孢桿菌屬，熱厭氧桿菌屬或熱厭氧細(xì)菌的種獲得的那些。
蛋白質(zhì)水解酶適宜作為本發(fā)明采用的酶雜合體類(lèi)型基礎(chǔ)的蛋白酶(肽酶)包括動(dòng)物，植物或微生物來(lái)源的那些。優(yōu)選微生物來(lái)源的那些。本發(fā)明包括這些蛋白酶的化學(xué)或遺傳修飾的突變體。蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例為枯草桿菌蛋白酶，尤其是來(lái)自芽孢桿菌屬的那些，如枯草桿菌蛋白酶Novo，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例為胰蛋白酶(如豬或牛來(lái)源)和描述在WO89/06270中的鐮孢霉屬蛋白酶。
相關(guān)的可購(gòu)得的蛋白酶包括AlcalaseTM,SavinaseTM,Primase,DurazymTM和EsperaseTM(均可得自Novo Nordisk A/S,Bagsvaserd，丹麥)，MaxataseTM,MaxacalTM,MaxapemTM和ProperaseTM(可得自Gist-Brocades，荷蘭)，PurafectTM和PurafectTMOXP(可得自Genencor International)，和OpticleanTM和OptimaseTM(可得自by Solvay Enzymes)。
脂解酶適宜作為本發(fā)明采用的酶雜合體類(lèi)型基礎(chǔ)的脂解酶(脂酶)包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。本文包括這些脂酶的化學(xué)或遺傳修飾的突變體。
有用的脂酶的實(shí)例包括腐毛狀腐質(zhì)霉H.lanuginosa脂酶，如在EP258068和EP305216中描述的；Rhizomucor miehei脂酶，如在EP238023中描述的；假絲酵母屬的脂酶，如南極假絲酵母脂酶，如在EP214761中描述的南極假絲酵母脂酶A或B；假單胞菌屬的脂酶，如在EP721981(如可從假單胞菌屬的種SD705菌株，其保藏登記號(hào)為FERM BP-4772獲得的脂酶)，在PCT/JP96/00426、在PCT/JP96/00454(如茄假單胞菌脂酶)，在EP571982或在WO95/14783(如門(mén)多薩假單胞菌脂酶)中描述的那些中的一種，產(chǎn)堿假單胞菌或類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌脂酶，如在EP218272中描述的，洋蔥假單胞菌脂酶，如在EP331376中描述的，施氏假單胞菌脂酶，如在GBl,372034中公開(kāi)的，或熒光假單胞菌脂酶；芽孢桿菌屬的脂酶，如枯草芽孢桿菌脂酶〔Dartois等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1137(1993)PP.253-260〕，嗜熱脂肪芽孢桿菌脂酶(JP64/744992)和短小芽孢桿菌脂酶(WO91/16422)。
而且，許多克隆脂酶可能是有用的，包括由Yamaguchi等在《基因103(1991),61-67頁(yè)中描述的沙門(mén)柏干酷青霉脂酶，白地霉脂酶〔Y.Schimada等，生物化學(xué)雜志106(1989),383-388頁(yè)〕，和各種根霉屬脂酶，如戴爾根霉(R.delemar)脂酶〔M.J.Hass等，基因109(1991)117-113頁(yè)〕，雪白根霉脂酶〔Kugimiya等，生物科學(xué)生物技術(shù)生物化學(xué)56(1992),716-719頁(yè)〕和米根霉脂酶。
其它可能有用的脂酶包括角脂酶，如在WO88/09367中描述的來(lái)自門(mén)多薩假單胞菌的角脂酶，或來(lái)自腐皮鐮孢f.pisi的角脂酶(描述在如WO90/09446中)。
適宜的可購(gòu)得的脂酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(可得自Novo Nordisk A/S),M1 LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(可得自Gist-Brocades)和Lipase P“Amano”(可得自Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
氧化還原酶適宜于作為本發(fā)明中采用的酶雜合體類(lèi)型基礎(chǔ)的氧化還原酶包括過(guò)氧化物酶(EC1.11.1)和氧化酶，如漆酶(EC1.10.3.2)和一些相關(guān)的酶。
過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶(EC1.11.1)為對(duì)作為接受體的過(guò)氧化物(如過(guò)氧化氫)起作用的酶，非常適宜的過(guò)氧化物酶是分類(lèi)在EC1.11.1.7下的那些，或來(lái)源于其中并顯示過(guò)氧化物酶活性的任何片段。在本發(fā)明中，其合成或半合成的衍生物(如具有卟啉環(huán)系，或微生物過(guò)氧化物酶，參見(jiàn)例如US4077768,EP537381,WO91/05858和WO92/16634)也是有價(jià)值的。
非常適宜的過(guò)氧化物酶為可從植物(如辣根過(guò)氧化物酶或大豆過(guò)氧化物酶)或從微生物如真菌或細(xì)菌獲得的過(guò)氧化物酶。在這方面，一些優(yōu)選的真菌包括屬于半知菌亞門(mén)，絲孢菌綱，如鐮孢霉屬，腐植菌屬，木霉屬，漆斑菌屬，輪枝孢屬，Arthromyces，卡爾黑霉屬，Ulocladium,Embellisia，枝孢屬或Dreschlera的菌株，尤其是尖鐮孢(DSM2672)，鞋墊腐質(zhì)霉(Humicola insolens)，木霉T.resii，漆斑菌M.verrucana(IFO6113)，黃萎輪枝孢，大麗花輪枝孢，Arthromyces ramosus(FERM P-7754)，煙色卡爾黑霉，Ulocladium chartarum,Embellisia alli或Dreschlera halodes。
其它優(yōu)選的真菌包括屬于擔(dān)子菌亞門(mén)，擔(dān)子菌綱，如鬼傘屬，Phanerochaete，革蓋菌屬，或栓菌屬的菌株，尤其是灰蓋鬼傘f.microsporus(IFO8371)，長(zhǎng)根鬼傘，Phanerochaete chrysosporium(如NA-12)或栓菌T.versicolor(如PR4 28-A)。
其它優(yōu)選的真菌包括屬于接合菌亞門(mén)，Mycoraceae綱，如根霉屬或毛霉屬的菌株，尤其是凍土毛霉。
一些優(yōu)選的細(xì)菌包括放線(xiàn)菌目的菌株，如渾球鏈霉菌(ATTC23965)，嗜熱紫鏈霉菌(IFO12382)或輪枝鏈霉菌(Streptoverticellum verticillium ssp.verticillium)。
其它優(yōu)選的細(xì)菌包括短小芽孢桿菌(ATCC12905)，嗜熱脂肪芽孢桿菌，紅色桿菌(Rhodobacter sphaeroides)，紅胞藻Rhodomonas palustri，乳鏈球菌，假單孢菌P.purrocinia)(ATCC15958)或熒光假單孢菌(NRRL B-11)。
其它優(yōu)選的細(xì)菌包括屬于粘液球菌屬的菌株，如變綠粘球菌。
特別有用的過(guò)氧化物酶的其它可能的來(lái)源列在B.C.Saunders等，過(guò)氧化物酶，倫敦，1964,p.41-43中。
過(guò)氧化物酶可進(jìn)一步為可通過(guò)下面方法制備的那一種，該方法包括在允許過(guò)氧化物酶表達(dá)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中回收過(guò)氧化物酶，其中該宿主細(xì)胞已用攜帶編碼所述過(guò)氧化物酶的DNA序列以及編碼允許編碼過(guò)氧化物酶的DNA序列表達(dá)的功能元件的DNA序列的重組DNA載體轉(zhuǎn)化。
適宜的重組產(chǎn)生的過(guò)氧化物酶為來(lái)自鬼傘屬菌種的過(guò)氧化物酶，尤其是根據(jù)WO92/16634的長(zhǎng)根鬼傘或灰蓋鬼傘或其變異體，如在WO94/12621中描述的變異體。
氧化酶和相關(guān)的酶本發(fā)明中的優(yōu)選的氧化物酶為分類(lèi)在EC1.10.3中的氧化酶，它們是采用分子氧作為接受體的氧化酶(即催化其中分子氧起氧化劑作用的氧化反應(yīng)的酶)。
如上所述，漆梅(EC1.10.3.2)是本文中非常適宜的氧化酶。本發(fā)明中的其它有用的氧化酶的實(shí)例包括兒茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)和膽紅素氧化酶(EC1.3.3.5)。其它有用的相關(guān)酶包括單酚單加氧酶(EC1.14.18.1)。
漆酶可從多種植物和微生物來(lái)源獲得，主要來(lái)自細(xì)菌和真菌(包括絲狀真菌和酵母)，漆酶適宜的實(shí)例見(jiàn)于可從真菌獲得的那些，包括可從曲霉屬、脈孢菌屬(如粗糙脈孢霉)、柄孢殼屬、葡萄孢屬、金錢(qián)菌屬、層孔菌屬、香茹屬、側(cè)耳屬、栓菌屬(如栓菌T.villosa)或栓菌T.versicolor〔栓菌屬的一些種類(lèi)、菌株以各種其它名稱(chēng)為人所和/或以前被分類(lèi)在其它屬；如栓菌T.villosa=T.pinsitus=多孔菌(也稱(chēng)為P pinsitus或P villosus)=篩孔革蓋菌〕，多孔菌屬，絲核菌屬(如立枯絲核菌)、鬼傘屬(如褶紋鬼傘或灰蓋鬼傘，小脆柄菇屬(Psatyrella)，毀絲霉屬(如毀絲霉M.thermophila),Schytalidium，射脈菌屬(如輻射射脈菌；參見(jiàn)WO92/01046)，革蓋菌屬(如毛革蓋菌；參見(jiàn)JP2-238885),Pyricularia或硬孔菌屬。
本發(fā)明中優(yōu)選的漆酶包括可從栓菌屬(如栓菌(Trametesvillosa)、毀絲霉屬(如毀絲霉(M.thermophila),Schytalidium或多孔菌屬的種/菌株獲得的漆梅。
其它酶適宜作為本發(fā)明采用的酶雜合體類(lèi)型基礎(chǔ)的其它類(lèi)型的酶包括果膠酶(聚半乳糖醛酸酶；EC3.2.1.15)。
質(zhì)粒本領(lǐng)域熟知可表達(dá)具有來(lái)自一個(gè)以上多肽片段的氨基酸序列之融合蛋白的質(zhì)粒制備方法(參見(jiàn)如WO90/00609和WO95/16782)。表達(dá)盒可包括在適宜細(xì)胞宿主游離體中保留的復(fù)制系統(tǒng)中或可不提供復(fù)制系統(tǒng)，其中它可被整合至宿主基因組中。根據(jù)已知方法可將DNA導(dǎo)入宿主中，如轉(zhuǎn)化、顯微注射等。
一旦融合基因被導(dǎo)入適宜宿主中，可培養(yǎng)宿主以表達(dá)融合基團(tuán)。通常希望另外加入用于融合基團(tuán)分泌的信號(hào)序列。有用的融合基因的一般實(shí)例為信號(hào)序列--(前肽)--碳水化合物結(jié)合區(qū)--接頭-感興趣的酶序列，或信號(hào)序列--(前肽)--感興趣的酶序列--接頭--碳水化合物結(jié)合區(qū)，其中前肽序列通常包含5-100，如5-25氨基酸殘基。
重組產(chǎn)物可為糖基化的或非糖基化的。
去污劑組合物表面活性劑系統(tǒng)本發(fā)明的去污劑組合物包括表面活性劑系統(tǒng)，其中表面活性劑可選自非離子和/或陰離子和/或陽(yáng)離子和/或兩性和/或半極性表面活性劑。
表面活性劑通常以0.1％-60％(重量計(jì))的水平存在。優(yōu)選的配制表面活性劑使之與存在于組合物中的酶雜合體和酶組分相容。在液體或凝膠組合物中，表面活性劑最優(yōu)選以促進(jìn)或至少不降低這些組合物中的酶雜合體或酶的穩(wěn)定性的方式配制。
本發(fā)明使用的適宜系統(tǒng)包括本文描述的作為表面活性劑的一種或多種非離子和/或陰離子表面活性劑。
烷基苯酚的聚環(huán)氧乙烷，聚環(huán)氧丙烷和聚環(huán)氧丁烷縮合物適宜用作本發(fā)明表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑，聚環(huán)氧乙烷縮合物是優(yōu)選的。這些化合物包括具有含約6-約14個(gè)碳原子，優(yōu)選約8-約14碳原子的直鏈或支鏈構(gòu)型的烷基的烷基苯酚與環(huán)氧化物的縮合產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)例中，環(huán)氧化物以等于約2-約25摩爾，較優(yōu)選約3-約15摩爾環(huán)氧化物/mol烷基苯酚的量存在?？少?gòu)得的這類(lèi)非離子表面活性劑包括IgepalTMCO-630，由GAF公司出售；及TritonTMX-45,X-114,X-100和X-102，均由Rohm&Haas公司出售。這些表面活性劑統(tǒng)稱(chēng)為烷基苯酚烷氧化物(如烷基苯酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇與約1-約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物適宜用作本發(fā)明非離子表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑、脂族醇的烷基鏈可為直鏈或支鏈，連在第一位或第二位上，并通常含有約8-約22個(gè)碳原子。優(yōu)選的為具有含約8-約20個(gè)碳原子，較優(yōu)選為約10-約18個(gè)碳原子的烷基的醇與約2-約10摩爾環(huán)氧乙烷/摩爾醇的縮合產(chǎn)物。約2-約7摩爾環(huán)氧乙烷，最優(yōu)選2-5摩爾環(huán)氧乙烷/摩爾醇存在于所述縮合產(chǎn)物中?？少?gòu)得的這類(lèi)非離子表面活性劑的實(shí)例包括TergitolTM15-S-9(C11-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，TergitolTM24-L-6NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的窄分子量分布的縮合產(chǎn)物)，均由Union Carbide Corporation出售；NeodolTM45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，NeodolTM23-3(C12-C13直鏈醇與3.0摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，NeodolTM45-7(C14-C15直鏈醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，NeodolTM45-5(C14-C15直鏈醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，由ShellChemical Company出售，KyroTMEOB(C13-C15醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，由Procter&Gamble Company出售，和Genapol LA050(C12-C14醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，由Hoechst出售。這些產(chǎn)品中的HLB優(yōu)選范圍為8-11，最優(yōu)選為8-10。
還可用作本發(fā)明表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑的為公開(kāi)在US4565647中的烷基多糖，其具有含約6-約30個(gè)碳原子，優(yōu)選約10-約16個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)，及多糖，如聚糖苷，其疏水基團(tuán)含有約1.3-約10，優(yōu)選約1.3-約3，最優(yōu)選為約1.3-約2.7個(gè)糖單元?？墒褂煤?或6個(gè)碳原子的任何還原糖，如葡萄糖，半乳糖，半乳糖基可被取代為葡萄糖基(任選在2-,3-,4-等位置連接疏水基團(tuán)，因此產(chǎn)生與葡萄苷或半乳糖苷相反的葡萄糖或半乳糖)。糖內(nèi)部的鍵可在如另外的糖單元的一個(gè)位置與前面糖單元的2-,3-,4-和/或6-位之間。
優(yōu)選的烷基聚糖苷具有通式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2選自烷基、烷基苯基、羥基烷基、羥基烷基苯基和其混合物，其中烷基鏈包含約10-約18個(gè)，優(yōu)選約12-約14個(gè)碳原子；n為2或3，優(yōu)選2；t為0-約10，優(yōu)選為0；X為1.3-約10，優(yōu)選約1.3-約3，更優(yōu)選約1.3-約2.7。糖基優(yōu)選來(lái)自葡糖。為了制備這些化合物，首先形成醇或烷基聚乙氧基醇，并接著與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)以形成葡糖苷(在1-位相連)。接著另外的葡糖基在它們的1-位和前面糖基單元的2-,3-,4-和/或6-位，優(yōu)選主要在2-位之間連接。
環(huán)氧乙烷與由1,2-環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合形成的疏水基的縮合產(chǎn)物也適宜于用作本發(fā)明的另外的非離子表面活性劑系統(tǒng)。這些化合物的疏水部分優(yōu)選具有分子量約1500-約1800，并顯示水不溶性。向該疏水部分加入聚氧乙烯部分可能從整體上增加分子的水溶性，在其中聚氧乙烯含量達(dá)縮合產(chǎn)物總重量的約50％這一點(diǎn)時(shí)保留了產(chǎn)物的液體特性，它相當(dāng)于縮合了高達(dá)約40摩爾的環(huán)氧乙烷。這類(lèi)化合物的實(shí)例包括一些可購(gòu)得的PluronicTM表面活性劑，由BASF出售。
還適宜于用作本發(fā)明的非離子表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑的是環(huán)氧乙烷與1,2-環(huán)氧丙烷與1,2-乙二胺反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的疏水部分由1,2-乙二胺和過(guò)量1,2-環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物組成，并通常分子量為約2500-約3000。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合至縮合產(chǎn)物包含約40％-約80％(重量計(jì))的聚氧乙烯并具有約5,000-約11,000的分子量的程度。這類(lèi)非離子表面活性劑的實(shí)例包括一些可購(gòu)得的TetronicTM化合物，由BASF出售。
優(yōu)選用作本發(fā)明表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑為烷基苯酚的聚環(huán)氧乙烷縮合物，伯和仲脂族醇與約1-約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，烷基多糖和其混合物。更優(yōu)選的是具有3-15個(gè)乙氧基的C8-C14烷基苯酚乙氧基化物，和具有2-10個(gè)乙氧基的C8-C18醇乙氧基化物(優(yōu)選平均為C10)，和其混合物。
極其優(yōu)選的非離子表面活性劑為下式的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑
其中R1為H，或R1為C1-4烴基、2-羥基乙基、2-羥基丙基或其混合物，R2為C5-31烴基，Z為具有帶至少3個(gè)直接與鏈相連的羥基的直鏈烴基鏈的多羥基烴基，或其烷氧基化衍生物。優(yōu)選的，R1為甲基，R2為直鏈C11-C15烷基或C16-18烷基或鏈烯基鏈，如椰子烷基或其混合物，Z是在還原胺化反應(yīng)中由還原糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖產(chǎn)生的。
極其優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷氧基化的硫酸烷酯表面活性劑。其實(shí)例為式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R為未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基組分的羥基烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，A為乙氧基或丙氧基單元，m大于0，通常在約0.5-約6之間，較優(yōu)選約0.5-約3之間，M為H或陽(yáng)離子，它可為如金屬陽(yáng)離子(如鈉，鉀，鋰，鈣，鎂等)，銨或取代的銨陽(yáng)離子。本文包括乙氧基化的硫酸烷酯以及丙氧基化的硫酸烷酯。取代的銨陽(yáng)離子的具體實(shí)例包括甲基-，二甲基-，三甲基銨陽(yáng)離子和季銨陽(yáng)離子，如四甲基銨和二甲基吡啶鎓陽(yáng)離子和由烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺產(chǎn)生的那些，其混合物等。表面活性劑的實(shí)例為C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸酯(C12-C18E(1.0)M)，C12-C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸酯(C12-C18(2.25)M和C12-C18烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸酯(C12-C18E(3.0)M)，和C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸酯(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地選自鈉和鉀。適用的陰離子表面活性劑為烷基酯磺酸表面活性劑，包括根據(jù)“美國(guó)油化學(xué)協(xié)會(huì)雜志”，52(1975),p.323-329用氣態(tài)SO3磺酸化的C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直鏈酯。適宜的起始材料包括如從動(dòng)物脂肪棕櫚油等產(chǎn)生的天然脂肪物質(zhì)。
尤其用于洗衣用途的優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑包括具有下面結(jié)構(gòu)式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑
其中R3為C8-C20烴基，優(yōu)選烷基或其混合物，R4為C1-C6烴基，優(yōu)選烷基或其混合物，M為與烷基酯磺酸形成水溶性鹽的陽(yáng)離子。適宜的成鹽陽(yáng)離子包括金屬，如鈉，鉀，鋰，和取代或未取代的銨陽(yáng)離子，如單乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺。優(yōu)選地，R3為C10-C16烷基，R4為甲基，乙基或異丙基。尤其優(yōu)選的是甲酯磺酸鹽，其中R3為C10-C16烷基。
其它適宜的陰離子表面活性劑包括式ROSO3M的水溶性鹽或酸的烷基硫酸鹽表面活性劑，其中R優(yōu)選為C10-C24烴基，優(yōu)選烷基或具有C10-C20烷基成分的羥基烷基，較優(yōu)選為C12-C18烷基或羥基烷基，M為H或陽(yáng)離子，如堿金屬陽(yáng)離子(如鈉，鉀，鋰)，或銨或取代的銨(如甲基-，二甲基-，和三甲基銨陽(yáng)離子和季銨陽(yáng)離子，如四甲基銨和二甲基吡啶鎓陽(yáng)離子和由烷基胺如乙胺，二乙胺、三乙胺產(chǎn)生的季銨陽(yáng)離子，和其混合物等)。通常，C12-C16烷基鏈對(duì)于低的洗滌溫度(如低于約50℃)是優(yōu)選的，C16-C18烷基鏈對(duì)于較高的洗滌溫度(如高于約50℃)是優(yōu)選的。
