專利名稱：利用來自具有磷脂酶a和/或b活性的絲狀真菌的磷脂酶降低含有大量非水合磷的食用油 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用磷脂酶在含有大量非水合磷的食用油中降低含有磷成分的含量的方法。
另外，本發(fā)明涉及具有磷脂酶活性的酶，編碼具有磷脂酶活性的酶的克隆DNA序列，生產酶的方法，以及所述的酶在許多工業(yè)應用中的用途。
發(fā)明的背景含有相對高量非水合磷含量的食用油的酶促脫膠已知利用磷脂酶對水脫膠的食用油進行酶促脫膠(美國5,264,367，Metallgesellschaft，Rohm)，可以降低所述的水脫膠食用油的磷含量。
但是，這一過程仍然可以改進，尤其是進行含有高量非水合磷(NHP)和/或相對高量的粘液的食用油的酶促脫膠。
因此，本發(fā)明的目的是提供降低這樣油的含磷成分的含量的方法，其中所述的方法包括利用磷脂酶。
本發(fā)明的磷脂酶磷脂如卵磷脂或磷脂酰膽堿，由將在外部(sn-1)和中間(sn-2)位置的兩個脂肪酸酯化和將在第三個位置的磷酸酯化的甘油組成；依次磷酸可以酯化成氨基乙醇。磷脂酶是參與磷脂的水解的酶?？梢詤^(qū)別幾個類型的磷脂酶的活性，包括磷脂酶A1(PLA1)和A2(PLA2)，它們水解一個脂酰基團(分別在sn-1和sn-2位置)，以形成溶血磷脂；和溶血磷脂酶(或磷脂酶B(PLB))，可以水解殘留在溶血磷脂中的脂酰基團。個脂?；鶊F的能力(即，顯示了PLA和/或PLB活性)。
以前鑒定的真菌PLA和/或PLB酶許多參考文獻敘述了真菌磷脂酶的鑒定。為了更容易了解過去的領域現有技術狀態(tài)的總的看法，已經將參考文獻劃分為兩個部分。
第一部分涉及敘述目前確信不與本發(fā)明的真菌磷脂酶相關的真菌磷脂酶的鑒定的參考文獻。包括這些參考文獻主要為了概述在真菌磷脂酶的鑒定領域內現有技術的狀態(tài)。
第二部分涉及敘述確信與本發(fā)明的真菌磷脂酶有關的真菌磷脂酶的鑒定的參考文獻。
部分I已經在各種真菌來源中發(fā)現具有磷脂酶A和/或B活性的酶，包括點青霉(也已知為產黃青霉；N.Kawasaki，生物化學雜志，77，1233-44，1975；N.Masuda等人，歐洲生物化學雜志，202，783-787，1991)，圓弧青霉(生物化學進程，30(5)393-401(1995))，啤酒酵母(M.Ichimasa等人，農業(yè)生物化學，49(4)，1083-89，1985；F.paultauf等人，生物化學雜志269，19725-30，1994)，戴爾凱氏有孢圓酵母(羅茜糖酵母的舊名稱；Y.Kuwabara，農業(yè)生物化學，52(10)，2451-58，1988；FEMS，微生物通訊，124，29-34)，粟酒裂殖酵母(H.Oishi等人，生物科學，生物技術，生物化學，60(7)，1087-92，1996)，黑曲霉(技術手冊，G-zymeTMG999，酶生物系統(tǒng)有限公司；生物化學進程30(5)393-401(1995)和離心伏革菌(S.Uehara等人，農業(yè)生物化學，43(3)，517-525，1979)。
部分IIEP575133 A2敘述了從曲霉獲得的真菌磷脂酶A1的分離和鑒定和將其用于工業(yè)應用。
在該應用中沒有公開序列信息(既沒有DNA也沒有氨基酸)，也沒有公開克隆該應用中討論或表明的曲霉磷脂酶的方案或建議。
Tsung-Che等人(植物病理學紀要，581437-38(1968))簡要地敘述了來自茄病鐮孢的磷脂酶的鑒定。
EP 130 064敘述了顯示從菌株尖孢鐮孢DSM2672獲得的脂酶活性的發(fā)酵肉湯的分離部分。另外，公開了在洗滌組合物中其應用。但是，EP130,064沒有描述顯示任何磷脂酶活性的這一部分。
WO96/13579敘述了從菌株大刀鐮孢CBS513，94獲得的脂酶，包括它的N末端序列。
但是，WO96/13579沒有敘述任何顯示磷脂酶活性的酶。
來自異孢鐮孢的編碼脂酶的cDNA序列被敘述了(來自異孢鐮孢的編碼脂酶的cDNA克隆和核苷酸序列，生物化學雜志，116，536-540，1994)。目前確信這一序列與本發(fā)明的克隆DNA序列相比是最相關的DNA序列(參見部分“與現有技術的比較”(見下文)。但是，這一參考文獻沒有敘述顯示磷脂酶活性的任何酶。
來自點青霉的編碼磷脂酶B的cDNA序列被敘述了(歐洲生物化學雜志202783-787，1991)。但是，這一克隆DNA序列與本發(fā)明的DNA序列的同源性非常有限(參見部分“與現有技術的比較”(見下文))。
磷脂酶的工業(yè)應用許多磷脂酶的應用是本領域已知的，如在例如水脫膠油的酶促脫膠中利用磷脂酶(美國專利，5,264,367，Metallgesellschaft，Rohm)；淀粉水解產物的處理(特別是來自小麥淀粉)以便提高濾過率(EP219,269,CPC International)；作為面包生面團中的添加劑以便提高面包的彈性(US4567046，Kyowa Hakko)；和用于制備具有特別的乳化特性的溶血卵磷脂。
目前磷脂酶Lecitase(Novo Nordisk A/S)具有市場用途如用于油的脫膠。Lecitase是從豬胰中獲得的哺乳動物酶。
已知特別是從絲狀真菌，以工業(yè)經濟可接受的產量重組生產真菌酶是可能的。
結果是，本發(fā)明的目的是提供改良的磷脂酶，例如用于如上所述的過程。
另外，本發(fā)明的目的是闡述以工業(yè)可接受的產量重組生產從絲狀真菌獲得的磷脂酶的過程和方法。
本發(fā)明的概要通過用水提取進行了食用油的水脫膠。在這一處理中，一部分磷脂留在油中。利用一般性術語“非水合磷脂”(NHP)描述該部分。在油的生產中，除去NHP含量是必要的(美國專利5264367)。
本發(fā)明提供了除去含有相當高量NHP的油中的NHP含量的方法。
因此，在本發(fā)明的第一方面涉及了降低通過下面步驟測量后至少具有50ppm的非水合磷含量的食用油中的含磷成分的含量的方法，i)在60℃，加入在水中含有檸檬酸單水合物的溶液預處理食用油30分鐘(加入的水對油等于4.8％w/w；[檸檬酸]在水相中＝106毫摩爾/升，在水/油乳化液中＝4.6毫摩爾/升)；ii)轉移油乳液中的10毫升預處理水到試管中；iii)在沸水浴中加熱乳液30分鐘；iv)以5000rpm離心10分鐘，v)轉移8毫升上層(油)相到新的試管，將它靜置24小時；并且vi)然后從上層的澄清相中取2克測量食用油中的非水合磷含量(ppm)；并且其中所述的方法包括，將在pH1.5-8的所述的油與磷脂酶A1，磷脂酶A2，或磷脂酶B的水溶液接觸，該溶液是在油中乳化直到油中的磷含量降低到小于11ppm，然后從處理的油中分離水相。
在本發(fā)明的另一方面涉及新克隆的磷脂酶。
在尖孢鐮孢DSM2672中發(fā)現(和在EP130,064中敘述的)脂酶活性的特性的進一步研究表明分離的部分含有具有脂酶活性的幾個成分，其中一個顯示了磷脂酶活性。
盡管具有許多技術困難(見下文)，本發(fā)明人已經能夠克隆顯示來自鐮孢屬的菌株，更具體地尖孢鐮孢菌株的磷脂酶A活性的酶。
已經第一次克隆了絲狀真菌磷脂酶A并且因此本發(fā)明提供了編碼絲狀真菌磷脂酶A酶的克隆的DNA序列。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及編碼具有磷脂酶A活性的多肽的克隆的DNA序列，其中從絲狀真菌中獲得DNA序列。
在歐洲生物化學雜志202783-787，1991中敘述了來自點青霉的編碼磷脂酶B的cDNA序列。
但是，這一DNA序列僅僅顯示了與本發(fā)明的DNA序列(SEQ ID NO123-1060)只有39％的非常有限的DNA同一性，另外，在所述的來自點青霉的PLB(66千道爾頓)和本發(fā)明的磷脂酶(29±10千道爾頓，見下文)之間生理特征如分子量的變化相當大。
另外，在現有技術的核苷酸和氨基酸序列之間的比較已經顯示了本發(fā)明的DNA序列和/或對應的編碼氨基酸序列與任何現有技術的DNA和/或氨基酸序列之間只有很小的同源性(見下文)。
因此，目前確信本申請中提供的DNA序列信息將有高價值，目的是例如克隆另一個相關的/同源磷脂酶編碼DNA序列，因為特異的雜交探針和/或PCR引物現在可以容易地在本發(fā)明的所述DNA序列基礎上構建。
另外，目前確信，在本申請?zhí)峁┑男蛄行畔⒌幕A上克隆編碼相關的/同源的磷脂酶A和/或磷脂酶B的DNA序列都是可能的。
因此，在本發(fā)明的其它方面涉及編碼顯示磷脂酶A和/或磷脂酶B活性的酶的克隆DNA序列，其中DNA序列選自包括下面的組(a)克隆到存在于大腸桿菌DSM11299中的質粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶A編碼部分；(b)在SEQ ID NO1中的位置23-1063，更優(yōu)選地，SEQ IDNO1中的位置113-1063，或甚至更優(yōu)選地SEQ ID NO1中位置113-929中顯示的DNA序列或它的互補鏈；(c)與(a)或(b)中確定的所述DNA序列至少有70％的同源性的DNA序列；(d)在(a)或(b)中確定的DNA序列，編碼顯示磷脂酶活性的多肽且至少與SEQ ID NO2的位置31-346顯示的多肽序列有70％同源性，或更優(yōu)選地與SEQ ID NO2的位置31-303顯示的多肽序列至少70％同源性；(e)與含有SEQ ID NO1中的位置23-1063顯示的DNA序列的雙鏈DNA探針在低嚴格性時雜交的DNA序列；(f)編碼具有SEQ ID NO2的殘基位置1到346，31到303，或31到303的同樣的氨基酸序列，或(e)的任何DNA序列編碼的氨基酸序列的的多肽DNA序列；和(g)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中所述的DNA序列的片段的DNA序列。
另外，本發(fā)明的磷脂酶已經被充分鑒定，并且已經發(fā)現在低pH時具有磷脂酶活性，這一特性使它非常適用于油脫膠。磷脂酶沒有與膜結合，使它適用于商業(yè)生產和純化。
因此，在本發(fā)明的另一方面涉及了具有磷脂酶A活性的分離的多肽，該多肽是從鐮孢屬的菌株獲得的，并且具有i)在pH范圍3-10具有PLA活性，是在40℃測量的。
ii)如SDS-PAGE確定的，分子量為29±10千道爾頓；iii)等電點(pI)范圍在4.5-8；iv)磷脂酶活性的最適溫度范圍在25-55℃，是利用卵磷脂作為底物在pH5測量的；v)磷脂酶活性的最適pH范圍為6-12，是利用卵磷脂作為底物在37℃測量的。
本發(fā)明的分離的磷脂酶的推斷的氨基酸序列表示在SEQ ID NO2。
已經確定了成熟分泌的分離的磷脂酶的N-末端氨基酸序列。所述的N末端序列顯示了本發(fā)明的磷脂酶的成熟部分具有SEQ ID NO2顯示的氨基酸序列，在SEQ ID NO2的氨基酸31為起始。參見本文的工作實施例以便進一步詳細了解(見下文)。
另外，已經確定了本發(fā)明的活性分泌的磷脂酶的C末端序列，具有SEQ ID NO2顯示的氨基酸序列。在絲狀真菌菌株米曲霉中，所述的C末端確定的磷脂酶獲得重組表達。參見本文工作實施例以便進一步參考。
這些結果顯示在從米曲霉表達的過程中，酶是C末端加工的，結果表明在SEQ ID NO2中的Ser303是表達的成熟活性酶中最有可能的C末端的殘基。但是，可以預見，即使發(fā)生進一步的C末端加工(即，給出所述序列的片段)，仍然具有表達的成熟活性酶。
因此，在本發(fā)明的另一方面涉及了顯示磷脂酶A和/或B活性并且選自包括下面的組的分離的酶(a)克隆到大腸桿菌DSM11299中存在的質粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶A和/或B酶編碼部分編碼的多肽；(b)具有SEQ ID NO2的位置31-346顯示的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQ ID NO2的位置31-303顯示的氨基酸序列的多肽；(d)(a)，(b)或(c)確定的多肽的類似物，該類似物與所述的多肽至少具有70％的同源性；和(e)(a)，(b)，(c)或(d)的片段。
在本發(fā)明的更進一步的方面提供了重組表達載體，該載體能夠異源重組生產本發(fā)明的酶。因此它可能生產高度純化的磷脂酶組合物，特征是無同源雜質。這在許多工業(yè)應用中是很大的優(yōu)點。
本發(fā)明實驗性(見下文)地證明了從大刀鐮孢和尖孢鐮孢兩個菌株獲得的磷脂酶在工業(yè)的相關應用中具有改良的特性?？梢灶A見從鐮孢屬的菌株獲得的磷脂酶將具有與工業(yè)應用有關的改良特性。
因此，甚至在的另一方面，本發(fā)明涉及磷脂酶在包括用該磷脂酶處理磷脂或溶血磷脂的過程中應用以水解脂?；鶊F，所述磷脂酶是從鐮孢屬，如大刀鐮孢，異孢鐮孢，茄病鐮孢的菌株，或特別是尖孢鐮孢的菌株獲得的。
最后，本發(fā)明涉及分離的，基本純化的大腸桿菌菌株DSM11299的生物學培養(yǎng)物，該菌株含有從絲狀真菌尖孢鐮孢的菌株獲得的磷脂酶編碼DNA序列(克隆到存在于大腸桿菌DSM11299中的質粒pYES2.0中的DNA序列的磷脂酶編碼部分)，或者具有保留的磷脂酶編碼能力的所述大腸桿菌菌株的任何突變體的分離的基本上純的生物學培養(yǎng)物。
與現有技術的序列同源性比較在核苷酸和蛋白質數據庫，利用本發(fā)明的磷脂酶進行了同源性檢索。同源性檢索顯示關系最近的已知序列是來自異孢鐮孢的脂酶(

