專利名稱：雙鏈構(gòu)象多態(tài)性分析的制作方法
此項發(fā)明用于檢測DNA突變有關(guān)人類及其它物種的遺傳信息量已有了極大的增加，特別是人類基因組計劃進(jìn)展以來。所有現(xiàn)存基因的鑒別使得我們會有能力來鑒別與一些特異表型有關(guān)的突變。已有相當(dāng)數(shù)量的基因庫可讓我們?nèi)ヨb別與各種疾病有關(guān)的突變。我們僅需要考慮諸如囊性纖維變性、享廷頓氏病，β-地中海貧血病、鐮狀細(xì)胞性貧血病以及其它類似病。在一些例子中，如鐮狀細(xì)胞貧血病，存在著一個與疾病有關(guān)的共有的點突變。而在另一些例子中，如囊性纖維變性，則在貫穿有關(guān)的基因上存在著大量的與疾病有關(guān)的點突變。
許多情況下，人們希望知道的是在一個患者或其它物種中是否存在著點突變或是感興趣的特異的多態(tài)性。我們不僅僅對疾病本身感興趣，尤其感興趣的是在其它物種中，還有興趣于宿主是否具有一個特異的等位基因。
已有大量的技術(shù)用來檢測已知序列和靶序列的差別。
等位基因特異的寡核苷酸(ASO)檢測方法用于鑒別短的探針和靶DNA間存在的單核苷酸錯配或兩者間的微小差別。靶DNA通過凝膠電泳，最后轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。用一標(biāo)記的探針在雜交條件下與該膜的溫育；以檢測互補的存在與否。檢測依賴于嚴(yán)格遵循所需的雜交及洗滌條件，以便區(qū)分錯配及互補情況。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)已被運用于直接檢測序列的差異。一項稱為擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng)(ARMS)的技術(shù)即以觀察寡核苷酸不起PCR引物作用為基礎(chǔ)，而該寡核苷酸引物除3′-端與靶序列發(fā)生一個錯配外，其它部分和靶序列互補。因而，通過選擇合適的引物對和PCR反應(yīng)條件，可檢測出突變。換句話說，所選擇的引物導(dǎo)致正?；蛲蛔償U(kuò)增產(chǎn)物形成時，將在一個或其它序列中產(chǎn)生限制性位點。
單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)看來是利用非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)遷移率不同來檢測單堿基差別。將靶DNA變性之后，可用非變性凝膠來檢測單鏈DNA二級結(jié)構(gòu)的變化。
互補及發(fā)生錯配的DNA-DNA雜交產(chǎn)物在彼此不同的條件下變性。此已被應(yīng)用于變性梯度凝脈電泳(DGGE)中。DGGE凝膠中含有逐漸增加的變性劑，因而可使得互補及發(fā)生錯配的雙鏈DNA(ds DNA)分子在凝膠的不同部位遷移并變性。
除電泳技術(shù)之外，還有一些化學(xué)技術(shù)可用于檢測序列間的差異，化學(xué)修飾劑，如鋨酸(Osmium tetroxide)，羥胺(hydroxylamine)等可在DNA中發(fā)生錯配的部位產(chǎn)生裂口；核糖核酸酶可裂解DNARNA雜交鏈上發(fā)生錯配的位點；用它們處理后可通過PAGE方法分析。其它技術(shù)還有異源雙鏈分析和核苷酸序列分析。所有這些技術(shù)有一定的局限性，如需嚴(yán)格的條件，要作對照，使用方案復(fù)雜，一般方法學(xué)上的局限等。
檢測錯配的各項技術(shù)論文包括Dowton和Slangh，臨床化學(xué)(Clin.Chem)41785-794(1995)；Newton等，Nucl.Acids Res.172503-2516(1989)；核酸研究1989年第十七卷第2503-2516頁Haliassos Nacl.Acids Res.173606(1989)；核酸研究1989年第十七卷第3606頁。