可用于洗滌目的的其它陰離子表面活性劑也可被包括在本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些可包括皂鹽(例如包括鈉、鋰、銨和取代銨鹽，如單-二-和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯或仲鏈烷磺酸鹽、C8-C24烯屬磺酸鹽、通過(guò)將檸檬酸堿土金屬鹽的熱解產(chǎn)物磺化而制備的磺化的多羧酸鹽，如在英國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)號(hào)1082179中描述的，C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸鹽(含高達(dá)10摩爾環(huán)氧乙烷)，烷基丙三醇磺酸鹽、脂酰丙三醇磺酸鹽、脂油酰丙三醇硫酸鹽、烷基苯酚環(huán)氧乙烷醚硫酸鹽、鏈烷烴磺酸鹽、烷基磷酸鹽、羥乙磺酸鹽，如?；u乙磺酸鹽、N-?；；撬猁}、烷基琥珀?；撬猁}和磺基琥珀酸鹽、磺基琥珀酸單酯(尤其是飽和和不飽和C12-C18單酯)和磺基琥珀酸二酯(尤其是飽和和不飽和C6-C12二酯)、?；“彼猁}、烷基多糖硫酸酯，如烷基聚葡糖苷(下面描述的非離子非硫酸化化合物)的硫酸鹽，支鏈伯烷基硫酸酯，和烷基多乙氧基羧酸鹽，或式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的那些，其中R為C8-C22烷基，k為1-10的整數(shù)，M為可溶性成鹽陽(yáng)離子。樹(shù)脂酸和氫化樹(shù)脂酸也是適宜的，如松香、氫化松香，和存在于或從浮油產(chǎn)生的樹(shù)脂酸和氫化樹(shù)脂酸。
烷基苯磺酸鹽是極其優(yōu)選的。尤其優(yōu)選的是線(xiàn)性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中烷基優(yōu)選包含10-18個(gè)碳原子。
其它實(shí)例描述在“表面活性劑和去污劑”(Vol.Ⅰ和Ⅱ，由Schwartz,Perry和Berch編)。各種這些表面活性劑還公開(kāi)在US3929678(欄23,58行-欄29,23行，其被本文引作參考)。
當(dāng)被本文包括時(shí)，本發(fā)明的洗衣去污劑組合物通常包含約1％-約40％，優(yōu)選約3％-約20％(重量計(jì))的這些陰離子表面活性劑。
本發(fā)明的洗衣去污劑組合物還可包含本文已描述的那些以外的陽(yáng)離子、兩性、兼性離子和半極性表面活性劑，以及非離子和/或陰離子表面活性劑。
適宜用于本發(fā)明的洗衣去污劑組合物的陽(yáng)離子去污表面活性劑為具有1個(gè)長(zhǎng)鏈烴基的那些。這些陽(yáng)離子表面活性劑的實(shí)例包括銨表面活性劑，如烷基三甲基銨鹵化物，和具有下式的那些表面活性劑。[R4(OR3)y]2R5N+X-其中R2為烷基或在烷基鏈中具有約8-約18個(gè)碳原子的烷基芐基，各R3選自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、CH2CH2CH2-和其混合物；各R4選自C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、通過(guò)連接兩個(gè)R4基因形成的芐基環(huán)結(jié)物、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH，其中R6為分子量小于約1000的任何己糖或己糖聚合物，及當(dāng)y不為0時(shí)則為H；R5與R4相同或?yàn)橥榛?，其中碳原子或R2加上R5的總數(shù)不大于約18；各個(gè)y為0-約10，y值的總和為0-約15；X為任何相容的陰離子。
極其優(yōu)選的陽(yáng)離子表面活性劑為可用于本發(fā)明的具有下式的水溶性季銨化合物R1R2R3R4N+X-(ⅰ)其中R1為C8-C16烷基，各個(gè)R2,R3和R4獨(dú)立地為C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、芐基和-(C2H4O)XH，其中X具有2-5的值，X為陰離子。R2,R3或R4中的最多一個(gè)應(yīng)為芐基。
R1的優(yōu)選的烷基鏈長(zhǎng)度為C12-C15，尤其是其中烷基為來(lái)自椰子或棕櫚核脂肪的鏈長(zhǎng)度的混合物或通過(guò)烯烴或OXO醇合成而合成產(chǎn)生。
R2R3和R4的優(yōu)選基團(tuán)為甲基和羥基乙基，陰離子X(jué)可選自鹵離子、甲硫酸根、乙酸根和磷酸根離子。
用于本文中的式(Ⅰ)的適宜的季銨化合物的實(shí)例為椰子基三甲基氯化銨或溴化銨；
椰子基甲基二羥基乙基氯化銨或溴化銨；癸基三乙基氯化銨；癸基二甲基羥基乙基氯化銨或羥基乙基溴化銨；C12-C15二甲基羥基乙基氯化銨或C12-C15二甲基羥基乙基溴化銨；椰子基二甲基羥基乙基氯化銨或椰子基二甲基羥基乙基溴化銨；肉豆蔻基三甲基銨甲基硫酸鹽；月桂基二甲基芐基氯化銨或月桂基二甲基芐基溴化銨；月桂基二甲基(乙氧基)4氯化銨或月桂基二甲基(乙氧基)4溴化銨；膽堿酯(式(ⅰ)化合物，其中R1為
烷基和R2R3R4為甲基)。
二烷基咪唑啉(式(ⅰ)化合物)。
可用于本文的其它陽(yáng)離子表面活性劑還描述在US4228044和EP000224中。
當(dāng)包括在本文時(shí)，本發(fā)明的洗衣去污劑組合物通常包含0.2-約25％，優(yōu)選約1％-約8％(重量計(jì))的這些陽(yáng)離子表面活性劑。
兩性表面活性劑也適宜于用于本發(fā)明的洗衣去污劑組合物中。這些表面活性劑可統(tǒng)稱(chēng)為仲或叔胺的脂族衍生物，或雜環(huán)仲和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基可為直鏈或支鏈。一個(gè)脂族取代基包含至少約8個(gè)碳原子，通常約8-約18碳原子，并且其中至少一個(gè)包含陰離子水溶性基團(tuán)，如羧基，磺酸基，硫酸基。對(duì)于兩性表面活性劑，參見(jiàn)US3929678(欄19,18-35行)。
當(dāng)包括在本文中時(shí)，本發(fā)明的洗衣去污劑組合物通常包含0.2-約15％，優(yōu)選約1％-約10％(重量計(jì))的這些兩性表面活性劑。
兩性離子表面活性劑也適宜于用于洗衣去污劑組合物中。這些表面活性劑可統(tǒng)稱(chēng)為仲和叔胺的衍生物，雜環(huán)仲和叔胺的衍生物，或季銨、季鏻或季锍化合物的衍生物。對(duì)于兩性離子表面活性劑，參見(jiàn)US3929678(欄19，第38行-欄22，第48行)。
當(dāng)包括在本文中時(shí)，本發(fā)明的洗衣去污劑組合物通常包含0.2％-約15％，優(yōu)選約1％-約10％(重量計(jì))的這些兩性離子表面活性劑。
半極性非離子表面活性劑為一特殊類(lèi)型的非離子表面活性劑，它包括包含約10-約18個(gè)碳原子的烷基和選自約1-約3個(gè)碳原子的烷基和羥基烷基的2個(gè)殘基的水溶性氧化胺；包含1個(gè)約10-約18個(gè)碳原子的烷基部分和2個(gè)選自含約1-約3個(gè)碳原子的烷基和羥基烷基的部分的水溶性氧化膦；及包含1個(gè)約10-約18個(gè)碳原子的烷基部分和1個(gè)選自約1-約3個(gè)碳原子的烷基和羥基烷基的部分的水溶性亞砜。
半極性非離子去污劑表面活性劑包括具有下式的氧化胺表面活性劑
其中R3為包含約8-約22個(gè)碳原子的烷基、羥基烷基或烷基苯基或其混合物；R4為包含約2-約3個(gè)碳原子的亞烷基或羥基亞烷基或其混合物；x為0-約3和各R5為包含約1-約3個(gè)碳原子的烷基或羥基烷基或包含約1-約3個(gè)環(huán)氧乙烷基團(tuán)的聚環(huán)氧乙烷。R5基團(tuán)可互相連接，如通過(guò)氧或氮原子形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
這些氧化銨表面活性劑尤其包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基氧化胺。
當(dāng)包括在本文中時(shí)，本發(fā)明的洗衣去污劑組合物通常包含0.2％-約15％，優(yōu)選約1％-約10％(重量計(jì))的這些半極性非離子表面活性劑。
助洗劑體系根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括助洗劑體系。任何常規(guī)的助洗劑體系適宜于用于本文，包括硅鋁酸鹽材料，硅酸鹽，多羧酸和脂肪酸，如乙二胺四乙酸的材料，金屬離子多價(jià)螯合劑，如氨基聚膦酸鹽，尤其是乙二胺四亞甲基膦酸和二亞乙基三胺五亞甲基膦酸。雖然由于明顯的環(huán)境原因優(yōu)選它們，但磷酸鹽助洗劑也可用于本發(fā)明。
適宜的助洗劑可為無(wú)機(jī)離子交換材料，通常為無(wú)機(jī)水合硅鋁酸鹽材料，較優(yōu)選的為水合合成沸石，如水合沸石A,X,B,HS或MAP。
另一個(gè)適宜的無(wú)機(jī)助洗劑材料為多層硅酸鹽，如SKS-6(Hoechst)。SKS-6為由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結(jié)晶多層硅酸鹽。
適宜的含一個(gè)羧基的多羧酸酯包括如公開(kāi)在比利時(shí)專(zhuān)利號(hào)831,368,821,369和821,370中的乳酸,乙醇酸和它們的醚衍生物。包含兩個(gè)羧基的多羧酸酯包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酸、馬來(lái)酸、二甘醇酸、酒石酸和富馬酸的水溶性鹽，以及描述在德國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)2,446,686和2,446,487，美國(guó)專(zhuān)利3,935,257的醚羧酸和描述在比利時(shí)專(zhuān)利號(hào)840,623中的亞硫?；人猁}。包含三個(gè)羧基的多羧酸酯其包括水溶性檸檬酸，烏頭酸和檸康酸以及描述在英國(guó)專(zhuān)利號(hào)1,379,241中的琥珀酸衍生物，如羧甲氧基琥珀酸，描述在荷蘭專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?205873中的乳氧基琥珀酸，及描述在英國(guó)專(zhuān)利號(hào)1,387,447中的氧聚羧酸材料，如2-氧雜-1,1,3-丙烷三羧酸。
包含四個(gè)羧基的多羧酸包括公開(kāi)在英國(guó)專(zhuān)利號(hào)1,261,829中的氧二琥珀酸，1,1,2,2-乙烷四羧酸、包含磺基取代基的四羧酸，包括公開(kāi)在英國(guó)專(zhuān)利號(hào)1,398,421和1,398,422和美國(guó)專(zhuān)利3,936,448中的那些，和描述在英國(guó)專(zhuān)利號(hào)1,082179中的磺化的熱解檸檬酸，以及公開(kāi)在英國(guó)專(zhuān)利號(hào)1,439,000中的含膦取代基的多羧酸。
脂環(huán)和雜環(huán)多羰酸包括環(huán)戊烷-順，順，順-四羧酸、環(huán)戊二烯五羧酸，2,3,4,5-四氫呋喃-順，順，順-四羧酸，2,5-四氫呋喃-順二羧酸2,2,5,5-四氫呋喃四羧酸，1,2,3,4,5,6-己烷-六羧酸和多羥基醇如山梨糖醇、甘露糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳香多羧酸包括公開(kāi)在英國(guó)專(zhuān)利號(hào)1,425,343中的苯六甲酸,1,2,4,5-苯四羧酸及苯二甲酸衍生物。
其中，優(yōu)選的多碳酸為每分子包含高達(dá)3個(gè)羧基的羥基羧酸，尤其是檸檬酸。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶的硅鋁酸鹽助洗劑如沸石A或多層硅酸鹽(SKS-6)與水溶性的羧酸螯合劑如檸檬酸的混合物。
包含在本發(fā)明的去污劑組合物中的適宜的螯合劑為1,2-乙二胺-N,N′-二琥珀酸(EDDS)或其堿金屬、堿土金屬、銨或取代銨的鹽，或它們的混合物。優(yōu)選的EDDS化合物為其游離酸和鈉或鎂鹽。EDDS的這些優(yōu)選鈉鹽的實(shí)例包括Na2EDDS和Na4EDDS。EDDS的這些優(yōu)選的鎂鹽的實(shí)例包括MgEDDS和Mg2EDDS。鎂鹽是最優(yōu)選的包含在本發(fā)明的組合物中的鹽。
優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶的鋁硅酸酸鹽助洗劑。如沸石A與水溶性羧酸螯合劑如檸檬酸的混合物。
可形成用于顆粒組合物中的助洗劑體系的一部分的其它助洗劑材料包括無(wú)機(jī)材料，如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，及有機(jī)材料，如有機(jī)膦酸鹽、氨多亞烷基膦酸鹽和氨基多羧酸。
其它適宜的水溶性有機(jī)鹽為均聚或共聚物酸或其鹽，其中多羧酸包含通過(guò)不超過(guò)2個(gè)碳原子被相互分開(kāi)的至少兩個(gè)羧基。
這類(lèi)聚合物公開(kāi)在GB-A-1,596,756中。它的鹽的實(shí)例為MW2000-5000的聚丙烯酸酯和它們與馬來(lái)酸酐的共聚物，其中共聚物分子量為20,000-70,000，尤其為約40,000。
去污助洗劑鹽通常以5％-80％(重量計(jì))的量包含在組合物中。液體去污劑助洗劑的最佳水平為5％-30％。
酶除所討論的酶雜合體外，本發(fā)明的去污劑組合物可包含產(chǎn)生洗滌性能和/或織物護(hù)理效果的其它酶。這些酶包括蛋白酶、脂酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過(guò)氧化物酶和氧化酶(如漆酶)。
蛋白酶可使用例如適用于堿性溶液中的任何蛋白酶。適宜的蛋白酶包括動(dòng)物，植物或微生物來(lái)源的那些。優(yōu)選微生物起源。包括化學(xué)或遺傳修飾突變體。蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例為枯草桿菌蛋白酶，尤其是來(lái)源于芽孢桿菌屬的那些，如枯草桿菌蛋白酶Novo，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例為胰蛋白酶(如豬或牛來(lái)源)及描述在WO89/06270中的鐮孢屬蛋白酶。
優(yōu)選的可購(gòu)得的蛋白酶包括由Novo Nordisk A/S(丹麥)以商品名Alcalase,Savinase,Primase,Durazym和Esperase出售的那些,由Genencor International以商品名Maxatase,Maxacal,Maxapem,Properase,Purafect和Purafect OXP出售的那些，及由Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase出售的那些。蛋白酶可以以占組合物0.00001％-2％的酶蛋白(按重量計(jì))的水平，適宜地以占組合物0.0001％-1％的酶蛋白(重量計(jì))的水平，如占組合物0.001％-0.5％的酶蛋白(重量計(jì))的水平，適宜地為占組合物0.01％-0.2％的酶蛋白(重量計(jì))的水平被摻入到本發(fā)明的組合物中。
脂酶可使用例如任何適用于堿性溶液的脂酶。適宜的脂酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。
有用的脂酶的實(shí)例包括腐質(zhì)霉H.lanuginosa脂酶，如在EP258068和EP305216中描述的，Rhizomucor miehei脂酶，如在EP238023中描述的；假絲酵母屬的脂酶，如南極假絲酵母脂酶，如在EP214761中描述的南極假絲酵母脂酶A或B，假單胞菌屬脂酶，如產(chǎn)堿假單孢菌和類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌脂酶，如在EP218272中所描述的，洋蔥假單胞菌脂酶，如EP331376中所描述的，施氏假單胞菌脂酶，如GB1,372034中所描述的，熒光假單胞菌脂酶，芽孢桿菌屬脂酶，如枯草芽孢桿菌脂酶(Dartois等，(1993)，生物化學(xué)及生物物理學(xué)報(bào)1131,253-260)，嗜熱脂肪芽孢桿菌脂酶(JP64/744992)和短小芽孢桿菌脂酶(WO91/16422)。
而且，許多克隆的脂酶可能是有用的，包括由Yamaguchi等(1991)，基因103,61-67中描述的沙門(mén)柏干酪青霉脂酶，白地霉脂酶(Schimada,Y.等(1989)，生物化學(xué)雜志，106,383-388)，和各種根霉屬脂酶，如戴爾根霉脂酶(Hass,M.J等(1991)，基因109,17-113)，雪白根霉脂酶(Kugimiya等，(1992)，生物科學(xué)生物技術(shù)生物化學(xué)，56,716-779)和米根霉脂酶。
其它類(lèi)型的脂解酶如角質(zhì)酶可能也是有用的，如WO88/09367中描述的來(lái)自門(mén)多薩假單胞菌的角質(zhì)酶或來(lái)自腐皮鐮孢f.pisi(如在WO90/03446中描述的)的角質(zhì)酶。
尤其適宜的脂酶為如M1 LipaseTM,Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor),LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NovoNordisk A/S)，和LipaseP“Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd)。
脂酶通常以占組合物0.00001％-2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平摻入去污劑組合物中，如以占組合物0.0001％-1％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，如以占組合物0.001％-0.5％(重量計(jì))的酶蛋白質(zhì)，適宜地以占組合物0.01％-0.2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平摻入。
淀粉酶可使用如適宜于用于堿性溶液中的任何淀粉酶(如α-和/或β-)。適宜的淀粉酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。淀粉酶包括如詳細(xì)描述在GB1,296,839中的從地衣形芽孢桿菌的特定菌株獲得的α淀粉酶?？少?gòu)得的淀粉酶為DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(可從Novo Nordisk A/S購(gòu)得)及RapidaseTM和Maxamyl PTM(可從Genencor購(gòu)得)。
淀粉酶通常以占組合物0.00001％-2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平摻入去污劑組合物中，如以占組合物0.0001-1％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，例如以占組合物0.001％-0.5％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，適宜地以占組合物0.01％-0.2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平摻入。
纖維素酶可使用如適宜用于堿性溶液中的任何纖維素酶。適宜的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。適宜的纖維素酶公開(kāi)在US4,435,307中，它公開(kāi)了從鞋墊腐質(zhì)霉(Humicola insolens)制備的真菌纖維素酶。尤其適宜的纖維素酶為具有色彩護(hù)理效果的纖維素酶。這些纖維素酶的實(shí)例為描述在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?495257中的纖維素酶。
可購(gòu)得的纖維素酶包括CelluzymeTM，它由鞋墊腐質(zhì)霉的一個(gè)菌株產(chǎn)生(Novo Nordisk A/S)和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。
纖維素酶通常以占組合物0.00001％-2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，加以占組合物0.0001％-1％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，例如以占組合物0.001％-0.5％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，適宜地以占組合物0.01％-0.2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平摻入去污劑組合物中。
過(guò)氧化物酶/氧化酶過(guò)氧化物酶通常與過(guò)氧化氫或其來(lái)源(如過(guò)碳酸鹽，過(guò)硼酸鹽或過(guò)硫酸鹽)一起結(jié)合使用。氧化酶與氧一起結(jié)合使用。兩種類(lèi)型的酶用于“溶液漂白”，即防止當(dāng)所述織物在洗滌液體一起洗滌，優(yōu)選與如WO94/12621和WO95/01426描述的增強(qiáng)劑一起時(shí)，紡織品染料從染色織物轉(zhuǎn)移到另一種織物上。適宜的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。
過(guò)氧化物酶和/或氧化酶通常以占組合物0.00001％-2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，如占組合物0.0001％-1％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，例如占組合物0.001％-0.5％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，適宜地為占組合物0.01％0.2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平摻入去污劑組合物中。
本發(fā)明的去污劑組合物也可包括上述酶的混合物。如蛋白酶，淀粉酶、脂酶和/或纖維素酶的混合物。
摻入去污劑組合物中的酶雜合體或任何其它酶通常以占組合物0.00001％-2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，優(yōu)選以占組合物0.0001％-1％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，如占組合物0.001％-0.5％(重量計(jì))的酶蛋白的水平，例如占組合物0.01％-0.2％(重量計(jì))的酶蛋白的水平摻入去污劑組合物中。
漂白劑可包含在本發(fā)明去污劑組合物中的另外任選的去污成分包括漂白劑，如PB1,PB4和顆粒大小為400-800微米的過(guò)碳酸鹽。這些漂白劑成分可包含一種或多種氧漂白劑，(取決于所選擇的漂白劑)還包含一種或多種漂白活化劑。當(dāng)存在氧時(shí)，漂白成分通常以約1％-約25％的水平存在。通常，漂白成分為非液體制劑如顆粒去污劑中任選被加入的成分。
用于本文的漂白劑成分可為可用于去污劑組合物的任何漂白劑，包括氧漂白劑以及本領(lǐng)域已知的其它種類(lèi)。
適用于本發(fā)明的漂白劑可為活化的或未活化的漂白劑。
可使用的一類(lèi)氧漂白劑包含過(guò)羧酸漂白劑和其鹽。這類(lèi)漂白劑適宜的實(shí)例包括單過(guò)氧鄰苯二甲酸鎂六水合物、間氯過(guò)苯甲酸鎂鹽、4-壬基氨基-4-氧代過(guò)氧丁酸鎂鹽和二過(guò)氧十二雙酸鎂鹽。這些漂白劑公開(kāi)在US4,483,781,US740,446,EP0133354和US4,412,934中。極其優(yōu)選的漂白劑還包括如US4,634,551中描述的6-壬基氨基-6-氧代過(guò)氧己酸。
