專利名稱：子宮內(nèi)膜功能或相關(guān)功能的改善的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明特別涉及改變哺乳動(dòng)物子宮內(nèi)膜組織之一種或多種特性的方法。
發(fā)明的背景子宮內(nèi)膜生理學(xué)胚脂逐漸植生于哺乳動(dòng)物子宮中需要兩個(gè)主要過程首先，準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜以使之對(duì)胚泡的存在有反應(yīng)，然后胚泡即可植入并通過胎盤形成而獲得營養(yǎng)支持；其次，改變子宮肌層活性使之一定處于靜止?fàn)顟B(tài)，從而允許胚泡逐漸定居在子宮腔內(nèi)而沒有被排出的危險(xiǎn)。這兩個(gè)過程都受到妊娠激素作用的控制，其中特別重要的是雌激素和孕酮。這些類固醇激素通過其定位于靶細(xì)胞核中的受體作用于子宮內(nèi)膜和子宮肌層。一旦被激活，類固醇一核受體復(fù)合物即與DNA內(nèi)的特定區(qū)域相互作用，以刺激、阻遏或去阻遏編碼蛋白質(zhì)及肽如酶或生長因子的基團(tuán)。
借助一系列生物化學(xué)和生物物理學(xué)改變的級(jí)聯(lián)過程原始胚胎植入。粘附分子(例如CAM 105)在胚泡附著于子宮壁上的早期階段即已卷入了這一過程。此后，胚泡和子宮內(nèi)膜采取各種策略以改善胎兒和母體組織間的密切聯(lián)系。在有蹄動(dòng)物中，形成胚泡之最外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移到它們繼后與之融合的子宮上皮中。細(xì)胞遷移是在婦女子宮中發(fā)生的一個(gè)進(jìn)一步的步驟，因?yàn)樗粌H是發(fā)生遷移的離體或特異細(xì)胞類型，而且是滋生于子宮上皮細(xì)胞之間的大面積的滋養(yǎng)層細(xì)胞。為此目的，一些滋養(yǎng)層細(xì)胞融合在一起形成合胞體。該過程很迅速，并且胚胎在子宮上皮沒有太多明顯退化的情況下逐步植生于子宮組織中。在某些種屬動(dòng)物延遲了植入過程，以便等待可確保新生動(dòng)物在一年內(nèi)有利時(shí)間出生的環(huán)境預(yù)示信號(hào)，或者有鑒于如哺乳這樣的生理學(xué)因素，以便母親能在下一次懷孕確立之前使前一窩仔畜完成斷奶。
子宮為植入進(jìn)行的準(zhǔn)備是通過分泌卵巢激素來調(diào)節(jié)的。受精卵通過輸卵管的輸送必須是按照精確的時(shí)間程序進(jìn)行的，以使之能夠在發(fā)育的正確時(shí)間，并且在子宮處于能接受胚胎的適宜狀態(tài)時(shí)到達(dá)子宮內(nèi)。在大多數(shù)條件下子宮對(duì)胚胎是不友好的，而且事實(shí)上比身體的某些其他區(qū)域更不友好。在多數(shù)狀態(tài)下，子宮的上皮襯層阻止北養(yǎng)層細(xì)胞的附著和侵入，而只有在十分精確的體液狀態(tài)下這種抗性才得以緩和。
就小鼠和大鼠來說，由于未交配的動(dòng)物沒有形成以漸增量產(chǎn)生孕酮的正常分泌的基體，所以它們沒有完整的發(fā)情周期。如果在發(fā)情期交配，即當(dāng)卵泡(從中排出卵細(xì)胞)分泌高水平雌激素時(shí)交配，將代替破裂的卵泡而形成黃體，然后由之分泌增高濃度的孕酮，開始植入并繼續(xù)妊娠(時(shí)間長度21天)。如果發(fā)生未受孕交配，雖然出現(xiàn)相似過程，但黃體只持續(xù)存在大約11天并進(jìn)而終止假妊娠。
已十分深入地研究了小鼠的大鼠子宮內(nèi)膜中發(fā)生的細(xì)胞和生化改變，而且近年來關(guān)于婦女體內(nèi)這些方面的研究資料也已大為增加。在所有品種的哺乳動(dòng)物中，子宮內(nèi)膜都是由三種主要組織構(gòu)成的腔上皮、腺上皮和基質(zhì)。在這三種組織中，細(xì)胞增殖發(fā)生在不同的時(shí)間。腔細(xì)胞在由卵巢中卵泡產(chǎn)生的高水平雌激素影響下，恰于動(dòng)情期之前(動(dòng)情前期)增殖。到妊娠第1天(嚙合動(dòng)物交配日)，細(xì)胞停止分裂，但其后到第3天又出現(xiàn)雖然較小但很突然的第二次分裂。顆粒細(xì)胞增殖在第4天最活躍，然后減弱?；|(zhì)細(xì)胞在第4天前一直沒有增殖，但其后在孕酮的影響下，于第5天達(dá)到高度增殖。在婦女體內(nèi)有關(guān)這些預(yù)示植入過程的改變所知不多，但同小鼠和大鼠一樣，在卵泡期內(nèi)上皮細(xì)胞雖然是呈峰值增殖，而基質(zhì)細(xì)胞則在黃體期或分泌期呈峰值增殖。