Orita，Proc.Natl.Acad Sci.USA 862766-2770(1989)；美國科學(xué)院院報1989年，第86卷第2766-2770頁Sarkar，Nucl.Acids Res.20871-878(1992)；核酸研究1992年，第二十卷第871-878頁Fischer和Lerman，Proc.Natl.Acad Sci.USA 801579-1583(1983)；美國科學(xué)院院報1983年，第八十卷第1579-1583頁Cotton，Proc.Natl.Acad Sci.USA 854397-4401(1988)；美國科學(xué)院院報1988年，第八十五卷第4397-4401頁Myers，Science 2301242-1246(1985)；科學(xué)1985年，第二百三十卷第1242-1246頁White，Genomics 12301-306(1992)。基因組1992年第十二卷第301-306頁提供了用于檢測靶序列和一已知序列間的發(fā)生一個或多個錯配的方法和組合物。該方法包括于不超過溫和的條件下雜交探針和長度少于300個堿基的靶序列。其中所用探針包括已知序列，一任意可檢測標(biāo)記及一交聯(lián)劑。在經(jīng)過足夠長時間的雜交以產(chǎn)生可檢測數(shù)量的雙鏈核酸后，改變介質(zhì)的條件以誘導(dǎo)雜交對間的交聯(lián)。然后樣品于變性條件下通過PAGE分離，從一已知標(biāo)準(zhǔn)可確定交聯(lián)到靶核酸上的標(biāo)記探針的遷移率。發(fā)生錯配的探針/靶對與互補的探針/靶對的遷移率是不同的。為進(jìn)一步確證，選擇較嚴(yán)格的雜交條件，發(fā)生錯配的序列對的雜交量與互補的雜交量是相當(dāng)?shù)牟煌摹Ｈ缟厦嫠龇椒訜岽藰悠?，發(fā)生交聯(lián)探針的數(shù)量與探針及靶序列間的錯配程度有關(guān)，錯配情況下，交聯(lián)的探針數(shù)量明顯地較少。
按本發(fā)明，關(guān)于檢測靶序列突變存在的條件具明顯增加的靈活性。
按本發(fā)明，所提供的探針用于檢測探針與靶序列間是否存在錯配的方法。發(fā)生錯配的原因可能是由于突變，等位基因變異、物種變異及交替剪接等因素引起的，通常單位點或多位點的錯配也可能是由插入、刪減，錯配對等引起。
一般說來，此方法將一具有已知序列，任選的可檢測標(biāo)記及交聯(lián)劑的探針與作為靶DNA主要部分或一復(fù)雜混合物成份的靶序列結(jié)合。靶序列以單鏈形式存在。探針和靶序列在不超過溫和的條件下雜交。在經(jīng)過足夠長時間以形成足夠量的雙鏈核酸后，改變條件以便發(fā)生交聯(lián)。交聯(lián)發(fā)生后，樣品通過凝膠電泳分離，此時發(fā)生錯配的雙鏈核酸的遷移率與互補雙鏈核酸的遷移率不同。通過比較探針-靶雙鏈復(fù)合物與一標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率即可檢測錯配的發(fā)生與否。
靶DNA可以是任意來源的，其平均大小約25-300核苷酸(nt)，更通常為50-250核苷酸，優(yōu)選地為以50-200核苷酸。DNA可來自于原核生物或真核生物，通常是真核生物。DNA可來自于宿主基因組，質(zhì)粒DNA，病毒DNA(該病毒可是天然的或作為不同來源DNA的載體)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，或類似物。靶DNA可以是一哺乳動物宿主的特異的等位基因，或是MHC等位基因，或是一編碼一種同工酶的序列，或是單細(xì)胞生物體的一個特異的基因或系或其它類似物。靶序列也可以是基因組DNA、cDNA，RNA，或類似物。
所需長度的核酸尤其可通過限制性酶切DNA，或利用引物及PCR等方法獲得。最好是，至少有約80mol％，通常至少約90mol％的靶序列具有相同的大小。用限制性酶切方法時，采用高頻內(nèi)切酶(frequently cuttingenzyme)(它們通常是帶有四個堿基共有序列的酶)，或進(jìn)行多種限制性酶切的方法(此時DNA會被徹底降解)。錯配一般發(fā)生于靶序列的內(nèi)部而不會位于降解樣品DNA的限制性內(nèi)切酶的酶切位點上。典型的有興趣的序列有鐮刀狀細(xì)胞貧血突變，與IDDM有關(guān)的MHC及與囊性纖維化，享廷頓氏病、β-地中海貧血，老年性癡呆病、各類癌癥(如那些是由癌基因，如ras，src，myc(等)的激活及(或)腫瘤抑制基因，如p53，RB等的失活引起的。)有關(guān)的突變。在一些病例中，如鐮狀細(xì)胞貧血病，有一個單堿基突變。在其他一些病例中，如囊性纖維化，則可檢測到多個位點的突變。通過選擇合適的限制性酶，可以知道一個預(yù)知大小的片段中存在有疑有隱匿的一個或多個突變的區(qū)域，因而可以通過探針的聯(lián)合來輕易地檢測基因中一個或多個突變的存在。