圖1中說明了氨基酸排列)。
編碼磷脂酶的本發(fā)明的DNA序列(SEQ ID NO123-1060)顯示與來自異孢鐮孢的已知脂酶序列(基因庫數據庫參考號S77816)只有62％的DNA同源性，并且本發(fā)明的磷脂酶的對應的氨基酸序列(SEQ ID NO2)顯示與根據上面的已知DNA序列推斷的氨基酸序列的同源性只有60％(參見圖1)。
這顯示了本發(fā)明的磷脂酶的DNA和/或氨基酸序列確實與任何已知DNA和/或氨基酸序列不同。
敘述了編碼來自點青霉的磷脂酶B的cDNA序列(歐洲生物化學雜志，202783-787，1991)。但是，這一DNA序列(基因庫數據庫參考號X60348)顯示與本發(fā)明的DNA序列(SEQ ID NO23-1060)只有39％的非常有限的DNA同一性，本發(fā)明的磷脂酶的對應的氨基酸序列(SEQ ID NO2)顯示與根據上面已知的PLB DNA序列推斷的氨基酸序列只有20％的同一性。
如本說明書后面敘述進行了同源性的計算。
附圖圖1SEQ ID NO2中顯示的氨基酸序列與現有技術的來自異孢鐮孢的脂酶序列的比較。
圖2LecitaseTM和來自本發(fā)明的尖孢鐮孢的磷脂酶的酶促脫膠能力的比較。
定義在進一步詳細討論本發(fā)明之前，定義了下面的術語。
“克隆的DNA序列”該術語“克隆的DNA序列”指根據基因工程中利用的標準克隆方法進行克隆的以將天然位置的DNA區(qū)段再定位到它將被再生的不同位點的DNA序列?？寺∵^程包括切出和分離需要的DNA區(qū)段，在載體分子中插入DNA的片段，和將重組的載體摻入將復制DNA區(qū)段的多個拷貝或克隆的細胞中。
可取代地將本發(fā)明的“克隆的DNA序列”命名為“DNA構建體”或“具有DNA序列的克隆的多聚核苷酸”，“分離的DNA序列”。
“從中獲得”對于本發(fā)明的目的，術語“從中獲得”，如本文所用，是有關特異的微生物來源的，指通過特異的來源或通過來源的基因已經插入的細胞生產該酶和隨后生產編碼所述的酶的DNA序列。
“分離的多肽”如本文定義，該術語“分離的多肽”或“分離的磷脂酶”如本發(fā)明的磷脂酶所用，是基本無其它非磷脂酶多肽例如SDS-PAGE確定至少20％純度，優(yōu)選地至少40％純度，更優(yōu)選地60％純度，甚至更優(yōu)選地80％純度，最優(yōu)選地90％純度，甚至最優(yōu)選地95％純度的磷脂酶或磷脂酶部分。
當分離的多肽至少是60％純度，可以使用術語“高度分離的多肽”。
可以替代地將“分離的多肽”命名為“純化的多肽”。
“同源雜質”如本文所用，術語“同源雜質”指來源于原始地獲得本發(fā)明的酶的同源細胞的任何雜質(例如，另一個多肽而不是本發(fā)明的酶)。在本發(fā)明中，同源細胞可以例如是尖孢鐮孢的菌株。
“磷脂酶編碼部分”如本文所用，術語“磷脂酶編碼部分”與DNA序列相關使用時指對應于翻譯成多肽序列的區(qū)域的DNA序列的區(qū)域。
在SEQ ID NO1顯示的DNA序列中，它是在第一個“ATG”起始密碼(mRNA中的“AUG”密碼)和接著的終止密碼(“TAA”，“TAG”或“TGA”)之間的區(qū)域。
另外，翻譯的多肽，除了顯示磷脂酶活性的成熟序列，可以進一步含有N末端信號和/或前肽序列。信號序列通常指導多肽的分泌，前肽通常指導多肽的折疊。進一步信息參見Egnell，P.等人，分子微生物學，6(9)1115-19(1992)或Stryer，L.，“生物化學”W.H.，Freeman和Company/紐約，ISBN 0-7167-1920-7。
“DNA和/或氨基酸序列的修飾”該術語“修飾”與本文討論的DNA和/或氨基酸序列的修飾的相關使用時定義為包括化學修飾以及遺傳操作。修飾可以是需要的氨基酸中的替代，缺失和/或插入。
“磷脂酶A”用于本文的與本發(fā)明的酶相關使用時術語“磷脂酶A”打算覆蓋具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。
根據標準的酶EC-分類定義磷脂酶A1為EC3.1.1.32。
官方名稱磷脂酶A1(PLA1)。
催化的反應磷脂酰膽堿+H(2)O<>
2-?；视土姿崮憠A+脂肪酸陰離子評論比EC 3.1.1.4具有廣譜的多的特異性根據標準酶EC分類法定義磷脂酶A2為EC3.1.1.4官方名稱磷脂酶A2(PLA2)。
可替代的名稱磷脂酰膽堿2-?；饷福宦蚜字琣；磷脂酶；或磷脂酰脂酶。
催化的反應磷脂酰膽堿+h(2)o<>
1-?；视土姿崮憠A+脂肪酸陰離子評論也作用于磷脂酰乙醇胺，縮醛磷脂膽堿和磷脂，除去附著于2-位置的脂肪酸。
“磷脂酶B”根據標準酶EC分類定義磷脂酶B為EC3.1.1.5。
官方名稱溶血磷脂酶可替代的名稱卵磷脂酶b；溶血卵磷脂酶；磷脂酶b；或plb。
催化的反應2-溶血磷脂酰膽堿+h(2)o<>
甘油磷酸膽堿+脂肪酸陰離子“磷脂酶活性”如本文所用，在與本發(fā)明的酶相關使用時，術語“磷脂酶活性”或“具有/顯示磷脂酶活性”打算特異地指具有至少下面實驗性定義的磷脂酶活性(PLA或PLB)的量的酶。
因此，本文定義顯示磷脂酶活性的酶為在本文實施例6中(見下文)顯示的“單層磷脂酶測試”中具有的磷脂酶活性至少0.25納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；更優(yōu)選地至少0.40納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；更優(yōu)選地至少0.75納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；更優(yōu)選地至少1.0納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；更優(yōu)選地至少1.25納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；甚至更優(yōu)選地至少1.5納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃的酶。
目前確信只有具有這樣的明顯的磷脂酶活性的酶是有工業(yè)重要性的，例如用于脫膠(美國專利5,264,367)。
“具有磷脂酶副活性的脂酶”因此，該術語“具有磷脂酶副活性的脂酶”定義為具有磷脂酶副活性的脂酶，其中在實施例6中顯示的“單層磷脂酶測試”中的磷脂酶副活性小于上面提到的數據。
許多脂酶具有這樣的磷脂酶副活性。在本文的工作實施例6(見下文)中，顯示了一些具有磷脂酶副活性的脂酶。
“粗制油”粗制油(也稱為非脫膠油)可以是來自例如，油菜籽，大豆，或葵花子的壓縮或提取油或其混合物。在粗制油中的磷脂含量可以對應于磷含量的范圍200-1200ppm，更優(yōu)選地，范圍為250-1200ppm的從0.5-3％w/w內變化。除了磷脂，粗制油也含有小濃度的碳水化合物，糖化合物和Ca，Mg和Fe的金屬/磷脂酸復合物。
“半粗制油”任何不是粗制油，但具有磷脂含量250ppm以上，更優(yōu)選地500ppm以上的油。這樣的油可以例如，通過進行同樣于下面所述的“水脫膠油”加工過程加工粗制油獲得。
“水脫膠油”通常通過將1-3％w/w的熱水與溫(60-90℃)粗制油混合獲得水脫膠油。通常處理時期是30-60分鐘。水脫膠步驟除去了磷脂和粘液膠，這些物質當水合時在油中變成不溶。通過沉淀，過濾，或離心，離心是較普遍的操作，可以從油中分離水合磷脂和膠。
所述的水脫膠過程中的基本目的是從油中分離水合磷脂。如上所述，在油中混合熱水在本文應該廣義地理解為根據本領域的標準水脫膠過程，將水溶液混合到油。
可替代地，本文命名為的“水脫膠油”的過程可以稱為“濕精制除去粘質”(參見美國專利5,264,367)。
本發(fā)明的詳細說明含有高量非水合磷脂/磷脂的食用油的酶促脫膠方法對于本發(fā)明，食用油中非水合磷的量測量如下i)在60℃，通過加入含有溶于水的檸檬酸單水合物的溶液，預處理食用油30分鐘(加入的水對油等于4.8％w/w；[檸檬酸]在水相中＝106mM，在水/油乳液＝4.6mM)；ii)轉移10毫升預處理的油包水乳液到試管中；iii)在沸水浴中加熱乳液30分鐘；iv)在5000rpm離心10分鐘，v)轉移約8毫升上層(油)相到新的試管，靜置24小時；vi)在靜置后，從上層澄清相取出2克用于測量食用油中非水合磷的含量(ppm)。
在本文的工作實施例中有進一步詳細的參考說明。
正如本文的工作實施例中說明的，不同食用油的磷脂組分(可水合對非水合磷脂)變化相當大。結果是，在不同的水脫膠油中的殘留的磷脂的水平將在寬的范圍內變化(例如，從約30ppm到200ppm)。
對于酶促脫膠，酶最適劑量是取決于在如上所述的水脫膠或檸檬酸/水預處理后存在的非水合磷脂的量。
另外，油中存在的非水合磷脂的量越高，酶促脫膠方法越有效。
本發(fā)明提供了除去含有相當高量NHP的油中NHP含量的方法。
優(yōu)選地，食用油含有非水合磷含量至少60ppm，更優(yōu)選地至少100ppm，甚至更優(yōu)選地至少200ppm。
更優(yōu)選地，食用油含有非水合磷的含量范圍為60-500ppm，更優(yōu)選地范圍為100-500ppm，甚至更優(yōu)選地200-500ppm。
根據本文的說明，定義為具有相當高量非水合磷的食用油可以是水脫膠油，或更優(yōu)選地可以是粗制油或半粗制油。
因此，本發(fā)明的實施方案涉及根據本發(fā)明的第一方面的方法，其中所述的食用油是粗制油，特征是在進行本發(fā)明的方法之前，所述的粗制食用油是具有磷含量超過250份/百萬(ppm)的油，在進行本發(fā)明的方法之前，該油還沒有水脫膠(水脫膠包括將熱水與溫粗制油混合，接著除去磷脂，這些磷脂當水合時在油中變成不可溶)。
優(yōu)選地，在進行本發(fā)明的所述方法之前，這樣的粗制食油具有的磷含量約350ppm以上，更優(yōu)選地，400ppm以上，甚至更優(yōu)選地500ppm以上，和最優(yōu)選地600ppm以上。
另外，在進行本發(fā)明的所述方法之前，所述的粗制食油優(yōu)選地具有的磷含量范圍為250-1500ppm，更優(yōu)選地范圍為350-1500ppm，甚至更優(yōu)選地范圍為500-1500ppm，和最優(yōu)選地范圍為500-1500ppm。
本發(fā)明的粗制食油的酶促脫膠方法比現有技術的水脫膠食用油的酶促脫膠的方法(US5,264,367)更具有優(yōu)點的，因為根據本發(fā)明，處理粗制油的直接酶促脫膠方法將節(jié)省油的水脫膠的現有步驟。
這就節(jié)省了時間和金錢。通常通過混合熱水和溫(60-90℃)粗制油30-60分鐘獲得水脫膠油。相反，本發(fā)明的粗制油的酶促脫膠的整個過程可以在小于1小時，真正的酶促處理約25分鐘中進行，參見本文的工作實施例以便進一步詳細了解。
另外，根據本文的敘述，定義為具有相當高量非水合磷的食用油可以是半粗制油。
因此，本發(fā)明的實施方案涉及根據本發(fā)明的第一方面的方法，其中所述的食用油是半粗制油，特征是在進行本發(fā)明的方法之前，所述的半粗制油具有的磷含量在500份/百萬(ppm)以上，并且其中的所述的油在進行本發(fā)明的方法之前已經進行水脫膠。
優(yōu)選地，所述的半粗制油是在進行本發(fā)明的方法之前，具有磷含量600份/百萬(ppm)以上，更優(yōu)選地750份/百萬(ppm)以上的油。
通常，食用油的水脫膠將降低油中的磷含量到低于500ppm的水平。
因此，根據本發(fā)明，進行降低食用油中含磷成分的水平的方法之前，如本文所述的半粗制油可以例如只是已經部分水脫膠的。
術語“部分水脫膠”是指與標準的水脫膠過程比較，油的水脫膠過程只是部分/短過程。
“部分水脫膠”過程可以通過只在油中混合0.5％的熱水(標準是1-3％熱水，參見本文的“定義”部分)，或通過降低處理時期到10分鐘(標準是30-60分鐘)進行。
可替代地，如本文定義的半粗制油可以是粗制油和半粗制油的混合物。
本發(fā)明的實施方案涉及本發(fā)明的任何第一方面的方法，包括下面步驟i)調節(jié)食用油的溫度到溫度在25℃到70℃之間；ii)通過加入含有至少85％水的水溶液0.5-6％(相對于油的重量)預處理食用油到上面調節(jié)的溫度5-120分鐘，其中所述的預處理之后沒有接著除去油中的水合粘質和磷含量；iii)調節(jié)水/油乳液的pH到pH1.5-8(例如，加入適當量的NaOH溶液)；iv)將水/油乳液與磷脂酶水溶液接觸(在根據步驟i)調節(jié)的溫度(+/-5℃)下)，在油中乳化磷脂酶直到油中的磷含量降低到小于11ppm；v)從處理的油中分離水相。
將上面步驟i)的食用油的溫度優(yōu)選地調節(jié)到用于本方法的酶的最佳磷脂酶活性溫度。
對于商業(yè)可得的磷脂酶LecitaseTM(Novo Nordisk A/S)，這約是60℃，并且對于從絲狀真菌鐮孢屬獲得的本發(fā)明的磷脂酶，這約是45℃。參見本文的工作實施例以便進一步詳細了解這一問題。
可以預見大多數絲狀真菌磷脂酶將具有的最佳溫度范圍是35-50℃。
因此，本發(fā)明的實施方案涉及上面剛剛敘述的方法，其中將步驟i)中的食用油的溫度調節(jié)到35-50℃之間的溫度，從絲狀真菌菌株獲得用于步驟iv)的磷脂酶。
在上面的方法的步驟ii)中，通過加入含有至少85％水的水溶液0.5-6％(相對于油的重量)，在調節(jié)的溫度(步驟i))預處理食用油5-120分鐘，并且其中所述的預處理后沒有接著除去油中的水合粘質和磷含量。
這一步驟是食用油的酶促脫膠中的標準的預處理步驟(美國專利5,264,367；美國專利5,558,781)。步驟ii)的目的是在食用油中水合可水合/親水成分(如可水合磷含量)，當水合時，這些物質變成油中的不溶成分。
但是，這一步驟不同于本文中稱為“食用油的水脫膠”的步驟。一個主要的差異是所述的預處理步驟沒有從油中除去水合磷脂和粘質。從油中除去所述的水合內容物是食用油的水脫膠的主要目的。
因此，當將磷脂酶與上面的步驟iv)的油中接觸時，油仍然含有所述的水合磷脂和粘質。
用另一句話說，如果食用油是非水脫膠食用油，上面的方法敘述了簡化的酶促脫膠方法，該方法沒有在將所述的油與磷脂酶接觸之前從油中除去水合磷脂和粘質。
優(yōu)選地，含有至少85％的水的水溶液(上面的步驟ii)進一步含有檸檬酸。優(yōu)選地，在所述的水溶液中含有1-15％(w/w)檸檬酸，更優(yōu)選地，在所述的水溶液中含有3-11％(w/w)的檸檬酸。
優(yōu)選地，在步驟ii)中的時間是15-50分鐘，更優(yōu)選地15-30分鐘。
涉及上面的步驟ii)中所述的預處理的更加詳細的參考可以在本文的工作實施例中進行。
在上面的步驟iii)中，將水/油乳液的pH調節(jié)到pH1.5-8(例如，通過加入適當量的NaOH溶液)。這可以進行，目的是在磷脂酶與步驟iv)中的油接觸之前調節(jié)油的pH值。通常，實際的最適pH值將取決于用于在步驟iv)中接觸油的實際的酶。涉及這一問題的參考的詳細情況在本文的工作實施例中說明。
通常，根據本發(fā)明的第一方面和它們的實施方案，所述的油與含有磷脂酶的水溶液的接觸在pH1.5-6，更優(yōu)選地在pH3-6時進行是優(yōu)選的。
在油乳液中的水中的pH值是通過從油乳液取2毫升水并且與2毫升水混合進行測量的。在相分離后，得到的頂部油層用移液管吸走，并且在水相中測量pH。通過下面的公式pH真正＝pH測量-0.38將測量值轉化成“真正”pH值。更加詳細的參考在本文的工作實施例中說明。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的食用油中降低含磷成分的量的方法中，在油中乳化的磷脂酶的量的范圍為0.1-15毫克酶(干物質)/千克油，更優(yōu)選地0.25-5毫克酶(干物質)/千克油，和甚至更優(yōu)選地0.25-2.5毫克酶(干物質)/千克油。
通常，將所利用的磷脂酶的量，和用于酶促脫膠食用油的時間最佳化，以便獲得低于11ppm的磷內容物是有利的。真正的最適酶劑量和時間將取決于所利用的真正的磷脂酶。為了進一步詳細了解關于該方法的酶劑量和時間的最佳化，在本文的工作實施例中說明了詳細參考。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的降低食用油中含磷成分的量的方法中，在將所述的油與0.5-6毫克磷脂酶(干物質)/千克油接觸后，油中的磷含量降低到小于11ppm，并且其中磷脂酶與所述的油的接觸時間為1-6小時，更優(yōu)選地，在將所述的油與0.25-2.5毫克磷脂酶(干物質)/千克油接觸后，油中的磷含量降低到小于11ppm，并且其中磷脂酶與所述的油的接觸時間為15分鐘到2小時。
參見本文的工作實施例以便進一步詳細了解個別磷脂酶的最適溫度的鑒定。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的降低食用油中含磷成分的量的方法的所有方面和實施方案中，油中的磷含量降低到小于5ppm。
測量油中的磷含量以在油乳液中存在的水的油相中的份/百萬(ppm)表示。根據“油，脂肪和衍生物的分析的標準方法，第7版(1987)”中方法2.421進行磷含量分析。本文的工作實施例進行了進一步的詳細參考說明。
本發(fā)明的實施方案涉及本發(fā)明中降低食用油中的含磷成分的量的方法，其中從哺乳動物種獲得磷脂酶，特別是，其中磷脂酶是從所述的哺乳動物種的胰臟獲得的，最優(yōu)選地，其中磷脂酶是從豬的胰中獲得的。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的降低食用油中的含磷成分的量的方法中，磷脂酶是從微生物，優(yōu)選地絲狀真菌，酵母，或細菌中獲得的。
優(yōu)選地，當上面提到的所述絲狀真菌是鐮孢屬內的種類時，優(yōu)選的菌株是如大刀鐮孢，異孢鐮孢，茄病鐮孢，或特別是尖孢鐮孢的菌株。
另外，當上面的所述絲狀真菌是曲霉屬內的種類時，優(yōu)選的菌株是如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或特別是米曲霉的菌株。
另外，在本發(fā)明的降低食用油中含磷成分的量的方法中，食用油優(yōu)選地是大豆油，葵花籽油，或更優(yōu)選地是菜籽油。
從尖孢鐮孢獲得的磷脂酶的鑒定從尖孢鐮孢獲得的本發(fā)明的磷脂酶已經被廣泛地鑒定了。
因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的一個方面是分離的磷脂酶A，該酶是從鐮孢屬的菌株獲得的，并且在pH范圍3-10，40℃測量時具有磷脂酶A活性，更優(yōu)選地在40℃，pH范圍3-7時測量具有磷脂酶A活性，更優(yōu)選地，在40℃，pH范圍3.5-6時測量具有磷脂酶A活性，甚至更優(yōu)選地在40℃，pH4.5-5.5范圍測量時具有磷脂酶A活性。
利用大豆卵磷脂作為底物(基于NEFA試驗的測試)，或在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩爾/升Britton-Robinson(BR)的緩沖液中測確定磷脂酶A活性，參見本文的工作實施例進一步了解詳細情況。
在本發(fā)明的另一實施方案中，從鐮孢屬的菌株獲得的分離的磷脂酶A優(yōu)選地具有分子量29±10千道爾頓，更優(yōu)選地具有分子量29±5千道爾頓，甚至更優(yōu)選地具有分子量29±3千道爾頓，和最優(yōu)選地具有分子量29±2千道爾頓。
正如在“材料和方法”部分中進一步的敘述(見下文)，通過SDS-PAGE電泳可以測量分子量。
在本發(fā)明的其它實施方案中，從鐮孢屬的菌株獲得的分離的磷脂酶A優(yōu)選地具有等電點(pI)的范圍為4.5-8，更優(yōu)選地等電點范圍為5-7.5，和甚至更優(yōu)選地等電點(pI)的范圍為5.5-7.5。
利用來自Pharmacia的兩性電解質PAGE平板確定等電點(pI)。參見本文的工作實施例以便進一步詳細說明(見下文)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，從鐮孢屬的菌株獲得的分離的磷脂酶A優(yōu)選地具有磷脂酶活性的最適溫度范圍為25-55℃。測量時利用卵磷脂作為底物，pH5；更優(yōu)選地在范圍為30-50℃，測量時利用卵磷脂作為底物，pH5，和更優(yōu)選地范圍為40-50℃，測量時利用卵磷脂作為底物和pH5。
在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩爾/升BrittonRobinson緩沖液的緩沖液中，在pH5測量磷脂酶活性的最適溫度。參見本文的工作實施例以便進一步詳細說明(見下文)。
仍然在本發(fā)明的另一實施方案中，從鐮孢屬的菌株獲得的分離磷脂酶A優(yōu)選地在37℃，pH最適范圍6-12；更優(yōu)選地在37℃，pH范圍為7-11.5；更優(yōu)選地在37℃，pH范圍為8-11；和更優(yōu)選地在37℃，pH范圍為8.5-11時具有磷脂酶活性。
在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩爾/升Britton-Robinson(BR)的緩沖液中，在37℃確定磷脂酶活性pH最適范圍。參見本文的工作實施例以便進一步詳細說明。
優(yōu)選地，本發(fā)明的磷脂酶至少具有上面提到的該酶的物理特征中的5個(編號i)到v))中的2個，更優(yōu)選地，本發(fā)明的磷脂酶至少具有上面提到的該酶的物理特征的5個(編號i)到v))中的3個，甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的磷脂酶至少具有上面提到的該酶的物理特征的5個(編號i)到v))中的4個，最優(yōu)選地，本發(fā)明的磷脂酶具有上面提到的該酶的物理特征中所有5個(編號i)到v))。
如上所述，本發(fā)明的磷脂酶已經克隆，重組表達，純化，并且已經確定了分泌的活性酶的N末端和C末端序列。
因此，本發(fā)明的其它實施方案涉及具有磷脂酶A活性的分離的多肽，該多肽是從鐮孢屬的菌株獲得的，并且具有I)在40℃時測量，在pH范圍3-10中的PLA活性；ii)如SDS-PAGE確定，分子量為29±10千道爾頓；iii)等電點(pI)范圍為4.5-8；iv)磷脂酶活性的溫度最適范圍為25-55℃，測量時利用卵磷脂作為底物，pH5；和/或
v)磷脂酶活性pH最適值范圍為6-12，測量時利用卵磷脂作為底物，37℃；并且進一步包括選自包括下面多肽的組的氨基酸序列(a)克隆到存在于大腸桿菌DSM11299中的質粒pYES2.0的編碼磷脂酶A酶的DNA序列部分編碼的多肽；(b)具有如SEQ ID NO2的位置31-346顯示的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQ ID NO2的位置31-303中顯示的氨基酸序列的多肽；(d)(a)，(b)或(c)中定義的多肽的類似物，至少與所述的多肽具有70％的同源性；和(e)(a)，(b)，(c)或(d)的片段。
在本發(fā)明的一個實施方案中，具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽是具有磷脂酶A1活性的磷脂酶。
在其它實施方案中，具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽是具有磷脂酶A2活性的磷脂酶，甚至在其它實施方案中，具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽是具有磷脂酶B活性的磷脂酶。
優(yōu)選地，所述的具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽是具有磷脂酶A1活性的磷脂酶。
對于測量單個PLA1，PLA2和/或PLB活性的標準技術的特異實施例，可以參考本文的工作實施例。
在本發(fā)明的其它實施方案中涉及了具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽，其中磷脂酶是在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩爾/升檸檬酸，pH5的緩沖液中；在37℃溫育10分鐘，接著在95℃5分鐘終止反應時測量從卵磷脂釋放的游離脂肪酸的磷脂酶活性測試中，在5毫摩爾/升EDTA和5毫摩爾/升Ca2+時作為相對的磷脂活性而測定的基本獨立于Ca2+濃度的磷脂酶的。其中在5毫摩爾/升EDTA/5毫摩爾/升Ca2+的相對磷脂酶活性的比例大于0.25，更優(yōu)選地大于0.5，最優(yōu)選地大于0.80。
