專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)麥角硫因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
微生物轉(zhuǎn)化組氨酸生產(chǎn)麥角硫因的菌種與方法，屬于發(fā)酵與生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種篩選獲得的菌種，分類(lèi)命名為白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.),及對(duì)其培養(yǎng)發(fā)酵，并用于轉(zhuǎn)化組氨酸制備麥角硫因的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著人們對(duì)抗氧化劑研究的不斷深入，麥角硫因作為一種天然的生物活性物質(zhì)，開(kāi)始受到人們廣泛的關(guān)注，國(guó)外已有部分相關(guān)報(bào)道，而國(guó)內(nèi)對(duì)其研究還處于探索階段。麥角硫因?qū)W名為2-巰基-L-組氨酸三甲基內(nèi)鹽，最初是在1909年由Tanret C從麥角(寄生在禾本科植物黑麥上的一種真菌所成的菌核)中分離得到。麥角硫因具有多種生物學(xué)活性。(I)抗氧化活性直接清除活性氧；螯合各種二價(jià)金屬陽(yáng)離子；激活抗氧化酶；影響各種血紅素蛋白的氧化作用，如血紅素和肌紅蛋白。(2)麥角硫因能抑制過(guò)氧亞硝基陰離子介導(dǎo)的氨基酸氧化，如酪氨酸硝化，從而對(duì)炎癥的治療提供了可行性。麥角硫因作為無(wú)毒的天然抗氧化劑，在水溶液中不易被氧化，并能夠激發(fā)細(xì)胞的天然抗氧化防御系統(tǒng)，其不僅能夠螯合重金屬離子，而且能夠保護(hù)細(xì)胞，從而保護(hù)機(jī)體紅細(xì)胞免于自由基的損傷。此外麥防止輻射的功效，可以保護(hù)皮膚表皮細(xì)胞免受紫外線損傷。可以用于開(kāi)發(fā)戶(hù)外護(hù)膚產(chǎn)品及防護(hù)性的化妝品；同時(shí)眼內(nèi)局部含有高濃度的麥角硫因則可以降低白內(nèi)障的發(fā)病率。麥角硫因由于其具有顯著而獨(dú)特生物學(xué)功能的物質(zhì)，各國(guó)學(xué)者很早就對(duì)其應(yīng)用展開(kāi)了研究。但是由于其在自然界中含量較低，不能
由動(dòng)物機(jī)體自身合成，只能從食物中攝取，屬于稀有氨基酸，因此限制該產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。目前研究表明食用真菌中麥角硫因的含量較高，說(shuō)明食用真菌中含有生產(chǎn)轉(zhuǎn)化麥角硫因的酶。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.)具有轉(zhuǎn)化生產(chǎn)麥角硫因的能力。能夠轉(zhuǎn)化組氨酸生成麥角硫因，從而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出一種能夠有效生物轉(zhuǎn)化組氨酸為麥角硫因的菌種，并提供一種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成麥角硫因的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一株轉(zhuǎn)化組氨酸制備麥角硫因的菌種，其分類(lèi)命名為白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres. ) Sing.).
用所述的白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.)菌株轉(zhuǎn)化組氨酸制備麥角硫因，其轉(zhuǎn)化方法
A.菌株的培養(yǎng)(1)使用菌株白香蘑菌(Lepistacaespitosa (Bres. ) Sing.)；
(2)保藏培養(yǎng)基葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；
(3)種子培養(yǎng)基葡萄糖5-15g/L，蛋白胨 l-4g/L，尿素 l-5g/L, MgSO4. 7H20 0. l_3g/L，PH 7.0,去離子水配制；種子培養(yǎng)條件用250mL三角瓶裝30_80mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻、接種后于26-30度，150-220r/min搖床培養(yǎng)12_36h做為種子培養(yǎng)液；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5-15g/L，蛋白胨l_4g/L，尿素l-20g/L,MgSO4. 7H200. l_3g/L，PH 7. 0，去離子水配制；發(fā)酵條件用500mL三角瓶裝100-300mL培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，接種后于26-30度，150-220r/min搖床培養(yǎng)12_24h后添加I. 5g/L的組氨酸作為底物繼續(xù)培養(yǎng)12-24h。B.生物轉(zhuǎn)化
(1)將培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液進(jìn)一步處理得到的保菌體、凍干菌粉、透性化細(xì)胞或固定化細(xì)胞作為細(xì)胞生物催化劑；
(2)將組氨酸按照0.1% -75%的比例配制成水溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物反應(yīng)液；
(3)將細(xì)胞生物催化劑，加入底物反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；生物轉(zhuǎn)化條件為底物組氨酸濃度為0. 1% -75%，細(xì)胞生物催化劑以游離細(xì)胞計(jì)對(duì)底物溶液的用量為10-200g/L ;初始pH 5. 0-10. 0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為20-45°C，150-220r/min搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間0. 5_48h。C.提純與精制將轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液用DOOl型強(qiáng)酸性苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，去離子水洗脫，再經(jīng)樹(shù)脂D301純化，去離子水洗脫，收集富含麥角硫因組分，濃縮，干燥后得到麥角硫因的提取物。


圖I為本發(fā)明的麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖譜。
圖2為本發(fā)明的一種含有50%麥角硫因提取物的高效液相色譜圖譜具體實(shí)施例一
檢測(cè)麥角硫因的方法利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈IOmmo 1/L醋酸銨(80 : 20)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,流速為I. Oml/min,色譜柱:氨基柱(250mmX4. 6mm)。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的配制稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，采用純凈水為溶劑，配制成溶液。進(jìn)樣量為10ul。色譜圖詳見(jiàn)圖I。具體實(shí)施例二