所用DNA需通過諸如分離蛋白質(zhì)、去除限制性酶抑制劑等純化。
探針一般約15-50個核苷酸，更通常為20-35個核苷酸。探針上具有1-5個交聯(lián)劑，更通常有1-3個交聯(lián)劑。所用交聯(lián)劑不能干擾雜交，它們一般位于胸腺嘧啶(T)，細(xì)胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)相對的位置上以便于交聯(lián)。許多官能度為具有光化學(xué)活性及可與幾乎所有的有機(jī)部分形成共價鍵。這些基團(tuán)包括卡賓(Carbenes)、氮賓(Nitrenes)，乙烯酮(Ketenes)，自由基(freeradicals)等。在本體溶液中可加入清除分子(scavenging molecule)，即非靶序列核酸，以使那些不與靶序列結(jié)合的探針和清除分子反應(yīng)，從而避免了探針與靶序列間的非特異性交聯(lián)的產(chǎn)生?？ㄙe(Carbenes)可通過重氮基化合物，如重氮酮鹽(diazonium salts)，磺酰基腙鹽(Sulfonylhydrazone salts)或diaziranes等獲得。乙烯酮(Ketenes)可從重氮酮(diazoketones)或去疊氮醌(quinonediazides)中獲得。氮賓(Nitrenes)來源于芳基疊氮化物(aryl azides)，?；B氮化物(acyl azides)和疊氮化合物(azido compounds)，更多的有關(guān)光裂解產(chǎn)生非分享電極對的信息，請參閱A.Schonberg的有機(jī)光化學(xué)制備(PreparativeOrganic Photochemistry)(Springer-Verlag，NY 1968)。
大多數(shù)情況下，所用于交聯(lián)的化合物是光激活化合物且可與堿基，特別是嘧啶形成共價鍵。這些化合物包括功能部分(functional moieties)，如香豆素及其替代品，呋喃駢香豆素(furocoumarin)，異香豆素(isocoumarin)，雙香豆素(bis-coumarin)，psoralen等，醌類物質(zhì)(quinones)，吡喃酮(pyrones)，α、β-不飽和酸(α、β-unsaturated acids)，酸衍生物(acid derivatives)(如酯，酮，及腈；疊氮化物等)。
另一類光激活反應(yīng)物為基于d區(qū)或f-區(qū)過渡金屬元素的有機(jī)金屬化合物。光激活可誘導(dǎo)金屬的配基的缺失以讓其取代物結(jié)合。合適的配基包括核苷酸。詳細(xì)的有關(guān)有機(jī)金屬化合物的光取代物的信息，請參閱G.F.Geoffrey和M.S.Wrighton合著的“有機(jī)金屬光化學(xué)(Organometallic Photochemistry)”一書。(Academic Press，San francisco，CA，1979)(科學(xué)出版社)。
結(jié)合到靶DNA上的探針同源序列通常具有天然的核苷酸。然而，在一些實施例中，磷酸-糖鏈會用非天然糖來修飾，或者其磷酸基團(tuán)中的氧原子被硫、碳、氮等所取代，或用其它一些修飾方法來修飾，其目的是為了提供綜合優(yōu)勢，檢測條件下的穩(wěn)定性，并抗酶促降解等。
探針可用任何便捷的方法獲得，最便捷的方法是在合成過程中的適當(dāng)位置逐步加入交聯(lián)修飾的核苷酸合成法。連接各種分子到核苷酸上的方法已有大量文獻(xiàn)報道，此處無需詳述。如可參閱EsksteinF等編的“寡核苷酸及分析，實踐方法(oligonueleotides and Analogues，A practial Approach)”一書(Oxford University Press，1991)(牛津大學(xué)出版社)。