有關(guān)子宮膜細(xì)胞增殖的目的尚未完全闡明，但據(jù)信是通過增加那些將發(fā)揮營養(yǎng)和分泌功能(腺上皮)及參與最早期胎盤形成(絨毛膜脫膜)過程的細(xì)胞數(shù)目，為植入而準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。作為成功地植入的先決條件，細(xì)胞有絲分裂可向著細(xì)胞分化的方向進(jìn)行，并因此在確立妊娠的早期過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。支持這種作用的證據(jù)是子宮內(nèi)膜產(chǎn)生生長因子(分裂素)、細(xì)胞因子和核致癌基團(tuán)。這些化合物中，許多都是在對(duì)通過其受體起作用的卵巢激素的反應(yīng)中，以逐增量產(chǎn)生的。
在生長因子中，同前特別關(guān)注的是表皮生長因子(EGF)、肝素結(jié)合的表皮生長因子(HBEGF)、雙調(diào)蛋白及胰島素結(jié)合的生長因子(IGF-1或IGF-II)。最近在小鼠中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已提供了其中至少一種生長因子，即雙調(diào)蛋白之局部(旁分泌)作用重要性的證據(jù)?？乖型?jiǎng)㏑U 486抑制了植入特異性的和孕酮調(diào)節(jié)的雙調(diào)蛋白基因，并由此導(dǎo)致植入不能進(jìn)行(Das等人，分子內(nèi)分泌學(xué)9，691-705，1995)。
在細(xì)胞因子中，又根據(jù)基因剔除實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白血病抑制因子(LIF)和集落刺激因子(CSF)(它們也是在植入時(shí)由小鼠子宮產(chǎn)生的)是必不可少的，證明除去這些因子是不能與植入和正常胎盤形成共容的(Stewart等人，自然359，76-79，1992；Pollard等人，發(fā)育生物學(xué)148，273-283，1991)。
在核致癌基因中，發(fā)現(xiàn)投用雌激素后在子宮中c-jun和c-fos水平(為基因轉(zhuǎn)錄的早期指標(biāo))增加，而且受到孕酮的抑制。
在植入時(shí)，各不同種哺乳動(dòng)物間的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入程度存在重要差異。在婦女體內(nèi)，早期滋養(yǎng)層是高度侵入性的，而豬則沒有侵入形式的植入，在整個(gè)三個(gè)月妊娠期間子宮內(nèi)膜上皮從未被破壞。兩者的植入失敗率分別達(dá)到60％和30％。這種高失敗率的原因很復(fù)雜，而且尚未完全弄清楚。在婦女中，約有半數(shù)是由于遺傳異常，但豬則如其他有蹄哺乳動(dòng)物一樣，雖植入失敗率也較高，但只有較小比例是因遺傳缺陷所致。
在婦女受精卵植入失敗后，如同正常月經(jīng)周期結(jié)束時(shí)一樣因孕酮分泌下降而引起出血；這種情況在大多數(shù)其他動(dòng)物中則沒有。月經(jīng)失調(diào)及植入異常是很常見的。此外，因系列激素治療，或與連續(xù)聯(lián)合激素替代治療或投用長效單一孕酮避孕藥結(jié)合引起的月經(jīng)出血，也是婦女健康不佳的重要原因。
這種出血的基本原因是目前許多有關(guān)生物化學(xué)(如前列腺素、酶、肽和蛋白質(zhì)、血管活性化合物如血小板活化因子PAF，以及血管內(nèi)皮生長因子VEGF)和細(xì)胞機(jī)制(例如細(xì)胞向產(chǎn)生免疫抑制化合物的子宮內(nèi)的遷移)研究的焦點(diǎn)。
目前對(duì)生殖過程的了解主要集中在控制類固醇激素產(chǎn)生和這些激素對(duì)其靶組織的作用上。盡管是與類固醇相互作用的，但已越來越多地看到旁分泌和自分泌因子是生殖功能的關(guān)鍵性介導(dǎo)物(Benton，1991細(xì)胞生物學(xué)的現(xiàn)行看法3，171-175；Rozengurt，1992細(xì)胞生物學(xué)的現(xiàn)行看法4，161-165；Tartalcovsky等人，1991發(fā)育生物學(xué)146，345-352；Robertson等人，1992免疫學(xué)的現(xiàn)行看法4，585-590；Smith，1994人類生殖9，936-946；和Tabibzadeh，1994人類生殖9，947-967)就這一點(diǎn)，一個(gè)最明確的例子見于卵巢切除的小鼠。在該模型中，子宮在對(duì)單劑雌二醇的反應(yīng)中經(jīng)歷顯著生長過程。而這種效應(yīng)可被抗TGFα抗體阻斷(TGF是“轉(zhuǎn)化生長因子”)，此提示雌激素在該組織中的促有緣分裂效應(yīng)是由TGFα介導(dǎo)的(Nelson等人，1992內(nèi)分泌學(xué)131，1657-1664)。