可使用的另一類(lèi)漂白劑包括鹵素漂白劑。次鹵酸鹽漂白劑的實(shí)例包括例如三氯異氰尿酸和二氯并異氰尿酸鈉和二氯異氰尿酸鉀及N-氯和N-溴烷基氨磺酰鈉和鉀。這些材料通常以占成品0.5-10％(重量計(jì))，優(yōu)選1-5％(重量計(jì))的量加入。
過(guò)氧化氫釋放劑可與漂白活化劑一起結(jié)合使用，如四乙酰基乙二胺(TAED)，壬酰氧苯磺酸鹽(NOBS，描述在US4,412,934中)、3,5-三甲基-己酰氧苯磺酸鹽(ISONOBS，描述在EP120591中)或五乙酰葡萄糖(PAG)，它們?nèi)庖孕纬勺鳛榛钚云孜锏倪^(guò)酸，從而產(chǎn)生增強(qiáng)的漂白效果。此外，極其適宜為漂白活化劑C8(6-辛基酰氨基-己?；?氧苯磺酸鹽，C9(6-壬基酰氨基-己酰基)氧苯磺酸鹽和C10(6-癸基酰氨基己?；?氧苯磺酸鹽或它們的混合物。適宜的活化劑還有乙?；臋幟仕狨?，如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1870207.7中公開(kāi)的。
在申請(qǐng)USSN08/136,626中描述了可用于本發(fā)明的洗滌組合物的有用的漂白劑，包括過(guò)氧酸和包含漂白活化劑和過(guò)氧漂白化合物的漂白體系的。
通過(guò)加入能在洗滌和/或漂洗過(guò)程開(kāi)始或期間產(chǎn)生過(guò)氧化氫的酶體系(即酶和它的底物)也可存在過(guò)氧化氫。這些酶體系公開(kāi)在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朎P0537381中。
本領(lǐng)域也已知氧漂白劑以外的漂白劑，且可被用于本發(fā)明。尤其感興趣的一類(lèi)非氧漂白劑包括光活化漂白劑，如磺化的酞菁鋅和/或鋁。這些材料在洗滌過(guò)程中可沉積在底物上。在光照射時(shí)，在存在氧，如將衣服掛在外面以在日光中干燥時(shí)，磺化的酞菁鋅被活化，因而底物被漂白。優(yōu)選的酞菁鋅和光活化漂白過(guò)程描述在US4,033,718中。通常，去污劑組合物包含約0.025％-約1.25％(重量計(jì))的磺化酞菁鋅。
漂白劑也可包含錳催化劑。錳催化劑可為如“用于低溫漂白的有效的錳催化劑”自然369,1994,P.637-639中描述的一種化合物。
抑泡劑另一種任選的成分為抑泡劑，實(shí)例為聚硅氧烷和硅石-聚硅氧烷混合物。聚硅氧烷通?？捎猛榛木酃柩跬椴牧蟻?lái)代表，而硅石通常以各種類(lèi)型的如硅石氣凝膠和干凝膠及疏水硅石的均勻分散形式使用。這些材料可以顆粒物形式摻入，其中抑泡劑有利地可釋放性地?fù)饺朐谒苄曰蛩煞稚⒌幕旧蠠o(wú)表面活性去污劑的不透性載體中。另外，抑泡劑可溶于或分散于液體載體中，并通過(guò)噴至一種或多種其它成分上來(lái)使用。
優(yōu)選的聚硅氧烷泡沫控制劑公開(kāi)在US3,933,672中。其它特別有用的抑泡劑為如描述在德國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)DTOS2,646,126中的自身乳化的聚硅氧烷抑泡劑。這個(gè)化合物的一個(gè)實(shí)例為DC-544，它可從Dow Corning購(gòu)得，為聚硅氧烷-甘醇的共聚物。尤其優(yōu)選的抑泡劑為包含硅氧烷油和2-烷基烷醇混合物的抑泡劑體系。適宜的2-烷基烷醇為2-丁基辛醇，它可以商品名Isofol 12R購(gòu)得。
這些抑泡劑體系描述在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP0593841。
尤其優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑描述在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2201649.8中。所述組合物可包含硅氧烷/硅石混合物及發(fā)煙滅孔硅石，如AerosilR。
上述抑泡劑通常以占組合物0.001％-2％(重量計(jì))的水平采用，優(yōu)選0.01％-1％(重量計(jì))。
其它成分用于去污劑組合物中的其它成分可采用如污垢懸浮劑、污垢釋放劑、光增亮劑、擦洗劑、滅菌劑、晦暗抑制劑、著色劑和/或包封或非包封的香料。
尤其適宜的包封材料為如GB1,464,616中描述的由多糖基質(zhì)和多羥基化合物組成的水溶性膠囊。其它適宜的水溶性包封材料包括如US3,455,838中描述的來(lái)自取代的二羧酸的未凝膠化的淀粉酸酯的糊精衍生物。這些酸酯糊精優(yōu)選從如含蠟質(zhì)的玉米、含蠟質(zhì)的高梁、西米、木薯和馬鈴薯的淀粉制備。所述包封材料的適宜實(shí)例包括由National Starch生產(chǎn)的N-Lok。N-Lok包封材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖構(gòu)成。通過(guò)加入單官能取代的基團(tuán)，如辛烯基琥珀酸酐將淀粉改性。
本文適宜的抗再沉淀劑和污垢懸浮劑包括纖維素衍生物，如甲基纖維素、羧甲基纖維素及羥乙基纖維素，及均聚或共聚的聚羧酸或其鹽。這類(lèi)聚合物包括前面提及作為助洗劑的聚丙烯酸酯和馬來(lái)酐-丙烯酸共聚物，以及馬來(lái)酐與乙烯、甲基乙烯基醚或異丁烯酸的共聚物，其中馬來(lái)酐占共聚物至少20％(摩爾)。這些材料通常以占組合物0.5％-10％(重量計(jì))，較優(yōu)選0.75％-8％，最優(yōu)選1％-6％(重量計(jì))的水平使用。
優(yōu)選的光增亮劑適宜地為陰離子性質(zhì)，它的實(shí)例為4,4′-雙(2-二乙醇胺-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2:2′二磺酸二鈉、4,4′-雙-(2-嗎啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基-芪-2:2′-二磺酸二鈉、4,4′-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2:2′-二磺酸二鈉、4′、4"-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-苯氨基)芪-2-磺酸鈉、4,4′-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二鈉、4,4′-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2′-二磺酸二鈉、4,4′-雙(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二鈉、2(芪基-4"-(萘并-1′,2′:4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸鈉和4,4′-雙(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。
其它有用的聚合物材料為聚乙二醇，尤其是分子量為1000-10000，較優(yōu)選2000-8000，最優(yōu)選約4000的那些。這些以0.20％-5％(重量計(jì))，較優(yōu)選0.25％-2.5％(重量計(jì))的水平使用。這些聚合物及前面提到的均聚或共聚聚羧酸鹽對(duì)于增加白度保持、織物灰沉積及對(duì)粘土，蛋白及存在過(guò)渡金屬污染物時(shí)的可氧化污垢的洗滌效率都是有價(jià)值的。
用于本發(fā)明組合物中的污垢釋放劑一般為各種排列的對(duì)苯二酸與乙二醇和/或丙二醇單元的共聚物或三元共聚物。這些聚合物的實(shí)例公開(kāi)在US4,116,885和4,711,730和EP0272033中。根據(jù)EP0272033的尤其優(yōu)選的聚合物具有下式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-,PO是(OC3H6O)和T是(pOOC6H4CO)。
非常有用的還有改性的聚酯，如對(duì)苯二酸二甲酯、磺基間苯二酸二甲酯、乙二醇與1,2-丙二醇的隨機(jī)共聚物，其末端基團(tuán)主要由磺基苯甲酸酯，其次由乙二醇和/或1,2-丙二醇單酯組成。目標(biāo)是獲得在兩個(gè)末端被磺基苯甲酸酯基團(tuán)封端的聚合物，“主要地”，在本文中所述的大多數(shù)共聚物被磺基苯甲酸酯封端。然而，一些共聚物未被其全部封端，從而它們的末端基團(tuán)可能由乙二醇和/或1,2-丙二醇單酯組成，從而“次要地”由這些物質(zhì)組成。
本文選擇的聚酯包含約46％(重量計(jì))的對(duì)苯二酸二甲酯，約16％(重量計(jì))的1,2-丙二醇，約10％(重量計(jì))的乙二醇，約13％(重量計(jì))的磺基苯甲酸二甲酯及約15％(重量地)的磺基間苯二甲酸，并且分子量為約3,000。聚酯及其制備方法詳細(xì)描述在EP311342中。
軟化劑也可將織物軟化劑摻入本發(fā)明的洗衣去污劑組合物中。這些試劑可為無(wú)機(jī)或有機(jī)類(lèi)型。無(wú)機(jī)軟化劑以公開(kāi)在GB-A-1400898和US5,019292中的綠土粘土作為實(shí)例。有機(jī)織物軟化劑包括如GB-A1514276和EP0011340中公開(kāi)的水不溶性叔胺，它們與單C12-C14季銨鹽的結(jié)合公開(kāi)在EP-B-0026528中，雙長(zhǎng)鏈酰胺公開(kāi)在EP0 242 919中?？椢镘浕w系的其它有用的有機(jī)成分包括如公開(kāi)在EP 0 299 575和O 313146中的高分子量的聚環(huán)氧乙烷。
綠土粘土的水平通常在5％-15％，優(yōu)選8％-12％(重量計(jì))的范圍內(nèi)，該物質(zhì)以干燥混合成分的形式被加入到制劑的其它部分中。有機(jī)織物軟化劑，如水不溶的叔胺或雙長(zhǎng)鏈酰胺材料被以0.5％-5％(重量計(jì))，一般為1％-3％(重量計(jì))的水平摻入，同時(shí)高分子量的聚環(huán)氧乙烷材料和水溶性的陽(yáng)離子材料被以0.1％-2％，一般為0.15％-1.5％(重量計(jì))的水平加入。雖然在一些情況下可以較方便地以干燥混合的顆粒形式加入，或以熔化液體的形式將它們噴至組合物的其它固體成分上，但這些材料一般被加至組合物的噴霧干燥部分中。
聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物還可包含0.001％-10％，優(yōu)選0.01％-2％，較優(yōu)選0.05％-1％(重量計(jì))的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑。所述聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑通常摻入到去污劑組合物中以抑制染料從染色織物轉(zhuǎn)移至在其中被洗滌的織物中。這些聚合物具有在染料有機(jī)會(huì)與洗滌中的其它物品接觸之前復(fù)合或吸附從染色織物中洗出的不穩(wěn)定的染料能力。
尤其適宜的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑為聚胺-N氧化物聚合物，N-乙烯基吡咯烷酮與N-乙烯基咪唑的共聚物，聚乙烯基吡咯烷酮聚合物，聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑或它們的混合物。
加入這些聚合物也增加根據(jù)本發(fā)明的酶的效率。
本發(fā)明的去污劑組合物可為液體，膏狀，凝膠，條狀或?；纬?即為顆粒形式)。
無(wú)粉塵顆?？砂凑杖鏤S4,106,991和4,661,452(均為NovoIndusti A/S)所公開(kāi)的來(lái)制備，并可任選用本領(lǐng)域已知的方法涂覆。蠟質(zhì)涂覆材料的實(shí)例為平均分子量為1000-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16-52個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇包含12-20個(gè)碳原子，并具有15-80個(gè)環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的一-和二-和三酸甘油酯。適宜于通過(guò)流化床技術(shù)使用的成膜涂覆材料的實(shí)例提供在GB1483591中。
本發(fā)明的顆粒組合物也可為“壓緊形式”，即它們可比常規(guī)顆粒去污劑具有相對(duì)更高的密度，即550-950g/L；與常規(guī)的顆粒去污劑相比，在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的顆粒去污劑組合物將包含較低量的“無(wú)機(jī)填料鹽”；典型的填料鹽為硫酸和鹽酸的堿土金屬鹽，通常為硫酸鈉；“壓緊”式去污劑通常包含不超過(guò)10％的填料鹽。根據(jù)本發(fā)明的液體組合物也可為“濃縮形式”，與常規(guī)的液體去污劑相比，在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的液體去污劑組合物將包含較低量的水。通常，濃縮液體去污劑的水含量小于30％，較優(yōu)選小于20％，最優(yōu)選小于去污劑組合物的10％(重量計(jì))。
本發(fā)明的組合物可為例如被配制成手洗和機(jī)洗去污劑組合物，包括洗衣添加劑組合物和適用于預(yù)處理受污織物的組合物。
下面的實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物，而不用來(lái)限制或用其它方法限定本發(fā)明的范圍，在該去污劑組合物中，簡(jiǎn)寫(xiě)的組分符號(hào)下面的含義LAS直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS動(dòng)物脂烷基硫酸鈉XYASC1X-C1Y烷基硫酸鈉SS2-丁基辛酸的二級(jí)皂表面活性劑25EY與平均Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的C12-C15主要為直鏈的伯醇。
45EY與平均Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的C14-C15主要為直鏈的伯醇XYEZS每摩爾與平均Z摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的C1X-C1Y烷基硫酸鈉非離子的平均乙氧基化程度為3.8及平均丙氧基化程度為4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化的脂肪醇，其由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404出售。
CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽非晶形硅酸鈉(SiO2∶Na2O比例=2.0)NaSKS-6式δ-Na2SiO5的結(jié)晶多層硅酸鹽，碳酸鹽無(wú)水碳酸鈉磷酸鹽三聚磷酸鈉MA/AA:1∶4馬來(lái)酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量為約80,000聚丙烯酸酯平均分子量為8,000，由BASF Gmbh以PA30商品名出售的聚丙烯酸酯均聚物沸石A主要顆粒大小為1-10微米的式Na12(AlO2SiO2)1227H2O的水合硅鋁酸鹽檸檬酸鹽檸檬酸三鈉二水合物檸檬酸檸檬酸過(guò)硼酸鹽具有式NaBO2、H2O2的無(wú)水過(guò)硼酸鹽一水合物漂白劑
PB4無(wú)水過(guò)硼酸鈉四水合物過(guò)碳酸鹽具有式2Na2CO3、3H2O2的無(wú)水過(guò)碳酸鈉漂白劑TAED四乙酰基乙二胺CMC羧甲基纖維素鈉DETPMP由Monsanto以Dequest2060商品名出售的二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)PVP聚乙烯基吡咯烷酮聚合物EDDS亞乙基二胺-N,N′-二琥珀酸〔S,S〕異構(gòu)體的鈉鹽形式泡沫抑制劑熔點(diǎn)50℃的25％鏈烷烴蠟，17％疏水硅石，58％石蠟油顆粒泡沫抑制劑12％聚硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％淀粉，顆粒形式硫酸鹽無(wú)水硫酸鈉HMWPEO高分子量聚環(huán)氧乙烷T(mén)AE25動(dòng)物脂醇乙氧基化物(25)在下面的組合物中，“酶”指酶雜合體和任何加入的酶去污劑實(shí)施例Ⅰ可如下制備根據(jù)本發(fā)明的顆?？椢锵礈旖M合物直鏈C12烷基苯磺酸鈉 6.5硫酸鈉 15.0沸石A 26.0次氮基三乙酸鈉 5.0酶 0.1PVP 0.5TAED3.0硼酸4.0過(guò)硼酸鹽18.0苯酚磺酸鹽 0.1次要物質(zhì)加至100
去污劑實(shí)施例Ⅱ可如下制備根據(jù)本發(fā)明的壓緊式顆粒織物洗滌組合物(密度為800g/l)45AS 8.025E3S 2.025E5 3.025E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS-612.0檸檬酸 3.0碳酸鹽 7.0MA/AA 5.0CMC0.4酶 0.1TAED 6.0過(guò)碳酸鹽 22.0EDDS 0.3顆粒抑泡劑 3.5水/次要物質(zhì)加至100％去污劑實(shí)施例Ⅲ可如下制備可用于洗滌染色織物的本發(fā)明的顆?？椢锵礈旖M合物L(fēng)AS 10.7-TAS 2.4 -TFAA - 4.045AS 3.110.045E7 4.0 -25E3S- 3.068E11 1.8 -25E5 - 8.0檸檬酸鹽15.0 7.0碳酸鹽 - 10檸檬酸 2.53.0沸石A 32.1 25.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA 5.05.0DETPMP 0.20.8酶 0.10 0.05硅酸鹽 2.5 -硫酸鹽 5.23.0PVP 0.5 -聚(4-乙烯基吡啶〔-N-氧- 0.2化物/乙烯基咪唑與乙烯基吡咯烷酮的共聚物過(guò)硼酸鹽1.0 -苯酚磺酸鹽 0.2 -水/次要物質(zhì)加0.5至100％去污劑實(shí)施例Ⅳ可如下制備產(chǎn)生“通過(guò)洗滌而軟化”能力的本發(fā)明的顆粒織物洗滌組合物45AS-10.0LAS7.6 -68AS 1.3 -45E7 4.0 -25E3- 5.0可可烷基-二甲基羥 1.41.0基乙基氯化銨檸檬酸鹽5.03.0Na-SKS-6- 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.04.0DETPMP 0.40.4過(guò)硼酸鹽 15.0-過(guò)碳酸鹽- 15.0TAED 5.05.0綠土粘土 10.0 10.0HMWPEO - 0.1酶 0.10 0.05硅酸鹽 3.05.0碳酸鹽 10.0 10.0顆粒抑泡劑 1.04.0CMC0.20.1水/次要物質(zhì)加至100％去污劑實(shí)施例Ⅴ可如下制備本發(fā)明的重載型液體織物洗滌組合物Ⅰ Ⅱ酸形式 - 25.0檸檬酸 5.02.0酸形式 8.0-酸形式 3.0-25AE7 8.0-CFAA 5 -DETPMP 1.01.0脂肪酸 8 -油酸 - 1.0乙醇 4.06.0丙二醇 2.06.0酶 0.10 0.05可可烷基二-甲基羥- 3.0基乙基氯化銨綠土粘土- 5.0PVP2.0 -水/次要物質(zhì)加至100％可以以去污劑中常用的濃度摻入酶雜合體。目前預(yù)測(cè)在本發(fā)明的去污劑組合物中，酶雜合體可適宜地以相當(dāng)于0.00001-1mg(以純酶蛋白計(jì)算)酶雜合體/升洗滌液的量加入。
反應(yīng)時(shí)間用于從織物中除去或漂白污斑或色斑的反應(yīng)時(shí)間是可以變化的；可將織物浸泡1或2天，或可在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行洗滌，通常機(jī)洗為1-90分鐘，優(yōu)選1-30分鐘。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及本文公開(kāi)的編碼或包含編碼如本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的酶雜合體的序列的DNA構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及由所述DNA構(gòu)建體或序列編碼的和/或本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的多肽(融合蛋白或酶雜合體)。因此，本發(fā)明包括一種酶雜合體，它由包含在序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18或SEQ IDNO.19的DNA序列中的編碼雜合物的DNA序列所編碼，或該酶雜合體具有包含在SEQ ID NO 2,SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.6或SEQID NO.8的氨基酸序列中的氨基酸序列。
在下列實(shí)施例中將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，它們決不限制本發(fā)明權(quán)利要求中所述的范圍。
材料和方法菌株芽孢桿菌B.agaradherens NCIMB No.40482包含下面實(shí)施例2的編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列。
大腸桿菌SJ2〔Diderichsen等，細(xì)菌學(xué)雜志，172(1990),4315-4321頁(yè)〕。
按T商的推薦使用Bio-Rad GenePulserTM制備和轉(zhuǎn)化電感受態(tài)細(xì)胞。
枯草芽孢桿菌PL2306該菌株為在已知的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄單元中被打斷的具有被打斷的apr和npr基因的桿草芽孢桿菌DN1885〔Diderichsen等，細(xì)菌學(xué)雜志172(1990)4315-4321頁(yè)〕，從而產(chǎn)生纖維素酶陰性細(xì)胞。打斷過(guò)程基本上如Sonenshein等(編)枯草芽孢桿菌和其它草蘭化陽(yáng)性菌，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(1993)，第618頁(yè)中描述的來(lái)進(jìn)行。
質(zhì)粒pDN1528〔Jφrgensen等，細(xì)菌學(xué)雜志173(1991),p.559-567〕。
pBluescriptKSII-(Stratagene,USA)pDN1981〔Jφrgensen等，基因96(1990),p.37-41〕。
溶液/培養(yǎng)基TY和LB瓊脂〔如Ausubel等(編)，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons(1995)所描述〕。
SB將32g胰蛋白胨、20g酵母提取物、5g氯化鈉和5ml1N氫氧化鈉混合在無(wú)菌水中至最終體積為1升。121℃下，將溶液通過(guò)高壓釜20分鐘來(lái)滅菌。
10％AvicelTM將100gAvicelTM(FLUKA；瑞士)與無(wú)菌水混合至最終體積為1升，121℃下，將得到的10％AvicelTM通過(guò)高壓釜20分鐘來(lái)進(jìn)行滅菌。
緩沖液0.05M磷酸鉀，pH7.5。
常規(guī)分子生物學(xué)方法使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法進(jìn)行DNA操作和轉(zhuǎn)化〔Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Lab.,Cold SpringHarbor,NY(1989)；Ausubel等(編)，現(xiàn)代分子生物方法，JohnWiley和Sons(1995)；C.R.Harwood和S.M.Cutting(編)細(xì)菌的分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons(1990)〕。
