專利名稱：新型微生物"脫葉鏈霉菌yj－118"及使用該菌株生產(chǎn)普伐他丁鈉的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新型微生物“脫葉鏈霉菌(Streptomyces exfoliatus)YJ-118”以及通過(guò)使用這種表現(xiàn)對(duì)ML-236B的強(qiáng)耐受性和將ML-236B轉(zhuǎn)化為普伐他丁(pravastatin)的高羥基化活性的微生物生產(chǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式I中所示的普伐他丁鈉的方法。
現(xiàn)有技術(shù)升高的血漿膽固醇水平長(zhǎng)期被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化疾病、特別是冠心病的主要危險(xiǎn)因素。因?yàn)?0％以上機(jī)體膽固醇的總輸入來(lái)自人體內(nèi)的從頭合成，所以預(yù)計(jì)作為抑制機(jī)體膽固醇生物合成的結(jié)果，血漿膽固醇會(huì)降低。1975年，在桔青霉(Penicillin citrium)液體培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)ML-236B，它是膽固醇生物合成中的限速酶“3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-Co A)還原酶”的有效抑制劑。篩選了數(shù)百種微生物代謝產(chǎn)物以及ML-236B的化學(xué)或生物學(xué)修飾的衍生物后，普伐他丁鈉因?yàn)槠浔仍蛷?fù)合物更強(qiáng)和更好的組織選擇性活性而被選為開發(fā)的候選者。
普伐他丁通過(guò)兩步發(fā)酵生產(chǎn)第一，ML-236B的生物合成；第二，此化合物向普伐他丁鈉的生物轉(zhuǎn)化。MB-236B的內(nèi)酯和羧酸酯分別在化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-a和II-b中表示，其中R代表氫(H)或鈉(Na)。
據(jù)報(bào)道玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌NRRL-1233、玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌IFO-3363、玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌IFO-3411(美國(guó)專利4,346,227)以及streptomycescarbophilus SANK-62585(Ferm BP-1145)、郝氏鏈霉菌IFO-3199(日本專利號(hào)Pyung 4-349034)能將ML-236B轉(zhuǎn)化為普伐他丁。然而由于底物的抗真菌活性，這些真菌不能耐受液體培養(yǎng)物中相對(duì)高含量的ML-236B并且表現(xiàn)低普伐他丁產(chǎn)率。
發(fā)明概述本發(fā)明人致力于尋找一種對(duì)高含量ML-236B耐受并具有強(qiáng)轉(zhuǎn)化活性的新型微生物。最終他們發(fā)現(xiàn)新型微生物脫葉鏈霉菌YJ-118。
附圖描述本發(fā)明將在附圖中得到詳細(xì)描述。


圖1為普伐他丁鈉的IR譜圖2為普伐他丁鈉的13C-NMR譜圖3為普伐他丁鈉的1H-NMR譜發(fā)明詳述本發(fā)明人分離了一種新型微生物“脫葉鏈霉菌YJ-118”。此微生物表現(xiàn)對(duì)高含量化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-a和II-b中所示的普伐他丁前體的強(qiáng)耐受性。通過(guò)使用這種微生物生產(chǎn)已知為血漿膽固醇降低劑的普伐他丁。(A)新型微生物的分離將用無(wú)菌蒸餾水稀釋10-3～10-5倍的土壤標(biāo)本涂在含有0.05-0.5％(w/v)ML-236B的ISP2號(hào)瓊脂平板上，于27℃培養(yǎng)7天。
在從培養(yǎng)物分離的500菌株中，選擇一個(gè)表現(xiàn)對(duì)ML-236B的高耐受性和高羥基化活性的菌株。此菌株命名為YJ-118。(B)新型微生物的鑒定上述新型微生物YJ-118的特性如下(1)形態(tài)學(xué)特征YJ-118在ISP(國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃)建議的培養(yǎng)基中于27℃生長(zhǎng)7-14天。該菌株在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)活躍，形成基內(nèi)菌絲體、氣生菌絲體和孢子。