因此如科學(xué)中的藥物干預(yù)主要是建立在對(duì)子宮進(jìn)行類固醇/抗類固醇調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上(Yen & Jaffe，1991，見于“生殖內(nèi)分泌學(xué)”，Eds.Yen，Jaffe& Benton，Pub.WB Saunders，Philadelphia；Baird，1993英國醫(yī)學(xué)公報(bào)49，73-87)。盡管這一研究獲得了不容置疑的成功，但20年來在避孕技術(shù)上未取得開創(chuàng)性進(jìn)展，沒有確定改善植入的手段，在促進(jìn)胎盤生長和發(fā)育方面沒有取得進(jìn)展，而且沒有找到治療良性婦科疾病(月經(jīng)失調(diào)和子宮肌瘤)的新方法。
已發(fā)表了許多有關(guān)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)使用“基因轉(zhuǎn)移”方法改變某些組織中至少某些細(xì)胞之基因型的元素。特別是，已知可向接受體內(nèi)導(dǎo)入核酸序列，通過表達(dá)由所導(dǎo)入的核酸序列編碼的多肽來克服接受體的遺傳缺陷，從而試圖對(duì)人進(jìn)行“基因治療”。已進(jìn)行了基因治療試驗(yàn)，例如將DNA序列(預(yù)先摻入病毒載體內(nèi))導(dǎo)入囊性纖維化患者的呼吸道內(nèi)，以便改變患者呼吸道內(nèi)壁上至少某些上皮細(xì)胞的表型。迄今，還沒有公開發(fā)表過有關(guān)無論使用什么樣的適當(dāng)技術(shù)將DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物子宮內(nèi)膜中的嘗試。
發(fā)明的概要一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過將核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物個(gè)體生殖道的至少某些細(xì)胞中，以改變所說細(xì)胞的一種或多種特征的方法。
第二個(gè)方面，本發(fā)明提供含有核酸的，用于改變哺乳動(dòng)物個(gè)體生殖道之至少某些細(xì)胞的一種或多種特征的組合物。
第三個(gè)方面，本發(fā)明提供含有核酸的組合物在改變哺乳動(dòng)物個(gè)體生殖道之至少某些細(xì)胞的一種或多種特征中的應(yīng)用。
第四個(gè)方面，本發(fā)明提供含有核酸的組合物在制備用于改變哺乳動(dòng)物個(gè)體生殖道之至少某些細(xì)胞的一種或多種特征的物質(zhì)中的應(yīng)用。
第五個(gè)方面，本發(fā)明提供創(chuàng)造用于改變哺乳動(dòng)物個(gè)體生殖道之至少某些細(xì)胞的一種或多種特征的組合物的方法。
決不能將本發(fā)明簡單地看作是已知的， 當(dāng)應(yīng)用可囊性纖維化患者的肺時(shí)已至少獲得部分成功的基因治療技術(shù)的顯而易見的延伸。遺傳性基因功能失調(diào)不是所有已知子宮內(nèi)膜疾病的原因，所以不會(huì)激發(fā)本領(lǐng)域技術(shù)人員將基因治療技術(shù)應(yīng)用于子宮內(nèi)膜。此外，與肺上皮(其為復(fù)層的)相比，子宮內(nèi)膜上皮是屬于不同類型的(立方上皮，從體腔上皮衍化的)，因此不能推測(cè)其以類似方式起作用。再者，至少在靈長類動(dòng)物中，子宮內(nèi)膜上皮有周期性脫落，從而可能導(dǎo)致被轉(zhuǎn)化之細(xì)胞的丟失。最后，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)被導(dǎo)入的DNA沒有轉(zhuǎn)移到母體的器官中，也沒有轉(zhuǎn)移到胚胎的胎盤中，兩種情況可能都出現(xiàn)了并且已導(dǎo)致了實(shí)際操作上的困難。
一般是將核酸導(dǎo)入雌性哺乳動(dòng)物(較好是女人)體內(nèi)，特別是導(dǎo)入其子宮內(nèi)膜細(xì)胞中?？赏麑⒑怂釋?dǎo)入子宮內(nèi)膜的腺上皮中。這些核酸可編碼某種已由其中導(dǎo)入核酸的細(xì)胞天然合成的多肽，從而可通過基因劑量作用增加該多肽的表達(dá)水平?；蛘咴摲椒ㄒ嗫捎糜谡T導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)以前沒有在那些細(xì)胞中合成的多肽。例如，多肽可能是自然界不存在的“人工”重組多肽，例如包括兩種或多種不同蛋白質(zhì)之全部或部分功能區(qū)域的嵌合多肽。