根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明使用用于DNA操作的酶。
實(shí)施例1部分Termamyl序列的亞克隆將在pDN1528上編碼的α-淀粉酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增以在編碼區(qū)的3′-末端導(dǎo)入BamHⅠ位點(diǎn)。如下進(jìn)行PCR和克隆在補(bǔ)充有200μM各種dNTP，26單位的HiFidelityTMExpand酶混合物及300pmol各種引物的HiFidelityTMpCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中將約10-20ng的質(zhì)粒pDN1528進(jìn)行PCR擴(kuò)增#52895′-GCT TTA CGC CCG ATT GCT GAC GCT G -3′#267485′-GCG ATG AGA CGC GCG GCC GCC TAT CTT TGA ACA TAA ATT GAAACG GAT CCG -3′(下劃線(xiàn)為BamHⅠ限制性位點(diǎn))。
使用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。在94℃,2分鐘，60℃,30秒鐘和72℃45秒鐘的保溫之后是使用在94℃下變性30秒，60℃下退火30秒72℃下延伸45秒的循環(huán)分布而進(jìn)行的10次循環(huán)和在94℃下變性30秒，60℃30秒，72℃下45秒(在此延伸步驟中，每次循環(huán)加20秒)的20次循環(huán)。通過(guò)在1.0％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)上，采用ReadyLoadTM100bp DNA階梯(GibcoBRL，丹麥)作為大小標(biāo)記的電泳來(lái)分析10μL擴(kuò)增產(chǎn)物的等分試樣。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAquickTMPCR純化試劑盒(Qiagen,USA)純化如上描述所產(chǎn)生的40μlPCR產(chǎn)物的等分試樣。將純化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5洗脫。將25μl純化的PCR片段用BamHⅠ和PstⅠ消化，在1.0％低膠凝溫度的瓊脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝膠中進(jìn)行電泳，從凝膠上切下相關(guān)片段并根據(jù)制選商的說(shuō)明使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen,USA)進(jìn)行純化。將分離的DNA片段連接至BamHⅠ-PstⅠ消化的pBluescriptⅡKS-，并用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。
將細(xì)胞平板接種在含氨芐青霉素(200μg/ml)并補(bǔ)充有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-半乳吡喃糖苷，50μg/ml)的平板上，37℃保溫過(guò)夜。第二天，將白色菌落再劃線(xiàn)至新的LB-氨芐青霉素瓊脂平板上，37℃保溫過(guò)夜。第三天將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至包含氨芐青霉素(200μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基上，37℃，以250rpm振蕩保溫過(guò)夜。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAgen質(zhì)粒純化微型試劑盒(Qiagen,USA)從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。將5μl質(zhì)粒樣品用PstⅠ和BamHⅠ消化。通過(guò)在0.1％瓊脂糖凝膠上(NuSieveTM,FMC)的凝膠電泳來(lái)檢查消化。將包含帶部分α-淀粉酶基因的PstⅠ-BamHⅠ片段的一個(gè)陽(yáng)性克隆稱(chēng)為pMB335。接著將該質(zhì)粒用于構(gòu)建α-淀粉酶-CBD雜合酶。
基因組DNA的分離如國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌收藏公司(The National Collectionsof Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，蘇格蘭的建議，60℃下，將糞堆梭菌NCIMB11754厭氧培養(yǎng)在特定的培養(yǎng)基中。離心收集細(xì)胞。
如Pitcher等，應(yīng)用微生物學(xué)通訊(Lett.Appl.)Microbil.8(1989),151-156頁(yè)所描述分離基因組DNA。
糞堆梭菌(NCIMB11754)Xyn A的CBD-二聚體的體外擴(kuò)增在補(bǔ)充有200μM各種dNTP，2.6單位HiFidelityTMExpand酶混合物和300pmol各種引物的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中將約100-200ng的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增#271835′-GCT GCA GGA TCC GTT TCA ATT TAT GTT CAA AGA TCT GGC GGACCT GGA ACG CCA AAT AAT GGA AGA GG -3′#271825′-GCA CTA GCT AGA CGG CCG CTA CCA GTC AAC ATT AAC AGG ACCTGA G -3′(下劃線(xiàn)為BamHⅠ和EagⅠ限制性位點(diǎn))設(shè)計(jì)的引物用于擴(kuò)增編碼糞堆梭菌NCIMB17754的Xyn A編碼基因的纖維素結(jié)合區(qū)的DNA；DNA序列從數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中的登記號(hào)D13325中提取。
使用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。94℃下2分鐘，60℃下30秒，72℃45秒的保溫之后是使用94℃下變性30秒，60℃下退火30秒，72℃下延伸45秒的循環(huán)方法進(jìn)行的PCR的十個(gè)循環(huán)，以及94℃下變性30秒，60℃下30秒和72℃45秒的二十個(gè)循環(huán)(在此延長(zhǎng)步驟中，每個(gè)循環(huán)加20秒)。通過(guò)在1.0％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)上采用ReadyLoodTM100bp DNA階梯(GibcoBRL，丹麥)作為大小標(biāo)記的電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的10μl等分試樣。
通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的克隆PCR片段的亞克隆根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIA quickTMPCR純化試劑盒(Qiagen,USA)純化如上所述產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的40μl等分試樣。將純化的DNA用50μl10mM Tris-HCl pH8.5洗脫。將25μl純化的PCR片段用BamHⅠ和EagⅠ消化，在1.0％低膠凝溫度的瓊脂糖(SeaPlaqneTMGTG,FMC)凝膠上進(jìn)行電泳，從凝膠上切下相關(guān)片段并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用QIAquickTMGel提取試劑盒(Qiagen,USA)進(jìn)行純化。接著將分離的DNA片段連接至BamHⅠ-NotⅠ消化的pMB335上，連接混合物被用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。
陽(yáng)性克隆的鑒定和表征將細(xì)胞平板接種在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上，37℃保溫過(guò)夜。第二天，將菌落再劃線(xiàn)至新的LB-氨芐青霉素瓊脂平板上，37℃保溫過(guò)夜。第三天，將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至含氨芐青霉素(200μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃下以250rpm振蕩保溫過(guò)夜。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAgen質(zhì)粒純化微型試盒(QiagenVSA)從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。將5μl質(zhì)粒樣品用BamHⅠ和NotⅡ消化。通過(guò)在1.0％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)上凝膠電泳檢查消化。與從PCR擴(kuò)增中看到的相同大小的DNA片段的出現(xiàn)說(shuō)明為陽(yáng)性克隆。
一個(gè)包含α-淀粉酶基因和糞堆梭菌(NCIMB,11754)XynA的CBD-二聚體的融合構(gòu)建物的陽(yáng)性克隆稱(chēng)為MBamyX。
融合構(gòu)建物克隆至基于芽孢桿菌的表達(dá)載體中pDN1528載體包含地衣型芽孢桿菌的amgL基因；該基因在枯草芽孢桿菌中活躍地表達(dá)，導(dǎo)致上清中活性α-淀粉酶的產(chǎn)生。為了表達(dá)目的，將如上構(gòu)建的編碼融合蛋白的DNA導(dǎo)入pDN1528中。
這通過(guò)將pMbamyX和pDN1528用SalⅠ-NotⅠ消化，純化片段并將4.7kb pDN1528 SalⅠ-NotⅠ片段與1.0kb pMBamyX SalⅠ-NotⅠ片段連接來(lái)完成。這產(chǎn)生了具有TermamylTM(地衣芽孢桿菌α-淀粉酶)的雜交構(gòu)建物的框內(nèi)融合。pMB206的融合構(gòu)建物的DNA序列以及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
連接混合物被用來(lái)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞平板接種在含氯霉素(6μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氫鉀的LB瓊脂平板上，37℃下保溫過(guò)夜。第二天，將菌落再劃線(xiàn)至新的LBPG(LB平板含0.4％葡萄糖和10mM磷酸鉀，pH10)氯霉素瓊脂平板上，37℃保溫過(guò)夜。第三天，將各個(gè)克隆的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至含氯霉素(6μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，以250rpm振蕩保溫過(guò)夜。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAgen粒純化微型試劑盒(Qiagen,USA)從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。然而，在37℃下將細(xì)胞裂解5分鐘之前，在重懸液中補(bǔ)充以1mg/ml小雞蛋白溶菌酶(SIGMA,USA)。將5μl質(zhì)粒樣品用BamHⅠ和NotⅠ消化。通過(guò)在1.5％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)上的凝膠電泳檢查消化。與從PCR擴(kuò)增中看到的相同大小的DNA片段的出現(xiàn)說(shuō)明為一陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆稱(chēng)為MB-BSamyx。
融合蛋白的表達(dá)，分泌和功能分析37℃下，將克隆MB-BSamyx(表達(dá)與糞堆梭菌XynA二聚體CBD融合的TermamylTM)在SB培養(yǎng)基中以250rpm搖床培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml無(wú)細(xì)胞上清與200μl10％AvicelTM混合。0℃下，將混合物保溫1小時(shí)，接著以5000×g離心5分鐘。將沉淀重新懸浮在100μlSDS-PAGE緩沖液中，95℃下，將懸浮液煮沸5分鐘，5000×g離心5分鐘，將25μl上樣至4-20％LaemmliTris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEXTM凝膠上(Novex,USA)。如制造商推薦，在XcellTMMini-Cell(NOVEX,USA)中將樣品進(jìn)行電泳，如制造商所描述地進(jìn)行所有后面的凝膠處理，包括染色(考馬斯)、脫色和干燥。
分子量為約85kDa的蛋白帶的出現(xiàn)表明了Termamyl-CBD融合amyx在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。
實(shí)施例2代表新的CBD家族的新的CBD的鑒定通過(guò)37℃下在SB培養(yǎng)基中將克隆以250rpm搖床培養(yǎng)20小時(shí)表達(dá)如下描述的在枯草芽孢桿菌中克隆的堿性纖維素酶。表達(dá)的纖維素酶通過(guò)其與AvicelTM的特異性結(jié)合的能力被表明包含CBD。
當(dāng)被進(jìn)一步保溫20小時(shí)時(shí)，纖維素酶被蛋白酶裂解，SDS-PAGE中出現(xiàn)兩條特異性蛋白帶，一條相當(dāng)于分子量(MW)為約35kD的纖維素酶的催化部分，另一條相當(dāng)于約8kD(MW)的所謂接頭和CBD。
CBD被發(fā)現(xiàn)為纖維素酶的C-末端部分，并且不與以前描述的CBD族系的任何成員匹配〔Tomme等，纖維素結(jié)合區(qū)分類(lèi)和性質(zhì)，出身J.N.Saddler和M.H.Penner(編)，不溶性碳水化合物的酶促降解，ACS Symposium Series No.618(1996)〕。因此，該CBD看來(lái)是新族系的第一個(gè)成員。
來(lái)自芽孢桿菌B.agaradherens的堿性纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)的克隆及堿性纖維素酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)通過(guò)PCR克隆編碼芽孢桿菌B.agaradherens(保藏登記號(hào)NCIMB40482)堿性纖維素酶的核苷酸序列以導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒pDN1981?；旧先缟纤鲇?00ng基因組DNA，使用下面兩個(gè)用于將編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列導(dǎo)入用于表達(dá)的pDN1981中的包含NdeⅠ和KpnⅠ限制性位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR#208875′-GTA GGC TCA GTC ATA TGT TAC ACA TTG AAA GGG GAG GAG AATCAT GAA AAA GAT AAC TAC TAT TTT TGT CG-3′#213185 ′-GTA CCT CGC GGG TAC CAA GCG GCC GCT TAA TTG AGT GGT TCCCAC GGA CCG-3′在PCR循環(huán)后，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAquickTMPCR柱盒(Qiagen,USA)純化PCR片段。將純化的DNA用50μl10mMTris-HCl,pH8.5洗脫，用NdeⅠ和KpnⅠ消化，純化并連接至消化的pDN1981中。連接混合物被用來(lái)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL2306。如Yasbin等細(xì)菌學(xué)雜志121(1975)，296-304頁(yè)所述制備并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體的分離和鑒定將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平板接種在含卡那霉素(10mg/ml)0.4％葡萄糖，10mM磷酸鉀和0.1％AZCL HE-纖維素(Megazyme，澳大利亞)的LB瓊脂平板上，并在37℃下保溫18小時(shí)。內(nèi)切葡聚糖酶陽(yáng)性菌落被鑒定為被蘭色暈圈圍繞的菌落。
將各個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體接種在含卡那霉素(10mg/ml)的10ml TY培養(yǎng)基中。37℃下以250rpm振蕩保溫1天后，取出50ml上清。通過(guò)將50ml上清加入在含0.1％AZCL HE-纖維素的LB瓊脂平板的瓊脂上鉆的孔中。
37℃下保溫16小時(shí)后，圍繞孔的蘭色暈圈表明了內(nèi)切葡聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。一個(gè)這樣的克隆被稱(chēng)為MB208。內(nèi)切葡聚糖酶的編碼DNA序列及氨基酸序列分別示于SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中。
如下確定DNA序列根據(jù)制造商的說(shuō)明操作，使用引物#21318和#20887(見(jiàn)上文)，采用Applied Biosystems373A自動(dòng)測(cè)序儀，用Taq脫氧末端循環(huán)測(cè)序盒(Perkin Elmer,USA)對(duì)Qiagen純化的質(zhì)粒DNA測(cè)序。根據(jù)Devereux等，癌的發(fā)生(Carcinogenesis)14(1993),pp.795-801進(jìn)行序列數(shù)據(jù)的分析。
芽孢桿菌B.agaradherens NCIMB40482內(nèi)切葡聚糖酶的CBD的體外擴(kuò)增在補(bǔ)充有200μM各種dNTP,2.6單位HiFidelityTMExpand酶混合物和300pmol各種引物的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中將約10-20ng質(zhì)粒pMB208進(jìn)行PCR擴(kuò)增#271845′-GCT GCA GGA TCC GTT TCA ATT TAT GTT CAA AGA TCT CCT GGAGAG TAT CCA GCA TGG GAC CCA A-3′#284955′-GC ACA AGC TTG CGG CCG CTA ATT GAG TGG TTC CCA CGG ACC G3′(下劃線(xiàn)處為BamHⅠ和NatⅠ限制位點(diǎn))。
設(shè)計(jì)的引物用來(lái)擴(kuò)增芽孢桿菌B.agaradherens NCIMB40482的纖維素酶編碼基因的CBD編碼DNA。
使用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。94℃下2分鐘，60℃30秒和72℃45秒的保溫之后是使用94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒的循環(huán)方式進(jìn)行的PCR的十次循環(huán)及94℃變性30秒，60℃30秒和72℃45秒的二十次循環(huán)(在該延長(zhǎng)步驟中，每次循環(huán)增加20秒)。通過(guò)在1.5％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)中，使用ReadyLoadTM100bp DNA階梯(GibcoBRL，丹麥)作為大小標(biāo)志的電泳分析10μl擴(kuò)增產(chǎn)物的等分試樣。
通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的克隆PCR片段的亞克隆根據(jù)制造商的說(shuō)明使用QIAquickTMPCR純化試劑盒(Qiagen,USA)純化如上所述產(chǎn)生的40μlPCR產(chǎn)物的等分試樣。將純化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,PH8.5洗脫。將25μl純化的PCR片段用BamHⅠ和NotⅠ消化，在1.5％低凝膠化溫度的瓊脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝膠中進(jìn)行電泳，從凝膠中切下相關(guān)片段，并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用QIAquickTM凝膠提取盒(Qiagen,USA)進(jìn)行純化。接著將分離的DNA片段與BamHⅠ-NotⅠ消化的pMB335連接，連接混合物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。
陽(yáng)性克隆的鑒定和表征將細(xì)胞平板接種在包含氨芐青霉素(200μg/ml)的LB瓊脂平板中，37℃保溫過(guò)夜。第二天，將菌落再劃線(xiàn)至新的LB-氨芐青霉素瓊脂平板上并37℃保溫過(guò)夜。第三天，將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至含氨芐青霉素(200ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基中并以250rpm振蕩保溫過(guò)夜。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAgen質(zhì)粒純化微型試劑盒(Qiagen,USA)從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。將5μl質(zhì)粒樣品用BamHⅠ和NotⅠ消化。通過(guò)在1.5％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)上的凝膠電泳檢查消化。與從PCR擴(kuò)增看見(jiàn)的相同大小的DNA片段的出現(xiàn)表明為陽(yáng)性克隆。
含有TermamylTMα-淀粉酶基因和芽孢桿菌B.agaradherens N CIMB40482堿性纖維素酶Cel5A之CBD的融合構(gòu)建體的一個(gè)陽(yáng)性克隆被稱(chēng)為MBamyC5A。