掃描電鏡顯微照片顯示孢子表面平滑、呈圓柱形，并且孢子鏈呈線狀或直角彎曲狀。
(2)YJ-118菌株的化學(xué)組成YJ-118的細(xì)胞壁類型按照參考文獻(xiàn)[Yamada等，Gen.Appl.Microbiol..16103-113，1970]中報(bào)道的方法進(jìn)行分析。
已發(fā)現(xiàn)L.L-二氨基庚二酸、谷氨酸、丙氨酸，因此證明YJ-118菌株細(xì)胞壁應(yīng)歸為1型。
YJ-118細(xì)胞中的糖模式用參考文獻(xiàn)[M.P.Lechevalier等，Journalof Laboratory and clinical medicine，71，934(1968)]中所述的方法進(jìn)行分析，未見(jiàn)異常模式。
上述所得結(jié)果證明本發(fā)明所分離的微生物屬于鏈霉菌屬。
(3)新型鏈霉菌菌株的數(shù)字化鑒定根據(jù)William等人的方法對(duì)該菌株的50個(gè)主要群體分類個(gè)體特征和34個(gè)次要群體個(gè)體特征進(jìn)行測(cè)定，利用TAXON程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化分析。TAXON程序由Alan Ward博士設(shè)計(jì)[英國(guó)Newcastle upon Tyne大學(xué)，微生物系]。所有數(shù)據(jù)以+或-號(hào)形式輸入，并用CLUSTAN分析和數(shù)字化分類。在數(shù)字化分類的基礎(chǔ)上形成概率鑒定模板。通過(guò)與未鑒定的鏈霉菌菌株概率鑒定模板的特征比較，完成數(shù)字化鑒定[Journal of generalMicrobiology(1983)，129，1734-1813；Rho Y.T.，Ph.D論文，漢城國(guó)立大學(xué)(1993)]。
YJ-118的54個(gè)鑒定此菌株所需的個(gè)體特征在表1a和表1b中表示。
表1a
<p>表1b<
<p>通過(guò)TAXON程序分析的分離鏈霉菌YJ-118的鏈霉菌主要群體鑒定值在表2中表示。
表2
結(jié)果，新分離的YJ-118表現(xiàn)以脫葉鏈霉菌為代表的鏈霉菌主要群體5的最高Willcox概率。用簡(jiǎn)單配比系數(shù)將YJ-118與18種歸為主要群體5的菌株進(jìn)行比較。在18個(gè)菌株中分離物YJ-118與納士維爾鏈霉菌僅有40％的相似性。
因此，本發(fā)明人將所述新分離的微生物命名為脫葉鏈霉菌YJ-118。該菌株已被國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)“韓國(guó)生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”接收并于1997年2月7日授予保藏號(hào)KCTC 0318BP。
脫葉鏈霉菌尚未用于生產(chǎn)普伐他丁。本發(fā)明人使用此菌株生產(chǎn)普伐他丁鈉。通過(guò)突變和DNA重組轉(zhuǎn)化的脫葉鏈霉菌YJ-118也可用于生產(chǎn)普伐他丁。
使用脫葉鏈霉菌YJ-118生產(chǎn)普伐他丁鈉的方法詳述如下。
對(duì)于種子培養(yǎng)物，制備含有0.5-1.0％葡萄糖、1.0-3.0％酵母提取物、0.1-1.0％牛肉提取物、0.5-2.0％酪蛋白水解物(N-Z胺A)的培養(yǎng)基(I)。向培養(yǎng)基添加已經(jīng)過(guò)過(guò)濾滅菌的0.01-0.05％(w/v)化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-a和II-b中所示的ML-236B。將脫葉鏈霉菌YJ-118菌株接種于培養(yǎng)基(I)中并于27℃培養(yǎng)2-3天。將被認(rèn)為起酶促羥基化反應(yīng)激活物作用的ML-236B加入種子培養(yǎng)基中。然而在培養(yǎng)液中超過(guò)0.05％(w/v)濃度的ML-236B將增加培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)不良。
將10％的種子培養(yǎng)物接種到含有1.0-3.0％葡萄糖、0.5-20％酵母提取物、0.1-2.0％多聚蛋白胨、0.01-0.5％K2HPO4、0.01-0.1％MgSO4·7H2O、0.01-0.1％NaCl的生產(chǎn)培養(yǎng)基(II)中，于27℃旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)。