涉及酶活性對Ca2+濃度的依賴的測量的其它細節(jié)參考本文的工作實施例。
一些脂酶可能具有有限的磷脂酶活性。在本文中，這樣的所述脂酶的有限的磷脂酶活性定義為“具有磷脂酶副活性的脂酶”(參見“定義”部分)。本發(fā)明涉及具有磷脂酶活性的分離的多肽，其中所述的分離的多肽的磷脂酶活性如它的工業(yè)上適用的一樣高。
因此，本發(fā)明涉及具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽，其中磷脂酶是具有磷脂酶活性的磷脂酶，其活性是至少0.25納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；更優(yōu)選地至少0.40納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；在單層磷脂酶測試中測量如下a.在緩沖溶液(10毫摩爾/升TRIS，pH8.0，25℃)的完全純化的表面的單層儀器(零級通過(zero-order through))，從氯仿溶液鋪一個磷脂單層DDPC(Di Dicanoyl(C10)磷脂酰膽堿)。
b.在單層松弛后(蒸發(fā)氯仿)，調節(jié)表面壓力到10mN/m，對應的DDPC的平均分子面積是約632/分子；c.含有60微克酶的緩沖溶液(如上所述)通過單層注射進入在“零級通過”中的反應艙(面積1520平方毫米和30400立方毫米的圓筒)的面下相。
d.通過壓縮單層的可動屏障的速度確定酶活性以便維持恒定的表面壓力，因為不溶底物分子水解成更加可溶于水的反應產物，其中從DDPC的平均分子面積(MMA)估計酶每分鐘水解的DDPC分子的數目。
參見“定義”部分和本文的工作實施例以便進一步說明本發(fā)明的具有磷脂酶活性的分離的多肽的磷脂酶活性的優(yōu)選的量。
另外，通過已知的標準磷脂酶活性測試可以測量本發(fā)明的磷脂酶的特異的磷脂酶活性。
因此，在本發(fā)明的進一步實施方案中，涉及具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽，其中磷脂酶是具有能夠釋放至少7微摩爾游離脂肪酸/分鐘/毫克酶，更優(yōu)選地，至少15微摩爾游離脂肪酸/分鐘/毫克酶；甚至更優(yōu)選地，至少30微摩爾游離脂肪酸/分鐘/毫克酶，和最優(yōu)選地至少50微摩爾游離脂肪酸/分鐘/毫克酶的磷脂酶活性的磷脂酶，磷脂酶活性測量如下在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩爾/升檸檬酸，pH5的緩沖液中；在測量從卵磷脂釋放游離脂肪酸的測試中，在37℃溫育10分鐘。接著在95℃5分鐘終止反應，測量磷脂酶活性。
涉及本發(fā)明的這一實施方案的其它細節(jié)參考本文的工作實施例。
具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽是非常適于進行食用油的酶促脫膠的。
因此，本發(fā)明涉及1.具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽，其中根據本發(fā)明的方法，磷脂酶能夠進行食用油的酶促脫膠，以便降低至少含有50ppm的非水合磷含量的食用油中含磷成分的量；和2.具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽，其中磷脂酶能夠進行水脫膠食用油(具有磷含量50-250ppm)的酶促脫膠，因此降低了油中的磷含量到小于11ppm，其中酶促脫膠過程包括將所述的油在pH1.5-8下與磷脂酶的水溶液接觸，磷脂酶的水溶液在油中乳化，直到油的磷含量小于11ppm，然后從處理的油中分離水相。
優(yōu)選地，具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽能夠在小于1.5小時的時間內進行所述的水脫膠食用油(上面剛定義)的酶促脫膠過程，并且利用少于2毫克磷脂酶(干物質)/千克油。
優(yōu)選地，從鐮孢屬內的絲狀真菌菌株獲得顯示磷脂酶活性并且具有本發(fā)明上面顯示的特征的分離的多肽。
但是，不受任何理論的限制，目前受到關注的是本發(fā)明的磷脂酶也可以從另一個微生物，優(yōu)選地另一個絲狀真菌菌株獲得。其實例在“微生物來源”部分給出(見下文)。
克隆的DNA序列盡管存在許多技術困難(參見部分“克隆絲狀真菌磷脂酶的方案”見下文)，本發(fā)明人已經能夠從鐮孢屬菌株，更具體地尖孢鐮孢的菌株克隆顯示PLA活性的磷脂酶。
另外，目前相信根據本申請書提供的序列信息，克隆相關的磷脂酶A和/或磷脂酶B編碼DNA序列都是可能的。
因此，本發(fā)明一個方面涉及克隆編碼顯示磷脂酶A和/或磷脂酶B活性的酶的DNA序列，DNA序列選自包括下面的組(a)克隆到存在于大腸桿菌DSM11299的質粒pYE2.0的多聚核苷酸的編碼磷脂酶A的部分；(b)SEQ ID NO1的位置23-1063，更優(yōu)選地SEQ ID NO1的位置113-1063，或甚至更優(yōu)選地SEQ ID NO1的位置113-929所示的DNA序列，或它的互補鏈；(c)與(a)或(b)中定義的所述DNA序列至少70％同源的DNA序列；(d)(a)或(b)中定義的DNA序列，編碼顯示磷脂酶活性的多肽，并且與SEQ ID NO2的位置31-346顯示的多肽序列至少70％同源性，或更優(yōu)選地與SEQ ID NO2的位置31-303顯示的多肽序列至少70％的同源性。
(e)在低嚴格性條件下，與含有SEQ ID NO1中的位置23-1063顯示的DNA的雙鏈DNA探針雜交的DNA序列；(f)編碼具有SEQ ID NO2的殘基1-346，31-346或31-303的氨基酸序列或(e)的任何DNA序列編碼的氨基酸序列的多肽的DNA序列；和(g)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)所示的DNA序列的片段的DNA序列。
在本說明書中，每當參考是針對克隆到DSM11299的質粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶的編碼部分的，這樣的參考也打算包括存在于SEQ ID NO1的DNA序列的磷脂酶編碼部分。
因此，可以相互交換使用術語“克隆到存在于DSM11299的質粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶編碼部分”和“存在于SEQ ID NO1中的DNA序列的磷脂酶編碼部分”。
DNA序列可以是基因組，cDNA，或合成起源或其任何聯(lián)合。
本發(fā)明也包括編碼顯示磷脂酶A和/或磷脂酶B活性的酶的克隆DNA序列，該酶具有SEQ ID NO2的成熟部分闡述的氨基酸序列，借助于遺傳密碼的簡并性，與SEQ ID NO1相區(qū)別。
從產生具有磷脂酶活性的酶的絲狀真菌尖孢鐮孢，或如下所述的另一個或相關生物體(參見，“微生物來源”部分)的菌株可以克隆SEQ ID NO1顯示的DNA序列和/或本發(fā)明的DNA序列的類似物。
可替代地，在以SEQ ID NO1的磷脂酶編碼部分，例如作為其亞序列存在的DNA序列的基礎上可以類似序列，和/或通過導入核苷酸取代構建而構建，這些取代不引起yynwDNA序列編碼的磷脂酶的另一個氨基酸序列，但對應于打算產生該酶的宿主生物體的密碼使用，或通過導入可能產生的不同的氨基酸序列的核苷酸取代而構建(即，本發(fā)明的磷脂酶突變體)。
當進行核苷酸取代時，氨基酸改變優(yōu)選地是次要的性質，即，保守氨基酸取代，它不明顯地影響蛋白質的折疊或活性；小的缺失，通常一個到約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延長，如氨基末端甲硫氨酸殘基；高達約20-25個殘基的小接頭肽；或小的延長，能夠便于純化，如多聚組氨酸序列；抗原表位或結合區(qū)域。
保守取代的例子是在堿性氨基酸，如精氨酸，賴氨酸，組氨酸；酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸；極性氨基酸，如谷氨酰胺和天冬酰胺；疏水氨基酸，如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸；芳香氨基酸，如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸；和小的氨基酸，如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸的組內的。核苷酸取代的一般敘述可以參見Ford等人，(1991)，蛋白質表達和純化2，95-107。
本領域技術人員將明了的是這樣的取代可以在分子的功能的關鍵區(qū)的外面進行，并且仍然產生活性多肽。根據本領域已知的過程，如位點特異的誘變或丙氨酸掃描誘變可以鑒定本發(fā)明的克隆DNA序列編碼的多肽的活性的關鍵的和因此優(yōu)選地不進行取代的氨基酸(參見例如，Cunningham和Wells，(1989)，科學244，1081-1085)。在后面的技術中，在分子的每個殘基中導入突變，并且測試得到的突變分子的生物活性(即磷脂酶)以便鑒定分子活性的關鍵氨基酸殘基。通過核磁共振分析，晶體學，或光親和標記這樣的技術確定的晶體結構的分析也可以確定底物-酶相互作用的位點(參見，例如de Vos等人(1992)，科學255，306-312；Smith等人，(1992)，分子生物學雜志，224，899-904；Wlodaver等人，(1992)，FEBS通訊，309，59-64)。
本發(fā)明的多肽也可以包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一個多肽在多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過融合編碼另一個多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)產生融合多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，以便它們在框架內，并且使融合多肽的表達在同樣的啟動子和終止子的控制下。
利用標準克隆技術例如Sambrook等人(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約中所述，從大腸桿菌DSM11299的菌株可以克隆本發(fā)明的DNA序列。
因為本發(fā)明人已經解決了開發(fā)用于表達克隆技術的適當的篩選測試以便克隆本發(fā)明的磷脂酶的問題，參見標題為“克隆絲狀真菌磷脂酶的方案”的開頭分，現在本發(fā)明的DNA序列可以通過任何一般的方法克隆，該方法包括. 在適當的載體中克隆來自于預期產生需要的磷脂酶的任何生物體的cDNA文庫，. 利用所述的載體轉化適當的酵母宿主細胞，. 在適當的條件下培養(yǎng)宿主細胞以便表達cDNA文庫中的克隆編碼的需要的任何酶，. 通過確定這樣的克隆產生的酶的任何磷脂酶活性篩選陽性克隆，和. 從這樣的克隆分離編碼酶的DNA。
可替代地，因為本發(fā)明第一次提供了編碼絲狀真菌PLA酶的克隆的DNA序列，根據已知的技術，編碼本發(fā)明的磷脂酶的DNA可以方便地從適當的來源克隆，如任何“微生物來源”部分提到的任何生物體，其中利用了在本文公開的DNA序列的基礎上制備的合成寡聚核苷酸探針。例如，可以在作為SEQ ID NO1提供的核苷酸序列的磷脂酶編碼部分或其任何適當亞序列的基礎上，或SEQ IDNO2的氨基酸序列的基礎上制備適當的寡聚核苷酸探針。
另外，因為本發(fā)明的克隆DNA序列編碼了具有本發(fā)明的磷脂酶活性的多肽，許多特異的實施方案涉及具有本發(fā)明的磷脂酶活性的分離的多肽，也是本發(fā)明的編碼具有磷脂酶活性的多肽的本發(fā)明的克隆DNA序列的實施方案。結果是，所述的具有磷脂酶活性的分離的多肽的參考和優(yōu)選的和最優(yōu)選的實施方案同樣涉及本發(fā)明的克隆DNA序列。
因此，本發(fā)明的實施方案涉及根據本發(fā)明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶是磷脂酶A1。
在其它實施方案中，本發(fā)明的克隆序列是克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶是磷脂酶A2，并且甚至在另一個實施方案中，本發(fā)明的克隆序列是克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶是磷脂酶B。
優(yōu)選地，本發(fā)明的所述克隆DNA序列編碼具有磷脂酶A1活性的多肽。
另外，本發(fā)明涉及根據本發(fā)明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶是基本獨立于Ca2+濃度的磷脂酶，其測量如下在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩爾/升檸檬酸，pH5的緩沖液中進行的磷脂酶活性測試中；在5毫摩爾/升EDTA和5毫摩爾/升Ca2+時，在37℃溫育10分鐘，接著在95℃5分鐘終止反應后測量從卵磷脂釋放的游離脂肪酸而測量相對磷脂酶活性。其中在5毫摩爾/升EDTA/5毫摩爾/升Ca2+的相對磷脂酶活性的比例大于0.25，更優(yōu)選地比例大于0.5。
甚至進一步，本發(fā)明涉及根據本發(fā)明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶是具有至少0.25納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；更優(yōu)選地至少0.40納摩爾/分鐘，酶劑量60微克，25℃；的磷脂酶活性的磷脂酶，在單層磷脂酶測試中如下進行測量a.在緩沖溶液(10毫摩爾/升TRIS，pH8.0，25℃)的完全純化的表面的單層儀器(零級通過)，在氯仿溶液中鋪一個磷脂DDPC(DiDicanoyl(C10)磷脂酰膽堿)的單層。
b.在單層松弛后(蒸發(fā)氯仿)，調節(jié)表面壓力到10mN/m，對應的DDPC的平均分子面積是約632/分子；c.含有60微克酶的緩沖溶液(如上所述)通過單層注射進入在“零級通過”的反應艙(面積1520平方毫米和30400立方毫米的滾筒)的面下相。
d.通過壓縮單層的可動屏障的速度確定酶活性以便維持恒定表面壓力，因為不溶底物分子水解成更加可溶于水的反應產物，其中從DDPC的平均分子面積(MMA)估計酶每分鐘水解的DDPC分子的數目。
在本發(fā)明的其它實施方案中涉及了根據本發(fā)明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶是具有能夠釋放至少7微摩爾游離脂肪酸/分鐘/毫克酶；更優(yōu)選地至少15微摩爾游離脂肪酸/分鐘/毫克酶的磷脂酶活性的磷脂酶；測量如下在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20mM檸檬酸，pH5的緩沖液，在37℃溫育10分鐘，接著在95℃5分鐘終止反應的測試中測量從卵磷脂釋放的游離脂肪酸而測量磷脂酶活性。
在本發(fā)明的其它實施方案中涉及根據本發(fā)明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶能夠根據本發(fā)明的方法進行食用油的酶促脫膠以便降低含有非水合磷含量至少50ppm的食用油中的含磷成分的量；和根據本發(fā)明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶能夠進行水脫膠食用油(具有磷含量50-250ppm)的酶促脫膠，因此降低油中的磷含量到小于11ppm，其中酶促脫膠過程包括將所述的油在pH1.5-8與磷脂酶的水溶液接觸，這一水溶液在油中乳化直到油的磷含量降低到小于11ppm，然后從處理的油中分離水相。
優(yōu)選地，根據本發(fā)明克隆的DNA序列是克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列編碼的磷脂酶能夠通過利用小于2毫克磷脂酶(干物質)/千克油進行水脫膠食用油的酶促脫膠過程，并且其中磷脂酶與所述的油接觸15分鐘到2小時的時間。
克隆絲狀真菌磷脂酶的方案當嘗試分離本發(fā)明的磷脂酶或克隆編碼它的多聚核苷酸時，遇到許多技術困難。分離酶似乎是不可能的，并且研究了多聚核苷酸的克隆的問題。
如本文所述，過去不能得到編碼絲狀真菌磷脂酶A的DNA序列。因此，本發(fā)明人在酵母技術中表達克隆的基礎上研制了克隆方案(H.Dalboege等人，分子遺傳學(1994)243253-260；WO93/11249；和WO94/14953)。
這一技術遇到的一個主要的問題是酵母在平板測試產生了產生磷脂酶背景的內部活性。發(fā)現這一背景高度依賴于測試平板中底物的量，所以，底物的量不得不小心地滴定到背景足夠低的水平，該水平使測試在表達克隆篩選過程中是可靠的，該水平也足夠高到能夠發(fā)生反應。
另外，通常絲狀真菌菌株包括許多不同的脂酶，其中一些甚至顯示了有限的磷脂酶活性。這樣的脂酶本文定義為“具有磷脂酶副活性的脂酶”(參見本文的“定義”部分)。
在平板測試中，也發(fā)現具有磷脂酶副活性的這樣的脂酶背景是高度依賴于測試平板中底物的量的，因此底物的量不得不更小心地滴定以便消除具有磷脂酶副活性的酵母細胞和絲狀真菌脂酶的背景活性。
此外，發(fā)現不得不小心選擇底物，因為在這一問題上許多不提供任何有效的溶液，因為許多測試的磷脂酶底物給出背景活性，因為沒有磷脂酶活性的脂酶能夠與底物反應。因此，不得不測試和滴定許多底物以便鑒定適當的底物。
發(fā)現使進行編碼磷脂酶的多聚核苷酸的表達克隆成為可能的溶液是利用小心檢測濃度的Lipoid E80(來自Lipoid GmbH)。在本文的材料和方法部分，公開了酵母方案中完全表達克隆的詳細說明，包括解決上面敘述的問題的平板測試。
DNA序列的同源性/同一性上面提到的DNA序列的同源性/同一性確定為兩個序列之間的同一性程度，表明了第一個序列與第二個序列之間的偏差。通過本領域已知的計算機程序可以適當確定同源性，如GCG程序包裝中提供的GAP(Wisconsin包裝的程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳計算機集團，575 Science Drive，麥迪生，成斯康星，美國53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物學雜志，48，443-453)。利用GAP，以及下面的設定用于DNA序列比較GAP產生罰分為5.0，和GAP延長罰分為0.3，DNA序列的編碼區(qū)顯示優(yōu)選地至少70％的程度，更優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，更優(yōu)選地至少97％與SEQ ID NO1顯示的DNA序列的磷脂酶編碼部分(即SEQ ID NO1的位置23-1063)的同一性；或更優(yōu)選地與SEQ ID NO1的位置113-1063顯示的DNA序列的同一性(位置113對應于成熟酶的N末端殘基)；或甚至更優(yōu)選地與SEQ ID NO1中位置23-929顯示的DNA的同一性(位置929對應于C末端加工分泌的活性酶中的C末端殘基)。
雜交上面提到的雜交是打算包括與對應于SEQ ID NO1中顯示的DNA序列，即核苷酸23-1063的磷脂酶編碼部分的雙鏈DNA探針，或更優(yōu)選地與對應于SEQ ID NO1中位置113-1063(位置113對應于成熟酶的N末端殘基)顯示的DNA序列的雙鏈DNA探針；或甚至更優(yōu)選地與對應于SEQ ID NO1中位置23-929(位置929對應于在C末端加工的分泌活性酶的C末端殘基)顯示的DNA序列的雙鏈DNA探針，至少在如下詳細敘述的低嚴格性條件下雜交的類似DNA序列。
在低，中度，或高嚴格性時確定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間雜交的適當實驗條件包括預先在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等人，1989)浸泡含有雜交的DNA片段或RNA的濾膜10分鐘，在5×SSC，5×Denhardt溶液(Sambrook等人，1989)，0.5％SDS和100微克/毫升超聲變性的鯨精子DNA(Sambrook等人1989)的溶液中預雜交濾膜，接著在同樣的含有10納克/毫升任意引導(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)生物化學年評，1326-13)，32P-dCTP標記(特異活性＞1×109cpm/微克)探針的溶液中雜交12小時，平均溫度45℃。然后，在2×SSC，0.5％SDS，在至少55℃(低嚴格性)，更優(yōu)選地至少60℃(中度嚴格性)，仍然更優(yōu)選地至少65℃(中度/高嚴格性)，甚至更優(yōu)選地至少70℃(高嚴格性)，甚至更優(yōu)選地至少75℃(非常高嚴格性)的溫度下洗滌濾膜30分鐘兩次。
利用X射線膠片檢測在這些條件下與寡聚核苷酸探針雜交的分子。
已經發(fā)現理論預測是否兩個給定的DNA序列在一定的特異條件下雜交是可能的。
因此，作為上面敘述的實驗方法的替代，確定是否類似DNA序列將與上面敘述的的核苷酸探針雜交可以是基于Tm(熔解溫度)的理論計算的，在該溫度下兩個異源DNA序列與已知序列將在特異條件(例如，有關陽離子濃度和溫度)下雜交。
為了確定異源DNA序列的熔解溫度(Tm(異源))，必須首先確定同源DNA的熔解溫度(Tm(同源))。
利用下面的公式可以確定兩個完全互補DNA鏈(形成同源雙鏈體)之間的熔化溫度(Tm(同源))Tm(同源)＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L(“分子生物學中的現代方案”John Wiley和Sons，1995)，其中“M”指洗滌緩沖液中的摩爾陽離子濃度，“％GC”DNA序列中的堿基總數的鳥嘌啉(G)和胞嘧啶(C)的百分數，“％form”在洗滌緩沖液中甲酰胺的百分數，和“L”DNA序列的長度。
利用這一公式和上面給出的實驗洗滌條件，對應于SEQ ID NO1顯示的DNA序列，即核苷酸23-1060的核苷酸探針的同源雙鏈體的Tm(同源)是Tm(同源)＝81.5+16.6(log0.30)+0.41(56)-0.61(0)-(500/1038)Tm(同源)＝103.5℃“M”對應于陽離子濃度0.3M的2×SSC。
“％GC”在SEQ ID NO1位置23-1060中的％GC是56％。
“％form”在洗滌緩沖液中沒有甲酰胺。
“L”SEQ ID NO1位置23-1063 1038bp的長度。
上面的公式確定的Tm是在兩個完全互補的DNA序列之間同源雙鏈體形成的Tm(Tm(同源))。為了使Tm值適用于兩個異源DNA序列，假設在兩個異源序列之間核苷酸序列1％的差異等于在Tm下降1℃(“分子生物學當前方案”，John Wiley和Sons，1995)。所以，發(fā)現異源雙鏈體形成的Tm(異源)是從Tm(同源)減去問題中的類似序列與上面所述的核苷酸探針之間的同源性(％)的差。如本文所述計算減去的DNA同源性百分數(出處同上)。
氨基酸序列的同源性上面提到的多肽同源性確定為兩個序列之間的同一性程度，表明第一個序列和第二個序列之間的差異。通過本領域已知的計算機程序如GCG程序包中提供的GAP(威斯康星包的程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳學計算機集團，575 Science Drive，麥迪生，威斯康星，美國53711)可以適當確定同源性(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物學雜志，48，443-453。利用GAP以及下面的設置用于多肽序列的比較GAP產生罰分3.0，GAP延長罰分0.1，類似DNA序列編碼的多肽的成熟部分顯示了與SEQ ID NO2顯示的氨基酸序列的成熟部分即，SEQ ID NO2中位置31-346，或更優(yōu)選地與SEQ ID NO2的位置31-303中顯示的氨基酸序列(位置303是C末端加工的分泌的活性酶的C末端殘基)具有至少70％的同一性，更優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，特定的至少97％。