將融合構(gòu)建體克隆至基于芽孢桿菌的表達(dá)載體中如前所述，地衣芽孢桿菌的amyl基因(包含在pDN1528載體中)在枯草芽孢桿菌中活躍地表達(dá)，導(dǎo)致上清中的活性α-淀粉酶的產(chǎn)生。為了表達(dá)目的，將如上構(gòu)建的編碼融合蛋白的DNA導(dǎo)入pDN1528中。這通過(guò)將pMBamyC5A和pDN1528用SalⅠ-NotⅠ消化，純化這些片段，并將4.7kb pDN1528 SalⅠ-NotⅠ片段與0.5kbpMBamy C5A SalⅠ-NotⅠ片段連接而完成。這產(chǎn)生了帶TermamylTM基因的雜合酶構(gòu)建體的框內(nèi)融合。pMB378的融合構(gòu)建體的DNA序列及相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別示于SEQ ID No.5和SEQ ID NO.6中。
連接混合物被用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL2306的感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞平板接種在含氯霉素(6μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氫鈉的LB瓊脂平板上，并在37℃保溫過(guò)夜。第二天，將菌落再劃線(xiàn)至新的LBPG氯霉素瓊脂平板上并37℃保溫過(guò)夜。第三天，將各個(gè)克隆的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至含氯霉素(6μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基，并在37℃下以250rpm振蕩保溫過(guò)夜。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAgen質(zhì)粒純化微型試劑盒(Qiagen,USA)從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。然而，在37℃下將細(xì)胞裂解15分鐘之前，在重懸緩沖液中補(bǔ)充以1mg/ml小雞蛋白溶菌梅(SIGMA,USA)。將5μl質(zhì)粒樣品用BamHⅠ和NotⅠ消化。通過(guò)在1.5％瓊脂糖凝膠上(NuSieveTM,FMC)的凝膠電泳檢查消化。與從PCR擴(kuò)增中看到的相同大小的DNA片段的出現(xiàn)表明為一陽(yáng)性克隆。一個(gè)陽(yáng)性克隆被稱(chēng)為MB378。
融合蛋白的表達(dá)、分泌和功能分析37℃下，將克隆MB378(表達(dá)與芽孢桿菌B.agaradherensCel5A CBD融合的TermamylTM)在SB培養(yǎng)基中250rpm搖床培養(yǎng)20小時(shí)，將1ml無(wú)細(xì)胞上清與200μl10％AvicelTM混合。0℃下，將混合物保溫1小時(shí)，并接著以5000×g離心5分鐘。將沉淀重新懸浮于100μlSDS-PAGE緩沖液中，95℃下將懸浮液煮沸5分鐘，5000×g離心5分鐘，并將25μl上樣至4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEXTM凝膠上(Novex,USA)。如制造商推薦，在XcellTMMinl-Cell(NOVEX,USA)上將樣品進(jìn)行電泳。如制造商所述，進(jìn)行所有后面的對(duì)凝膠的處理，包括染色(考馬斯)、脫色和干燥。
分子量約為60kDa的蛋白帶的出現(xiàn)表明了編碼在質(zhì)粒pMB378上的TermamylTMCBD融合蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。
實(shí)施例3本實(shí)施例描述了使用序列重疊延伸(SOE)方法[參見(jiàn)Sambrook等，Ausubel等或C.R.Harwood和S.M.Cutting(同上)]融合TermamylTM和來(lái)自纖維單孢菌(C.fimi(ATC C484)cenA基因的CBD。最終構(gòu)建物如下TermamylTM啟動(dòng)子-TermamylTM信號(hào)肽-cenA CBD-接頭-成熟TermamylTM。
用于SOE的TermamylTM片段的擴(kuò)增在補(bǔ)充有200μM各種dNTP、2.6單位的HiFidelityTMExpand酶混合物和100pmol各種引物的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中將約10-20ng的質(zhì)粒pDN1528進(jìn)行PCR擴(kuò)增#45765′-CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC-3′#284035′-TGC ACT GGT ACA GTT CCT ACA ACT AGT CCT ACA CGT GCA AATCTT AAT GGG ACG CTG-3′組成TermamylTM序列的一個(gè)片段的引物#28403的那個(gè)部分被下劃線(xiàn)。該下劃線(xiàn)序列的5′端的序列為編碼CBD接頭區(qū)的序列。
使用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。90℃,2分鐘，55℃,30秒及72℃,45秒的一次保溫之后是使用96℃變性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒的循環(huán)方式進(jìn)行的PCR二十次循環(huán)。通過(guò)在1.0％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)，使用ReadyLoadTM100bp DNA階梯(GibcoBRL，丹麥)作為大小標(biāo)記的電泳分析10Ml擴(kuò)增產(chǎn)物的等分試樣。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAquickTMPCR純化試劑盒(Qiagen,USA)純化如上所述產(chǎn)生的40μlPCR產(chǎn)物的等分試樣。將純化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5洗脫。
基因組DNA的分離30℃下，在TY培養(yǎng)基中，將纖維單孢菌C.fimi ATCC484以250rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。離心收集細(xì)胞。
如Pitcher等應(yīng)用微生物學(xué)通訊8(1989),p.151-156中所描述分離基因組DNA。
用于SOE方法的纖維單孢菌C.fimi(ATCC484)cenA基因的CBD的體外擴(kuò)增。
在補(bǔ)充有200μM各種dNTP、2.6單位HiFidelityTMExpand酶混合物及100pmol各種引物的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中將約100-200ng的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增#88285′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCT CCCGGC TGC CGC GTC GAC TAC-3′#284045′-TGT AGG AAC TGT ACC AGT GCA CGT GGT GCC GTT GAG C-3′(PstⅠ限制性位點(diǎn)下劃線(xiàn))設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增纖維單孢菌C.fimi(ATC C484)的cenA編碼基因的編碼纖維素結(jié)合區(qū)的DNA。從數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank登記號(hào)M15823中提取DNA序列。
PCR循環(huán)如下進(jìn)行94℃,2分鐘，55℃,30秒及72℃,45秒的一次保溫之后是使用96℃變性10秒，55℃復(fù)性30秒，72℃延伸45秒的循環(huán)方式的PCR的三十次循環(huán)。通過(guò)在1.0％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)，使用ReadyLoadTM100bp DNA階梯(GibcoBRL，丹麥)作為大小標(biāo)記的電泳分析10μl擴(kuò)增物的等分試樣。
根據(jù)制造商說(shuō)明，使用QIAquickTMpCR純化試劑盒(Qiagen,USA)純化如上描述產(chǎn)生的40μl PCR產(chǎn)物的等分試樣。
將純化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5洗脫。
來(lái)自纖維單孢菌C.fimi(ATCC484)cenA基因的CBD和TermamylTM基因的SOE使用100-200ngPCR擴(kuò)增的TermamylTM片段和PCR擴(kuò)增cenA CBD片段進(jìn)行第二輪PCR。在補(bǔ)充有200μM各種dNTP、2.6單位HiFidelityTMExpand酶混合物的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中進(jìn)行兩個(gè)片段的SOE。
如下進(jìn)行觸降式(touch-down)PCR循環(huán)96℃,2分鐘，60℃,2分鐘和72℃,45秒的保溫。在每次循環(huán)中將復(fù)性溫度降低1℃將此循環(huán)重復(fù)十次。
通過(guò)加入100pmol兩個(gè)側(cè)翼引物#8828和#4576(參見(jiàn)上文)來(lái)開(kāi)始第三次PCR反應(yīng)以擴(kuò)增雜合DNA。通過(guò)將SOE反應(yīng)混合物在96℃,2分鐘，55℃,30秒，72℃,45秒進(jìn)行保溫來(lái)進(jìn)行PCR。此后接著是使用96℃變性10秒，55℃復(fù)性30秒，72℃延伸45秒的循環(huán)方式進(jìn)行PCR的二十次循環(huán)。通過(guò)在1.0％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)上，使用ReadyLoadTM100bp DNA階梯(GibcoBRL，丹麥)作為大小標(biāo)記，電泳分析10μl擴(kuò)增產(chǎn)物的等分試樣。
編碼CBD-Termamyl雜合酶的SOE片段的亞克隆根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAquickTMPCR純化試劑盒(Qiagen,USA)純化如上所述產(chǎn)生的40μl SOE-PCR產(chǎn)物。將純化的DNA用50ul 10mM Tris-HCl,pH8.5洗脫。將25μl純化的PCR片段用PstⅠ和KpnⅠ消化，在1.0％低凝膠化溫度的瓊脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝膠中進(jìn)行電泳，從凝膠中切837bp片段，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIA quickTM凝膠提取盒(Qiagen,USA)純化，接著將分離的DNA片段連接至PstⅠ和KpnⅠ消化的pDN1981中，連接混合物被用來(lái)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL2306的感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞平板接種在含卡那霉素(10μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氫鉀的LB瓊脂平板上，并37℃保溫過(guò)夜。第二天，將菌落重新劃線(xiàn)至新的LBPG卡那霉素瓊脂平板并37℃保溫過(guò)夜。第三天，將各克隆的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至含卡那霉素(10ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，并在37℃下，以250rpm振蕩保溫過(guò)夜。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用QIAgen質(zhì)粒純化微型試劑盒(Qiagen,USA)，從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。然而，在37℃下將細(xì)胞裂解15分鐘之前，在重懸緩沖液中補(bǔ)充以1mg/ml小雞蛋白溶菌酶(SIGMA,USA)。將5μl質(zhì)粒樣品用PstⅠ和KpnⅠ消化。通過(guò)1.5％瓊脂糖凝膠(NuSieveTM,FMC)上的凝膠電泳檢查消化。與從PCR擴(kuò)增看到的相同大小的837bp的DNA片段的出現(xiàn)表明為陽(yáng)性克隆。一個(gè)陽(yáng)性克隆稱(chēng)為MOL1297。
融合蛋白的表達(dá)，分泌和功能分析37℃下，將克隆MOL1297(表達(dá)與TermamyTM的N-末端融合的纖維單孢菌C.fimi)cenA CBD)在SB培養(yǎng)基中以250rpm振蕩保溫20小時(shí)。將1ml無(wú)細(xì)胞上清與200μl10％AvicelTM混合。0℃下，將混合物保溫1小時(shí)，并接著以5000xg離心5分鐘。將沉淀物重新懸浮在100μlSDS-PAGE緩沖液中，95℃煮沸5分鐘，5000xg離心5分鐘，將25μl上樣至4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEX凝膠(Novex,USA)上。如制造商所推薦，在XcellTMMini-Cell(NOVEX,USA)中將樣品進(jìn)行電泳。如制造商所述進(jìn)行所有后面的對(duì)凝膠的處理，包括染色(考馬斯)、脫色和干燥。
分子量為約85kDa的蛋白帶的出現(xiàn)表明了CBD-TermamylTM融合蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。
纖維單孢菌C.fimi cenA CBD-Termamyl雜合酶的編碼序列示于SEQ ID NO.7中(其中小寫(xiě)字母表示該序列的CBD編碼部分)。雜合酶的相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列示于SEQ ID NO.8中(其中小寫(xiě)字母表示CBD氨基酸序列)。
實(shí)施例4本實(shí)施例描述了從脂酶(LipolaseTM；腐質(zhì)霉H.lanuginosa脂酶)和CBD構(gòu)建融合蛋白(雜合體)。由于酶的N-端遠(yuǎn)離活性部位，而C-末端與活性部位相對(duì)鄰近，則因而擇了具有N-末端CBD的構(gòu)建物。
pIVI450構(gòu)建物(CBD-接頭-脂酶)為了表達(dá)在LipolaseTM的N-末端具有嗜熱毀絲霉纖維素酶CBD和接頭的蛋白，制備了該構(gòu)建物。
使用包含嗜熱毀絲霉纖維素酶基因的克隆pA2C161(DSM9967)作為模板和下面的寡聚體作為引物產(chǎn)生了一個(gè)PCR片段#82025′ACGTAGTGGCCACGCTAGGCGAGGTGGTGG 3′#196725′CCACACTTCTCTTCCTTCCTC 3′將該P(yáng)CR片段用BamHⅠ和BalⅠ切割，并克隆至正好在推測(cè)的信號(hào)肽加工位點(diǎn)上游也被BamHⅠ和BalⅠ切割的pAHL中。通過(guò)測(cè)序(參見(jiàn)SEQ ID NO.9)驗(yàn)證克隆。
除去位于CBD和脂酶之間的接頭制備該構(gòu)建物以便感興趣的任何接頭可被插在CBD和脂酶之間以尋找最佳接頭。
通過(guò)USE方法(Stratagene商品號(hào)200509)將NheⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入pIVI450中的CBD和接頭區(qū)之間，產(chǎn)生pIVI450+NheⅠ位點(diǎn)。將pIVI450+NheⅠ位點(diǎn)用XhoⅠ和NheⅠ切割，分離含CBD部分的載體。
將質(zhì)粒pIVI392用XhoⅠ和NheⅠ切割，分離含LipolaseTM基因(減去信號(hào)肽編碼序列)的片段。
連接這些DNA片段，產(chǎn)生在CBD和脂酶基因之間包含NheⅠ的pIVI450 CBD-NheⅠ位點(diǎn)-LipolaseTM。在該NheⅠ位點(diǎn)可導(dǎo)入不同的接頭。
非糖基化接頭的導(dǎo)入從本文描述的構(gòu)建物表達(dá)的蛋白包含下述結(jié)構(gòu)CBD-非糖基化接頭-脂酶。
接頭的氨基酸序列如下NNNPQQGNPNQGGNNGGGNQGGGNGG使用下面引物進(jìn)行PCR#293155′GATCTAGCTAGCAACAATAACCCCCAGCAGGGCAACCCCAACCAGGGCGGGAACAACGGC 3′#293165′GATCTAGCTAGCGCCGCCGTTGCCGCCGCCCTGGTTGCCGCCGCCGTTGTTCCCGCCCTG 3′將PCR片段用NheⅠ切割，同樣將載體pIVI450 CBD-NheⅠ-LipolaseTM用NheⅠ切割，連接兩個(gè)片段，產(chǎn)生pIVI450 CBD-非糖基化的接頭-LipolaseTM(SEQ IDNO.10)。
鞋墊腐質(zhì)霉第54家族纖維素酶接頭的導(dǎo)入從本文描述的構(gòu)建物表達(dá)的蛋白包含如下結(jié)構(gòu)CBD-糖基化接頭-脂酶接頭的氨基酸序列如下VQIPSSSTSSPVNQPTSTSTTSTSTTSSPPVQPTTPS使用下述引物進(jìn)行PCR#293135′GATACTGCTAGCGTCCAGATCCCCTCCAGC 3′#293145′GATACTGCTAGCGCTGGGAGTCGTAGGCTG 3′將PCR片段用NheⅠ切割，同樣將載體pIVI450 CBD-NheⅠ-LipolaseTM用NheⅠ切割，連接兩個(gè)片段，產(chǎn)生pIVI450 CBD-鞋墊腐質(zhì)霉45家族纖維素酶接頭-LipolaseTM(SEQ ID NO.11)。
實(shí)施例5本實(shí)施例涉及包含與灰蓋鬼傘過(guò)氧化物酶(CiP)或與其突變體(mCiP842)相連的CBD的融合蛋白(參見(jiàn)如WO95/10602)。
酵母表達(dá)系統(tǒng)選擇PJC106/YNG344宿主/載體系統(tǒng)作為用于使用酵母表達(dá)的所有CiP實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)系統(tǒng)。突變mCiP842與親本CiP相比含有下面的氨基酸取代V53A,E239G,Y272F,M242I。使用與用于將CBD與野生型CiP基因融合的相同方法用該質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建。
CBD-CiP融合載體JC20A或JC20D的構(gòu)建CiP信號(hào)序列-鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD-鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶接頭-CiP或mCiP842通過(guò)使用PCR擴(kuò)增四種單獨(dú)的基因片段構(gòu)建CBD-CiP融合蛋白。A)CiP5-非翻譯區(qū)和來(lái)自質(zhì)粒JC106或mCiP842的編碼氨基酸1-22的CiP編碼序列，B)來(lái)自質(zhì)粒pCaHj418的編碼氨基酸248-305的鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD，C)來(lái)自質(zhì)粒pCaHj418的編碼氨基酸213-247的鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶接頭區(qū)，及D)來(lái)自質(zhì)粒JC106或mCiP842的編碼氨基酸21-344的CiP編碼序列鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶的序列公開(kāi)在WO91/17244中。
用于A至D擴(kuò)增中的引物如下擴(kuò)增A1．CiPpcrdwn:CCCCCTTCCCTGGCGAATTCCGCATGAGG2．JC20.1:ACCTTGGGGTAGAGCGAGGGCACCGATG擴(kuò)增B3．JC20.2:TGCACTGCTGAGAGGTGGGC4．JC20.3:CAGGCACTGATGATACCAGT擴(kuò)增C5．JC20.4:CCCTCCAGCAGCACCAGCTCT6．JC20.5:TCCTCCAGGACCCTGACCGCTCGGAGTCGTAGGCTG
擴(kuò)增D7．JC20.6:TACGACTCCGAGCGGTCAGGGTCCTGGAGGAGGCGGG8．YES2term:GGGAGGGCGTGAATGTAAG純化反應(yīng)A和B的擴(kuò)增產(chǎn)物并使用T4多核苷酸激酶磷酸化，室溫下互相連接15分鐘，并用引物1和4擴(kuò)增以產(chǎn)生產(chǎn)物AB。純化并混合反應(yīng)C)和D)的擴(kuò)增產(chǎn)物，接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生產(chǎn)物CD。純化反應(yīng)產(chǎn)物AB和CD，并使用T4多核苷酸激酶磷酸化。室溫下互相連接15分鐘，并使用引物1和8擴(kuò)增以產(chǎn)生最終產(chǎn)物。純化得到的產(chǎn)物，與通過(guò)用BamHⅠ和XhoⅠ消化除去了CiP基因的質(zhì)粒JC106混合。質(zhì)粒JC20A包含野生型CiP基因，而質(zhì)粒JC20D包含過(guò)氧化物穩(wěn)定的突變mCiP842。在缺乏尿苷的基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。
其它CBD-CiP融合載體JC21、22、23的構(gòu)建基本上如對(duì)上面質(zhì)粒JC20A描述的相同方法，使用PCR和重疊延伸構(gòu)建在鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD與CiP之間包含其他接頭的其它質(zhì)粒。產(chǎn)生的質(zhì)粒編碼具有下面區(qū)域結(jié)構(gòu)的融合蛋白JC21:CiP信號(hào)序列-截短的鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD-鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶接頭-CiPJC22:CiP信號(hào)序列-鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD-來(lái)自肺炎克雷白氏桿菌的NifA基因的接頭-CiP。
JC23:CiP信號(hào)序列-鞋墊腐質(zhì)霉家族系45纖維素酶CBD-來(lái)自大腸桿菌OmpA基因的接頭-CiP。
評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化體過(guò)氧化物酶和纖維素結(jié)合活性平板分析將酵母轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在含2％半乳糖(誘導(dǎo)驅(qū)動(dòng)CBD-CiP表達(dá)的GAL1酵母啟動(dòng)子)的覆蓋有由位于硝基纖維素頂部的乙酸纖維素組成的雙濾紙層的基本培養(yǎng)基平板中。過(guò)夜培養(yǎng)后，將濾紙用100ml20mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌5分鐘，此后未能檢測(cè)出菌落碎片。接著通過(guò)將其用含50μg/ml二氨基聯(lián)苯胺和1mM過(guò)氧化氫的100mM磷酸緩沖液(pH7.0)覆蓋來(lái)分析濾紙上結(jié)合的過(guò)氧化物酶活性。結(jié)合的過(guò)氧化物酶活性以在濾紙上的褐色沉淀的形式出現(xiàn)。