向液體培養(yǎng)物中加入0.1-5.0％(w/v)的ML-236B，優(yōu)選地0.1-3.0％(w/v)，于27℃繼續(xù)培養(yǎng)。2或3天后加入0.3-0.5％(w/v)的葡萄糖溶液。推測(cè)添加的葡萄糖可能在ML-236B羥基化作用中用作能量的提供和催化劑。在生產(chǎn)培養(yǎng)過(guò)程中，ML-236B濃度可保持在0.1-5.0％范圍內(nèi)。低于0.1％時(shí)普伐他丁的產(chǎn)率降低，而高于5.0％時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢同時(shí)普伐他丁產(chǎn)率降低。
據(jù)報(bào)道，產(chǎn)生普伐他丁的微生物可以耐受液體培養(yǎng)物中0.05-0.1％(w/v)的ML-236B濃度范圍，然而本發(fā)明中分離的脫葉鏈霉菌YJ-118表現(xiàn)對(duì)5％(w/v)ML-236B的耐受性。
為純化普伐他丁鈉，將液體培養(yǎng)物離心并棄去細(xì)胞團(tuán)。將上清在多聚吸附樹脂柱上吸附并用水沖洗。用20-50％丙酮或甲醇溶液洗脫普伐他丁鈉。普伐他丁鈉組分在真空中濃縮。將殘余物上樣到ODS逆相HPLC上，活性普伐他丁鈉組分在真空中干燥。在乙醇和乙酸中得到普伐他丁鈉白色結(jié)晶。
本發(fā)明通過(guò)下面實(shí)施例詳細(xì)描述，不僅為舉例說(shuō)明。制備實(shí)施例用無(wú)菌蒸餾水將從韓國(guó)各地采集的土壤標(biāo)本稀釋10-3～10-5倍并涂至含有0.05-0.5％(w/v)化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-b中所示的普伐他丁前體ML-236B的ISP 2號(hào)瓊脂平板上。
于27℃培養(yǎng)5-10天。得到約500個(gè)分離物并接種于盛有20ml Bennett氏培養(yǎng)基的125ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中，于27℃旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)5天。2天后，向培養(yǎng)物中加入0.05％ML-236B并繼續(xù)培養(yǎng)2天。從液體培養(yǎng)物生成的普伐他丁鈉的量通過(guò)HPLC分析。在10株表現(xiàn)ML-236B羥基化活性的菌株中，選擇表現(xiàn)很強(qiáng)的ML-236B耐受性的一株并命名為脫葉鏈霉菌YJ-118。實(shí)施例1
將0.02％(w/v)ML-236B加入裝有20ml種子培養(yǎng)基(I)的125mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中，種子培養(yǎng)基(I)含有1％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.2脫脂奶、0.5酪蛋白水解物(N-Z胺)pH7.0，并且接種制備實(shí)施例中分離的脫葉鏈霉菌YJ-118。在旋轉(zhuǎn)搖床上于27℃、200rpm培養(yǎng)2天。將上述20ml種子培養(yǎng)物接種到盛有400ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(II)的2升Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中，生產(chǎn)培養(yǎng)基(II)包含1.0％葡萄糖、0.1％酵母提取物、0.5％多聚蛋白胨、0.1％K2HPO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.01-0.1％NaCl，pH7.2，培養(yǎng)瓶于272、150rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)1天后，每天加入0.05％(w/v)ML-236B(化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-a)直至液體培養(yǎng)物中ML-236B終濃度為0.2％(w/v)。于27℃、150rpm繼續(xù)培養(yǎng)6天并且每隔2天補(bǔ)加0.3％葡萄糖共2次。隨后將培養(yǎng)液pH值調(diào)至9.0并攪拌3小時(shí)。離心后除去細(xì)胞團(tuán)，并將上清上樣到500ml HP-20柱上。