本發(fā)明也涉及與具有與SEQ ID NO2中闡述的氨基酸序列的成熟部分區(qū)別不超過3個氨基酸優(yōu)選地不超過2個氨基酸，更優(yōu)選地不超過1個氨基酸的氨基酸序列的磷脂酶變異體。
另外，上面提到的優(yōu)選的氨基酸同一性也涉及本發(fā)明的克隆的DNA序列類似物，該序列編碼顯示磷脂酶活性的多肽，它與SEQ IDNO2的位置31-346顯示的多肽序列至少70％的同源性，或更優(yōu)選地與含有SEQ ID NO2的位置31-303的多肽序列至少70％的同源性。
免疫交叉反應性通過利用純化的磷脂酶可以制備用于確定免疫交叉反應性的抗體。更具體地說，根據N.Axelsen等人在定量免疫電泳的手冊，Blackwell科學出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，實踐中的免疫化學，Blackwell科學出版社，1982(更具體地說，27-31頁)敘述的過程可以通過免疫接種兔可以產生抗本發(fā)明的磷脂酶的抗血清。從獲得的抗血清，例如通過鹽沉淀((NH4)2SO4)，接著透析和離子交換層析，例如，在DEAE-葡聚糖凝膠上可以獲得純化的免疫球蛋白。通過Outcherlony雙擴散分析(O.Ouchterlony在實驗免疫學手冊(D.M.Weir編輯)，Blackwell科學出版社，1967，655-706頁)，通過交叉免疫電泳(N.Axelsen等人，出處同上，3章和4章)，或通過火箭免疫電泳(N.Axelsen等人，第2章)可以進行蛋白質的免疫化學鑒定。
微生物來源在本發(fā)明的優(yōu)先權日期，下面應用的分類學根據是World WideWeb(www)NCBI分類學分支。
從任何微生物，優(yōu)選地絲狀真菌，酵母細胞或細菌可以獲得本發(fā)明的具有磷脂酶活性的分離的多肽和對應的本發(fā)明的克隆的DNA序列。
優(yōu)選地，從絲狀真菌菌株可以獲得本發(fā)明的磷脂酶和對應的克隆的DNA序列，其中優(yōu)選的門是子囊菌門(Ascomycota)，其中優(yōu)選的綱是核菌綱(Pyrenomycetes)，包括優(yōu)選的科Nectriaceae。
更優(yōu)選地，從鐮孢屬菌株，如大刀鐮孢，異孢鐮孢，或茄病鐮孢，特定的尖孢鐮孢的菌株可以獲得本發(fā)明的磷脂酶和對應的克隆的DNA序列。
另外，從曲霉屬內，如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或特別是米曲霉的絲狀真菌菌株可以獲得本發(fā)明的磷脂酶和對應的克隆的DNA序列。
根據為了專利程序的目的的國際公認的微生物保藏的布達佩斯條約，可以獲得本發(fā)明的磷脂酶的尖孢鐮孢的菌株的分離物已經保藏在德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏有限公司，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國聯(lián)邦共和國，(DSM)。
保藏日期1983年6月6日保藏人號 NN041759DSM號尖孢鐮孢DSM No.2672另外，含有編碼本發(fā)明的磷脂酶的全長cDNA序列的表達質粒pYES2.0已經轉化進入大腸桿菌菌株，該菌株根據為了專利程序的目的的國際公認的布達佩斯條約保藏在德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏有限公司，Mascheroder Weg lb，D38124 Braunschweig，德國聯(lián)邦共和國(DSM)。
保藏日期1996年11月25日保藏人號 NN049279DSM號大腸桿菌DSM No.11299表達載體本發(fā)明的表達載體可以是常規(guī)進行重組DNA過程的任何表達載體，載體的選擇經常取決于載體待導入的宿主細胞。所以，載體可以是自動復制的載體，即，作為染色體外的整體存在的載體，它的復制是獨立于染色體的復制，例如質粒?？商娲?，載體可以是當導入宿主細胞時整合進入宿主細胞基因組并且與已經整合的染色體一起復制的載體。
在表達載體中，編碼磷脂酶的DNA序列應該可操作地連接適當的啟動子和終止子序列。啟動子可以是在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性并且起源于編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的任何DNA序列。用于連接編碼磷脂酶的DNA序列，啟動子和終止子并且將它們插入適當的載體的方法是本領域技術人員已知的(參見，例如Sambrook等人(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港紐約)。
用于絲狀真菌宿主細胞的適當的啟動子的例子是例如ADH3啟動子(McKnight等人，EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA啟動子。其它有用的啟動子的例子是起源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定α淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)，Rhizomucor miehei脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構酶或構巢曲霉乙酰胺酶的基因的那些。
宿主細胞本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的核酸序列的重組宿主細胞，這些細胞可以有利地用于重組生產多肽。術語“宿主細胞”包括由于復制過程中發(fā)生的突變而與親本不同的任何親本細胞的子代。
該細胞優(yōu)選地利用含有本發(fā)明的核酸序列的載體轉化，然后將載體整合進入宿主染色體。
“轉化”指在宿主細胞中導入含有本發(fā)明的核酸序列的載體，以致載體保持為與染色體整合或作為自我復制的染色體外的載體。整合通常認為是優(yōu)選的，因為核酸序列似乎在細胞中更加保持穩(wěn)定。載體整合進入宿主染色體可以通過如上所述的同源或非同源重組發(fā)生。
在優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢比绫疚乃冒ㄗ幽揖T，擔子菌門，壺菌門，和結合菌門(如Hawksworth等人，在真菌的Ainsworth和Bisby的詞典，8版，1995，CAB國際公開，大學出版社，Cambridge，英國)以及卵菌門(如Hawksworth等人，1995，出處同上，171頁引證)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，出處同上)。子囊菌門的代表組包括例如Neurospora，Eupenicillium(＝青霉屬)，Emericella(＝曲霉屬)，Eurotium(＝曲霉屬)，和上面列出的真正的酵母。擔子菌門的例子包括蘑菇，銹菌和黑粉菌。壺菌門的代表例子包括例如，Allomyces，Blastocladiella，Coelomomyces，和水生真菌。卵菌門的代表例子包括例如水霉水生真菌(水霉)如Achlya。有絲分裂孢子真菌的例子包括曲霉屬，青霉屬，假絲酵母屬，和鏈格孢屬。結合菌門的代表組包括例如根霉和毛霉。
在優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括Eumycota和Oomycota亞門的所有絲狀形式(如Hawkswirth等人，1995，出處同上定義)。通過營養(yǎng)菌絲鑒定絲狀真菌，營養(yǎng)菌絲由幾丁質，纖維素，葡聚糖，脫乙酰幾丁質，甘露聚糖，和其它復合多糖組成。營養(yǎng)菌絲的生長是通過菌絲延長和專性需氧的碳代謝。相反，酵母如啤酒酵母的營養(yǎng)菌絲的生長是通過單層菌體的發(fā)芽并且碳代謝可以是發(fā)酵的。在更優(yōu)選地實施方案中，絲狀真菌的宿主細胞是下面種類，但不限于支頂孢屬，曲霉屬，鐮孢屬，腐質酶屬，毛霉屬，毀絲霉屬，鏈孢霉屬，曲霉屬，草根霉屬，Tolypocladium，和木霉屬或有性型(teleomorph)或其同義物的種類。甚至在更優(yōu)選實施方案，絲狀真菌宿主細胞是曲霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案，絲狀真菌宿主細胞是支頂孢屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案，絲狀真菌宿主細胞是鐮孢屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是腐質酶屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是毛霉屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是毀絲霉屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是鏈孢霉屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是青霉屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是草根霉屬細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Tolypoclakium細胞。甚至在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是木霉屬細胞。在最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Discolor部分的鐮孢屬細胞(也已知為鐮孢部分)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌親本細胞是Elegans部分的鐮孢屬菌株，例如尖孢鐮。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Humicola insolens或Thermomyces lanuginosa細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Rhizomucor miehei細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Myceliophthora thermophilum細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是粗糙鏈孢霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是產紫青霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Thielavia terrestris細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，木霉細胞是Trichoderma harzianum，康寧氏木霉，Trichoderma longibrachiatum，Trichoderma reesei或綠色木霉細胞。
可以通過一些方法轉化真菌細胞，包括原生質體的形成，原生質體轉化，和以已知的方式再生細胞壁。曲霉宿主細胞的轉化的適當過程敘述在EP238 023和Yelton等人，1984，美國科學院年報811470-1474。轉化鐮孢屬種類的適當方法敘述在Malardier等人，1989，基因78147-156或在審的美國專利申請系列號08/269,449。利用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.編輯的酵母遺傳學和分子生物學指導，酶學方法，194卷，182-187，學術出版社，紐約；Ito等人，1983，細菌學雜志，153163；和Hinnen等人，1978，美國科學院年報，751920中敘述的方法可以轉化酵母。通過Graham和Van der Eb(1978，病毒學52546)的磷酸鈣沉淀方法直接吸收可以轉化哺乳動物細胞。
生產磷脂酶的方法本發(fā)明提供了生產本發(fā)明的分離的酶的方法，其中已經利用編碼酶的DNA序列轉化的適當的宿主細胞，在允許生產的酶的條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中回收得到的酶。
當將含有編碼酶的DNA序列的表達載體轉化到異源宿主細胞，異源重組生產本發(fā)明的酶是可能的。
因此，獲得高度純化的無同源雜質的磷脂酶組分是可能的。
在本發(fā)明中，同源宿主細胞可能是尖孢鐮孢的菌株。
用于培養(yǎng)轉化宿主細胞的培養(yǎng)基可能是任何適用于生長需要的宿主細胞的常規(guī)培養(yǎng)基。表達的磷脂酶通?？赡芊置诘脚囵B(yǎng)基，可以通過已知方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基分離的細胞，通過鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基的蛋白質成分，接著層析如離子交換層析，親和層析或諸如此類從中進行回收。
磷脂酶的應用除了在本發(fā)明的新方法中將磷脂酶用于含有高量的非水合磷酸的食用油的酶促脫膠，許多其它磷脂酶的用途是本領域已知的。
這樣的本領域已知磷脂酶的用途/應用如下所述。
本發(fā)明的磷脂酶可以用于需要水解磷脂或溶血磷脂如卵磷脂或溶血卵磷脂的脂?；鶊F的任何應用中。磷脂酶優(yōu)選地在pH3-10和30-70℃(特別是40-60℃)使用。如果需要，可以在進行熱處理如pH7，80℃1小時，或90℃10分鐘反應后失活磷脂酶。
作為例子，本發(fā)明的磷脂酶可以用于制備生面團，面包和蛋糕，例如提高面包或蛋糕的彈性。所以，磷脂酶可用于生產面包的方法，包括在生面團的成分中加入磷脂酶，揉捏生面團和烘烤生面團生產面包。這可以利用美國專利4,567,046(Kyowa Hakko)，JP-A60-78529(QP公司)，JP-A62-11629(QP公司)，JP-A63-258528(QP公司)，或EP426211(Unilever)的類似方法進行。
通過利用磷脂酶處理本發(fā)明的磷脂酶也可以用于提高碳水化合物起源的水溶液或漿料的可過濾性。這特別可用于含有淀粉水解產物特別是小麥淀粉水解產物的溶液或漿料，因為它趨向于難于過濾并且得到濁的過濾物。在類似EP219,269(CPC International)中可以進行該處理。
另外，本發(fā)明的磷脂酶可以用于部分水解磷脂，特別是卵磷脂，以便獲得改良的磷脂乳化劑。在涉及這一用途的LecitaseTM(NovoNordisk A/S)的生產頁中，和在工業(yè)化學的Ullmann的百科全書(出版社VCH Weinheim(1996))中進一步敘述的這一應用。
另外，本發(fā)明的磷脂酶可用于生產動物飼料的過程，包括混合磷脂酶與食物和至少一種磷脂。這可以在EP743 017的類似方法中可以進行。
根據本領域已知的方法使植物油/食用油脫膠根據本領域已知的方法，本發(fā)明的磷脂酶可用于降低食用油中磷脂的含量的過程，包括利用磷脂酶處理油以便水解磷脂的主要部分，并且從油中分離含有水解的磷脂的水相。這一過程可用于純化含有磷脂的任何食用油，例如植物油如大豆油，油菜籽油和葵花油。
在酶處理之前，優(yōu)選地預處理植物油以便除去粘質，例如通過濕精煉。通常，在利用磷脂酶處理的開始時，油將含有50-250ppm的磷脂形式的磷，本發(fā)明的過程可以降低這一值到低于11ppm，更優(yōu)選地低于5ppm。
通過分散磷脂酶的水溶液，優(yōu)選地成為平均直徑低于10微米的小滴進行酶處理。水和油的量的重量關系優(yōu)選地是0.5-5％。可以非強制性地加入乳化劑。應用機械攪拌維持乳化狀態(tài)。
在pH范圍1.5-8可以進行酶處理。通過加入檸檬酸，檸檬酸緩沖液或HCl可以調節(jié)pH。
適當的溫度通常是30-70℃(特別是40-60℃)。反應時間通常是0.5-12小時(例如，2-6小時)。適當的酶劑量通常是100-5000IU每升油，特別是200-2000IU/升。
酶處理可以分批進行，例如在攪拌的筒中，或它可以連續(xù)地，例如系列攪拌筒反應器。
酶處理后接著分離水相和油相。通過常規(guī)方法例如離心可以進行這一分離。
在其它方面，根據本領域已知的原理可以進行該過程，例如在美國5,264,367的類似方法(Metallgesell schaft，Rohm)；K.Dahlke和H.Buchold，INFORM，6(12)，1284-91(1995)；H.Buchold，脂肪科學技術95(8)，300-304(199 3)；JP-A2-153997(Showa Sangyo)；或EP654,527(Metallgesellschaft，Rohm)。
本發(fā)明的磷脂酶在焙烤中的應用本發(fā)明的磷脂酶也可以用于改良面包的添加劑，例如生面組合物，生面添加劑，生面團調節(jié)劑，預混合物，和在生產面包和其它烘烤產品的過程中通常加入面粉和/或生面團的類似的制劑以便提供面包或其它烘烤產品改良的特性。
所以，本發(fā)明的實施方案涉及改良面包和/或改良生面團的組合物，并且另外涉及本發(fā)明的磷脂酶在這樣的組合物的應用，和涉及含有本發(fā)明的改良面包和/或改良生面團的組合物的生面團或烘烤產品。
在本文中，術語“改良面包的組合物”和“改良生面團的組合物”打算表示除了酶成分可以包括其它通常用于烘烤以便改良生面團和/或烘烤產品的特性的其它物質的組合物。這樣的成分的例子在下面給出了。
在本文中，術語“改良的特性”打算表示可以通過本發(fā)明的磷脂酶的作用改良的任何特性。特別是，磷脂酶的利用導致體積的增加和面包瓤結構的改良和烘烤產品的烘烤產品的抗老化特性，以及增加強度，穩(wěn)定性和粘度降低并且因此改良生面團的機械加工性。已經發(fā)現當利用質量差的面粉時對生面團的效果特別好。提高機械加工性在與待機械加工的生面團的關系中特別重要。
通過與沒有加入本發(fā)明的磷脂酶制備的生面團和/或烘烤產品比較可以評估改良的特性。
本發(fā)明的面包和/或生面團改良組合物可以進一步含有另一種酶。其它酶的例子有纖維素酶，半纖維素酶，戊聚糖酶(用于增強生面團的延伸性的戊聚糖的部分水解)，葡萄糖氧化酶(用于增強生面團強度)，脂酶(用于修飾存在于生面團或生面團構造的脂酶以便柔軟生面團)，過氧化物酶(用于改良生面團稠度)，蛋白酶(用于明膠蛋白的弱化，特別是當利用硬的小麥面粉)，肽酶和/或淀粉酶，例如α-淀粉酶(用于提供酵母發(fā)酵糖)。
另外，或作為其它酶成分的替代，改良生面團和/或面包改良組合物可以包括常規(guī)使用的發(fā)粉，例如，一種或多種下面的成分奶粉(提供皮的顏色)，面筋(提高弱的面粉的氣體滯留能力)，乳化劑(提高生面團的延伸性和得到的面包的一定程度的稠度)，顆粒脂肪(為了生面團柔軟和面包稠度)，氧化劑(加入以便增強面筋結構，例如抗壞血酸，溴化鉀，碘化鉀或過硫酸銨)，氨基酸(例如，半胱氨酸)，糖，和鹽(例如，氯化鈉，乙酸鈣，硫酸鈉或硫酸鈣作用是使生面團更加堅硬)，面粉或淀粉。
適當的乳化劑的例子是單或二甘油酯，甘油的二乙酰酒石酸單或二酯，脂肪酸的糖酯，脂肪酸的聚甘油酯，甘油單酯的乳酸酯，單酰甘油的乙酸酯，聚氧乙烯硬脂酸，磷脂和卵磷脂。
在本文中，術語“烘烤產品”打算包括柔軟或脆特性的從生面團制備的任何產品。烘烤產品的例子，不管是白色，淡色或黑色類型，可以有利地通過本發(fā)明產生的是面包(特別是白色，全粉的或燕麥面包)，通常的形式是圓錐形或卷形，法式baguette型面包，pita面包，tacos，蛋糕，扁平面包，餅干，脆皮面包和諸如此類。
本發(fā)明的生面團可以是上面討論的任何類型，并且可以是新鮮或冷凍的。
從上面的公開，可以明了本發(fā)明的生面團通常是發(fā)酵的生面團或待進行發(fā)酵的生面團。生面團可以各種方式發(fā)酵，如加入重碳酸鈉和諸如此類，或通過加入曲(發(fā)酵生面團)，但優(yōu)選地通過加入適當的酵母培養(yǎng)物如啤酒酵母的培養(yǎng)物(烘烤酵母)發(fā)酵生面團?？梢岳萌魏问袌隹傻玫钠【平湍妇?。
在本發(fā)明最后的實施方案中涉及了利用本發(fā)明的磷脂酶制備面食制品生面團，優(yōu)選地從硬麥質面粉或相當質量的面粉制備。利用常規(guī)技術和如上所述利用同樣劑量的磷脂酶可以制備生面團。例如上面公開，優(yōu)選地磷脂酶是微生物來源。本發(fā)明涉及當用于制備面稂制品時，磷脂酶導致面筋結構的增強，所以降低了生面團的粘度和增強了生面團的強度。
本發(fā)明的酶的脂酶活性的應用如本文工作實施例所示，本發(fā)明的磷脂酶可進一步顯示脂酶活性。
因此本發(fā)明進一步涉及在脂酶的標準用途中利用這一脂酶活性，特別是用于去污和清潔組合物。本領域已經很好敘述了這樣的去污和清潔組合物并且參考文獻有WO96/34946；WO97/07202；和WO95/30011以便進一步敘述適當的去污和清潔組合物。
在下面的實施例中進一步詳細敘述了本發(fā)明，這些實施例不打算以任何方式限制權利要求中的本發(fā)明的范圍。
材料和方法保藏的生物體尖孢鐮孢DSM No.2672含有本發(fā)明的編碼磷脂酶的DNA序列。含有質粒的大腸桿菌DSM 11299，在穿梭載體pYES2.0中含有編碼本發(fā)明的磷脂酶的全長cDNA序列的質粒。
其它菌株酵母菌株利用的啤酒酵母菌株是W3124(MATa；ura3-52；leu2-3，112；his3-D200；pep4-1137；prc1∷HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。
大腸桿菌菌株DH10B(生命技術)質粒曲霉屬表達載體pHD414是質粒p775的衍生物(在歐洲專利238023中敘述)。在WO93/11249中進一步敘述了pHD414的構建。
pYES2.0(Invitrogen)pA2PH10(參見實施例7)常規(guī)的分子生物學方法除非另有說明，否則利用分子生物學的標準方法進行DNA操作和轉化(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港紐約；Ausubel，F.M.等人“分子生物學當前方案”JohnWiley和Sons，1995；Harwook，C.R.，和Cutting，S.M.“芽胞桿菌的分子生物學方法”John Wiley和Sons，1990)。
根據供應商的說明書使用用于DNA操作的酶。
用于DNA操作的酶除非另有說明，否則用于DNA操作的所有酶例如限制性核酸內切酶，連接酶等等是從新英格蘭生物實驗室公司獲得的。
基于NEFA-C測試的磷脂酶活性測試底物L-α-溶血磷脂酰膽堿(西格瑪)
底物大豆卵磷脂(西格瑪#P3644)。用于測量磷脂酶A活性。
Nefa-C測試試劑盒是來自Wako化學品公司，德國。
緩沖液20毫摩爾/升NaOAc pH4.5。
底物溶液在1毫升milli Q水和1毫升緩沖液中的10毫克底物(對所有樣品制備足夠的底物溶液)1.在150微升底物溶液中加入15微升酶2.在40℃，溫育10分鐘。
3.將30微升轉移到300微升試劑1(來自Nefa試劑盒)4.在37℃溫育10分鐘。
5.加入600微升試劑2(來自Nefa-試劑盒)6.在37℃溫育10分鐘。
7.在550納米，根據Nefa試劑盒的說明測量最后反應產物的吸收值。
將每分鐘酶反應生產1微摩爾脂肪酸需要的酶活性定義為1單位。
在酵母中表達克隆如H.Dalboege等人的綜合性敘述進行酵母中的表達克隆(H.Dalboege等人，分子遺傳學(1994)243253-260；WO93/11249；WO94/14953)，該文獻引入本文作為參考。
根據上面提到的參考，進行總RNA的提取，cDNA合成，綠豆核酸酶處理，利用T4DNA聚合酶將末端平齊化，和文庫的構建的所有每個步驟。
用于mRNA分離的尖孢鐮孢DSM編號2672的發(fā)酵過程在30℃，在YPD培養(yǎng)基中將尖孢鐮孢DSM2672培養(yǎng)4天。在如下所述的平板測試中測試10微升上清液中的磷脂酶活性。
如H.Dalboege等人，分子遺傳學(1994)243253-260；WO93/11249；和WO94/14953中所述，從這一培養(yǎng)物中的營養(yǎng)菌絲分離mRNA。
陽性酵母克隆的鑒定(平板測試)如下所述進行陽性酵母克隆(即，含有編碼磷脂酶活性的基因的克隆)的鑒定。