相似地，標(biāo)記(如果有話)可以連接在任何便于連接的探針鏈上的核苷酸上，但不能干擾探針與靶序列的雜交。一般來說，標(biāo)記要小，通常為100～1000Da。標(biāo)記可以是任何可檢測的物質(zhì)，它可以直接檢測到或是結(jié)合到受體上，其同樣需標(biāo)記上一個易檢測的分子。通過電泳方法檢測的分子包括放射性標(biāo)記，(如32P35S等)，熒光物質(zhì)(如羅丹明(rhodamine)，熒光素fluorescein等)，受體的配基(如用于鏈霉抗生物素蛋白的生物素，用于抗地高辛的地高辛配體等)，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)及類似物?；蛘?，當(dāng)DNA在分離前后或分離過程中已用諸如溴乙錠，乙錠二聚體，噻唑橙(thiazole orange)、噻唑藍(lán)(thiazoleblue)及它們的二聚體等染色，就不必使用上述的標(biāo)記了。如果用PCR方法，則以標(biāo)記引物來替代標(biāo)記探針，用引物來進(jìn)行檢測。如果利用配體的話，受體可用任何可直接檢測的標(biāo)記來標(biāo)記。
此方法通過探針與靶DNA的結(jié)合進(jìn)行。測定的靶DNA的用量一般約10-20～10-8摩爾(moles)，更通常為1017～10-10摩爾。所用探針的量與測定的靶核酸量相當(dāng)或過量，但一般不超過靶DNA用量的109倍，更通常認(rèn)為不能超過107倍。雜交介質(zhì)使用溫和到低的嚴(yán)格性，以確保所有靶核酸都發(fā)生交聯(lián)。此嚴(yán)格性一般相當(dāng)于溫度為25-70℃(通常使用40-70℃，更經(jīng)常用30-50℃)，鈉離子含量為0.05-1.5M(更通常為具0.25-1M鈉離子或0-20％甲酰胺)。當(dāng)為RNA時，異硫氰酸胍的量應(yīng)加至0.1-6M。除甲酰胺外，其它變性劑還有尿素，二甲基亞砜(DMSO)。所用雜交條件為可提供探針和靶序列間無論是錯配或配對時都達(dá)到最大數(shù)量的雜交。雜交所用時間應(yīng)足夠長，以便形成可檢測數(shù)量的雙鏈核酸，這取決于雜交條件以及所用標(biāo)記檢測時的敏感性。時間一般至少為五分鐘，但不能超過六小時，更通常在十分鐘到一小時之間。
雜交發(fā)生后，含探針的雙鏈核酸將發(fā)生交聯(lián)。使用光的波長應(yīng)等于或大于300nm，以避免核酸發(fā)生自然交聯(lián)。一般來說，光波長應(yīng)在300-400nm范圍，這可通過一連接有Pyrex膜的光源獲得。當(dāng)使用化學(xué)激活方法時，由于光裂解激活更方便而成為備選的方法。照射時間一般約1分鐘到兩小時，更通常約五分鐘到一小時，這取決于樣品的大小，照射光源強(qiáng)度以及所需產(chǎn)物的量等。必要時，可取一份樣品進(jìn)行電泳以確定是否已形成足夠量的交聯(lián)。
照射之后，樣品即通過加熱或加入指示染料(front-runingdye)，甘油，蔗糖，甲酰胺等處理以便上樣。這些技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)已眾所周知，這里不需再加詳述。
用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳分析，一般為5-23％的丙烯酰胺，丙烯酰胺與雙-單體的比例為10-30/1。采用變性條件以去除交聯(lián)核酸區(qū)域中所有非交聯(lián)核酸。可用其它的變性劑以代替尿素。典型的電泳緩沖液可選用如Tris-硼酸-EDTA。電泳可于有利于分離錯配序列和配對序列的條件下進(jìn)行。在其中一個泳道加入一個合適的配對或錯配的標(biāo)準(zhǔn)序列，就可將樣品的條帶與它們進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)序列與樣品序列的差別顯示出靶序列與標(biāo)準(zhǔn)序列是否相同。利用合適的標(biāo)記或?qū)δz進(jìn)行染色，就可檢查出靶序列和探針序列間是否發(fā)生了錯配。
如需更進(jìn)一步的確證，可結(jié)合ASO技術(shù)來檢測雙鏈形成的程度。然而，所供交聯(lián)會顯著降低所運用條件的嚴(yán)格性。在這個過程中，溫度一般為50-70℃，鈉離子濃度約為50-500mM，更通常約100-400mM。對每個靶序列和探針而言，可優(yōu)化所用條件使得錯配序列和配對序列間形成雙鏈的程度達(dá)到最大的差別。最好，交聯(lián)配對的序列量和交聯(lián)非配對序列量間至少有大約兩倍比率(通常為至少約五倍比率)。在此過程中，使用較嚴(yán)格的條件。要不然，此條件實際上將與遷移率差異的條件相似。交聯(lián)DNA的量可通過測定與配對標(biāo)準(zhǔn)序列、探針序列和靶序列有關(guān)條帶的信號而方便地確定。如果信號明顯較弱，說明序列發(fā)生了錯配。如果信號與標(biāo)準(zhǔn)序列信號相同，說明序列是配對的。