用水沖洗后，用25％丙酮溶液洗脫普伐他丁鈉。普伐他丁鈉在真空中濃縮并將殘余物上樣到半制備級(jí)HPLC(Kromasil C18樹脂)上。用35％乙腈溶液洗脫普伐他丁鈉，獲得1,254mg(627mg/l)白色結(jié)晶。實(shí)施例2除了培養(yǎng)12小時(shí)后每隔12小時(shí)向液體培養(yǎng)物加入0.04％(w/v)化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-b中所示的ML-236B。用如實(shí)施例1所述的相同方法生產(chǎn)普伐他丁鈉。在27℃、150rpm培養(yǎng)7天。結(jié)果，獲得2.68g(1,340mg/l)普伐他丁鈉。實(shí)施例3除了在種子培養(yǎng)基中不加ML-236B，用如實(shí)施例1所述的相同方法生產(chǎn)普伐他丁鈉。得到的普伐他丁鈉是778mg(389mg/l)。這時(shí)普伐他丁鈉的量比其它微生物高60-65％。比較實(shí)施例美國(guó)專利No.4,346,227將玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌NRRL-1233接種于20個(gè)裝有100ml培養(yǎng)基的500ml培養(yǎng)瓶中，其中培養(yǎng)基含有2.0％葡萄糖、0.2％玉米漿、0.15％K2HPO4、0.1％酵母提取物、0.15％MgSO4·7H2O、0.001％ZnSO4·7H2O、0.1％NH4NO3、0.1％蛋白胨，pH7.0。在旋轉(zhuǎn)搖床上于26℃，120rpm培養(yǎng)2天。培養(yǎng)2天后，向液體培養(yǎng)物中加入0.05％(w/v)化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-b中所示的ML-236B。培養(yǎng)5天后按上述實(shí)施例1中所述的方法獲得120mg(60mg/l)普伐他丁鈉。
就液體培養(yǎng)物中ML-236B濃度和普伐他丁產(chǎn)率而言，本發(fā)明明顯優(yōu)于上述比較實(shí)施例。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例表3描述了從實(shí)施例1和比較實(shí)施例獲得的普伐他丁的物理特性。
表3
從本發(fā)明所得的普伐他丁鈉的IR譜、13C-NMR譜、1H-NMR譜分別在圖1、圖2和圖3中表示。
通過(guò)使用本發(fā)明分離的新型微生物脫葉鏈霉菌YJ-118，液體培養(yǎng)物中ML-236B濃度可升至0.5％(w/v)，普伐他丁鈉的產(chǎn)率可升高到600-1,340mg/l，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于使用其它微生物的產(chǎn)率(60mg/l)。
權(quán)利要求
1.新菌株脫葉鏈霉菌YJ-118。
2.使用脫葉鏈霉菌YJ-118從化學(xué)結(jié)構(gòu)式II-a和II-b中所示的ML-236B的羥基化作用生產(chǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式I中所示的普伐他丁鈉的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)普伐他丁鈉的方法，使用含有低于0.05％(w/v)ML-236B的種子培養(yǎng)基(I)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)普伐他丁鈉的方法，使用含有0.1-0.5％(w/v)ML-236B的生產(chǎn)培養(yǎng)基(II)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型微生物“脫葉鏈霉菌YJ－118”以及通過(guò)使用這種表現(xiàn)對(duì)ML－236B的強(qiáng)耐受性和將ML－236B轉(zhuǎn)化為普伐他丁的高羥基化活性的微生物生產(chǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)中所示的普伐他丁鈉的方法。
文檔編號(hào)C12P17/02GK1254373SQ97182193
公開日2000年5月24日 申請(qǐng)日期1997年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月10日
發(fā)明者李周炅, 樸柱雄, 徐東珍, 李尚春, 金芝潤(rùn) 申請(qǐng)人:永進(jìn)藥品工業(yè)株式會(huì)社