核酸較好是DNA，但也可以試著導(dǎo)入RNA(有義鏈或反義鏈)。可以使用反義分子抑制或干擾多肽在導(dǎo)入了核酸的細(xì)胞中的表達(dá)。被導(dǎo)入的核酸序列可以是反義RNA，或者可以是指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)反義RNA合成的DNA序列。實(shí)現(xiàn)這種抑制作用的另一種方法是在細(xì)胞中導(dǎo)入指導(dǎo)核酶合成的序列，然后所說的核酶將特異性地切割合成那些試圖要抑制其表達(dá)的多肽所需的mRNA。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，投用核酸的時(shí)間(相對(duì)于生殖周期的不同階段)對(duì)核酸攝入的效率有很大影響。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一般說來，為了使所投用的核酸的攝入達(dá)到最佳程度，有必要在排卵后的時(shí)間并包括在血液內(nèi)孕酮水平處于峰值時(shí)按周期給藥。一般孕酮水平在一個(gè)大約與胚胎(如果存在于子宮中的話)逐漸植入的時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值。
因此，例如本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，所投用的DNA被小鼠子宮內(nèi)膜最大攝入發(fā)生于周期的第2-3天(將第一次檢測(cè)陰道栓的這一天定為第1天)。在人體中，排卵一般發(fā)生在周期的第14天，并且一般估計(jì)植入是發(fā)生在黃體中期(但對(duì)人來說很難定出準(zhǔn)確時(shí)間)。
可以以裸露形式，或者與其他物質(zhì)(如脂質(zhì)體)結(jié)合的形式投用核酸?？梢酝ㄟ^簡單的轉(zhuǎn)染方法(有或沒有脂質(zhì)體)將核酸導(dǎo)入接受體哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這種方法特別有效，而且不需將核酸序列預(yù)先導(dǎo)入病毒載體內(nèi)。不過，病毒載體也可能是適用的，特別是那些能以某些類型的細(xì)胞為靶目標(biāo)的病毒載體(如WO 93/20221中所公開的病毒載體)。
可將核酸作為構(gòu)建體(如質(zhì)粒、粘粒等)的一部分方便地導(dǎo)入細(xì)胞中，所說的構(gòu)建體應(yīng)包括可在哺乳動(dòng)物中工作的啟動(dòng)子，以例引起至少一部分被導(dǎo)入的核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以是組成型的，更好是可誘導(dǎo)的，從而得以對(duì)被導(dǎo)入之序列的表達(dá)進(jìn)行更大程度的控制。
在按照本發(fā)明完成的一個(gè)特定方法中，將核酸分子導(dǎo)入個(gè)別雌性哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，以便對(duì)個(gè)體的生育進(jìn)行向上或向下調(diào)節(jié)。本發(fā)明可特別用于提供使伴侶動(dòng)物(如貓和狗)避孕以阻止不需要的懷胎的方法。本發(fā)明的其他實(shí)施方案中提供了改善豬、牛、羊等家畜的生育力的方法。
較好通過陰道將核酸導(dǎo)入生殖道中，而不必使用侵害性外科手術(shù)。但必要時(shí)也可借助外科技術(shù)將核酸直接導(dǎo)入生殖道內(nèi)(如子宮內(nèi))。本發(fā)明提供了通過導(dǎo)入一種或多種很大數(shù)目的不同核酸序列來改變細(xì)胞的一種或多種特征的可能性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)入生殖道中的序列可指導(dǎo)細(xì)胞因子或生長因子之有效部分的表達(dá)(較好的高水平表達(dá)) (有效部分是指保留與整體特定聯(lián)系，例如與特異性配體等相結(jié)合之生物學(xué)活性的分子的那個(gè)部分)。這些可由被導(dǎo)入的序列表達(dá)的多肽可包括但不只限于白介素、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、肝素結(jié)合的表皮生長因子(HBEGF)、胰島素結(jié)合的生長因子I和II(IGF-1和IGF-II)、雙調(diào)蛋白、集落刺激因子(CSF)及腫瘤壞死因子(TNF)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，被導(dǎo)入的序列可指導(dǎo)細(xì)胞因子或生長因子拮抗劑，如IL-1受體拮抗劑之有效部分的表達(dá)。特別有利的是，拮抗劑可以是細(xì)胞因子或生長因子的可溶性受體。適當(dāng)?shù)睦影ㄏ铝幸蜃拥目扇苄允荏w；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)α、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGE)、白介素-6(IL-6)和VEGF。