在含有2％葡萄糖的SC瓊脂平板上涂布酵母轉化體并且在30℃溫育3天。在細胞的表面放置乙酸纖維素濾紙(OE67，Schleicher&Schuell)，然后轉移到含有SC瓊脂和2％半乳糖的平板上，細胞在濾紙的上面。在30℃溫育3天后，將含有細胞的濾紙轉移到底物平板上。鑒定陽性克隆為在菌落的底物平板中產生藍綠圈的菌落。
以下面方式制作底物平板在137.5毫升水中加入2.5克瓊脂(BA-30INA瓊脂，Funakoshi有限公司)，在微波爐中加熱到沸騰。在冷卻到約60℃，加入30毫升下面的混合物62.5毫升0.4MTris-HCl緩沖液(pH7.5)和溶解于2％Triton X-100(v/v)的50毫升3％Lipoid E80(Lipoid GmbH，D-67065 Ludwigshafen，德國)和0.5毫升的2％亮綠水溶液。底物的濃度是重要的。如果濃度過高，它可以引起來自酵母細胞和/或來自具有磷脂酶副活性的絲狀真菌脂酶的背景活性。
用于在曲霉中表達的cDNA基因的分離在50毫升玻璃試管中的20毫升YPD肉湯中接種產生磷脂酶的酵母菌落。在30℃振搖試管2天。通過在3000rpm離心10分鐘收集細胞。
根據WO94/14953分離DNA并且溶解于50毫升水。通過標準方法將DNA轉化進入大腸桿菌。利用標準方法從大腸桿菌分離質粒DNA，并且進行限制性酶分析。利用適當的限制性酶切出cDNA插入片段并且連接到曲霉表達載體。
米曲霉或黑曲霉的轉化如WO95/02043，第16頁，第21行-第17頁第12行中所述可以制備原生質體，該文獻引入本文作為參考。
將100微升原生質體懸浮液與10微升STC(1.2摩爾/升山梨醇，10毫摩爾/升Tris-HCl，pH＝7.5，10毫摩爾/升CaCl2)中的5-25微克適當的DNA混合。將原生質體與p3SR2(攜帶構巢曲霉amdS基因的質粒)混合。在室溫下保留混合物25分鐘。加入0.2毫升60％PEG4000(BDH29576)，10毫摩爾/升CaCl2，和10毫摩爾Tris-HCl，pH 7.5并且小心混合(兩次)，最后加入同樣的溶液0.85毫升并且小心混合。在室溫下保留混合物25分鐘，在2500g離心15分鐘，并且在2毫升1.2摩爾/升的山梨醇中再懸浮沉淀。在再次沉降后，在最小平板上涂布原生質體(Cove，Biochem.Biophys.Acta113(1966)51-56)，最小平板中含有1.0摩爾/升蔗糖，pH7.0，10毫摩爾/升乙酰胺作為氮源和20毫摩爾/升CsCl以便抑制背景生長。在37℃溫育4-7天后，挑出孢子和涂布單個菌落。重復這一過程，在二次分離后儲藏單個菌落的孢子作為確定的轉化體。
米曲霉或黑曲霉轉化體的測試在10毫升YPE(參見下面)中接種每個米曲霉轉化體，并且繁殖。在30℃溫育2-5天后，除去上清液。在底物平板中穿刺的洞中加載20微升上清液(見上文)。在1-24小時后，磷脂酶活性顯色是洞周圍的藍綠圈。
補料分批的發(fā)酵在含有麥芽糖糊精作為碳源，脲和酵母提取物作為氮源的培養(yǎng)基中進行批量進料發(fā)酵。在含有3.5％碳源和0.5％氮源的培養(yǎng)基中接種需要的米曲霉宿主細胞的振搖燒瓶培養(yǎng)物進行補料分批發(fā)酵。在pH7.0和34℃培養(yǎng)24小時后，開始連續(xù)供應其它碳源和氮源。維持碳源作為限制因子，并且保證氧過量存在。連續(xù)批量進料培養(yǎng)4小時。
SEQ ID NO1中顯示的DNA序列的分離從保藏生物體大腸桿菌DSM11299，通過本領域已知方法提取質粒(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)可以獲得編碼本發(fā)明的磷脂酶的SEQ ID NO1中顯示的DNA序列的磷脂酶編碼部分。
培養(yǎng)基YPD10克酵母提取物，20克蛋白胨，加水到900毫升高壓滅菌，加入100毫升20％葡萄糖(無菌過濾)。
YPM10克酵母提取物，20克蛋白胨，加水到900毫升，高溫滅菌，加入100毫升20％麥芽糖糊精(無菌過濾)。
10×基礎鹽75克酵母氮堿，113克琥珀酸，68克NaOH，水加到1000毫升，無菌過濾。
SC-URA100毫升10×基礎鹽，28毫升20％沒有維生素的酪蛋白氨基酸，10毫升1％色氨酸，水加到900毫升，高溫滅菌，加入3.6毫升5％蘇氨酸和100毫升20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-瓊脂SC-URA，加入20克/升瓊脂。
SC-變異瓊脂20克瓊脂，20毫升10×基礎鹽，水加到900毫升，高壓滅菌。
PEG4000(聚乙二醇，分子量＝4,000)(BDH，英格蘭)。
實施例1尖孢鐮孢磷脂酶的發(fā)酵將在瓊脂斜面上的尖孢鐮孢DSM2672的培養(yǎng)物轉移到5個500毫升的振搖燒瓶中，每個含有100毫升Bouillon-3培養(yǎng)基，在30℃振搖1天(200rpm，振幅2.5厘米)。
Bouillon-3培養(yǎng)基的組成如下蛋白胨 6克/升胰蛋白酶消化的酪蛋白 4克/升酵母提取物 3克/升肉提取物 1.5克/升葡萄糖 1克/升在121℃高壓滅菌該培養(yǎng)基40分鐘。
利用這些Bullion-3振搖燒瓶的培養(yǎng)肉湯作為種子培養(yǎng)物用于接種20個500毫升振搖燒瓶，每個含有200毫升PL-1培養(yǎng)基。
PL-1培養(yǎng)基的組成如下蛋白胨10克/升吐溫-8012克/升MgSO4；7H2O 2克/升CaCl2；2H2O 0.1克/升在高壓滅菌之前的pH 6.0在121℃高壓滅菌該培養(yǎng)基40分鐘。
將含有0.5-2毫升Boullion-3培養(yǎng)肉湯的每個PL-1振搖燒瓶高溫滅菌，并且在200rpm(振幅2.5厘米)，在30℃振搖5天。在收集時，合并來自振搖燒瓶的培養(yǎng)肉湯，總共3.9升，酶產量53LU/毫升。
實施例2磷脂酶的純化步驟1)離心1升發(fā)酵上清液，并且丟棄得到的沉淀。然后，通過加入固體乙酸銨將上清液調節(jié)到0.8摩爾/升乙酸銨。
步驟2)從Toso Hass(Rohm和Hass公司，德國)購買疏水層析-Toyopearl丁基650C基質。利用基質填充50毫升的柱。利用50％乙醇并且隨后利用水洗滌柱。然后，利用0.8摩爾/升乙酸銨平衡柱。利用0.8摩爾/升乙酸銨調節(jié)發(fā)酵上清液，然后加到柱上。然后，利用0.8摩爾/升乙酸銨洗滌未結合的物質直到除去所有UV吸收的物質(280納米)。
然后，利用水，隨后利用50％乙醇洗脫柱。
利用如上所述的NEFA試劑盒在pH4.5和40℃確定磷脂酶活性。合并在水和乙醇洗脫物中含有活性的組分。利用NEFA試劑盒測試在pH4.5測試活性。
然后合并含有磷脂酶活性的組分，并且利用截止分子量為10千道爾頓的Amicon超濾膜透析和濃縮。
步驟3-在DEAE快速流動層析上的陰性吸收。
DEAE FF是從Pharmacia購買的，利用該基質填充柱。
然后，如制造商的說明洗滌柱，利用pH7，25毫摩爾/升的Tris乙酸緩沖液平衡。
然后，將透析和濃縮的樣品調節(jié)到pH7和傳導性為2msi。并且加到陽離子交換DEAE FF柱上。
以流出物收集活性。該活性在pH7不結合陰離子交換物。
利用截止分子量為10千道爾頓的Amicon膜和25毫摩爾/升乙酸鈉緩沖液pH6濃縮和透析來自含有活性的DEAE FF的流出物。
在Superdex75上凝膠過濾。
洗滌已經填充來自Pharmacia的柱Hiload Tm16/60的Superdex75，并且利用含有150毫摩爾/升NaCl的pH6d 25毫摩爾/升乙酸鈉洗滌和平衡。
將來自在pH4.5和40℃的顯示磷脂酶活性的陰離子交換物的2毫升濃縮的流出物加到Superdex柱上。
利用流速為1毫升/分鐘通過凝膠過濾分離活性。
實施例3從尖孢鐮孢獲得的純化的磷脂酶的鑒定在如實施例1所述發(fā)酵的尖孢鐮孢磷脂酶上進行如下所述的鑒定，并且如實施例2所述純化。
利用來自Novex Tm的4-20％SDS-PAGE預制平板確定磷脂酶的分子量。在如上所述的還原條件下確定蛋白質的分子量。
在還原條件下發(fā)現尖孢鐮孢磷脂酶的分子量是29-30千道爾頓。
利用來自Pharmacia的兩性電解質PAGE平板確定等電點。
發(fā)現尖孢鐮孢的pI約為中性pH，優(yōu)選地在范圍5.8到6.8。
磷脂酶的熱穩(wěn)定性通過DSC(差示掃描量熱法)測試來自尖孢鐮孢的磷脂酶的熱穩(wěn)定性。在恒定的，程序加熱速度加熱酶溶液后獲得在示差熱分析圖(Cpvs.T)中的變性峰的峰值確定熱變性溫度，Td。
實驗在實驗中，利用來自Hart Scientific的DSC II(Utah，美國，1993)。
在pH10(50毫摩爾/升甘氨酸緩沖液)，pH7(50毫摩爾/升HEPES緩沖液+10毫摩爾/升EDTA)或pH4(50毫摩爾/升檸檬酸緩沖液)時利用50毫摩爾/升緩沖液作為酶的溶劑(約2毫克/毫升)。根據上面的實施例2純化酶。
將750微升酶溶液轉移到來自Hart Scietific的標準1毫升可封閉的hastelloy安瓿。將安瓿加載到比色計，并且冷卻到5℃15分鐘。在DSC掃描之前進行熱平衡。以掃描速度約90K/小時從5℃到95℃進行DSC掃描。以約+/-2℃的精確度確定變性溫度。
結果表1作為pH的函數的變性峰值pH Td(℃)457℃762℃10 55℃應該注意到這些實驗是在缺乏可以明顯影響酶穩(wěn)定性的油基質時進行的。DSC的結果表明最大的穩(wěn)定性接近中性pH。
假設熱變性是不可逆的，在工業(yè)應用如油的脫膠中相關的執(zhí)行溫度(美國5,264,367)至少是低于上面表1列出的Td-溫度約10℃。
氨基末端序列利用Edman降解，利用如制造商所述進行的應用生物系統(tǒng)儀器(ABI 473A蛋白質序列儀，應用生物系統(tǒng)，美國)確定氨基酸末端分析。
N末端序列對于尖孢鐮孢磷脂酶，N末端序列是N-末端A-V-G-V-T-T-T-D-F-S-N-F-K-F-Y-IN末端氨基酸“A”(丙氨酸)定位于SEQ ID NO2的位置31。這表明本發(fā)明的成熟的磷脂酶在SEQ ID NO2的位置31開始。
結果是，成熟的序列來自SEQ ID NO2的31-346。
實施例4磷脂酶A活性利用大豆卵磷脂作為底物，如上所述在pH4.5，40℃可以確定磷脂酶A活性(基于NEFA測試的測試)。
在如上所述的條件下尖孢鐮孢磷脂酶顯示了明顯的磷脂酶A的活性。
實施例5針對L-α-溶血磷脂酰膽堿的活性利用L-α-溶血磷脂酰膽堿作為底物，如上所述在pH4.5，在40℃確定磷脂酶的活性(NEFA測試基本測試)。
在如上所述的條件下尖孢鐮孢磷脂酶顯示了針對L-α-溶血磷脂膽堿的明顯的活性。
實施例6在單層建立(monolayer setup)中磷脂酶的活性已經利用單層儀器(zero-order trough，KSV5000，KSV儀器，芬蘭)評估針對磷脂DDPC(Di Dicanoyl(C10)磷脂酰膽堿)的各種酶活性。
實驗在完全純化的緩沖液表面(10毫摩爾/升TRIS，pH8.0，25℃)上，涂布來自氯仿溶液的DDPC單層。在松弛單層后(蒸發(fā)氯仿)，將表面壓力調節(jié)到15mN/m，對應的DDPC的平均分子面積約為632/分子。通過單層注射含有約60微克(微克)酶的緩沖液(參見上面)進入“zero-order trough”中的反應艙(面積1520平方毫米和30400立方毫米的體積的滾筒)的面下相中。通過壓縮單層的可動屏障的速度表示酶活性以便維持恒定的表面壓力因為不溶的底物分子水解成更加水溶性的反應產物。已經證實反應產物(葵酸和DDPC)的水溶性比DDPC高得多，可以從DDPC的平均分子面積(MMA)估計酶每分鐘水解的DDPC分子的數目。
結果表2.在單層建立中針對DDPC的酶的活性酶 活性(納摩爾/分鐘)*)西格瑪P9279(來自蜂毒的PLA2，850U/毫克 1.9
來自尖孢鐮孢的酶 2.7Candida antarctica B成分脂酶 0Candida antarctica A成分脂酶 0重組的豚鼠胰脂酶(rGPL) 0.2Lipolase(Novo Nordisk A/S) ＜0.1*)從酶的存在誘導的每單位時間的單層面積的降低計算在表2中“來自尖孢鐮孢的酶”是本發(fā)明的磷脂酶，是如上所述的實施例2中純化的。
結論對于大多數酶沒有檢測到磷脂酶活性，除了從豚鼠脂酶獲得的脂酶，顯示較小的磷脂酶活性。
從尖孢鐮孢獲得的本發(fā)明的磷脂酶顯示驚人地高的明顯的磷脂酶活性。
結果是，在本發(fā)明中，術語“磷脂酶活性”，用于本文的本發(fā)明的磷脂酶的關系中，作為上面顯示的“單層磷脂酶測試”中的活性確定至少為0.25納摩爾/分鐘，酶劑量60微克；更優(yōu)選地至少0.40納摩爾/分鐘，酶劑量60微克；更優(yōu)選地至少0.75納摩爾/分鐘，酶劑量60微克；更優(yōu)選地1.0納摩爾/分鐘，酶劑量60微克；更優(yōu)選地至少1.25納摩爾/分鐘，酶劑量60微克；和甚至更優(yōu)選地至少1.5納摩爾/分鐘，酶劑量60微克。
因此，定義術語“具有磷脂酶副活性的脂酶”為具有磷脂酶副活性的脂酶，瓊脂實施例6中顯示的“單層磷脂酶測試”中的磷脂酶副活性是小于上面提到的描述磷脂酶活性的數據。
根據本文的定義，具有磷脂酶副活性的脂酶的例子是上面的表2顯示的豚鼠脂酶。所述的豚鼠脂酶在“單層磷脂酶測試”中具有磷脂酶副活性，該活性小于0.25納摩爾/分鐘，酶劑量60微克。
實施例7從尖孢鐮孢DSM 2672克隆和表達磷脂酶利用如上所述在酵母技術中的表達克隆進行克隆和表達。
從如上所述生長的尖孢鐮孢DSM2672分離mRNA，包括攪拌保證足夠的空氣。在3-5天的生長后收集菌絲體，立即在液氮中冷凍，并且儲藏在-80℃。如上所述，在大腸桿菌中構建來自含有約9×105個單個克隆的尖孢鐮孢DSM2672的文庫，載體背景為1％。將來自一些合并液的質粒DNA轉化進入酵母，并且從每個合并液中獲得含有250-400酵母菌落的50-100平板。
在底物平板上鑒定和分離磷脂酶陽性菌落(見上文)。直接從酵母菌落擴增cDNA插入，并且如材料和方法部分所述鑒定。SEQ ID NO1顯示了編碼磷脂酶的cDNA的DNA序列，在SEQ ID NO2中顯示了對應的氨基酸序列。在從23到1060的SEQ ID NO1 DNA核苷酸定義了磷脂酶編碼區(qū)。在編碼磷脂酶的成熟部分的SEQ ID NO1中的DNA序列的部分包括位置113-1060，對應于SEQ ID NO2中的氨基酸位置31-346。
從DSM11299中的質?？色@得cDNA。
從酵母菌落獲得總DNA，通過如上所述的轉化大腸桿菌恢復質粒DNA。為了在曲霉中表達磷脂酶，利用適當的限制酶消化DNA，在凝膠上進行大小分級分離，并且純化對應于磷脂酶基因的片段。隨后將基因連接到pHD414，利用適當的限制酶消化，得到質粒pA2PH10。
在大腸桿菌中擴增DNA后，如上所述將質粒轉化進入米曲霉。
米曲霉轉化體的測試如上所述，測試每個轉化體的活性。一些轉化體具有明顯高于米曲霉背景的磷脂酶活性。這證明在米曲霉有效地表達了磷脂酶。
實施例8尖孢鐮孢磷脂酶的重組表達如上所述補料分批發(fā)酵含有曲霉表達載體pA2PH10的米曲霉轉化體(參見實施例7)。如實施例2中所述進行重組生產的尖孢鐮孢磷脂酶的純化。
實施例9從尖孢鐮孢獲得的重組表達和純化的磷脂酶的鑒定對重組表達和隨后純化的尖孢鐮孢磷脂酶進行鑒定(參見實施例8)。
這些鑒定導致與實施例3中顯示的特征結果準確的相關的本發(fā)明的重組尖孢鐮孢磷脂酶，其中證明重組表達和純化的酶是與實施例3中鑒定的非重組表達和純化的磷脂酶相同的。
用于鑒定從尖孢鐮孢獲得的重組產生的磷脂酶的一般測試磷脂酶測試當從卵磷脂釋放游離的脂肪酸時，測量磷脂酶活性(PHLU)。加入50微升4％L-α-磷脂酰膽堿(來自Avanti，美國的植物卵磷脂)，4％Triton X-100，在50毫摩爾/升HEPES中的5毫摩爾/升CaCl2，pH7，將50微升酶溶液在50毫摩爾HEPES，pH7中稀釋到適當的濃度。將樣品在30℃溫育10分鐘，并且在離心之前在95℃5分鐘終止反應(在7000rpm5分鐘)。利用來自Wako化學GmbH的NEFA C試劑盒確定游離的脂肪酸；在250微升試劑A中加入25微升反應混合物，在37℃溫育10分鐘。然后加入500微升試劑B，再次在37℃溫育樣品10分鐘。利用HP 8452A二極管排列分光光度計測量550納米的吸收。至少以二份跑樣品。包括了底物和無酶樣品(預熱酶樣品(在95℃10分鐘)+底物。利用脂肪酸標準作為油酸。1PHLU等于能夠在這些條件下釋放1微摩爾游離脂肪酸/分鐘的酶量。
可替代地，在20毫摩爾/升檸檬酸緩沖液，pH5(Ca2+-游離)或20毫摩爾/升Britton-Robinson緩沖液中，在37℃進行測試(pH-圖譜/溫度圖譜/穩(wěn)定性)。
利用1-(S-葵?；?-2-葵?；?1-硫代-sn-甘油-3-磷酸膽堿(D3716分子探針)作為底物測量磷脂酶A1活性(PLA1)。在200微升比色杯中的190微升底物(100微升D3761(2毫克/毫升乙醇中)+50微升1％ Triton X-100+1.85毫升50毫摩爾/升HEPES，0.3毫摩爾/升DTNB，2毫摩爾/升CaCl2，pH7)中加入10微升酶，在室溫下，在HP8452A二極管排列分光光度計上以時間的函數測量410納米的吸光值。在線性范圍以曲線的斜率計算活性。PLA1等于在這些條件下能夠釋放1微摩爾游離脂肪酸(硫代)/分鐘的酶的量。
利用1-己葵酰-2-(1-芘葵酰)-sn-甘油-磷酸膽堿(H361分子探針)，在40℃測量磷脂酶A2活性(PLA2)。在2毫升比色杯中攪拌加入2毫升(50毫升1％ Triton X-100+25微升0.1％H361于乙醇中+10毫升50毫摩爾/升HEPES，pH7)中加入10微升酶，利用Perkin Elmer LS50儀器以時間的函數(1秒，間隔)測量376納米(激發(fā)波長340納米)處的芘熒光發(fā)射。在Triton X-100/磷脂膠束中，將磷脂的濃度調節(jié)到具有受激準分子形成(在480納米發(fā)射)。在裂解后，在含有芘基團的2位置的脂肪酸釋放加入水溶液導致單體發(fā)射的增加。確定PLA2為等條件的線性范圍中曲線的斜率。
脂酶測試根據Novo Nordisk公開物AF95測量脂酶的活性(LU)。在30℃，pH7中水解三丁酸甘油酯后進行pH-狀態(tài)滴定實驗。1LU等于在標準條件下能夠釋放1微摩爾丁酸/分鐘的酶量。
如下測量對橄欖油的活性(SLU)在2.5毫升西格瑪脂酶底物中加入12毫升5毫摩爾/升Tris-HCl，40毫摩爾/升NaCl，5毫摩爾/升CaCl2，pH9。在加入0.5毫升脂酶溶液(在緩沖液中稀釋)和利用來自RadiometerA/S，Copenhagen丹麥得到的Titralab在30℃進行pH狀態(tài)滴定測試之前將pH調節(jié)到pH9或調節(jié)到剛剛低于pH9。1SLU等于在pH9，30℃能夠釋放1微摩爾游離脂肪酸/分鐘的酶量。
鑒定本發(fā)明的重組產生的尖孢鐮孢磷脂酶下面提到的用于鑒定酶的測試是上面剛剛敘述的測試方法。
酶具有SEQ ID NO2顯示的氨基酸序列的尖孢鐮孢的PL。
批號F-9700989，OD2800.83(0.69毫克/毫升)，純度＞95％(SDS-PAGE)。
如上所述重組表達和純化酶。
LecitaseTM批號L546-F06(10368IU/毫升，約20毫克/毫升)Lipolase(Novo Nordisk A/S)研究Ca2+對尖孢鐮孢脂酶/磷脂酶的磷脂酶活性的影響。不管是否在測試中含有EDTA或Ca2+或沒有，沒有觀察到主要的差異(參見表3)，所以酶似乎是相對獨立于Ca2+。表3依賴于EDTA和氯化鈣-2％卵磷脂，2％ Triton X-100，20毫摩爾濃度檸檬酸鹽，pH5，37℃時尖孢鐮孢磷脂酶活性(pHLU)。
1相對活性是相對于以1毫摩爾濃度氯化鈣的活性為1作為標準值計算獲得的。
利用植物卵磷脂作為底物在Britton-Robinson緩沖液中研究pH值分布圖(表4)。雖然該酶顯示對于磷脂堿性pH分布圖上最適pH為9或更高，低pH值時活性仍然足夠高以在使油脫膠和提供用于烘烤的性能(參見下文的比活性比較)。表4 在37℃，2％卵磷脂，2％ Triton X-100，20mM BR時尖孢鐮孢磷脂酶pH分布圖
1相對活性相對于作為標準值為1的pH9時的活性。
在pH5時獲得了關于磷脂酶的溫度分布圖；在40℃以上溫度時活性開始下降(表5)。這與通過將該酶預保溫和然后測量殘余的活性測定的溫度穩(wěn)定性合理地一致(表6)，其中酶在高達45℃溫度，pH5時穩(wěn)定。表5 2％卵磷脂，2％ 2％ Triton X-100，20mM BR時尖孢鐮孢磷脂酶溫度分布圖
<p>所有的數據以相對于作為標準值1的pH5，40℃時的活性的相對活性數據表示。表6 在20mM BR預保溫30分鐘，尖孢鐮孢磷脂酶的溫度穩(wěn)定性<
>所有數據以殘余活性數據表示，其中以5℃預保溫后的活性作為標準值1。
有利地，以該酶的低穩(wěn)定性顯示一種最終產物作為加工助劑，因為在食用油的脫膠或烘烤產物的最終產物中不能期望有活性酶。
從本發(fā)明的尖孢鐮孢獲得的磷脂酶具有磷脂酶和脂酶活性。
因此，對該酶對各種不同的酯酶和磷脂酶底物的活性進行調查并且與商品磷脂酶LecitaseTM和商品脂酶Lipolase(Novo NordiskA/S)的活性進行比較。
尖孢鐮孢磷脂酶/脂酶在pH7和9時對丁酸甘油酯和橄欖油具有活性(表7)。為了進行比較，Lipolase的比活性約為5000LU/毫克。但是，與Lipolase相反，尖孢鐮孢脂酶顯示具有相當大磷脂酶活性和也有硫酯酶活性的寬得多的特異性(參見上面實施例6的單層，顯示Lipolase不具有可測量的磷脂酶活性)。
在pH7時本發(fā)明的尖孢鐮孢磷脂酶/脂酶對卵磷脂的比活性比磷脂酶LecitaseTM(豬胰PLA2)的活性高得多(表7)。
與LecitaseTM相比，尖孢鐮孢酶在pH7時具有高100倍的活性。在類似的條件下(pH7和30℃)對于尖孢鐮孢酶的磷脂酶∶脂酶的比例約為0.225(1000LU/毫克/225pHLU/毫克)。表7 與LecitaseTM比較，尖孢鐮孢脂酶/磷脂酶的活性<
<p>1PLU以類似于pHLU的方式測量，但是不同的是50毫摩爾濃度HEPES，pH7，30℃被20毫摩爾濃度的檸檬酸鹽，pH5和37℃替代。
利用特異于磷脂酶A1的底物；測量在1-(S-癸酰基)-2-癸?；?1-硫-sn-甘油-3-膽堿磷酸的1-位置的硫酯鍵的裂解研究尖孢鐮孢脂酶/磷脂酶的特異性。
該酶明顯地在磷脂的1-位置水解(表7)，而LecitaseTM(豬胰臟PLA2)如預期的對該底物沒有顯示活性。
本發(fā)明的尖孢鐮孢磷脂酶C-末端的氨基酸序列按照實施例3的描述，測定重組表達的成熟磷脂酶蛋白質的N-末端的氨基酸序列，并且證實該N-末端序列與對于非重組生產和純化的酶測定的結果類似(參見實施例3)。
按照Christgau等人，生物化學雜志319，705-712，1996的描述，利用VG TofSpec質譜分析儀進行MALDI-TOF質譜分析。
背景技術：
如從DNA序列推測的尖孢鐮孢磷脂酶的N-末端的氨基酸序列預測與315個氨基酸殘基的成熟磷脂酶蛋白質(如SEQ ID NO的31到346位氨基酸)的已知的N-末端的氨基酸序列結合。該預測的蛋白質的理論質量是33256.8道爾頓。
利用MALDI-TOF質譜分析，我們以前已經測定了尖孢鐮孢的真實的脂酶/磷脂酶的質量是28.2千道爾頓(數據未顯示)，在SDS-PAGE上它顯示的分子量為29-30千道爾頓(參見上文)。
由于真實的和重組的尖孢鐮孢脂酶的N-末端氨基酸序列是相同的，可能由于C-末端的加工引起了預測的質量和試驗質量之間看到的質量差異。
為了進行研究，我們已經分離了來自于在A.oryzae中表達的重組的尖孢鐮孢脂酶的C-末端的肽并且從C-末端進行測序。
方案可以將尖孢鐮胞的真實的脂酶/磷脂酶的平均分子量28.2千道爾頓用于預測最合適的C-末端殘基，它是絲氨酸303(SEQ ID NO2)。
該推測是基于假設該酶是非糖基化。存在于該序列的天冬酰胺163的單個潛在的N-糖基化位點可以沒有被利用，因為脯氨酸殘基存在于第164位。從未有報道在共有序列中存在脯氨酸作為第二位殘基以便糖基化(天冬酰胺-Xaa-絲氨酸/蘇氨酸)。另外，在質譜圖上峰的形狀不能顯示糖基化作用。但是，該峰比通常包含于勻質蛋白質的峰較寬，這表明可能是大小異質性。由于該酶的N-末端被好地限定了，大小異質性最有可能是以異質性的C-末端的加工作為基礎。
檢查SEQ ID NO2(參見下文)表明預測的C-末端緊密定位于該序列的8個Cys殘基的最后。將放射性標記導入Cys殘基使含有Cys殘基的肽易于通過肽純化變得痕量。將放射性標記與利用在Asp殘基之前裂解Asp-N蛋白酶的蛋白質降解結合使用導致產生帶標記的C-末端肽。另外，三個內部肽被標記。對所有的標記肽進行測序應該顯示該酶的C-末端。