為了用戶的方便，提供了試劑盒。試劑盒中包括一至多個(通常為兩個或以上)的探針，尤其是一對探針，其中一個探針與序列互補，稱之為“野生型”序列，另一個探針稱之為“突變”序列。然而，應(yīng)知道的是這些稱謂是隨機(jī)的，因為許多情況下，人們只想知道靶序列與探針序列是否相同，而不應(yīng)形成這樣的概念即一個序列是普通的或野生型的，另一個序列是非普通的或突變的。舉個例子，如人們想知道兩個MHC等位基因中哪一個存在著一個或兩個錯配的差異。探針對之間一般不超過五個，更通常不超過三個的差別。基于靶序列，可能存在著大多數(shù)的探針，尤其是探針對(通常不超過約十二對)，靶序列中具有許多的潛在的突變，它們分布于整個基因上。試劑盒中還有一些輔助物，如染料，標(biāo)記的抗體(其中的配體作為標(biāo)記)，PCR方法中用的標(biāo)記的引物等。
下面的實施例為示范而不是限制的目的而提供。
實施例實施例1利用(A)等位基因特異的雜交及交聯(lián)和(B)DSCP分析方法檢測單個堿基錯配。
具人乳頭瘤病毒16型的E6基因第374-403核苷酸序列的寡核苷酸(Oligo#1)用DNA合成方法中的亞磷酰胺方法合成，在其5′-端用32P標(biāo)記。同時制備與Oligo#1除第388位以A替代G外，其余序列相同的寡核苷酸(Oligo#2)，同樣用32P標(biāo)記。
Oligo#15′-CAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTA-3′Oligo#25′-CAATACAACAAACCATTGTGTGATTTGTTA-3′準(zhǔn)備一具有光激活交聯(lián)基團(tuán)，3-氧代(7-香豆素基)甘油(序列中以X為記號)的長20-鏈節(jié)(mer)的DNA探針(Oligo#3)。此探針的DNA序列與Oligo#1序列完全互補，其亦可與Oligo#2雜交形成雙鏈，但在形成的雙鏈中具有一個A/C錯配對。
Oligo#3 3′-TTGTTTGGCAACACACTAXA-5′Oligo#1/#3雙鏈5′-CAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTA-3′3′-TTGTTTGGCAACACACTAXA-5′
Oligo#2/#3雙鏈5′-CAATACAACAAACCATTGTGRGATTTGTTA-3′3′-TTGTTTGGCAACACACTAXA-5′20pmole的Oligo#3在具有2pmole量的用32P進(jìn)行5′-端標(biāo)記的Oligo#1或Oligo#2的0.15mL樣品中溫育，溫度和NaCl濃度總結(jié)如下
溫育20分鐘后，溶液置于UV-A波長的光下照射四十五分鐘。在照射處理結(jié)束前，取十分之一體積(0.015ml)樣品，和等體積的甲酰胺-溴酚藍(lán)染料混合，70℃加熱三分鐘。將樣品于冰上冷卻，然后加樣于含有7M尿素的15％聚丙烯酰胺凝膠(19∶1的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺)中，300V下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底端。取下凝膠，蓋上X-光膠片，于-80℃過夜。
方法1等位基因特異的雜交和交聯(lián)通過在45-55℃的雜交溫度下及15-300mM的NaCl濃度范圍中的實驗，可以確定互補的寡核苷酸#/1和#3間形成顯著交聯(lián)的條件，而發(fā)生錯配的寡核苷酸#2和#3在此條件則不發(fā)生顯著交聯(lián)。為確定錯配鑒別的最佳條件，將放射性帶從膠上切除，用閃爍計數(shù)儀定量并確定交聯(lián)產(chǎn)物的百分得率(相對于不反應(yīng)的32P標(biāo)記的寡核苷酸)。結(jié)果顯示如下
從上表中的數(shù)據(jù)可以確定區(qū)別互補和錯配雙鏈的最佳條件是樣品9和樣品10(55℃，150mM NaCl)；在此條件下，互補寡核苷酸對可產(chǎn)生較錯配寡核苷酸多十三倍量的交聯(lián)產(chǎn)物(39％比3％)。