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，被導(dǎo)入的序列可指導(dǎo)具有免疫學(xué)作用之多肽的有效部分的表達(dá)。具體地說，多肽可具有免疫原活性，從而可用于刺激局部免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明可用于提供新的免疫方法。免疫原性多肽較好是來自粘膜病原體的抗原。依靠通用粘膜免疫系統(tǒng)，刺激抗體在生殖道中產(chǎn)生，可導(dǎo)致遠(yuǎn)端粘膜部位，如胃腸道、呼吸道、淚腺等部位相應(yīng)抗體的產(chǎn)生。但抗原較好是來源于侵染和/或移植于生殖道之病原體，例如可引起性傳播疾病的病原體的抗原。這類病原體的例子包括病毒如HIV、乳頭瘤病毒(如各種類型的HPV)、衣原體和細(xì)菌(如N.gonorrhoea)。或者，具有免疫學(xué)效應(yīng)的多肽也可以是免疫球蛋白或其有效部分(如Fab、Fv或scFv片段，或單鏈抗體)。免疫球蛋白或其有效部分可以是針對(duì)病原體(如上文提到的病原體)，或可以是針對(duì)某些其他抗原如類固醇或其他激素的。因此可在局部表達(dá)免疫球蛋白或其部分，以提供對(duì)抗疾病的保護(hù)作用或調(diào)節(jié)生育力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)入的序列可指導(dǎo)多肽或其有效部分的表達(dá)，其對(duì)月經(jīng)有一定影響。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)入的核酸可在生殖道細(xì)胞的表面上指導(dǎo)受體分子有效部分的表達(dá)。受體可以是細(xì)胞因子、類固醇激素或生長因子的受體(如EGF受體、TGFα受體、或VEGF受體)。許多受體是已知的，但因?yàn)槠渌Y(jié)合的配體是未知的，故被描述為“孤獨(dú)”受體。因?yàn)檫@些孤獨(dú)受體可為新的治療或預(yù)防化合物提供靶子，所以對(duì)醫(yī)藥工業(yè)是相當(dāng)有用的。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了鑒定多肽之生物學(xué)性質(zhì)的方法，其包括將被鑒定的多肽編碼序列導(dǎo)入哺乳動(dòng)物生殖道的細(xì)胞中，并估價(jià)所表達(dá)的多肽的作用。哺乳動(dòng)物較好是實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，如小鼠或大鼠。被定性的多肽通常是孤獨(dú)受體，并且一般對(duì)其特性的至少一部分的鑒定工作應(yīng)包括鑒定其配體?？偟卣f來，該方法將包括分析取自實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的組織學(xué)切片，并用多種已知技術(shù)中的任何一種進(jìn)行處理(如組織化學(xué)染色、原位雜交、免疫學(xué)染色等)。
因此本發(fā)明提供一種經(jīng)體內(nèi)直接基因轉(zhuǎn)移對(duì)子宮內(nèi)膜功能(以及生殖能力或生育力)進(jìn)行類固醇調(diào)節(jié)的新的替代性方法。為此目的，可設(shè)計(jì)基因構(gòu)建體用以特異性地調(diào)節(jié)細(xì)胞因子作用。可用多種方法實(shí)現(xiàn)這一目的。例如可使用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的反義構(gòu)建體或核酶阻斷轉(zhuǎn)錄和翻譯，以使產(chǎn)生分泌性細(xì)胞因子的細(xì)胞不能合成這種因子。另外，也可以用受體拮抗劑來阻斷分泌性因子的作用。可以清除天然存在的可溶性受體并中和生物活性配體，從而發(fā)揮競爭性受體拮抗劑的作用。另外還有天然受體拮抗劑，例如IL1Ra(白介素-1受體拮抗劑)。腹腔內(nèi)投用這種蛋白質(zhì)可阻斷小鼠體內(nèi)的胚泡植入(Simon et al.，1994，文獻(xiàn)如前所列)。
有相當(dāng)多的證據(jù)表明，由輸卵管和子宮上皮分泌的可溶性生長因子可直接通過胚胎上表達(dá)的受體發(fā)揮作用，控制哺乳動(dòng)物胚胎的植入前發(fā)育(Pampfer等人，1990，體外細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)26，944-948)。反過來，發(fā)育的胚胎又產(chǎn)生可以按自分泌方式，或者在子宮內(nèi)膜上起作用的生長因子，以影響其感受性。例如在小鼠體內(nèi)，正好在植入前，于第4天顯著地上調(diào)腺上皮中的LIF表達(dá)(來自母體組織)。LIF能夠作用于表達(dá)LIF受體(LIF-R)的植入前胚泡。母體表達(dá)LIF對(duì)于植入是至關(guān)重要的，因?yàn)樵贚IF剔除小鼠中雖然按相似過程進(jìn)行，但胚胎卻沒有植入，所以只以假妊娠過程結(jié)束。(Stewart等人，1992，文獻(xiàn)同前所述)。