31 AVGVTTTDFS NFKFYIQHGA AAYCNSEAAA GSKITCSNNG CPTVQGNGAT 80

81 IVTSFVGSKT GIGGYVATDS ARKEIVVSFR GSINIRNWLT NLDFGQEDCS 130

(◇)131 LVSGCGVHSG FQRAWNEISS QATAAVASAR KANPSFNVIS TGHSLGGAVA 180181 VLAAANLRVG GTPVDIYTYG SPRVGNAQLS AFVSNQAGGE YRVTHADDPV 230


231 PRLPPLIFGY RHTTPEFWLS GGGGDKVDYT ISDVKVCEGA ANLGCNGGTL 280

281 GLDIAAHLHY FQATDACNAG GFSWRRYRSA ESVDKRATMT DAELEKKLNS 330↑331 YVQMDKEYVK NNQARS 346SEQ ID NO2尖孢鐮胞脂酶/磷脂酶的預測的氨基酸序列該序列是從DNA序列推導的并且對于真實的和重組酶都在試驗測定的N-末端開始的。用

表示8個半胱氨酸殘基，而從真實的酶的MALDI-TOF質譜分析推測的C-末端的絲氨酸殘基用↑表示。存在于共有序列的用于糖基化的天冬酰胺殘基(NXS/T)用(◇)顯示，但是十有八九不使用，因為X是脯氨酸殘基。
試驗結果酶是來自于尖孢鐮胞PL，具有顯示于SEQ ID NO2的氨基酸序列。
批號F-9700989，OD2800.83(0.63毫克/毫升)，純度＞95％(SDS-PAGE)。
該酶是重組表達的并且如上所述進行純化。
將酶變性并且在硫醇基與I[1-14C]CH2CONH2反應之前二硫鍵被還原。
將半胱氨酸殘基放射性標記之后，利用Asp-N蛋白酶降解該脂酶。
利用反相HPLC將產生的肽分級分離。將收集的餾份進行MALDI-TOF質譜分析并且進行閃爍計數。選擇含有顯著量的放射性活性的餾份利用活性HPLC進行純化。
將再純化的餾份進行閃爍計數并且隨后對含有放射性活性的餾份進行測序。
下面給出了結果的概述。由于給出許多序列，該示意圖似乎無秩序。但是，該示意圖含有從放射性餾份獲得的所有序列數據，因此它代表了計算結果的基礎。應該注意到通過測序覆蓋了所有的Cys-殘基；大多數測序過程在一次以上。值得注意到的另一件事情是所看到的異常裂解，導致產生大量的小肽放射性標記的。



NG CPTNNG CPTVQCSNCSNNG CPCSNNG CPTVCNSEAAA GSKI31 AVGVTTTDFS NFKFYIQHGA AAYCNSEAAA GSKITCSNNG CPTVQGNGAT80

DCSDCS81 IVTSFVGSKT GIGGYVATDS ARKEIVVSFR GSINIRNWLT NLDFGQEDCS 130

LVSGCLVSGCGVHSG FQRAW131 LVSGCGVHSG FQRAWNEISS QATAAVASAR KANPSFNVIS TGHSLGGAVA 180181 VLAAANLRVG GTPVDIYTYG SPRVGNAQLS AFVSNQAGGE YRVTHADDPV 230


DVKVCEGDVKVCEGA ANLGCNGGTLDVKVCEGA ANLGCNGGTL231 PRLPPLIFGY RHTTPEFWLS GGGGDKVDYT ISDVKVCEGA ANLGCNGGTL 280

DACNAG GFSGLTDACNAG GF281 GLDIAAHLHY FQATDACNAG GFSWRRYRSA ESVDKRATMT DAELEKKLNS 330↑331 YVQMDKEYVK NNQARS346
通過對來自于重組的尖孢鐮胞酶的放射性標記的肽進行測序獲得的氨基酸序列。將序列與從DNA序列推測的預測的氨基酸序列進行序列比較。用

表示8個半胱氨酸殘基，而從真實的酶的MALDI-TOF質譜分析推測的C-末端的絲氨酸殘基用↑表示。
試驗結果從對所有放射性比較的肽進行測序可以清楚地看到在從尖孢鐮胞表達脂酶期間將DNA編碼的氨基酸序列的C-末端部分進行加工。根據MALDI-TOF質譜分析獲得的結果，該肽序列暗示絲氨酸303最有可能是成熟蛋白質的C-末端的殘基。
但是基于這些數據，但不能拒絕考慮出現了差異的C-末端加工，導致異質性的C-末端；例如一個肽表示也發(fā)現苯丙氨酸272作為C-末端殘基。
實施例10食用油的酶促脫膠測試的總的描述用于實施酶促脫膠的設備該設備由裝備了一個鋼蓋，一個螺旋槳(600rpm)，擋板，一個溫度傳感器，頂部的一個輸入管，頂部的一個回流冷凝器(4℃)，底部的一個輸出管的1升套層鋼反應罐組成。將反應罐套連接到恒溫浴。借助于硅管將輸出管連接到silvarson排齊的混合器頭，所述混合器頭裝備了“方形的孔眼高煎切篩”，所述篩由silvetson L4RT高煎切實驗室混合器(8500rpm，流速約為1.1l/分鐘)驅動。混合器的頭部裝備了冷卻線圈(5-10℃)和一個輸出管，該輸出管借助于硅管與反應罐的輸入管連接。在緊接混合器頭部后將溫度傳感器插入到硅管。反應罐/混合器頭部系統(tǒng)到大氣的唯一的連接是通過回流冷凝器。
實施酶促脫膠的總的程序開啟所有的冷卻和恒溫設備。然后將0.6升(約560克)的油加載到反應罐，反應罐保持在特異性的實驗所需的溫度。打開實驗室用混合器，從而油開始從反應罐到混合器頭部和反應罐北部的循環(huán)。允許該系統(tǒng)平衡約10分鐘，在此期間，溫度精確地轉動。在27克MilliQ水中加入0.6克(2.86mmol)一水檸檬酸開始預處理階段(加入的水/油等于4.8％w/w；水相中(檸檬酸)＝106mM，在水/油乳液中＝4.6mM)，設置t＝0，在t＝30分鐘時，加入合適量的4M氫氧化鈉溶液。
0.0當量4M氫氧化鈉 →pH3.71.0當量4M氫氧化鈉(0.714毫升) →pH4.51.5當量4M氫氧化鈉(1.07毫升)→pH5.02.0當量4M氫氧化鈉(1.43毫升)→pH5.52.5當量4M氫氧化鈉(1.79毫升)→pH6.23.0當量4M氫氧化鈉(2.14毫升)→pH8.0在t＝35分鐘時，獲取樣品進行P-分析和pH測定。緊接在該步驟之后，加入所需量的酶溶液(預處理期間的結束時)。在t＝1，2，3.5，5，6小時獲取進行P-分析和pH測定的樣品，然后終止該反應。
倒空反應罐/混合器系統(tǒng)并且用2×500毫升10％Deconex/DT水溶液清洗，隨后最少的3×500毫升的DI水清洗。表8提供了反應期間各種添加劑和獲取的樣品。
表8酶促脫膠的時間表

磷分析用于P-分析的樣品在玻璃離心管中加入10毫升的油包水乳液。將該乳液在沸水浴中加熱30分鐘。以5000rpm離心10分鐘。將約8毫升的上部(油)相轉移到12毫升的聚苯乙烯管并且將它保持(沉積)12-24小時。之后從上部澄清相獲取約1-2克沉淀物進行P-分析。
根據在“用于油，脂肪和衍生物分析的標準方法，第7版(1987)”的2.421程序進行P-分析稱取100毫克的氧化鎂(leicht，Merck#5862)置于瓷盤并且用氣體爐子加熱。加入1-2克的油并且用氣體爐子點燃一獲得黑色的，硬的塊。在Vecstar爐子中在850℃加熱2小時獲得白色灰。將白色灰溶解于5毫升的6M硝酸并且加入20毫升的試劑混合物。保留20分鐘。在460nm測量吸收值(利用空白(5毫升硝酸+20毫升試劑混合物)用于校正0)。利用標準曲線計算。
pH測定取2毫升的水溶于油乳液并且與2毫升的MilliQ水混合。在相分離后，用吸管吸取頂部油層。用pH電極Orion測量含水相的pH值。采用下面的通式將測量值轉化為“真正”pH值pH真正＝pH測量-0.38通過將0.6克的一水檸檬酸溶解于27克的去離子水獲得校正曲線；采用pH電極Orion測量該溶液的pH值(pH真正)。將100微升與2毫升的MilliQ水混合，采用pH電極Orion測量該溶液的pH值(pH測量)。通過將氫氧化鈉溶液加入逐漸改變檸檬酸溶液的pH，并且對每次調整，如上所述進行稀釋和pH測量。
實施例11LecitaseTM的最適脫膠條件涉及食用油脫膠的所有的試驗按照實施例10的描述進行。
油水脫膠的菜籽油(Colzro)來自于丹麥的Aarhus Oliefabrik。
批號C00730/B01200，9千克，P-含量為186ppm(0.74％磷脂)。
油不是商品產物，但是可直接從磨坊的生產線獲取。
酶10升LecitaseTM批號L646-F02(10190U/毫升)，估測的濃度20毫克/毫升。
在表9中給出了用LecitaseTM進行的一系列參數最適化試驗的特異性條件。標準條件是酶劑量535U/千克油(1.1毫克/千克油)，60℃，2.0當量的氫氧化鈉(pH5.5)。酶量已從268-1070u/kg油變化，溫度已經從40-70℃變化，和加入的氫氧化鈉已經從1.0-3.0當量變化，這對應于各個pH水平，如表9顯示的。
表9 LecitaseTM最適化的特異性條件<


*pH值是從T＝35分鐘到6小時。該時間期間內所有pH測定是在一個窄的窗口內進行的。在下面的實施例13中對此進一步描述。
在表10中獲得了所提供的單個的最適化研究。
表10的結果顯示，i)從劑量/應答調查可以看到最適的酶劑量(在60℃和2.0當量氫氧化鈉)是約535U/千克油。半劑量將脫膠時間從約3.5增加到6小時，雙倍劑量對脫膠性能沒有引起任何變化。已經插入酶空白結果進行比較；ii)最適氫氧化鈉的加入是約2.0當量(pH在約5.5)，在1.0當量(pH在約4.5)和3.0當量(pH在約8)有差性能；iii)最適溫度是約60℃，因為70℃沒有引起P-水平總的下降，50℃將脫膠時間從約3.5增加到6小時，和40℃獲得差性能。
表10LecitaseTM脫膠條件的最適化的結果