用白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.)進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵,斜面培養(yǎng)基為葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖5g/L，蛋白胨lg/L，尿素lg/L，MgSO4. 7H200. lg/L, PH 7.0,去離子水配制；種子培養(yǎng)條件用250mL三角瓶裝30mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻、接種后于26度，150r/min搖床培養(yǎng)12h做為種子培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5g/L,蛋白胨lg/L,尿素lg/L, MgSO4. 7H20 0. lg/L, PH 7. 0,去離子水配制；發(fā)酵條件用500mL三角瓶裝IOOmL培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，接種后于26度，150r/min搖床培養(yǎng)12h后添加I. 5g/L的組氨酸作為底物繼續(xù)培養(yǎng)12h。生物轉(zhuǎn)化將培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液進(jìn)一步處理得到的保菌體、凍干菌粉、透性化細(xì)胞或固定化細(xì)胞作為細(xì)胞生物催化劑；將組氨酸按照0. I %的比例配制成水溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物反應(yīng)液；將細(xì)胞生物催化劑，加入底物反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；生物轉(zhuǎn)化條件為底物組氨酸濃度為0. 1% -%，細(xì)胞生物催化劑以游離細(xì)胞計(jì)對(duì)底物溶液的用量為10g/L ;初始pH5. 0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為20°C，180r/min搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間0. 5h。提純與精制將轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液用DOOl型強(qiáng)酸性苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，去離子水洗脫，再經(jīng)樹(shù)脂D301純化，去離子水洗脫，收集富含麥角硫因組分，濃縮，干燥后得到麥角硫因的提取物，轉(zhuǎn)化率達(dá)到51%。具體實(shí)施例二
使用菌株白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.)進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵,保藏培養(yǎng)基葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，尿素5g/L，MgSO4. 7H203g/L，PH7. 0，去離子水配制；種子培養(yǎng)條件用250mL三角瓶裝80mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方·法滅菌、冷卻、接種后于30度，220r/min搖床培養(yǎng)36h做為種子培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖15g/L,蛋白胨4g/L,尿素20g/L, MgSO4. 7H20 3g/L, PH 7. 0,去離子水配制；發(fā)酵條件用500mL三角瓶裝300mL培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，接種后于30度，220r/min搖床培養(yǎng)24h后添加I. 5g/L的組氨酸作為底物繼續(xù)培養(yǎng)24h。生物轉(zhuǎn)化將培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液進(jìn)一步處理得到的保菌體、凍照75%的比例配制成水溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物反應(yīng)液；將細(xì)胞生物催化劑，加入底物反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；生物轉(zhuǎn)化條件為底物組氨酸濃度為75%，細(xì)胞生物催化劑以游離細(xì)胞計(jì)對(duì)底物溶液的用量為200g/L;初始pH 10.0，，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為45°C，220r/min搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間48h。提純與精制將轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液用DOOl型強(qiáng)酸性苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，去離子水洗脫，再經(jīng)樹(shù)脂D301純化，去離子水洗脫，收集富含麥角硫因組分，濃縮，干燥后得到麥角硫因的提取物，轉(zhuǎn)化率為56%。具體實(shí)施例三
生物轉(zhuǎn)化使用菌株為白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.);保藏培養(yǎng)基為葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，尿素2g/L，MgSO4. 7H200. 2g/L，PH7. 0，去離子水配制；種子培養(yǎng)條件用250mL三角瓶裝60mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻、接種后于28度，180r/min搖床培養(yǎng)24h做為種子培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖10g/L,蛋白胨2g/L,尿素10g/L, MgSO4. 7H20 0. 2g/L, PH 7.0,去離子水配制；發(fā)酵條件用500mL三角瓶裝200mL培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，接種后于28度，180r/min搖床培養(yǎng)24h后添加I. 5g/L的組氨酸作為底物繼續(xù)培養(yǎng)24h。生物轉(zhuǎn)化將培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液進(jìn)一步處理得到的保菌體、凍干菌粉、透性化細(xì)胞或固定化細(xì)胞作為細(xì)胞生物催化劑；將組氨酸按照50%的比例配制成水溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物反應(yīng)液；將細(xì)胞生物催化劑，加入底物反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；生物轉(zhuǎn)化條件為底物組氨酸濃度為50%，細(xì)胞生物催化劑以游離細(xì)胞計(jì)對(duì)底物溶液的用量為100g/L ;初始PH6. 0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為36°C，180r/min搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間48h。提純與精制將轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液用D001型強(qiáng)酸性苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，去離子水洗脫，再經(jīng)樹(shù)脂D301純化，去離子水洗脫，收集富含麥角硫因組分，濃縮，干燥后得到麥角硫因的提取物，轉(zhuǎn)化率為80%。具體實(shí)施例四