本發(fā)明人現(xiàn)已將這一工作擴(kuò)展到人，并通過RT-PCR顯示人胚胎表達(dá)編碼LIF-R的mRNA，但不表達(dá)LIF本身。LIF通過與低親和性受體LIF-R結(jié)合而起作用。當(dāng)LIF/LIF-R復(fù)合物與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)輔助蛋白gp130相互作用時(shí)出現(xiàn)高親和性結(jié)合。人胚胎也含有編碼這種蛋白質(zhì)的mRNA(Sharkey等人，1995生殖生物學(xué)53，955-562)。本發(fā)明人也已證明人腺上皮中的LIF分泌受類固醇的調(diào)節(jié)，在黃體期(大約在預(yù)期的植入時(shí)間)為最大(Charnock-Jones等人，1994，文獻(xiàn)出處同前)。此外，已報(bào)導(dǎo)在體外給人的植入前胚胎投用LIF可改善發(fā)育狀況。這一證據(jù)有力地支持LIF在人胚胎植入中可能如其在小鼠中一樣重要這一觀點(diǎn)。很顯然，細(xì)胞因子可介導(dǎo)(以兩個(gè)方向)子宮腔中的胚胎與子宮內(nèi)膜間的重要訊息聯(lián)系。本發(fā)明的方法得以利用基因轉(zhuǎn)移來破壞或增進(jìn)這種聯(lián)系，產(chǎn)生新的避孕方法，或者相互地改善植入。
由于缺乏調(diào)節(jié)局部細(xì)胞因子/受體水平的有效方法，民以目前有關(guān)生殖功能的旁泌和自泌性調(diào)節(jié)的研究工作主要限于描述性分析。本申請(qǐng)中給出的證據(jù)表明，體外轉(zhuǎn)染子宮上皮細(xì)胞是可行的。這一方法得以實(shí)驗(yàn)操作子宮內(nèi)膜并提供新的治療策略。下文概述的使用報(bào)導(dǎo)基因完成的工作者在證明體內(nèi)子宮基因轉(zhuǎn)移的可實(shí)踐性。實(shí)踐中，使用了能夠改變子宮功能的基因(或其他DNA構(gòu)建體)。這些基因包括受體拮抗劑(如IL-1Ra，可溶性VEGF受體等)、天然或修飾的細(xì)胞因子及生長因子、蛋白酶抑制劑或類固醇受體和各種核酶的基因，以及反義構(gòu)建體。這一工作顯示，可在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移到子宮內(nèi)膜，并將在處理許多子宮內(nèi)膜(和胎盤)條件中找到其實(shí)用性，例如用于改善動(dòng)物和人的胚胎植入、破壞植入(即避孕)、子宮內(nèi)膜異位和月經(jīng)過多、增生及腺癌。
使用我們建立的方法獲得了下述的結(jié)果。這些結(jié)果證明可于體內(nèi)(小鼠體內(nèi))和體外將基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到子宮內(nèi)膜中，而且證明這些構(gòu)建體在轉(zhuǎn)錄上(和翻譯上)是有活性的。
現(xiàn)將參照附圖以闡述性實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。


圖1A和1B顯示用(A)指導(dǎo)β半乳糖苷酶報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的質(zhì)粒，或(B)缺少報(bào)導(dǎo)基因的相似質(zhì)粒轉(zhuǎn)化之小鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)切片的顯微照片。在胞質(zhì)內(nèi)可由強(qiáng)烈的深(藍(lán))染色清楚地顯示被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在切片B中則沒有；圖2是由如圖1A中所述的同樣質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的體外人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的照片，其中由于報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)主要與余留的腺結(jié)構(gòu)有關(guān)而出現(xiàn)深(藍(lán))染色，而周圍細(xì)胞則染色較淺；圖3是顯示CAT試驗(yàn)結(jié)果(以每管的計(jì)數(shù)表示)的條線圖，其中子宮內(nèi)膜細(xì)胞是被編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因(pcDNA3CAT)成功地轉(zhuǎn)染的，并與由對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比較；圖4是顯示熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果(以相對(duì)光單位表示)的條線圖，其中子宮內(nèi)膜細(xì)胞是被編碼熒光素酶的基因(pc DNA3LUC)成功地轉(zhuǎn)染的，并與由對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比較。