方法2DSCP分析(雙鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)分析在最低嚴(yán)格的條件(45℃，300mM NaCl)下的樣品3和樣品4的放射性強(qiáng)度，可清楚地顯示出發(fā)生錯配的寡核苷酸#2和#3間形成的交聯(lián)產(chǎn)物在凝膠上的遷移速率慢于互補的寡核苷酸#1和#3間形成的交聯(lián)產(chǎn)物的遷移速率(DSCP效應(yīng))。
從此項實驗的結(jié)果來看，DSCP方法較更傳統(tǒng)的利用雜交條件檢測單個堿基錯配的方法具有兩個優(yōu)點1.DSCP方法簡單，無需仔細(xì)地優(yōu)化雜交條件來區(qū)別錯配序列和配對序列。DSCP方法使用非嚴(yán)格雜交條件。
2.通過非嚴(yán)格條件，交聯(lián)得率及其檢測信號顯示強(qiáng)于嚴(yán)格條件下的雜交產(chǎn)物；在用于DSCP分析方法的條件(45℃，300mM NaCl)下，互補的寡核苷酸1#和#3間反應(yīng)形成的交聯(lián)產(chǎn)物得率為49％，而在嚴(yán)格雜交條件(55℃，150mM NaCl)下產(chǎn)生最佳錯配區(qū)別時的交聯(lián)效率為39％。因而DSCP方法增強(qiáng)了26％的信號。
實施例2利用DSCP分析方法檢測正常(βA)及鐮狀細(xì)胞(βS)的β-球蛋白等位基因兩個長為56堿基的具有正常人β-球蛋白基因(βA-靶)或鐮狀細(xì)胞β-球蛋白基因(βS-靶)的一部分序列的寡核苷酸用DNA合成中的亞磷酰胺法合成，并在它們的5′-端用32P標(biāo)記。βS-球蛋白靶序列與βA靶序列的不同之處在于以一個T取代A，從而在鐮狀細(xì)胞的β-球蛋白中以纈氨酸代替了谷氨酸。
βA-靶序列5′-TGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGAT-3′βS-靶序列5′-TGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGAT-3′合成兩個與βA-靶序列或βS-靶序列互補的探針(βA-探針和βS-探針)。這兩個探針均用光激活交聯(lián)基團(tuán)3-氧代-(7-香豆素基)-甘油(序列中以X為記號)修飾。
βA-探針3′-TGAGGACTCCTCTTCAXA-5′βS-探針3′-TGAGGACACCTCTTCAXA-5′雜交和交聯(lián)實驗表明可用這兩個β-球蛋白探針的DSCP分析來檢測和辨別以單獨形式存在的β-球蛋的靶序列或以1∶1形式混合存在(如在異源個體中)。實驗結(jié)果總結(jié)如下:
每個0.05ml樣品中含有10pmole相應(yīng)的探針和0.2pmole32P標(biāo)記的靶序列(樣品7和樣品8中含有0.2pmole的每種靶分子)。溶液中的NaCl濃度為0.75M。
在35℃下雜交二十分鐘，樣品用UV-A光源照射六十分鐘。取出十分之一體積(0.010ml)樣品，與等體積甲酰胺-溴酚藍(lán)染料混合物混合后，70℃加熱三分鐘，然后置于冰上冷卻，將此處理樣品加于具7M尿素的10％聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺/雙丙烯酰胺＝19∶1)上，300V電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部。取下膠塊，蓋上X-光膠片，-80℃下過夜。
此實驗數(shù)據(jù)顯示DSCP分析可通過用兩個交聯(lián)修飾的探針的任一來檢測和區(qū)分此兩個β-球蛋白的等位位點。通過完全互補的βA-探針和βA-靶序列(樣品3)及βS-探針和βS-靶序列(樣品5)間反應(yīng)形成的主要交聯(lián)產(chǎn)構(gòu)在凝膠上的遷移率明顯快于樣品4和樣品6中錯配探針和靶序列間形成的交聯(lián)產(chǎn)物的遷移率。進(jìn)一步分析，βA-靶序列和βS-靶序列同時存在下(樣品7和樣品8)的反應(yīng)結(jié)果，表明這兩個探針可同時檢測及區(qū)分此兩等位基因。這個結(jié)果是臨床相關(guān)的，因為具鐮狀細(xì)胞貧血病的個體的DNA中同時具有βA-及βS-等位基因。