生物轉(zhuǎn)化使用菌株為白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.);保藏培養(yǎng)基為葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，蛋白胨3g/L，尿素4g/L，MgSO4. 7H20 0. 5g/L，PH 7. 0，去離子水配制；種子培養(yǎng)條件用250mL三角瓶裝50mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻、接種后于28度，200r/min搖床培養(yǎng)36h做為種子培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖10g/L,蛋白胨4g/L,尿素15g/L, MgSO4. 7H20 0. 53g/L, PH 7.0,去離子水配制；發(fā)酵條件用500mL三角瓶裝300mL培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，接種后于30度，220r/min搖床培養(yǎng)24h后添加I. 5g/L的組氨酸作為底物繼續(xù)培養(yǎng)24h。生物轉(zhuǎn)化過(guò)程即將培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液進(jìn)一步處理得到的保菌體、凍干菌粉、透性化細(xì)胞或固定化細(xì)胞作為細(xì)胞生物催化劑；將組氨酸按照50%的比例配制成水溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物反應(yīng)液；將細(xì)胞生物催化劑，加入底物反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；生物轉(zhuǎn)化條件為底物組氨酸濃度為50%，細(xì)胞生物催化劑以游離細(xì)胞計(jì)對(duì)底物溶液的用量為IOOg/L ;初始PH8. 0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為35°C，200r/min搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間36h。提純與精制將轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液用DOOl型強(qiáng)酸性苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行離子 交換，去離子水洗脫，再經(jīng)樹(shù)脂D301純化，去離子水洗脫，收集富含麥角硫因組分，濃縮，干燥后得到麥角硫因的提取物，轉(zhuǎn)化率為70%。
權(quán)利要求
1.一株轉(zhuǎn)化組氨酸制備麥角硫因的菌種，其分類(lèi)命名為白香蘑菌(Lepistacaespitosa (Bres. ) Sing.). 用權(quán)力要求I所述的白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.)菌株轉(zhuǎn)化組氨酸制備麥角硫因，其特征是 菌株的培養(yǎng) 出發(fā)菌株白香蘑菌(Lepista caespitosa (Bres. ) Sing.)； 保藏培養(yǎng)基葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基； 種子培養(yǎng)基葡萄糖 5-15g/L，蛋白胨 l-4g/L，尿素 l_5g/L，MgSO4. 7H20 0. l_3g/L，PH.7.0，去離子水配制； 種子培養(yǎng)條件用250mL三角瓶裝30-80mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻、接種后于26-30度，150-220r/min搖床培養(yǎng)12_36h做為種子培養(yǎng)液； 發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5-15g/L，蛋白胨l-4g/L，尿素l-20g/L，MgSO4. 7H20 0. l_3g/L，PH7. 0，去離于水配制； 發(fā)酵條件用500mL三角瓶裝100-300mL培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，接種后于.26-30度，150-220r/min搖床培養(yǎng)12_24h后添加I. 5g/L的組氨酸作為底物繼續(xù)培養(yǎng).12-24h。
2.生物轉(zhuǎn)化 將培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液進(jìn)一步處理得到的保菌體、凍干菌粉、透性化細(xì)胞或固定化細(xì)胞作為細(xì)胞生物催化劑；將組氨酸按照0. 1% -75%的比例配制成水溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物反應(yīng)液；將細(xì)胞生物催化劑，加入底物反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；生物轉(zhuǎn)化條件為底物組氨酸濃度為0. 1% -75%，細(xì)胞生物催化劑以游離細(xì)胞計(jì)對(duì)底物溶液的用量為10-200g/L ;初始pH 5.0-10.0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為20-50°C，150-250r/min搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間.0. 5-48h ； 提純與精制將轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液用DOOl型強(qiáng)酸性苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，去離子水洗脫，再經(jīng)樹(shù)脂D301純化，去離子水洗脫，收集富含麥角硫因組分，濃縮，干燥后得到麥角硫因的提取物。
全文摘要
一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)麥角硫因的方法，屬于發(fā)酵與生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。本發(fā)明以組氨酸為轉(zhuǎn)化前體，白香蘑菌為轉(zhuǎn)化微生物，通過(guò)微生物培養(yǎng)，底物加入，生物轉(zhuǎn)化的步驟培養(yǎng)生產(chǎn)麥角硫因。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1)直接利用微生物的轉(zhuǎn)化作用生產(chǎn)麥角硫因，不需要化學(xué)試劑，既節(jié)省成本，又利于環(huán)境保護(hù)。2)微生物轉(zhuǎn)化的效率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，生成的麥角硫因，產(chǎn)率大于80％；3)工藝簡(jiǎn)單，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102978121SQ20111026139
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者劉成航, 劉岱琳, 李長(zhǎng)惠 申請(qǐng)人:天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司