1在所指的時間(小時)在油相中的磷含量(ppm)實施例12根據本發(fā)明的尖孢鐮胞磷脂酶的最適的脫膠條件涉及食用油酶促脫膠的所有的試驗按照實施例10的描述進行。
油水脫膠的菜籽油(Colzro)來自于丹麥的Aarhus Oliefabrik。
批號C00730/B01208，P-含量為約200ppm。
批號C00730/B01209，P-含量為約200ppm。
批號C00730/B01429，P-含量為227ppm。
批號C00730/B01430，P-含量為252ppm。
油不是商品產物，但是可直接從磨坊的生產線獲取。
酶從尖孢鐮胞獲得的具有顯示于SEQ ID NO2的氨基酸序列的PL。
批號F-9700123，OD2801.48，純度約58％，估測的濃度0.9毫克/毫升。
如上所述進行酶的重組表達和純化。
在表11中給出了用來自于尖孢鐮胞的PL進行的一系列參數最適化試驗的特異性條件。標準條件是酶劑量1.6毫克/千克油，40℃，1.5當量的氫氧化鈉(pH5.0)。酶劑量已經從0.2-1.6毫克/千克油變化，溫度已經從30-50℃變化，和加入的氫氧化鈉已經從1.0-2.5當量變化，這對應于各個pH水平，如表11顯示的。
表11來自尖孢鐮孢的PL的最優(yōu)化的具體條件


試驗結果在下面的表12中提供。時間窗口35分鐘-6小時內的pH偏差都是在具有微小的不規(guī)則的預期的間隔內。
總之，在下面的表12中的結果顯示，i)從劑量/應答測試可以看到最適的酶劑量(在40℃和1.5當量氫氧化鈉)是約0.8毫克/千克油；ii)最適氫氧化鈉的加入是約1.5當量(pH在約5.0)，而在1.0當量(pH在約4.5)沒有性能，和在2.0當量(pH約5.5)和在2.5當量(pH約6.2)有有限的性能，和；iii)最適溫度是約45℃，而50℃獲得有限的性能。
表12尖孢鐮胞脫膠條件的最適化的結果


1在以小時表示的指示的時間油相的磷含量(ppm)。
實施例13在酶促脫膠過程期間標準的pH偏差的描述下面的表13顯示在如實施例10描述的酶促脫膠過程期間pH偏差的一般例子。
用LecitaseTM進行試驗。進一步詳細情況參見實施例11。
表13從t＝35分鐘到6小時的pH值


如果在本文公開的酶促脫膠試驗的實施例沒有進一步提到，那么在所述試驗中標準的pH偏差顯示于上文的表13。
實施例14LecitaseTM和本發(fā)明的尖孢鐮胞的磷脂酶的酶促脫膠性能的比較在附圖2中，顯示了在其各自的最適條件下PL’s的結果，如在上面的實施例11和12中測定的。
顯示于附圖2的試驗條件LecitaseTM60℃，pH5.5(2.0當量的氫氧化鈉)，和1毫克的酶/千克油(約535U)(試驗#9)。
尖孢鐮胞PL40℃，pH5.0(1.5當量氫氧化鈉)，和0.8毫克酶/千克油(試驗#33)。
尖孢鐮胞PL45℃，pH5.0(1.5當量氫氧化鈉)，和1.6毫克酶/千克油(試驗#64)。
顯然，與LecitaseTM相比，來自于尖孢鐮胞的PL獲得了非?？斓拿撃z效果。
根據本發(fā)明，在將酶與油接觸25分鐘之后來自于鐮胞的PL獲得了幾乎完全的脫膠作用。
實施例15存在于不同類型的食用油的非可水解的磷脂的量的測定油來自于丹麥的Aarhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批號C00745/B01146，P-含量609ppm。該批號含有固體殘留物。
來自于Scanola(丹麥)的粗制菜籽油，批號C00745/B01593，P-含量315ppm。
經過濾的粗制菜籽油，過濾的批號C00745/B01146，P-含量231ppm。
該油的批號是經過100微米Johnson濾膜過濾的上面所述的C00745/B01146(609ppm)。
來自于丹麥的Aarhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批號C00745/B01700，P-含量459ppm。
來自于德國Lurgi的菜籽油，批號C00932/B01381，P-含量148ppm。
來自于丹麥的Aarhus Oliefabrik(AOM)的粗制油菜子油，批號C00745/B01145，P-含量593ppm。
通過用包括溶解于水的一水檸檬酸的溶液預處理油進行如上顯示的存在于食用油的不同類型的非可水解的磷脂的量的測定，如在上面實施例10描述的。
簡單地說，預處理過程包括，i)在60℃，通過加入包括溶解于水的一水檸檬酸的溶液預處理食用油(加入的水比油等于4.8％w/w；(檸檬酸)在水相＝106mM，在水/油乳液＝4.6mM)30分鐘；ii)將10毫升的預處理的油包水乳液轉移到試管；iii)在沸水浴中加熱該乳液30分鐘；iv)以5000rpm離心10分鐘，v)將約8毫升的上層(油)相轉移到新的試管并且將其放置24小時；在沉淀之后，從上層澄清相取2克用于測定食用油中的非可水解的磷的含量(ppm)。如上面實施例10描述測定ppm值。
在該過程之后，如上顯示的存在于不同類型的食用油中的非可水解的磷脂的量是，來自于AOM的粗制菜籽油#1146含有固體顆粒狀物質，這部分是由于高P-水平(609ppm)引起的；經過100微米的Johnson篩過濾獲得了磷含量為231ppm的澄清油。
對粗制油和過濾的油進行預處理獲得了140ppm的P-水平，這是存在于該油的非可水解的磷脂的測量值；通過預處理來自于粗制菜籽油的磷脂的含量是從315ppm降低到約30ppm；通過預處理過程來自于Lurgi的菜籽油(可能是粗制油和完全精煉的油的任意混合物)的磷脂含量降低到60ppm；預處理的來自于AOM的粗制菜籽油#1710的P-含量從459降低到200-250ppm；對來自于AOM的粗制黃豆油#1145預處理的P-含量從593降低到10ppm。該黃豆油構成了通過單獨的水脫膠/檸檬酸處理而脫膠的油的例子。在預處理之后向該粗制豆油中加入酶沒有進一步降低P-含量。
這些資料顯示粗制菜籽油的磷脂的組成(水合與非水合的磷脂的比例)每批與每批之間有很大的不同，結果是，水脫膠的油菜子油的剩余的磷脂的水平在較寬的范圍內(30ppm(Scanola)到200-500ppm(AOM))變化。
為了進行酶促脫膠，最適的酶劑量依賴于脫膠或預處理之后存在的非水合的磷脂的量。
此外，存在于油的非水合的磷脂的年越高，該酶促脫膠方法越有效。
在下面的實施例16中也進行描述，其中本發(fā)明顯示存在菜籽油#1146的酶促脫膠，所述的油具有約140ppm的非水合的磷脂的水平。
實施例16粗制菜籽食用油(I)的脫膠根據上面的實施例10描述的“用于實施酶促脫膠的一般的程序”進行試驗A和B。
油來自于丹麥的Arhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批號C00745/B01146，P-含量609ppm。該批號含有固體殘留物。
酶LecitaseTM10L批號L646-F02(10190U/毫升)，估測的濃度20毫克/毫升。
從尖孢鐮胞獲得的具有顯示于SEQ ID NO2的氨基酸序列的PL。
批號F-9700123，OD2801.48，純度約58％，估測的濃度0.9毫克/毫升。
如上所述進行酶的重組表達和純化。
試驗A(參照)將0.6升(580克)的粗制菜籽油上樣到該設備并且加熱到60℃。在t＝30分鐘時，加入1.43毫升(5.7mmoles)的4M氫氧化鈉溶液，產生pH約5.6。在t＝35分鐘時，加入30微升(300單位)的LecitaseTM10L(從Novo Nordisk A/S獲得)。在離心之后測定的油相中的磷的含量以及水相的pH值顯示于表14。
表14 用LecitaseTM對粗制的菜籽油脫膠的結果

試驗B將0.6升(581克)的粗制菜ob油上樣到該設備并且加熱到40℃。在t＝30分鐘時，加入1.07毫升(4.3mmoles)的4M氫氧化鈉溶液，產生pH約5.4。在t＝35分鐘時，加入來自于尖孢鐮胞的磷脂酶的純化的溶液(實施例2)1毫升(0.9毫克)。在離心之后測定的油相中的磷的含量以及水相的pH值顯示于表15。
表15用來自于尖孢鐮胞的磷脂酶對粗制的菜籽油脫膠的結果

實施例17粗制菜籽食用油(II)的脫膠根據上面的實施例10描述的“用于實施酶促脫膠的一般的程序”進行試驗A和B。
油來自于丹麥的Arhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批號C00745/B01710，P-含量459ppm。
酶LecitaseTM10L批號L646-F02(10190U/毫升)，估測的濃度20毫克/毫升。
從尖孢鐮胞獲得的具有顯示于SEQ ID NO2的氨基酸序列的PL。
批號F-9700476，OD2800.8，純度約58％，估測的濃度0.45毫克/毫升。
如上所述進行酶的重組表達和純化。
試驗A(參照)將0.6升(580克)的粗制油菜子油上樣到該設備并且加熱到60℃。在t＝30分鐘時，加入1.43毫升(5.7mmoles)的4M氫氧化鈉溶液，產生pH約5.6。在t＝35分鐘時，加入合適量(例如50微升(約500單位)的1毫克酶/千克油)的LecitaseTM10L(從Novo NordiskA/S獲得)。在離心之后測定的油相中的磷的含量以及水相的pH值顯示于表16。
表16 用Lecitase對粗制的菜籽油脫膠的結果

試驗B將0.6升(581克)的粗制油菜子油上樣到該設備并且加熱到40℃。在t＝30分鐘時，加入1.07毫升(4.3mmoles)的4M氫氧化鈉溶液，產生pH約5.0。在t＝35分鐘時，加入來自于尖孢鐮胞的磷脂酶的純化的溶液(實施例2)的合適量(即1.6毫克酶/千克油，和3.2毫克酶/千克油)。在離心之后測定的油相中的磷的含量顯示于表17。
表17用來自于尖孢鐮胞的磷脂酶對粗制的菜籽油脫膠的結果


結果概述如下，Lecitase，60℃，pH5.5酶劑量在1.0到3.0毫克/千克油的范圍內變化。結果在上面的表16中給出。在1.0毫克/千克油的酶劑量時，脫膠慢并且在6小時獲得約20ppm。在高酶劑量時，用3.0毫克酶/千克油在約3.5小時內將脫膠性能改善到10ppm磷含量。
推測如果使用較高的酶劑量脫膠性能將進一步獲得改善。尖孢鐮胞PL，45℃，pH5.0測試1.6和3.2毫克/千克油的酶劑量，發(fā)現其性能同樣的好(上面表17)。用1.6毫克/千克油-或可能較低-觀察到優(yōu)秀的脫膠作用，在約2小時獲得9ppm的磷?？梢灶A見可以利用更低量的尖孢鐮胞磷脂酶(例如0.9毫克/千克油)并且仍然具有好的脫膠性能。
實施例18利用從大刀鐮胞獲得磷脂酶制劑對水脫膠的食用油進行脫膠根據上面的實施例10描述的“用于實施酶促脫膠的一般的程序”進行試驗A和B。
油來自于丹麥的Arhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批號C00745/B01700，P-含量231ppm。
酶來自于大刀鐮胞的發(fā)酵液如下所述培養(yǎng)，離心大刀鐮胞菌株并且純化上清液。
在含有100毫升的下面的組分的500毫升的搖瓶中產生大刀鐮胞CBS513.94菌株(保藏于1994年10月25日)的種子培養(yǎng)物
玉米浸出液(無水)12克/升葡萄糖 24克/升向每個瓶中加入0.5克碳酸鈣和0.5毫升的油。在高壓蒸汽滅菌之前將pH調節(jié)到5.5。
在26℃和250rpm培養(yǎng)3天之后，將各5毫升的種子培養(yǎng)液接種到含有100毫升的下面培養(yǎng)基的搖瓶中蛋白胨，Difco 0118 6克/升Pepticase，Sheffield產 4克/升酵母提取物，Difco 0127 3克/升肉提取物，Difco 01261.5克/升葡萄糖，Roquette 101-0441 1克/升橄欖油，Sigma 10克/升在高壓蒸汽滅菌之前將pH調節(jié)到7.3-7.4。
在26℃和250rpm培養(yǎng)9天，離心和過濾(0.45微米)該培養(yǎng)液，收集上清液并且用于下面顯示的脫膠試驗。
估測的活性是200PHLU/毫升。
試驗利用從尖孢鐮胞獲得的磷脂酶制劑對水脫膠的油進行酶促脫膠將0.6升(581克)的粗制菜籽油上樣到該設備并且加熱到40℃。在t＝30分鐘時，加入1.43毫升(5.7mmoles)的4M氫氧化鈉溶液，產生pH約5.5。在t＝35分鐘時，加入合適量的來自于大刀鐮胞的磷脂酶的純化的溶液(即1070PHLU/千克油)。在離心之后測定的油相中的磷的含量，顯示于表18。
表18 用來自于大刀鐮胞的磷脂酶對粗制的菜籽油脫膠的結果


實施例19利用Degomma VOD對粗制油進行酶促脫膠油粗制菜ob油，批號C00745/B01700，P-含量459ppm。
酶商品磷脂酶Degomma VOD(Rohm；德國)，估測的濃度10毫克/毫升。
將0.6升(581克)的粗制菜ob油上樣到該設備并且加熱到40℃。在t＝30分鐘時，加入0.714毫升(2.86mmoles)的4M氫氧化鈉溶液，產生pH約4.5。在t＝35分鐘時，加入合適量的Degomma VOD磷脂酶的純化的溶液(即3.6毫克/千克油，或7.1毫克/千克油)。在離心之后測定的油相中的磷的含量顯示于表19。
表19

該實施例說明Degomma VOD能夠對食用油脫膠。但是，為了獲得滿意的所述油的脫膠，與本發(fā)明的鐮胞磷脂酶相比需要相對高劑量的Degomma VOD。參見例如實施例16和17進行比較。
實施例20利用來自于尖孢鐮胞的磷脂酶作為面包改良劑材料和方法面包的制備按照下面的基本配方制備歐洲直式生面團白面包和小白面包(roll)基本配方面粉(Meneba BBZ) 100％(2000克)水 61％酵母 4％鹽 1.5％糖 1.5％抗壞血酸 40ppm烘烤程序混合(螺旋式混合器)，625RPM 3分鐘混合(螺旋式混合器)，1250rpm3.5分鐘生面團的評價 7分鐘發(fā)酵(室溫) 15分鐘壓片/成形 3分鐘在室溫下松馳 5分鐘摺疊 2分鐘在室溫下松馳 5分鐘壓片/成形/放入模內(panning)2分鐘醒發(fā)成形(32℃，82％RH) 小白面包 45分鐘裝?？镜拿姘?Panned bread) 55分鐘烘烤(230分鐘) 小白面包 22分鐘裝?？镜拿姘? 35分鐘生面團和烘烤的產品的評價生面團和烘烤的產品的特性如下所述測定比容指數借助于傳統(tǒng)的菜籽替換方法可以測量一個面包或小白面包的體積。將比容計算為每克面包毫升體積。對照(沒有酶)的比容定義為100。相對比容指數計算為面包的比容比容指數＝-----------------------------------×100對照面包的比容

*用于烘烤的商品卵磷脂制劑(Superfos，丹麥)。
該結果顯示在不含有卵磷脂的配方中尖孢鐮孢磷脂酶對小白面包和裝模烤的面包有明顯的體積增加作用。如果配方包括卵磷脂，可以獲得更好的體積效果，雖然卵磷脂對本身體積不起作用。用Statgraphics Plus，release3.0進行的統(tǒng)計學分析(ANOVA，α＝0.05)顯示磷脂酶和卵磷脂之間顯著的陽性協(xié)同作用。
在有和沒有卵磷脂的配方中，用尖孢鐮孢磷脂酶獲得了小白面包形狀的顯著改善(小白面包站立性)。在該實施例中，通過將卵磷脂和磷脂酶(1500LU/千克面粉)結合獲得了最好的小白面包站立性。
實施例21將從尖孢鐮孢獲得的磷脂酶用于面包中作為抗老化劑材料和方法面包的制備按照下列基礎配方制備歐洲直式生面團白面包和小白面包基礎配方面粉(Meneba BBZ) 100％(2000克)水61％酵母 5％鹽1.5％糖1.5％抗壞血酸 40ppm烘烤程序混合(螺旋混合器)，625RPM 3分鐘混合(螺旋混合器)，1250RPM 3.5分鐘生面團的評估 7分鐘發(fā)酵(室溫)15分鐘壓片/成形 3分鐘在室溫下松弛 5分鐘摺疊 2分鐘在室溫下松弛 5分鐘壓片/成形/放入模內2分鐘醒發(fā)成形(32℃，82％RH)55分鐘烘烤(230℃) 35分鐘在該實施例，在有蓋的模內中烤制面包，以便避免在結構分析之前比容的不同。在冷卻之后，將面包在室溫下保存，包裝到塑料袋。
烘烤的產物的評估根據AACC方法74-09可以進行不新鮮程度和結構的評估。根據下面的程序，在烘烤之后0，1，3和7天對面包屑的柔軟性進行評估作為面包不新鮮程度的指標在結構分析儀(TA TX-2)中以不變的速度壓縮一片面包，以克測量壓縮使用的力。測量面包屑的堅固性以25％壓縮力表示。由于面包變成不新鮮，面包屑的堅固性增加。
結果堅固性測量與儲藏天數的函數關系的結果顯示于表2。以1克/千克面粉的濃度加入Lecimulthin，以500U/千克面粉的劑量加入尖孢鐮孢磷脂酶。表中的每個數據是6次測量的平均值(2個面包，各測量3次)。
表21