實(shí)施例實(shí)施例1小鼠缺對(duì)成組BALB/cJ小鼠被圈養(yǎng)在光(14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗；在20.00小時(shí)關(guān)掉光照)和溫度(22℃)控制的小動(dòng)物房(Smal AnimalHouse)內(nèi)，并飼以小鼠和大鼠食物(Labsure；Christopher Hill Group，Poole，Dorset，UK)。將它們與同一批的切除輸精管的雄性小鼠一起放置過夜，并于次日早晨檢查陰道栓是否存在。假定交配發(fā)生在02.00小時(shí)，即0時(shí)間，并將第1天計(jì)數(shù)為第一次檢查栓子的日期。于實(shí)驗(yàn)前將交配的雌性動(dòng)物單獨(dú)圈養(yǎng)。
在Metafane(甲氧基熒烷，C-Vet Ltd.，Bury St.Edmunds)麻醉下使用無菌程序進(jìn)行剖腹手術(shù)。經(jīng)中腹部或兩側(cè)切開以暴露子宮角。在輸卵管一子宮接合處向子宮角頂端注射，或者在子宮頸接合處向角的基底部注射。重復(fù)研究顯示后一種技術(shù)提供了最好的給藥方法，但為了某些目的，當(dāng)必須盡可能地減小對(duì)生殖道的擾亂時(shí)則較好使用前一種方法。將扁平Stratatip的尖端插入子宮角的基底部以注射胎質(zhì)體/DNA(pcDNA3構(gòu)建體+/-β-半乳糖苷酶報(bào)導(dǎo)基因)、裸DNA或?qū)φ杖芤?25-100μl)。借助Travesty涂藥器(也可用于控制向子宮角內(nèi)緩慢注射溶液)預(yù)先將溶液向上抽入尖端。
注射后，使用斷開的褥墊縫合線縫合切口，使小鼠在其籠內(nèi)蘇醒并隨意提供食物和水。
質(zhì)粒構(gòu)建體本申請(qǐng)中(以實(shí)例方式)描述的質(zhì)粒都是基于市購的載體pcDNA3(Catalogue No.V790-20，購自Invitrogen；San Diego，California，USA)。使用沒有報(bào)導(dǎo)基因的質(zhì)粒pcDNA3作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒pcDNA3-βgal、pcDNA3-CAT行pcDNA3-Luc分別含有β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶及熒光素酶報(bào)導(dǎo)基因。這些質(zhì)粒含有下列遺傳元件氨芐青霉素抗性基因、Co1E1復(fù)制原點(diǎn)、CMV啟動(dòng)子(報(bào)道基因)、牛生長激素polyA加入位點(diǎn)、f1復(fù)制原點(diǎn)、SV40復(fù)制原點(diǎn)、新霉素抗性基因及SV40 poly A加入位點(diǎn)，這些元件以可運(yùn)轉(zhuǎn)的方式連接，從而在導(dǎo)入質(zhì)粒后可于真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)報(bào)導(dǎo)基因。用堿溶解法從大腸桿菌中純化質(zhì)粒DNA，并使用Qiagen離子交換柱(按照生產(chǎn)商的說明書)進(jìn)一步純化之。
脂質(zhì)體制備所使用的脂質(zhì)體是DOPSA(2，3-二油酰氧基-N-〔2(精胺甲酰氨基)乙基〕-N，N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽)和DOPE(二油?；字Ｒ掖及?(Lipofect AMINE；Gibco BRL Paisley，Scotland)的3∶1(w/w)脂質(zhì)配方?？墒褂萌绫?中所示的許多不同的DNA/脂質(zhì)比例和注射體積。在每次實(shí)驗(yàn)前立即混合DNA/脂質(zhì)。向10μl脂質(zhì)溶液內(nèi)加入10μlDNA溶液，輕輕混合并于室溫下旋轉(zhuǎn)15分鐘。然后加入80μlPBS達(dá)到如表1中所示的DNA和脂質(zhì)終濃度。然后將此溶液注射到假妊娠小鼠的子宮內(nèi)(有關(guān)小鼠及其外科處理的方法參見上文)。