液體分析將在濾紙分析中顯示纖維素結(jié)合的突變體的液體培養(yǎng)物在含2％半乳糖的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。將20μl培養(yǎng)液的樣品與Avicel結(jié)晶纖維素(20g/l)在含0.01％Tween20的0.1M磷酸緩沖液(pH7)中混合，總體積為100μl,22℃下，保溫10分鐘。接著將混合物離心以沉淀不溶性纖維素成分，使用標(biāo)準(zhǔn)CiP分析(參見(jiàn)如WO95/10602)分析上清的過(guò)氧化物酶活性。根據(jù)可溶性活性的降低，以與不溶性纖維素成分結(jié)合的活性％來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)合作用。
對(duì)CBD-CiP融合蛋白的高pH/熱穩(wěn)定性篩選本篩選方法使用來(lái)自在微量滴定平板上生長(zhǎng)的酵母培養(yǎng)液樣品。通過(guò)如下方法進(jìn)行96孔板篩選，首先在96孔微量滴定平板中，在50μl體積的URA(-)培養(yǎng)基(pH6.0)中培養(yǎng)突變體庫(kù)的酵母轉(zhuǎn)化體。通過(guò)稀釋至培養(yǎng)基中并用移液管(機(jī)器或人工自動(dòng)移液器)吸至96孔平板中來(lái)接種培養(yǎng)物。將其放置在30℃、35bRPM培養(yǎng)箱中，并搖床溫養(yǎng)約5天。將平板直接從培養(yǎng)箱中放入機(jī)器系統(tǒng)中。
將CiP和mCiP842及相關(guān)的融合蛋白進(jìn)行pH-溫度-H2O2聯(lián)合試驗(yàn)在初始活性分析后，將培養(yǎng)物稀釋至約0.06PODU/ml(參見(jiàn)WO95/10602的PODU的定義)，并在50℃下保溫于200μM過(guò)氧化氫、100mM磷酸鹽/硼酸鹽緩沖液(pH10.5)中。0.1、0.20和30分鐘后，除去樣品，使用標(biāo)準(zhǔn)ABTS分析，在pH7.0測(cè)定殘留活性。改進(jìn)的突變體為顯示比CiP更高的殘留活性的那些，并以相對(duì)于時(shí)間0分析結(jié)果的殘留活性的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。
構(gòu)建并測(cè)序被設(shè)計(jì)用來(lái)制備五個(gè)鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD-CiP融合蛋白的酵母表達(dá)質(zhì)粒。這些融合蛋白之間的主要不同在于連接CBD與CiP的接頭區(qū)的類(lèi)型。因?yàn)樗徽J(rèn)為對(duì)于使CBD與纖維素底物的結(jié)合最大化是很重要的。
所有的構(gòu)建物編碼四個(gè)不同區(qū)域的融合CiP信號(hào)序列-鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD-接頭-CiP。質(zhì)粒JC20A是與野生型CiP的CBD-CiP融合，而質(zhì)粒JC20D是與含氨基酸取代V53A、E239G、M242Ⅰ和Y272F的穩(wěn)定突變體mCiP842的融合。兩種JC20構(gòu)建物都包含天然鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶接頭區(qū)。
質(zhì)粒JC21編碼除開(kāi)它含有缺乏鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶接頭的殘基7-23的截短接頭之外與JC20產(chǎn)物相同的融合蛋白。質(zhì)粒JC22具有來(lái)自大腸桿菌外膜蛋白(來(lái)自O(shè)mpA基因)的12個(gè)富含脯氨基殘基的接頭，取代鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶接頭區(qū)。最終質(zhì)粒JC23包含來(lái)自肺炎克雷白氏桿菌的NifA基因的第四個(gè)接頭(稱(chēng)為Q接頭)。長(zhǎng)度為14個(gè)氨基酸的該接頭包含3個(gè)谷氨酰胺殘基(因此稱(chēng)為Q接頭)以及3個(gè)精氨酸殘基，這使得其在中性pH時(shí)帶正電。
將這些JC20-系列質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酒酒酵母中以用于表達(dá)和檢測(cè)，轉(zhuǎn)化后，將酵母菌落培養(yǎng)在覆蓋有雙層濾紙層的選擇平板上乙酸纖維素濾紙位于硝基纖維素上部。由酵母JC106分泌的野生型CiP和穩(wěn)定的突變體mCiP842通過(guò)乙酸纖維素，接著與硝酸纖維素結(jié)合，在那里它可使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和H2O2而被肉眼觀察到。乙酸纖維素濾紙沒(méi)有結(jié)合任何野生型或mCiP842過(guò)氧化物酶。相反，由質(zhì)粒JC20A、JC20D、JC21、JC22和JC23編碼的N-末端CBD-CiP融合體均可使用DAB分析在兩個(gè)濾紙上檢測(cè)到，這表明融合蛋白具有過(guò)氧化物酶和纖維素結(jié)合活性。對(duì)濾紙的肉眼觀測(cè)表明NifA接頭可能增進(jìn)結(jié)合使其略高于其它，盡管差別有限。在所有情況下，甚至在pH7用緩沖液充分洗滌后與乙酸纖維素濾紙結(jié)合的過(guò)氧化物酶活性仍然保留。與下面的硝酸纖維濾紙的結(jié)合活性表明CBD-CiP的結(jié)合可能是不完全的，或該纖維素濾紙達(dá)到飽和，使得一些融合蛋白穿過(guò)而到達(dá)下面的濾紙，或一部分融合蛋白被截短得僅包括過(guò)氧化物酶區(qū)域。
對(duì)相應(yīng)于構(gòu)建物的序列識(shí)別號(hào)說(shuō)明如下。簡(jiǎn)寫(xiě)如下EGV鞋墊腐質(zhì)酶家族45內(nèi)切葡聚糖酶(纖維素酶)
CiPss:CiP信號(hào)序列CiP842:CiP突變體/變異體mCiP842；SEQ IDNO.12:JC20.A中的CiPss(+2個(gè)氨基酸)-EGV CBD-EGV接頭-CiP融合體的核苷酸序列；SEQ ID NO 13:JC20.D1中的CiPss(+2個(gè)氨基酸)-EGVCBD-EGV接頭-CiP842融合體的核苷酸序列；SEQ ID NO 14:JC21中的CiPss(+2個(gè)氨基酸)-EGV CBD-截短的EGV接頭-CiP融合體的核苷酸序列SEQ ID NO 15:JC22中的CiPss(+2個(gè)氨基酸)-EGV CBD-大腸桿菌OmpA接頭-CiP融合體的核苷酸序列；SEQ ID NO 16:JC23中的CiPss(+2個(gè)氨基酸)-SGV CBD-NifA接頭-CiP融合體的核苷酸序列。
實(shí)施例6本實(shí)施例涉及包含與嗜熱毀絲霉漆酶(MtL)(MtL描述在如WO95/33836中)相連的CBD的融合蛋白N-末端MtL-CBD融合體pJC24的構(gòu)建使用質(zhì)粒pJC23的兩個(gè)特定引物，將含有灰蓋鬼傘過(guò)氧化物酶(CiP)信號(hào)序列(22個(gè)氨基酸)、鞋墊腐質(zhì)霉家族45纖維素酶CBD(37個(gè)氨基酸)及來(lái)自肺炎克雷白氏桿菌的NifA接頭區(qū)(14個(gè)氨基酸)的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
引物名 序列CiPpcrdwnCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGJC24.1 AGCGCGTGGACGTTCGATGC根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用提供的緩沖液，采用Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。96℃下，加入聚合酶3分鐘后反應(yīng)開(kāi)始，并以96℃30秒，60℃30秒及72℃2分鐘循環(huán)30次。從包含在質(zhì)粒pJRoC30的毀絲霉漆酶的cDNA克隆，將編碼缺乏信號(hào)肽和前肽(殘基48-620)的成熟MtL肽的第二個(gè)PCR片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用如上所述的相同條件及下面的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增
引物名 序列JC24.2 CAGCAGAGCTGCAACACCCCCAGYES2termGGGGAGGGCGTGAATGTAAG擴(kuò)增后，根據(jù)制造商的推薦，使用QiaquickTMSpin純化試劑盒(Qiagen,Inc.)純化兩個(gè)DNA片段。接著連接兩個(gè)DNA片段，連接混合物的一部分被用作模板使用CiPpcrdwn和YES2term引物，在如上所述的相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將產(chǎn)生的2.3kb嵌合DNA片段進(jìn)行凝膠純化，用BamHⅠ和NotⅠ限制性酶切割，并與質(zhì)粒pJC106的載體骨架相連，獲得質(zhì)粒pJC24。
C-末端MtL-CBD融合pJC25的構(gòu)建從質(zhì)粒pJRoC30，使用下述引物對(duì)擴(kuò)增編碼完整MtL肽(殘基1-620)及232bp上游序列的PCR片段引物名 序列CiPpcrdwnCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGJC25.2 CGCCTTGACCAGCCACTCGCCCTCCTCG從鞋墊腐質(zhì)酶家族45纖維素酶質(zhì)粒pCaH；418，使用下述引物擴(kuò)增編碼鞋墊腐質(zhì)酶家族45纖維素酶接頭區(qū)135個(gè)氨基酸)、鞋墊腐質(zhì)酶家族45纖維素CBD(37個(gè)氨基酸)和20bP的3′-非編碼序列的第二個(gè)DNA片段引物名 序列JC20.4CCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCJC25.1NotⅠATAAGAATGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGGTACCAGT將兩個(gè)DNA片段迅速連接，并如上所述，使用引物CiPpcrdwn和JC25.1NotⅠ擴(kuò)增全長(zhǎng)2.3kb融合產(chǎn)物。將該最終PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pJC106中以獲得質(zhì)粒pJC25。
C-末端MtL-CBD融合pJC26的構(gòu)建除開(kāi)用引物ML-ct替代引物JC25.1外，用幾乎與pJC25相同的方式構(gòu)建質(zhì)粒pJC26，產(chǎn)生缺乏最終17個(gè)密碼子的MtL基因的截短的產(chǎn)物引物名 序列ML-ctCAGCAGAGCTGCAACACC相應(yīng)于構(gòu)建物的序列識(shí)別號(hào)說(shuō)明如下。簡(jiǎn)寫(xiě)如下EGV鞋墊腐質(zhì)酶家族45內(nèi)切葡聚糖酶(纖維素酶)CiPss:CiP信號(hào)序列MtLss:MtL信號(hào)序列SEQ ID NO.17:pJC24中的CiPss(+2個(gè)氨基酸)-EGVCBD-NifA接頭-MtL融合體的核苷酸序列；SEQ ID NO.18:pJC25中的MtLss-MtL前肽-MtL-EGV接頭-EGV CBD融合體的核苷酸序列；SEQ ID No.19:pJC26中的MtLss-MtL前肽-MtL(減去17個(gè)氨基酸)-EGV接頭-EGV CBD融合體的核苷酸序列。相應(yīng)于所述17個(gè)氨基酸的密碼子用黑體示于SEQ ID NO.18中。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)NOVO NORDISK A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵編(ZIP)DK-2880(G)電話(huà)+45 44 44 88 88(H)電傳+45 44 49 32 56(ⅱ)發(fā)明題目從纖維素織物中除去或漂白污斑或色斑的方法(ⅲ)序列數(shù)目6(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version# 1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度2253堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:TGAAACAAC AAAAACGGCT TTACGCCCGA TTGCTGACGC TGTTATTTGC GCTCATCTTC 60TTGCTGCCTC ATTCTGCAGC AGCGGCGGCA AATCTTAATG GGACGCTGAT GCAGTATTTT 120GAATGGTACA TGCCCAATGA CGGCCAACAT TGGAAGCGTT TGCAAAACGA CTCGGCATAT 180TTGGCTGAAC ACGGTATTAC TGCCGTCTGG ATTCCCCCGG CATATAAGGG AACGAGCCAA 240GCGGATGTGG GCTACGGTGC TTACGACCTT TATGATTTAG GGGAGTTTCA TCAAAAAGGG 300ACGGTTCGGA CAAAGTACGG CACAAAAGGA GAGCTGCAAT CTGCGATCAA AAGTCTTCAT 360TCCCGCGACA TTAACGTTTA CGGGGATGTG GTCATCAACC ACAAAGGCGG CGCTGATGCG 420ACCGAAGATG TAACCGCGGT TGAAGTCGAT CCCGCTGACC GCAACCGCGT AATCTCAGGA 480GAACACCTAA TTAAAGCCTG GACACATTTT CATTTTCCGG GGGCCGGCAG CACATACAGC 540GATTTTAAAT GGCATTGGTA CCATTTTGAC GGAACCGATT GGGACGAGTC CCGAAAGCTG 600AACCGCATCT ATAAGTTTCA AGGAAAGGCT TGGGATTGGG AAGTTTCCAA TGAAAACGGC 660AACTATGATT ATTTGATGTA TGCCGACATC GATTATGACC ATCCTGATGT CGCAGCAGAA 720ATTAAGAGAT GGGGCACTTG GTATGCCAAT GAACTGCAAT TGGACGGAAA CCGTCTTGAT 780GCTGTCAAAC ACATTAAATT TTCTTTTTTG CGGGATTGGG TTAATCATGT CAGGGAAAAA 840ACGGGGAAGG AAATGTTTAC GGTAGCTGAA TATTGGCAGA ATGACTTGGG CGCGCTGGAA 900AACTATTTGA ACAAAACAAA TTTTAATCAT TCAGTGTTTG ACGTGCCGCT TCATTATCAG 960TTCCATGCTG CATCGACACA GGGAGGCGGC TATGATATGA GGAAATTGCT GAACGGTACG 1020GTCGTTTCCA AGCATCCGTT GAAATCGGTT ACATTTGTCG ATAACCATGA TACACAGCCG 1080GGGCAATCGC TTGAGTCGAC TGTCCAAACA TGGTTTAAGC CGCTTGCTTA CGCTTTTATT 1140CTCACAAGGG AATCTGGATA CCCTCAGGTT TTCTACGGGG ATATGTACGG GACGAAAGGA 1200GACTCCCAGC GCGAAATTCC TGCCTTGAAA CACAAAATTG AACCGATCTT AAAAGCGAGA 1260AAACAGTATG CGTACGGAGC ACAGCATGAT TATTTCGACC ACCATGACAT TGTCGGCTGG 1320ACAAGGGAAG GCGACAGCTC GGTTGCAAAT TCAGGTTTGG CGGCATTAAT AACAGACGGA 1380CCCGGTGGGG CAAAGCGAAT GTATGTCGGC CGGCAAAACG CCGGTGAGAC ATGGCATGAC 1440ATTACCGGAA ACCGTTCGGA GCCGGTTGTC ATCAATTCGG AAGGCTGGGG AGAGTTTCAC 1500GTAAACGGCG GATCCGTTTC AATTTATGTT CAAAGATCTG GCGGACCTGG AACGCCAAAT 1560AATGGCAGAG GAATTGGTTA TATTGAAAAT GGTAATACCG TAACTTACAG CAATATAGAT 1620TTTGGTAGTG GTGCAACAGG GTTCTCTGCA ACTGTTGCAA CGGAGGTTAA TACCTCAATT 1680CAAATCCGTT CTGACAGTCC TACCGGAACT CTACTTGGTA CCTTATATGT AAGTTCTACC 1740GGCAGCTGGA ATACATATCA ACCGTATCTA CAAACATCAG CAAAATTACC GGCGTTCATG 1800ATATTGTATT GGTATTCTCA GGTCCAGTCA ATGTGGACAA CTTCATATTT AGCAGAAGTT 1860CACCAGTGCC TGCACCTGGT GATAACACAA GAGACGCATA TTCTATCATT CAGGCCGAGG 1920ATTATGACAG CAGTTATGGT CCCAACCTTC AAATCTTTAG CTTACCAGGT GGTGGCAGCG 1980CTTGGCTATA TTGAAAATGG TTATTCCACT ACCTATAAAA ATATTGATTT TGGTGACGGC 2040GCAACGTCCG TAACAGCAAG AGTAGCTACC CAGAATGCTA CTACCATTCA GGTAAGATTG 2100GGAAGTCCAT CGGGTACATT ACTTGGAACA ATTTACGTGG GGTCCACAGG AAGCTTTGAT 2160ACTTATAGGG ATGTATCCGC TACCATTAGT AATACTGCGG GTGTAAAAGA TATTGTTCTT 2220GTATTCTCAG GTCCTGTTAA TGTTGACTGG TAG 2253(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度750氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe1 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu20 25 30Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly35 40 45Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His50 55 60Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln65 70 75 80Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe85 90 95His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu100 105 110Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly115 120 125Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val130 135 140Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly145 150 155 160Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Ala Gly165 170 175Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr180 185 190Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly195 200 205Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr210 215 220Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu225 230 235 240Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly245 250 255Asn Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp260 265 270Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val275 280 285Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn290 295 300Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln305 310 315 320Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu325 330 335Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe340 345 350Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val355 360 365Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu370 375 380Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly385 390 395 400Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile405 410 415Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe420 425 430Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val435 440 445Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala450 455 460Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp465 470 475 480Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp485 490 495Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg500 505 510Ser Gly Gly Pro Gly Thr Pro Asn Asn Gly Arg Gly Ile Gly Tyr Ile515 520 525Glu Asn Gly Asn Thr Val Thr Tyr Ser Asn Ile Asp Phe Gly Ser Gly530 535 540Ala Thr Gly Phe Ser Ala Thr Val Ala Thr Glu Val Asn Thr Ser Ile545 550 555 560Gln Ile Arg Ser Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu Leu Gly Thr Leu Tyr565 570 575Val Ser Ser Thr Gly Ser Trp