從以上的結(jié)果證明，提供了簡便精確的容易檢測單個堿基發(fā)生的錯配的方法。其方法學(xué)簡便，方法快速，也不會因為條件控制的細(xì)微改變而產(chǎn)生錯誤結(jié)果。
所有本說明書中所提及的出版物及專利申請均以參考文獻(xiàn)并入本發(fā)明，如同每一個所提及的出版物及專利申請均被具體地和分別地評述而以參考文獻(xiàn)并入本發(fā)明。
此項發(fā)明已被全面闡述，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說明顯的是可進(jìn)行不脫離附加的權(quán)利要求的范圍和精神的變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種檢測核酸探針和靶核酸間至少一個錯配的存在與否的方法，其中所說的探針與靶的序列間有不超過五個錯配的差異，該探針包括已知序列和光激活交聯(lián)劑，其中所說的探針序列在與該靶序列的雜交時，該探針序列和靶序列間通過光激活作用形成共價鍵，所說方法包括在一雜交介質(zhì)中，于溫和的雜交條件以雜交足夠的時間結(jié)合探針序列和包括靶序列的核酸樣品以使該探針和靶序列雜交；照射其中所說的雜交介質(zhì)以使該探針和其雜交的靶序列間形成交聯(lián)以形成交聯(lián)的雙鏈核酸；通過變性電泳分離雜交介質(zhì)中的核酸并比較該交聯(lián)雙鏈核酸和已知的發(fā)生錯配或互補的交聯(lián)雙鏈核酸標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率，以確定至少一個錯配的存在與否。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說探針用一可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說樣品用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，該樣品核酸用一可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5.一種檢測核酸探針和靶核酸間至少一個錯配存在與否的方法，其中所說探針和靶序列間有不超過五個的錯配的差異，其中所說的靶序列包括長約25-300個核苷酸的核酸分子，探針序列包括已知的長15-50個核苷酸的序列和光激活交聯(lián)劑，該探針序列與靶序列進(jìn)行雜交時，通過光激活作用在該靶序列和探針序列間形成一共價鍵。所說方法包括在雜交介質(zhì)中，使探針與含有所說的靶序列的核酸樣品在溫和的雜交條件下結(jié)合足夠長時間使該靶序列和探針序列雜交；在約300-400nm的波長范圍內(nèi)照射所說雜交介質(zhì)，使該探針和其雜交的靶序列間形成交聯(lián)以形成交聯(lián)雙鏈核酸；通過變性電泳分離所說雜質(zhì)中的核酸并比較該交聯(lián)雙鏈核酸和已知的發(fā)生錯配或互補的交聯(lián)雙鏈核酸標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率，可確定至少一個錯配的存在與否。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說樣品用限制性酶切降解基因組DNA獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說樣品通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備而該樣品核酸用一可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說探針用可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說的電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