*用于烘烤的商品卵磷脂制劑(Superfos，丹麥)。
如表21顯示的，在儲藏達3天時，用磷脂酶處理的面包稍微比對照松軟。與卵磷脂結合時，在整個儲藏期間，可以獲得顯著的抗老化作用(僅用卵磷脂或磷脂酶不能獲得)。
序列表SEQ ID NO1顯示了本發(fā)明的克隆的DNA序列，包括編碼顯示磷脂酶活性的酶的DNA序列。
(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1170個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物體尖孢鐮孢(B)菌株DSM 2672(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置23..1063(xi)序列描述SEQ ID NO1TTGGAGAATA TTCCTTGTCA CG ATG CTT CTT CTA CCA CTC CTC TCG GCC ATC 52Met Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ala Ile1 5 10ACC CTC GCG GTA GCC AGT CCT GTA GCT CTC GAC GAC TAC GTC AAC TCT 100Thr Leu Ala Val Ala Ser Pro Val Ala Leu Asp Asp Tyr Val Asn Ser15 20 25CTT GAG GAG CGA GCT GTT GGT GTC ACT ACA ACC GAC TTC AGC AAC TTC 148Leu Glu Glu Arg Ala Val Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe30 35 40AAG TTC TAC ATC CAA CAC GGC GCC GCA GCT TAC TGC AAC TCT GAA GCC 196Lys Phe Tyr Ile Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala
45 50 55GCA GCT GGT TCC AAG ATC ACC TGC TCC AAC AAT GGC TGT CCA ACC GTT 244Ala Ala Gly Ser Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val60 65 70CAG GGC AAC GGA GCG ACC ATC GTG ACA TCT TTC GTT GGC TCC AAG ACA 292Gln Gly Asn Gly Ala Thr Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr75 80 85 90GGT ATC GGT GGC TAC GTC GCG ACA GAC TCT GCC CGA AAG GAA ATC GTC 340Gly Ile Gly Gly Tyr Val Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val95 100 105GTC TCG TTC CGC GGA AGC ATC AAT ATT CGA AAC TGG CTT ACC AAC CTC 388Val Ser Phe Arg Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu110 115 120GAC TTC GGC CAG GAA GAC TGC AGT CTC GTC TCT GGA TGC GGT GTG CAC 436Asp Phe Gly Gln Glu Asp Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His125 130 135TCT GGC TTC CAG CGA GCC TGG AAT GAG ATC TCG TCT CAA GCA ACC GCT 484Ser Gly Phe Gln Arg Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala140 145 150GCT GTT GCC TCC GCC CGC AAG GCG AAC CCT TCT TTC AAC GTC ATT TCT 532Ala Val Ala Ser Ala Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser155 160 165 170ACA GGC CAC TCC CTT GGA GGT GCC GTG GCC GTT CTT GCT GCC GCA AAC 580Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn175 180 185TTG AGA GTC GGT GGA ACA CCC GTC GAT ATT TAC ACC TAC GGC TCT CCC 628Leu Arg Val Gly Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro190 195 200CGT GTC GGA AAC GCG CAG CTC TCA GCC TTC GTC TCA AAC CAG GCT GGT 676Arg Val Gly Asn Ala Gln Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly205 210 215GGA GAG TAC CGC GTT ACA CAC GCT GAT GAC CCT GTC CCC CGT CTC CCT 724Gly Glu Tyr Arg Val Thr His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro220 225 230CCT CTG ATC TTC GGA TAC AGG CAC ACA ACT CCT GAG TTC TGG CTG TCC 772Pro Leu Ile Phe Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser235 240 245 250GGC GGT GGA GGC GAC AAG GTT GAC TAC ACC ATC AGC GAT GTC AAG GTC 820Gly Gly Gly Gly Asp Lys Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val255 260 265TGT GAG GGT GCT GCC AAC CTT GGA TGC AAC GGT GGA ACT CTT GGT TTG 868Cys Glu Gly Ala Ala Asn Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu270 275 280GAT ATT GCT GCT CAT CTG CAT TAC TTC CAG GCG ACT GAC GCC TGT AAC 916Asp Ile Ala Ala His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn285 290 295GCT GGT GGC TTC TCT TGG CGA CGA TAC AGA AGC GCC GAG AGC GTC GAC 964Ala Gly Gly Phe Ser Trp Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Glu Ser Val Asp300 305 310AAG AGG GCC ACC ATG ACT GAT GCC GAG CTT GAG AAG AAG CTG AAC TCT1012Lys Arg Ala Thr Met Thr Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser315 320 325 330TAT GTC CAG ATG GAT AAG GAG TAT GTG AAG AAT AAC CAG GCC CGC TCT1060Tyr Val Gln Met Asp Lys Glu Tyr Val Lys Asn Asn Gln Ala Arg Ser335 340 345TAA CGAGGGTATG AGGTTTGATG GGAAATGACA TGATTCATGA ACGAAACCAT 1113*AGTACATATG ATGCAAATAG GATATAAAAA CATATTTCAT TCACTAGCTT TACACAA 1170SEQ ID NO2顯示了本發(fā)明的磷脂酶的氨基酸序列(2)SEQ ID NO的信息(i)序列特征(A)長度346個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala Val Ala Ser1 5 10 15Pro Val Ala Leu Asp Asp Tyr Val Asn Ser Leu Glu Glu Arg Ala Val20 25 30Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gln His35 40 45Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser Lys Ile50 55 60Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly Ala Thr65 70 75 80Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr Val85 90 95Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser100 105 110Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln Glu Asp115 120 125Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln Arg Ala130 135 140Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser Ala Arg145 150 155 160Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser Thr Gly His Ser Leu Gly
165 170 175Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly Gly Thr180 185 190Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Ala Gln195 200 205Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg Val Thr210 215 220His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe Gly Tyr225 230 235 240Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys245 250 255Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala Asn260 265 270Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala His Leu275 280 285His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe Ser Trp290 295 300Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Glu Ser Val Asp Lys Arg Ala Thr Met Thr305 310 315 320Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser Tyr Val Gln Met Asp Lys325 330 335Glu Tyr Val Lys Asn Asn Gln Ala Arg Ser *340 345
關于微生物保藏的說明書(PCT第13條附則)

Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
關于微生物保藏的說明書(PCT第13條附則)

Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
權利要求
1.用于在食用油中降低含有磷的成分的含量的方法，其中所述的油包括至少50ppm的非水合的磷含量，所述的含量按照下面測定i)通過加入包括溶于水的一水檸檬酸的溶液(加入的水與油的比例等于4.8％w/w；[檸檬酸]水相中＝106mM，在水/油乳液中＝4.6mM)，在60℃將食用油預處理30分鐘；ii)將10毫升的預處理的油包水乳液轉移到一個試管；iii)在沸水浴中加熱該乳液30分鐘；iv)以5000rpm離心10分鐘，v)將約8毫升的上層(油)相轉移到新的試管并且將其靜置沉積24小時；vi)在沉積之后，從上層澄清相獲取2克用于測量食用油中非水合的磷含量(ppm)；和其中所述的方法包括，將所述的油在pH為1.5-8時與磷脂酶A1，磷脂酶A2，或磷脂酶B的水溶液接觸，在油中將其乳化直到油中磷的含量降低到低于11ppm，然后從處理的油分離水相。
2.根據權利要求1所述的方法，其中食用油具有至少60ppm的非水合的磷含量，更優(yōu)選的是具有至少100ppm的非水合的磷含量，甚至更優(yōu)選的是至少200ppm的非水合的磷含量。
3.根據前面任一項所述的方法，其中所述的食用油是粗制油，其在所述的接觸步驟之前是具有大于250份/百萬(ppm)的磷的含量的油，并且不是已經水脫膠的。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的粗制食用油具有350ppm以上的，更優(yōu)選的是400ppm以上，和甚至更優(yōu)選的是500ppm以上的磷的含量。
5.根據權利要求3-4任一項所述的方法，其中所述的食用油具有250-1200ppm范圍內，更優(yōu)選的是350-1200ppm范圍內，甚至更優(yōu)選的是在500-1200ppm范圍內的磷的含量。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述的食用油是半粗制食用油，它具有500份/百萬(ppm)以上的磷的含量，并且在所述的接觸步驟之前已經是水脫膠的。
7.根據前面權利要求任一項所述的方法，它包括i)將食用油的溫度調整到25-70℃之間的溫度；ii)通過加入0.5-6％(相對于油的重量)的含水溶液，在上述調整的溫度預處理食用油5-120分鐘，所述的含水溶液包括至少85％的水；iii)調節(jié)水/油乳液的pH到pH1.5-8之間；iv)將水/油乳液與磷脂酶A1，磷脂酶A2，或磷脂酶B的含水溶液接觸，在油中將該溶液乳化直到油中磷的含量降低到低于11ppm；v)從處理的油分離含水相。
8.根據權利要求7所述的方法，其中步驟I)的食用油的溫度調整到35℃-50℃之間的溫度，并且從絲狀真菌菌株獲得步驟iv)使用的磷脂酶。
9.根據前面權利要求任一項所述的方法，其中所述油與包括磷脂酶的含水溶液的接觸是在pH1.5-8，更優(yōu)選的是pH3-6的pH值時進行的。
10.根據前面權利要求任一項所述的方法，其中磷脂酶的量是在0.1毫克酶(干物質)千克油到15毫克酶(干物質)/千克油的范圍內。
11.根據前面權利要求任一項所述的方法，其中磷脂酶的量是在0.5毫克磷脂酶(干物質)千克油到6毫克磷脂酶(干物質)/千克油的范圍內，其中磷脂酶與所述的油接觸1小時到6小時的時間。
12.根據權利要求12所述的方法，其中磷脂酶的量是從0.25毫克磷脂酶(干物質)千克油到2.5毫克酶(干物質)/千克油的范圍內，并且其中磷脂酶與所述的油接觸15分鐘到2小時的時間。
13.根據前面權利要求任一項所述的方法，其中磷脂酶是從哺乳動物種類獲得的，特別是其中磷脂酶是從所述哺乳動物種類的胰臟獲得的。
14.根據權利要求13所述方法，其中磷脂酶是從豬胰臟獲得的。
15.根據前面權利要求任一項所述的方法，其中磷脂酶是從微生物，優(yōu)選的是絲狀真菌，酵母或細菌獲得的。
16.根據權利要求15所述的方法，其中絲狀真菌是鐮孢屬內的種，例如大刀鐮孢，異孢鐮孢，茄病鐮孢或特別是尖孢鐮孢菌株。
17.根據權利要求15所述的方法，其中絲狀真菌是曲霉屬內的種，例如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或特別是米曲霉。
18.根據前面權利要求任一項所述的方法，其中食用油是大豆油，向日葵籽油，或更優(yōu)選的是油菜籽油。
19.克隆的多聚核苷酸，它具有編碼顯示磷脂酶A活性的多肽的DNA序列，其中DNA序列是從絲狀真菌獲得的。
20.克隆的多聚核苷酸，具有編碼顯示磷脂酶A和/或磷脂酶B活性的酶的DNA序列，其中該DNA序列選自于下列組(a)克隆到存在于大腸桿菌DSM11299中的質粒pYES2.0的多聚核苷酸的編碼磷脂酶A部分；(b)在SEQ ID NO1的位置23-1063，更優(yōu)選的是SEQ ID NO1的位置113-1063，或甚至更優(yōu)選的是SEQ ID NO1的位置23-929顯示的DNA序列，或其互補序列；(c)與(a)或(b)定義的所述的DNA序列至少70％同源的DNA序列；(d)由(a)或(b)定義的所述的DNA序列，它編碼顯示磷脂酶活性的多肽并且與SEQ ID NO2的位置31-346顯示的多肽序列至少70％同源性，或更優(yōu)選的是與SEQ ID NO2的位置31-303顯示的多肽序列至少70％同源性；(e)以低嚴格性與包括顯示于SEQ ID NO1的位置23-1063的DNA序列的雙鏈DNA探針雜交的DNA序列；(f)編碼具有SEQ ID NO2的殘基1到346，31到346或31到303的氨基酸序列或由(e)的任一DNA序列編碼的氨基酸序列的多肽的DNA序列；和(g)在(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，或(f)限定的DNA序列的片段的DNA序列。
21.根據權利要求19或20所述的克隆的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶是磷脂酶A1。
22.根據權利要求19或20所述的克隆的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶是磷脂酶A2。
23.根據權利要求20所述的克隆的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶是磷脂酶B。
24.根據權利要求19-23任一項所述的克隆的多聚核苷酸，其中由所述多聚核苷酸編碼的磷脂酶是基本上不依賴于鈣離子濃度的磷脂酶，所述鈣離子濃度由下面測定，在磷脂酶活性測試中的5mM EDTA和5mM Ca2+時的相對磷脂酶活性，所述測試在緩沖液中測量從卵磷脂釋放的游離脂肪酸，所述的緩沖液包括2％卵磷脂，2％的Triton X-100，20mM檸檬酸，pH5；在37℃保溫10分鐘，隨后在95℃終止反應5分鐘；其中5mM EDTA/5mMCa2+時的相對磷脂酶活性的比例大于0.25，更優(yōu)選的是大于0.5。
25.根據權利要求19-24任一項所述的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶是具有磷脂酶活性的磷脂酶，所述活性是在酶劑量60微克和25℃時為至少0.25nmol/分鐘；更優(yōu)選的是在酶劑量60微克和25℃時為至少0.40nmol/分鐘；所述的活性是在單層磷脂酶測試中測定的。
26.根據權利要求19-25任一項所述的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶是具有磷脂酶活性的磷脂酶，在測定從卵磷脂釋放游離脂肪酸的測試中測定它能夠釋放至少7微摩爾的游離的脂肪酸/分鐘/毫克酶；更優(yōu)選的是至少15微摩爾的游離的脂肪酸/分鐘/毫克酶；所述的測試在包括2％卵磷脂，2％的TritonX-100，20mM檸檬酸，pH5的緩沖液中進行；測試在37℃保溫10分鐘，隨后在95℃終止反應5分鐘。
27.根據權利要求19-26任一項所述的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶能夠根據權利要求1-18任一項所述的方法進行食用油的酶促脫膠。
28.根據權利要求19-27任一項所述的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶能夠進行水脫膠的食用油(50-250ppm的磷含量)的酶促脫膠并且從而將油的磷含量降低到低于11ppm，其中酶促脫膠方法包括在pH1.5-8時將所述的油與磷脂酶的含水溶液接觸，所述的磷脂酶在油中乳化直到油的磷含量降低到小于11ppm，并且然后從處理的油分離水相。
29.根據權利要求28所述的多聚核苷酸，其中由所述的多聚核苷酸編碼的磷脂酶能夠利用低于2毫克磷脂酶(干物質)/千克油進行水脫膠的食用油的所述的酶促脫膠過程，和其中磷脂酶是與所述的油接觸15分鐘到2小時的時間。
30.根據權利要求20-29任一項所述的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸是從微生物，優(yōu)選的是絲狀真菌，酵母或細菌獲得的。
31.根據權利要求19-30任一項所述的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸是從核菌綱的絲狀真菌菌株，例如鐮孢屬獲得的。
32.根據權利要求31所述的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸是從鐮孢屬內的菌株，例如大刀鐮孢，異孢鐮孢，尖孢鐮孢或特別是尖孢鐮孢菌株獲得的。
33.根據權利要求32所述的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸是基于尖孢鐮孢DSM No.2672菌株的DNA文庫獲得的。
34.根據權利要求30所述的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸是曲霉屬內的絲狀真菌菌株，例如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或特別是米曲霉菌株獲得的。
35.具有磷脂酶A活性的分離的多肽，它是從鐮孢屬的菌株獲得并且具有I)pH3-10范圍內，40℃測定的PLA活性；ii)分子量為29±10千道爾頓，用SDS-PAGE測定；iii)等電點(pI)在4.5-8范圍內；iv)用卵磷脂作為底物，在pH5時測定的磷脂酶活性的最適溫度在25-55℃范圍內和/或v)用卵磷脂作為底物，在37℃測定的磷脂酶活性的最適pH在6-12的pH范圍內。
36.顯示磷脂酶A和/或B的活性的分離的多肽，它選自于下列組(a)由克隆到存在于大腸桿菌DMS11299的質粒pYES2.0的DNA序列編碼磷脂酶A和/或B酶部分編碼的多肽；(b)具有顯示于SEQ ID NO2的31-346位置的氨基酸序列的多肽；(c)具有顯示于SEQ ID NO2的31-303位置的氨基酸序列的多肽；(d)與(a)，(b)或(c)定義的所述的多肽具有至少70％的同源性的多肽；和(e)(a)，(b)(c)或(d)的片段。
37.根據權利要求35或36所述的分離的多肽，它是磷脂酶A1。
38.根據權利要求35或36所述的分離的多肽，它是磷脂酶A2。
39.根據權利要求36所述的分離的多肽，它是磷脂酶B。
40.根據權利要求35-39任一項所述的分離的多肽，如下列所述測定的它是基本上不依賴于Ca2+的濃度的，在磷脂酶活性測試中5mM EDTA和5mM Ca2+時的相對磷脂酶活性，所述測試在緩沖液中測量從卵磷脂釋放的游離脂肪酸，所述的緩沖液包括2％卵磷脂，2％的Triton X-100，20mM檸檬酸，pH5；在37℃保溫10分鐘，隨后在95℃終止反應5分鐘；其中5mM EDTA/5mMCa2+時的相對磷脂酶活性的比例大于0.25，更優(yōu)選的是大于0.5。
41.根據權利要求35-40任一項所述的分離的多肽，在單層磷脂酶測試測定，它在25℃和60微克的酶劑量時具有至少0.25nmol/分鐘的磷脂酶活性；更優(yōu)選的是在25℃和60微克的酶劑量時具有至少0.40nmol/分鐘的磷脂酶活性。
42.根據權利要求35-41任一項所述的分離的多肽，它具有能夠釋放至少7微摩爾的游離的脂肪酸/分鐘/毫克酶；更優(yōu)選的是至少15微摩爾的游離的脂肪酸/分鐘/毫克酶的磷脂酶活性；如下測定磷脂酶活性是在測定從卵磷脂釋放的游離的脂肪酸的測試中測定的，所述的測試在包括2％卵磷脂，2％的Triton X-100，20mM檸檬酸，pH5的緩沖液中進行；測試在37℃保溫10分鐘，隨后在95℃終止反應5分鐘。
43.根據權利要求35-42任一項所述的分離的多肽，能夠根據權利要求1-18任一項所述的方法進行食用油的酶促脫膠。
44.根據權利要求35-43任一項所述的分離的多肽，它能夠進行水脫膠的食用油(具有50-250ppm的磷含量)的酶促脫膠并且從而將油的磷含量降低到低于11ppm，其中酶促脫膠方法包括在pH1.5-8時將所述的油與磷脂酶的含水溶液接觸，所述的磷脂酶在油中乳化直到油的磷含量降低到小于11ppm，并且然后從處理的油分離水相。
45.根據權利要求44所述的分離的多肽，它能夠利用低于2毫克磷脂酶(干物質)/千克油進行水脫膠的食用油的所述的酶促脫膠過程，和其中磷脂酶是與所述的油接觸15分鐘到2小時的時間。
46.根據權利要求36到45任一項所述的分離的多肽，它是從微生物，優(yōu)選的是絲狀真菌，酵母或細菌獲得的。
47.根據權利要求36到45任一項所述的分離的多肽，它是從核菌綱的菌株，例如鐮孢屬獲得的。
48.根據權利要求47所述的分離的多肽，它是從鐮孢屬的菌株，例如大刀鐮孢，異孢鐮孢，茄病鐮孢或特別是尖孢鐮孢菌株獲得的。
49.根據權利要求48所述的分離的多肽，它是從尖孢鐮孢DSMNo.2672菌株獲得的。
50.根據權利要求46所述的分離的多肽，它是從曲霉屬內的絲狀真菌菌株，例如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或特別是米曲霉菌株獲得的。
51.包括權利要求19-34任一項所述的多聚核苷酸的重組的表達載體。
52.包括權利要求19-34任一項所述的多聚核苷酸或權利要求51所述的重組表達載體的宿主細胞。
53.根據權利要求52所述的宿主細胞，它是真核細胞，特別是真菌細胞，例如酵母細胞或絲狀真菌細胞。
54.根據權利要求53所述的宿主細胞，它是曲霉屬的菌株，特別是黑曲霉的或米曲霉菌株。
55.根據權利要求54所述的宿主細胞，它是鐮孢屬的菌株，特別是尖孢鐮孢的菌株。
56.生產顯示磷脂酶活性的酶的方法，該方法包括在適用于生產該酶的條件下培養(yǎng)權利要求51-55任一項所述的宿主細胞，并且從該培養(yǎng)物回收酶。
57.顯示磷脂酶活性的分離的酶，其特征在于(i)沒有同源雜質和(ii)由權利要求56所述的方法產生的。
58.利用從鐮孢屬的菌株，例如大刀鐮孢，異孢鐮孢，尖孢鐮孢或特別是茄病鐮孢菌株獲得的磷脂酶在包括用磷脂酶處理磷脂或溶血磷脂以水解脂肪?；鶊F的方法中的用途。
59.根據權利要求35-50和57任一項的磷脂酶在包括用磷脂酶處理磷脂或溶血磷脂以水解脂肪?；鶊F的方法中的用途。
60.根據權利要求58或59所述的用途，其中磷脂或溶血磷脂包括卵磷脂或溶血卵磷脂。
61.根據權利要求58-60所述的用途，其中處理是在pH3-10和30-70℃(優(yōu)選的是35-50℃)進行的。
62.根據權利要求59-61任一項所述的用途，所述的方法部分水解磷脂以獲得改善的磷脂乳化劑，特別是其中所述的磷脂是卵磷脂。
63.根據權利要求59-61任一項所述的用途，其中所述的方法用于改善包含磷脂的碳水化合物來源的含水溶液或漿料的濾過性。
64.根據前面任一項權利要求所述的用途，其中溶液或漿料包含淀粉水解產物，特別是小麥淀粉水解產物。
65.根據權利要求58-61任一項所述的用途，其中所述方法用于制備烘烤的產品，包括將磷脂酶加入到生面團，和將生面團烘烤以制備烤制產物。
66.生面團或烤制產品，包括權利要求35-50和57任一項的磷脂酶。
67.根據權利要求58-61任一項所述的用途，其中所述的方法用于降低具有50-250ppm的磷含量的食用油的磷脂的含量，包括用磷脂酶處理該油以水解磷脂的主要部分，和從該油分離含有水解的磷脂的水相。
68.根據權利要求67所述的用途，其中所述的油是在酶促脫膠過程之前是經過水脫膠的油。
69.根據權利要求58-61任一項所述的應用，其中所述的方法用于生產動物飼料，包括將磷脂酶與飼料物質和至少一種磷脂混合。
70.保藏的大腸桿菌DSM No.11299的分離的基本上純化的生物學培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在包括大量的非水合的磷含量的食用油中降低含有磷的成分的含量的方法,所述方法包括使用磷脂酶。本發(fā)明進一步涉及具有磷脂酶活性的酶,編碼具有磷脂酶活性的酶的克隆的DNA序列,涉及生產該酶的方法,和所述酶在許多工業(yè)應用中的用途。
文檔編號C13B20/00GK1245532SQ97181706
公開日2000年2月23日 申請日期1997年12月9日 優(yōu)先權日1996年12月9日
發(fā)明者伊勃·G·克勞森, 香坎特·A·帕特卡, 金·博爾奇, 托本·哈爾基爾, 馬丁·巴福德, 金·克勞森, 克勞斯·C·富格爾桑, 朗·戴布達爾 申請人:諾沃挪第克公司