Asn Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Gln Thr580 585 590Ser Ala Lys Leu Pro Ala Phe Met Ile Leu Tyr Trp Tyr Ser Gln Val595 600 605Gln Ser Met Trp Thr Thr Ser Tyr Leu Ala Glu Val His Gln Cys Leu610 615 620His Leu Val Ile Thr Gln Glu Thr His Ile Leu Ser Phe Arg Pro Arg625 630 635 640Ile Met Thr Ala Val Met Val Pro Thr Phe Lys Ser Leu Ala Tyr Gln645 650 655Val Val Ala Ala Leu Gly Tyr Ile Glu Asn Gly Tyr Ser Thr Thr Tyr660 665 670Lys Asn Ile Asp Phe Gly Asp Gly Ala Thr Ser Val Thr Ala Arg Val675 680 685Ala Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Gln Val Arg Leu Gly Ser Pro Ser690 695 700Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ile Tyr Val Gly Ser Thr Gly Ser Phe Asp705 710 715 720Thr Tyr Arg Asp Val Ser Ala Thr Ile Ser Asn Thr Ala Gly Val Lys725 730 735Asp Ile Val Leu Val Phe Ser Gly Pro Val Asn Val Asp Trp740 745 750(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1203堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型基因組(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATGAAAAAGA TAACTACTAT TTTTGTCGTA TTGCTTATGA CAGTGGCGTT GTTCAGTATA 60GGAAACACGA CTGCTGCTGA TAATGATTCA GTTGTAGAAG AACATGGGCA ATTAAGTATT 120AGTAACGGTG AATTAGTCAA TGAACGAGGC GAACAAGTTC AGTTAAAAGG GATGAGTTCC 180CATGGTTTGC AATGGTACGG TCAATTTGTA AACTATGAAA GTATGAAATG GCTAAGAGAT 240GATTGGGGAA TAAATGTATT CCGAGCAGCA ATGTATACCT CTTCAGGAGG ATATATTGAT 300GATCCATCAG TAAAGGAAAA AGTAAAAGAG GCTGTTGAAG CTGCGATAGA CCTTGATATA 360TATGTGATCA TTGATTGGCA TATCCTTTCA GACAATGACC CAAATATATA TAAAGAAGAA 420GCGAAGGATT TCTTTGATGA AATGTCAGAG TTGTATGGAG ACTATCCGAA TGTGATATAC 480GAAATTGCAA ATGAACCGAA TGGTAGTGAT GTTACGTGGG GCAATCAAAT AAAACCGTAT 540GCAGAGGAAG TCATTCCGAT TATTCGTAAC AATGACCCTA ATAACATTAT TATTGTAGGT 600ACAGGTACAT GGAGTCAGGA TGTCCATCAT GCAGCTGATA ATCAGCTTGC AGATCCTAAC 660GTCATGTATG CATTTCATTT TTATGCAGGG ACACATGGTC AAAATTTACG AGACCAAGTA 720GATTATGCAT TAGATCAAGG AGCAGCGATA TTTGTTAGTG AATGGGGAAC AAGTGCAGCT 780ACAGGTGATG GTGGCGTGTT TTTAGATGAA GCACAAGTGT GGATTGACTT TATGGATGAA 840AGAAATTTAA GCTGGGCCAA CTGGTCTCTA ACGCATAAAG ATGAGTCATC TGCAGCGTTA 900ATGCCAGGTG CAAATCCAAC TGGTGGTTGG ACAGAGGCTG AACTATCTCC ATCTGGTACA 960TTTGTGAGGG AAAAAATAAG AGAATCAGCA TCTATTCCGC CAAGCGATCC AACACCGCCA 1020TCTGATCCAG GAGAACCGGA TCCAACGCCC CCAAGTGATC CAGGAGAGTA TCCAGCATGG 1080GATCCAAATC AAATTTACAC AAATGAAATT GTGTACCATA ACGGCCAGCT ATGGCAAGCA 1140AAATGGTGGA CACAAAATCA AGAGCCAGGT GACCCGTACG GTCCGTGGGA ACCACTCAAT 1200TAA 1203(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度400氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Lys Lys Ile Thr Thr Ile Phe Val Val Leu Leu Met Thr Val Ala1 5 10 15Leu Phe Ser Ile Gly Asn Thr Thr Ala Ala Asp Asn Asp Ser Val Val20 25 30Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn Gly Glu Leu Val Asn Glu35 40 45Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His Gly Leu Gln50 55 60Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser Met Lys Trp Leu Arg Asp65 70 75 80Asp Trp Gly Ile Asn Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser Ser Gly85 90 95Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser Val Lys Glu Lys Val Lys Glu Ala Val100 105 110Glu Ala Ala Ile Asp Leu Asp Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ilel15 120 125Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys Glu Glu Ala Lys Asp Phe130 135 140Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Tyr Pro Asn Val Ile Tyr145 150 155 160Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp Val Thr Trp Gly Asn Gln165 170 175
Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro Ile Ile Arg Asn Asn Asp180 185 190Pro Asn Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val195 200 205His His Ala Ala Asp ASn Gln Leu Ala Asp Pro Asn Val Met Tyr Ala210 215 220Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Asn Leu Arg Asp Gln Val225 230 235 240Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser Glu Trp Gly245 250 255Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asp Glu Ala Gln260 265 270Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp Ala Asn Trp275 280 285Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Sar Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly Ala290 295 300Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly Thr305 310 315 320Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala Ser Ile Pro Pro Ser Asp325 330 335Pro Thr Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Pro Asp Pro Thr Pro Pro Ser340 345 350Asp Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Pro Asn Gln Ile Tyr Thr Asn355 360 365Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys Trp Trp Thr370 375 380Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro Trp Glu Pro Leu Asn385 390 395 400
(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1683堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型基因組(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:
ATGAAACAAC AAAAACGGCT TTACGCCCGA TTGCTGACGC TGTTATTTGC GCTCATCTTC 60TTGCTGCCTC ATTCTGCAGC AGCGGCGGCA AATCTTAATG GGACGCTGAT GCAGTATTTT 120GAATGGTACA TGCCCAATGA CGGCCAACAT TGGAAGCGTT TGCAAAACGA CTCGGCATAT 180TTGGCTGAAC ACGGTATTAC TGCCGTCTGG ATTCCCCCGG CATATAAGGG AACGAGCCAA 240GCGGATGTGG GCTACGGTGC TTACGACCTT TATGATTTAG GGGAGTTTCA TCAAAAAGGG 300ACGGTTCGGA CAAAGTACGG CACAAAAGGA GAGCTGCAAT CTGCGATCAA AAGTCTTCAT 360TCCCGCGACA TTAACGTTTA CGGGGATGTG GTCATCAACC ACAAAGGCGG CGCTGATGCG 420ACCGAAGATG TAACCGCGGT TGAAGTCGAT CCCGCTGACC GCAACCGCGT AATCTCAGGA 480GAACACCTAA TTAAAGCCTG GACACATTTT CATTTTCCGG GGGCCGGCAG CACATACAGC 540GATTTTAAAT GGCATTGGTA CCATTTTGAC GGAACCGATT GGGACGAGTC CCGAAAGCTG 600AACCGCATCT ATAAGTTTCA AGGAAAGGCT TGGGATTGGG AAGTTTCCAA TGAAAACGGC 660AACTATGATT ATTTGATGTA TGCCGACATC GATTATGACC ATCCTGATGT CGCAGCAGAA 720ATTAAGAGAT GGGGCACTTG GTATGCCAAT GAACTGCAAT TGGACGGAAA CCGTCTTGAT 780
GCTGTCAAAC ACATTAAATT TTCTTTTTTG CGGGATTGGG TTAATCATGT CAGGGAAAAA 840ACGGGGAAGG AAATGTTTAC GGTAGCTGAA TATTGGCAGA ATGACTTGGG CGCGCTGGAA 900AACTATTTGA ACAAAACAAA TTTTAATCAT TCAGTGTTTG ACGTGCCGCT TCATTATCAG 960TTCCATGCTG CATCGACACA GGGAGGCGGC TATGATATGA GGAAATTGCT GAACGGTACG 1020GTCGTTTCCA AGCATCCGTT GAAATCGGTT ACATTTGTCG ATAACCATGA TACACAGCCG 1080GGGCAATCGC TTGAGTCGAC TGTCCAAACA TGGTTTAAGC CGCTTGCTTA CGCTTTTATT 1140CTCACAAGGG AATCTGGATA CCCTCAGGTT TTCTACGGGG ATATGTACGG GACGAAAGGA 1200GACTCCCAGC GCGAAATTCC TGCCTTGAAA CACAAAATTG AACCGATCTT AAAAGCGAGA 1260AAACAGTATG CGTACGGAGC ACAGCATGAT TATTTCGACC ACCATGACAT TGTCGGCTGG 1320ACAAGGGAAG GCGACAGCTC GGTTGCAAAT TCAGGTTTGG CGGCATTAAT AACAGACGGA 1380CCCGGTGGGG CAAAGCGAAT GTATGTCGGC CGGCAAAACG CCGGTGAGAC ATGGCATGAC 1440ATTACCGGAA ACCGTTCGGA GCCGGTTGTC ATCAATTCGG AAGGCTGGGG AGAGTTTCAC 1500GTAAACGGCG GATCCGTTTC AATTTATGTT CAAAGATCTC CTGGAGAGTA TCCAGCATGG 1560GATCCAAATC AAATTTACAC AAATGAAATT GTGTACCATA ACGGCCAGCT ATGGCAAGCA 1620AAATGGTGGA CACAAAATCA AGAGCCAGGT GACCCGTACG GTCCGTGGGA ACCACTCAAT 1680TAA 1683(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度560氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:
Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe1 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu20 25 30Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly35 40 45Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His50 55 60Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln65 70 75 80Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe85 90 95His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu100 105 110Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly115 120 125Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val130 135 140Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly145 150 155 160Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Ala Gly165 170 175Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr180 185 190Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly
195 200 205Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr210 215 220Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu225 230 235 240Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly245 250 255Asn Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp260 265 270Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val275 280 285Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn290 295 300Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln305 310 315 320Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu325 330 335Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe340 345 350Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val355 360 365Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu370 375 380Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly385 390 395 400Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile405 410 415Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe
420 425 430Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val435 440 445Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala450 455 460Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp465 470 475 480Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp485 490 495Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg500 505 510Ser Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Pro Asn Gln Ile Tyr Thr Asn515 520 525Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys Trp Trp Thr530 535 540Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro Trp Glu Pro Leu Asn545 550 555 560SEQ ID No.7:ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCAGCGGCGGCAAATCTTAATgctcccggctgccgcgtcgactacgccgtcaccaaccagtggcccggcggcttcggcgccaacgtcacgatcaccaacctcggcgaccccgtctcgtcgtggaagctcgactggacctacaccgcaggccagcggatccagcagctgtggaacggcaccgcgtcgaccaacggcggccaggtctccgtcaccagcctgccctggaacggcagcatcccgaccggcggcacggcgtcgttcgggttcaacggctcgtgggccgggtccaacccgacgccggcgtcgttctcgctcaacggcaccacgtgcactggtacagttcctacaactagtcctacacgtGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACATGCCCAATGACGGCCAACATTGGAGGCGTTTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGATGTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGCTGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCGCGTAATTTCAGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAGGCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGATGTCGCAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAACTGCAATTGGACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCTGAATATTGGCAGAATGACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGACGTGCCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAGGAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCGATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTCGACTGTCCAAACATGGTTTAAGCCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGGGATATGTACGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAATTGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTCGACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCAAATTCAGGTTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCAAAACGCCGGTGAGACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCAATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACGGCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTCAAAGATAGSEQ 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ID No.11:GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGCATTCCGAATACGAGGCCTGATTAATGATTACATACGCCTCCGGGTAGTAGACCGAGCAGCCGAGCCAGTTCAGCGCCTAAAACGCCTTATACAATTAAGCAGTTAAAGAAGTTAGAATCTACGCTTAAAAAGCTACTTAAAAATCGATCTCGCAGTCCCGATTCGCCTATCAAAACCAGTTTAAATCAACTGATTAAAGGTGCCGAACGAGCTATAAATGATATAACAATATTAAAGCATTAATTAGAGCAATATCAGGCCGCGCACGAAAGGCAACTTAAAAAGCGAAAGCGCTCTACTAAACAGATTACTTTTGAAAAAGGCACATCAGTATTTAAAGCCCGAATCCTTATTAAGCGCCGAAATCAGGCAGATAAAGCCATACAGGCAGATAGACCTCTACCTATTAAATCGGCTTCTAGGCGCGCTCCATCTAAATGTTCTGGCTGTGGTGTACAGGGGCATAAAATTACGCACTACCCGAATCGATAGAACTACTCATTTTTATATAGAAGTCAGAATTCATAGTGTTTTGATCATTTTAAATTTTTATATGGCGGGTGGTGGGCAACTCGCTTGCGCGGGCAACTCGCTTACCGATTACGTTAGGGCTGATATTTACGTGAAAATCGTCAAGGGATGCAAGACCAAAGTAGTAAAACCCCGGAAGTCAACAGCATCCAAGCCCAAGTCCTTCACGGAGAAACCCCAGCGTCCACATCACGAGCGAAGGACCACCTCTAGGCATCGGACGCACCATCCAATTAGAAGCAGCAAAGCGAAACAGCCCAAGAAAAAGGTCGGCCCGTCGGCCTTTTCTGCAACGCTGATCACGGGCAGCGATCCAACCAACACCCTCCAGAGTGACTAGGGGCGGAAATTTAAAGGGATTAATTTCCACTCAACCACAAATCACAGTCGTCCCCGGTATTGTCCTGCAGAATGCAATTTAAACTCTTCTGCGAATCGCTTGGATTCCCCGCCCCTAGTCGTAGAGCTTAAAGTATGTCCCTTGTCGATGCGATGATACACAACATATAAATACTAGCAAGGGATGCCATGCTTGGAGGATAGCAACCGACAACATCACATCAAGCTCTCCCTTCTCTGAACAATAAACCCCACAGGGGGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAAAGCGACTTGAAACGCCCCAAATGAAGTCCTCCATCCTCGCCAGCGTCTTCGCCACGGGCGCCGTGGCTCAAAGTGGTCCGTGGCAGCAATGTGGTGGCATCGGATGGCAAGGATCGACCGACTGTGTGTCGGGCTACCACTGCGTCTACCAGAACGATTGGTACAGCCAGTGCGCTAGCGTCCAGATCCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGCTAGCCCTCCTCGTCGACCTGTCTCGCAGGATCTGTTTAACCAGTTCAATCTCTTTGCACAGTATTCTGCAGCCGCATACTGCGGAAAAAACAATGATGCCCCAGCTGGTACAAACATTACGTGCACGGGAAATGCCTGCCCCGAGGTAGAGAAGGCGGATGCAACGTTTCTCTACTCGTTTGAAGACTCTGGAGTGGGCGATGTCACCGGCTTCCTTGCTCTCGACAACACGAACAAATTGATCGTCCTCTCTTTCCGTGGCTCTCGTTCCATAGAGAACTGGATCGGGAATCTTAAGTTCCTCTTGAAAAAAATAAATGACATTTGCTCCGGCTGCAGGGGACATGACGGCTTCACTTCGTCCTGGAGGTCTGTAGCCGATACGTTAAGGCAGAAGGTGGAGGATGCTGTGAGGGAGCATCCCGACTATCGCGTGGTGTTTACCGGACATAGCTTGGGTGGTGCATTGGCAACTGTTGCCGGAGCAGACCTGCGTGGAAATGGGTATGATATCGACGTGTTTTCATATGGCGCCCCCCGAGTCGGAAACAGGGCTTTTGCAGAATTCCTGACCGTACAGACCGGCGGAACACTCTACCGCATTACCCACACCAATGATATTGTCCCTAGACTCCCGCCGCGCGAATTCGGTTACAGCCATTCTAGCCCAGAATACTGGATCAAATCTGGAACCCTTGTCCCCGTCACCCGAAACGATATCGTGAAGATAGAAGGCATCGATGCCACCGGCGGCAATAACCGGCCGAACATTCCGGATATCCCTGCGCACCTATGGTACTTCGGGTTAATTGGGACATGTCTTTAGTGGCCGGCGCGGCTGGGTCGACTCTAGCGAGCTCGAGATCTAGAGGGTGACTGACACCTGGCGGTAGACAATCAATCCATTTCGCTATAGTTAAAGGATGGGGATGAGGGCAATTGGTTATATGATCATGTATGTAGTGGGTGTGCATAATAGTAGTGAAATGGAAGCCAAGTCATGTGATTGTAATCGACCGACGGAATTGAGGATATCCGGAAATACAGACACCGTGAAAGCCATGGTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAGACAGTCCCTGATTTACCCTTGCACAAAGCACTAGAAAATTAGCATTCCATCCTTCTCTGCTTGCTCTGCTGATATCACTGTCATTCAATGCATAGCCATGAGCTCATCTTAGATCCAAGCACGTAATTCCATAGCCGAGGTCCACAGTGGAGCAGCAACATTCCCCATCATTGCTTTCCCCAGGGGCCTCCCAACGACTAAATCAAGAGTATATCTCTACCGTCCAATAGATCGTCTTCGCTTCAAAATCTTTGACAATTCCAAGAGGGTCCCCATCCATCAAACCCAGTTCAATAATAGCCGAGATGCATGGTGGAGTCAATTAGGCAGTATTGCTGGAATGTCGGGCCAGTTGGCCCGGGTGGTCATTGGCCGCCTGTGATGCCATCTGCCACTAAATCCGATCATTGATCCACCGCCCACGAGGCGCGTCTTTGCTTTTTGCGCGGCGTCCAGGTTCAACTCTCTCGCTCTAGATATCGATGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGACGCGTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTT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ID No.12:GAGAAAAAACTATAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTCTAAAGACTATGAAGCTCTCGCTTTTGTCCACCTTCGCTGCTGTCATCATCGGTGCCCTCGCTCTACCCCAGGGTTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGCCAGGGTCCTGGAGGAGGCGGGTCAGTCACTTGCCCCGGTGGACAGTCCACTTCGAACAGCCAGTGCTGCGTCTGGTTCGACGTTCTAGACGATCTTCAGACCAACTTCTACCAAGGGTCCAAGTGTGAGAGCCCTGTTCGCAAGATTCTTAGAATTGTTTTCCATGACGCGATCGGATTTTCGCCGGCGTTGACTGCTGCTGGTCAATTCGGTGGTGGAGGAGCTGATGGCTCCATCATTGCGCATTCGAACATCGAATTGGCCTTCCCGGCTAATGGCGGCCTCACCGACACCGTCGAAGCCCTCCGCGCGGTCGGTATCAACCACGGTGTCTCTTTCGGCGATCTCATCCAATTCGCCACTGCCGTCGGCATGTCCAACTGCCCTGGCTCTCCCCGACTTGAGTTCTTGACGGGCAGGAGCAACAGTTCCCAACCCTCCCCTCCTTCGTTGATCCCCGGTCCCGGAAACACGGTCACCGCTATCTTGGATCGTATGGGCGATGCAGGCTTCAGCCCTGATGAAGTAGTCGACTTGCTTGCTGCGCATAGTTTGGCTTCTCAGGAGGGTTTGAACTCGGCCATCTTCAGATCTCCTTTGGACTCGACCCCTCAAGTTTTCGATACCCAGTTCTACATTGAGACCTTGCTCAAGGGTACCACTCAGCCTGGCCCTTCTCTCGGCTTTGCAGAGGAGCTCTCCCCCTTCCCTGGCGAATTCCGCATGAGGTCCGATGCTCTCTTGGCTCGCGACTCCCGAACCGCCTGCCGATGGCAATCCATGACCAGCAGCAATGAAGTTATGGGCCAGCGATACCGCGCCGCCATGGCCAAGATGTCTGTTCTCGGCTTCGACAGGAACGCCCTCACCGATTGCTCTGACGTTATTCCTTCTGCTGTGTCCAACAACGCTGCTCCTGTTATCCCTGGTGGCCTTACTGTCGATGATATCGAGGTTTCGTGCCCGAGCGAGCCTTTCCCTGAAATTGCTACCGCCTCAGGCCCTCTCCCCTCCCTCGCTCCTGCTCCTTGATCTGGTGAAGATGGTACATCCTGCTCTCTCATCATCCCTCTTAGCTATTTATCCAATCTATCTACCTATCTATGCAGTTTCTGTTCTATCACCACAGGAAGCAAGAAAGAAAAACAACAATGCAACGTGAGCAGAAATCAGCAAAAAAATAAATCAGTATACTACAGTAATGAGGCCAGTTTGCGTGGTGTCAGAAGTAAGTACGACTCGGCTTTACACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCSEQ ID No.13:GAGAAAAAACTATAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTCTAAAGACTATGAAGCTCTCGCTTTTGTCCACCTTCGCTGCTGTCATCATCGGTGCCCTCGCTCTACCCCAAGGTTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTATCATCAGTGCCTGCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCGAGCGGTCAGGGTCCTGGAGGAGGCGGGTCAGTCACTTGCCCCGGTGGACAGTCCACTTCGAACAGCCAGTGCTGCGTCTGGTTCGACGTTCTAGACGATCTTCAGACCAACTTCTACCAAGGGTCCAAGTGTGAGAGCCCTGTTCGCAAGATTCTTAGAATTGTTTTCCATGACGCGATCGGATTTTCGCCGGCGTTGACTGCTGCTGGTCAATTCGGTGGTGGAGGAGCTGATGGCTCCATCATTGCGCATTCGAACATCGAATTGGCCTTCCCGGCTAATGGCGGCCTCACCGACACCGTCGAAGCCCTCCGCGCGGTCGGTATCAACCACGGTGTCTCTTTCGGCGATCTCATCCAATTCGCCACTGCCGTCGGCATGTCCAACTGCCCTGGCTCTCCCCGACTTGAGTTCTTGACGGGCAGGAGCAACAGTTCCCAACCCTCCCCTCCTTCGTTGATCCCCGGTCCCGGAAACACGGTCACCGCTATCTTGGATCGTATGGGCGATGCAGGCTTCAGCCCTGATGAAGTAGTCGACTTGCTTGCTGCGCATAGTTTGGCTTCTCAGGAGGGTTTGAACTCGGCCATCTTCAGATCTCCTTTGGACTCGACCCCTCAAGTTTTCGATACCCAGTTCTACATTGAGACCTTGCTCAAGGGTACCACTCAGCCTGGCCCTTCTCTCGGCTTTGCAGAGGAGCTCTCCCCCTTCCCTGGCGAATTCCGCATGAGGTCCGATGCTCTCTTGGCTCGCGACTCCCGAACCGCCTGCCGATGGCAATCCATGACCAGCAGCAATGAAGTTATGGGCCAGCGATACCGCGCCGCCATGGCCAAGATGTCTGTTCTCGGCTTCGACAGGAACGCCCTCACCGATTGCTCTGACGTTATTCCTTCTGCTGTGTCCAACAACGCTGCTCCTGTTATCCCTGGTGGCCTTACTGTCGATGATATCGAGGTTTCGTGCCCGAGCGAGCCTTTCCCTGAAATTGCTACCGCCTCAGGCCCTCTCCCCTCCCTCGCTCCTGCTCCTTGATCTGGTGAAGATGGTACATCCTGCTCTCTCATCATCCCTCTTAGCTATTTATCCAATCTATCTACCTATCTATGCAGTTTCTGTTCTATCACCACAGGAAGCAAGAAAGAAAAACAACAATGCAACGTGAGCAGAAATCAGCAAAAAAATAAATCAGTATACTACAGTAATGAGGCCAGTTTGCGTGGTGTCAGAAGTAAGTACGACTCGGCTTTACACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCSEQ ID No. 14:GAGAAAAAACTATAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTCTAAAGACTATGAAGCTCTCGCTTTTGTCCACCTTCGCTGCTGTCATCATCGGTGCCCTCGCTCTACCCCAAGGTTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGCCCTCCTCCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCTCCAGCCCTCCAGTCCAGCCTACGACTCCTAGCGGACAAGGTCCTGGAGGAGGCGGGTCAGTCACTTGCCCCGGTGGACAGTCCACTTCGAACAGCCAGTGCTGCGTCTGGTTCGACGTTCTAGACGATCTTCAGACCAACTTCTACCAAGGGTCCAAGTGTGAGAGCCCTGTTCGCAAGATTCTTAGAATTGTTTTCCATGSEQ ID No.15:GAGAAAAAACTATAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTCTAAAGACTATGAAGCTCTCGCTTTTGTCCACCTTCGCTGCTGTCATCATCGGTGCCCTCGCTCTACCCCAAGGTTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTCGCCCCCGTCGTCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCCAAGGTCCTGGAGGAGGCGGGTCAGTCACTTGCCCCGGTGGACAGTCCACTTCGAACAGCCAGTGCTGCGTCTGGTTCGACGTTCTAGACGATCTTCAGACCAACTTCTACCAAGGGTCCAAGTGTGAGAGCCCTGTTCGCAAGATTCTTAGAATTGTTTTCCATGACGCGATCGGATTTTCGCCGGCGTTGACTGCTGCTGGTCAATTCGGTGSEQ ID No.16:GAGAAAAAACTATAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTCTAAAGACTATGAAGCTCTCGCTTTTGTCCACCTTCGCTGCTGTCATCATCGGTGCCCTCGCTCTACCCCAAGGTTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGCAAGCCCCCCAACAGAGCCCCCGCATCGAACGTCCACGCGCTCAGGGTCCTGGAGGAGGCGGGTCAGTCACTTGCCCCGGTGGACAGTCCACTTCGAACAGCCAGTGCTGCGTCTGGTTCGACGTTCTAGACGATCTTCAGACCAACTTCTACCAAGGGTCCAAGTGTGAGAGCCCTGTTCGCAAGATTCTTAGAATTGTTTTCCATGACGCGATCGGATTTTCGCCGGCGTTGACTGCTGCTGGTCAATSEQ ID No.17:CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAA 60AAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATT 120CAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAG 180GAGAAAAAACTATAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTCTAAAGACTATGAAGC 240TCTCGCTTTTGTCCACCTTCGCTGCTGTCATCATCGGTGCCCTCGCTCTACCCCAGGGTT 300GCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCG 360TCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGCAAGCCCCCC 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1980CTACTGGCCTACCAACCCCTACCCCAAGTCCGACCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGCTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGTAGGCGGCCGCATTCTTAT
權(quán)利要求
1．一種除去或漂白存在于纖維素纖維品上的污斑或色斑的方法，其中將纖維品與含有改性酶(雜合酶)的水介質(zhì)接觸，該改性酶包含與包含纖維素結(jié)合區(qū)的氨基酸序列相連的非纖維素分解酶的具有催化活性的氨基酸序列。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述污斑或色斑來(lái)自淀粉，蛋白質(zhì)，脂肪，土壤，粘土，水果，蔬菜，咖啡，茶，調(diào)味品，紅酒，體液，草或墨水。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述具催化活性的氨基酸序列來(lái)自選自淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶，果膠酶和氧化還原酶的酶。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述淀粉酶為可從芽孢桿菌屬的種類(lèi)獲得的α-淀粉酶。
5．根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中所述α-淀粉酶可從地衣牙芽孢桿菌獲得。
6．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述蛋白酶可從芽孢桿菌屬或鐮孢屬的種獲得。
7．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述脂肪酶可從腐質(zhì)霉屬，假絲酵母屬，假單孢菌屬或芽孢桿菌屬的種獲得。
8．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述氧化還原酶為過(guò)氧化物酶或漆酶。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述過(guò)氧化物酶可從鬼傘屬的種獲得。
10．根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中所述過(guò)氧化物酶可從灰蓋鬼傘獲得。
11．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述漆酶可從栓菌屬，毀絲霉屬，Schytalidium或多孔菌屬的種獲得。
12．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維素結(jié)合區(qū)可從纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶或殼多糖酶獲得。
13．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述雜合酶通過(guò)包括培養(yǎng)包含表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的方法而獲得，其中該表達(dá)盒包含編碼所述雜合酶的DNA序列，從而表達(dá)所述雜合酶。
14．一種去污劑組合物，包含一種包含與含纖維素結(jié)合區(qū)的氨基酸序列相連的非纖維素分解酶的具有催化活性的氨基酸序列的雜合酶，和表面活性劑。
15．一種洗滌被污染或染色的纖維素纖維品的方法，其中將所述纖維品在其中加入了根據(jù)權(quán)利要求14的去污劑組合物的水介質(zhì)中洗滌。
16．一種雜合酶，其由包括在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18或SEQ IDNO.19的DNA序列中的編碼雜合物的DNA序列所編碼。
17．一種雜合酶，具有包括在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6或SEQ ID NO.8的氨基酸序列中的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種除去或漂白存在于纖維素纖維品上的污斑或色斑的方法,其中將纖維品與含改性酶(雜合酶)的水介質(zhì)接觸,該改性酶包含與包含纖維素結(jié)合區(qū)的氨基酸序列相連的非纖維素水解酶的具催化活生的氨基酸序列。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種去污劑組合物,其中該組合物包括一種所討論類(lèi)型的雜合酶和一種表面活性劑,以及涉及一種洗滌被污染或染色的纖維素纖維品的方法,其中將該纖維品在其中加入了所述去污劑組合物的水介質(zhì)中洗滌。
文檔編號(hào)C12N9/20GK1209833SQ9719193
公開(kāi)日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1997年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月29日
發(fā)明者C·馮德奧斯騰, J·R·切利, M·E·比約恩韋德, J·文德, M·D·拉斯穆森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司