10.一種檢測核酸探針和靶核酸間至少一個錯配存在與否的方法，其中所說探針和靶序列間有不超過五個的錯配的差異，其中所說靶序列包括長約25-300個核苷酸的核酸分子，所說探針序列為已知的長15-50個核苷酸的序列和光激活交聯(lián)劑，該探針序列與靶序列進(jìn)行雜交時，通過光激活作用在該探針序列和靶序列間形成一共價鍵。所說方法包括在一雜交介質(zhì)中，使探針和含有該靶序列的核酸樣品在溫和的雜交條件下結(jié)合足夠長時間以使該靶序列和探針發(fā)生雜交，此條件相當(dāng)于25-70℃下，0.1-1.5M NaCl；用約300-400nm波長的光照射該雜交介質(zhì)，使該探針和其雜交的靶序列間形成交聯(lián)以形成交鏈的雙鏈核酸；利用變性膠電泳分離該雜交介質(zhì)中的核酸并比較該交聯(lián)雙鏈核酸和已知的錯配或互補的交聯(lián)雙鏈核酸標(biāo)準(zhǔn)的遷移率，以確定至少一個錯配的存在與否。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所說交聯(lián)劑包含有一個香豆素基團(tuán)。
12.一種檢測核酸探針和靶核酸間至少一個錯配存在與否的方法，其中所說探針序列和靶序列間有不超過五個的錯配差異，該靶序列包括長約25-300個核苷酸的核酸分子，探針序列為已知的長15-50個核苷酸的序列，并包含有光激活交聯(lián)劑，該探針序列和靶序列進(jìn)行雜交時，通過光激活作用在探針序列和靶序列間形成一共價鍵，所說方法包括在一雜交介質(zhì)中，使探針和含有該靶序列的核酸樣品在高度嚴(yán)格的雜交條件下雜交足夠長時間以使靶序列和探針序列發(fā)生雜交，與靶序列互補的探針將產(chǎn)生至少約大于兩倍量于發(fā)生一個錯配的探針的雜交量；用300-400nm波長的光照射該雜交介質(zhì)，使探針和其雜交的靶序列間形成交聯(lián)以形成交聯(lián)雙鏈核酸；利用變性膠電泳分離雜交介質(zhì)中的核酸并確定該交聯(lián)雙鏈核酸的量，而該交聯(lián)雙鏈核酸的量與探針及其靶序列間錯配的有無有關(guān)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說高度嚴(yán)格的雜交條件至少相當(dāng)于40-70℃范圍的溫度，0.05-0.5M的鈉離子濃度。
14.一種含兩種探針的試劑盒，特征是由15-50個核苷酸組成，該每一探針與一光激活交聯(lián)劑相連，每個探針與其它探針間有不超過三個的錯配，且均為天然產(chǎn)生的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所說光激活交聯(lián)劑包含有香豆素基團(tuán)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所說天然序列是彼此相關(guān)的，其中一個是另一個的突變。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所說天然序列是彼此相關(guān)的，其中一個是另一個的等位基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所說探針用一可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所說的每個探針帶有許多的交聯(lián)劑。
全文摘要
雙鏈構(gòu)象多態(tài)性分析是通過將一個包括交聯(lián)劑和任選的標(biāo)記在內(nèi)的探針和具有靶序列的樣品結(jié)合,而該靶序列對探針序列完全互補或有一至幾個錯配。在溫和或較低嚴(yán)格的條件下雜交足夠的時間,輻照處理雜交產(chǎn)物以誘導(dǎo)通過交聯(lián)劑的交聯(lián)的發(fā)生,然后用變性膠電泳分析樣品,其遷移率與探針和靶序列的互補程度有關(guān)。為進(jìn)一步確證,在第二個實驗中,將探針和樣品在(嚴(yán)格)的條件下結(jié)合,可見到探針/靶序列間發(fā)生錯配時形成的交聯(lián)數(shù)量明顯少于完全互補時的交聯(lián)數(shù)量。交聯(lián)后,可用凝膠電泳分離樣品,并確定交聯(lián)的核酸數(shù)量。
文檔編號C12P19/00GK1207137SQ96199509
公開日1999年2月3日 申請日期1996年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月1日
發(fā)明者邁克爾·伍德, 魯埃爾·范阿塔, 戴維·阿爾巴格利 申請人:納克斯科公司