β半乳糖苷酶的組織化學(xué)定位用二氧化碳吸入法殺死動(dòng)物并切下不帶脂肪的腸系膜的子宮角。將每個(gè)角切成3片，頂和底部切片放在液氮中快速冷凍并貯存于-70℃，然后定量檢測(cè)β-半乳糖苷酶含量。將每個(gè)子宮角的中間一片在溶于PBS的1.25％戊二醛中固定15分鐘。在PBS中漂洗兩次，并置于X-gal染色溶液(1mg/ml X-gal、5mM K3Fe(CN)6、5mMK4Fe(CN)6、2mMMgCl2、0.02％NP40和0.01％脫氧膽酸鈉)中室溫下著染24小時(shí)。然后在PBS/3％DMSO可(2×5分鐘)和70％乙醇中(3×5分鐘)沖洗，并置于100％乙醇中。在乙二醇異丁烯酸樹脂中包埋組織并切成7μm切片，用中性紅反染色后進(jìn)行顯微鏡檢查。
結(jié)果下列表1中顯示所使用的各種條件和投用DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物后所得子宮切片的染色強(qiáng)度。表中所示的結(jié)果證明投用質(zhì)粒DNA的時(shí)間的重要性，于第2天投用時(shí)表達(dá)水平最高，于第3天投用表達(dá)水平較好，但于第4天投用則報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)很差，推測(cè)這是由于在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上子宮內(nèi)膜細(xì)胞可能沒有攝入基因構(gòu)建體，但進(jìn)一步的原因還不完全清楚。
表1
染色強(qiáng)度+++強(qiáng)；++中等；+弱；-無染色對(duì)照未注射的6天假妊娠小鼠未出現(xiàn)子宮中β-半乳糖苷酶活性的染色。
注射50μl缺少β-半乳糖苷酶(2μg/ml)和脂質(zhì)(20μg/ml)的pcDNA3的假妊娠小鼠(第2天投藥；第6天尸體解剖)子宮中沒有出現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性染色。
用X-gal染色后檢查組織學(xué)切片顯示，腺上皮有強(qiáng)染色，腔上皮雖然也著染，但強(qiáng)度較低。在假妊娠第二天的50μl投藥量，用2μg/ml DNA和20μg/ml脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的動(dòng)物中可見有最佳染色。圖1a顯示從這樣的動(dòng)物制得的切片，圖1b顯示接受(在相同條件下)不帶β-gal基因之質(zhì)粒的對(duì)照動(dòng)物的切片。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜的原始培養(yǎng)物本發(fā)明人也已證明，可在體外以高效率轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。
使用已介紹過的同樣的質(zhì)粒(pcDNA3，+/-β-半乳糖苷酶報(bào)導(dǎo)基因)和脂質(zhì)。用Smith和Kelly(Smith等人，1987前列腺素34，553-561)的方法制行子宮內(nèi)膜細(xì)胞。培養(yǎng)物一旦建立，便使用下列轉(zhuǎn)染方案。分別在100μl無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM1 BRL)中稀釋DNA(2μg)和脂質(zhì)體(8μg)，混合并于室溫下保溫15分鐘。此后再加入800μl Opti-MEM1、先用PBS，然后再用Opti-MEM1洗細(xì)胞(在24孔平板中)。將DNA/脂質(zhì)體混合物(0.5ml)加到細(xì)胞中并在CO2培養(yǎng)箱中于37℃溫育3小時(shí)，然后加入0.5ml含有20％胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)固定細(xì)胞(0.1％戊二醛)、淋洗并用X-gal染色。
該工作顯示可于體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移到子宮內(nèi)膜中，并且這一方法可實(shí)際應(yīng)用于許多的子宮內(nèi)膜(和胎盤)生理或病理?xiàng)l件，例如改善動(dòng)物和人的胚胎植入、破壞植入(即避孕)，治療子宮內(nèi)膜異位和月經(jīng)過多、增生及腺癌。
得到與體外轉(zhuǎn)染純化的人子宮上皮細(xì)胞有關(guān)的進(jìn)一步的數(shù)據(jù)。這一數(shù)據(jù)是對(duì)體內(nèi)小鼠研究工作的補(bǔ)充，并表明在經(jīng)過最少的培養(yǎng)時(shí)間之后，可由體內(nèi)使用的同樣脂質(zhì)體和DNA有效地轉(zhuǎn)染相似的細(xì)胞。
實(shí)施例3體外轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜上皮分離子宮內(nèi)膜中的人原始上皮細(xì)胞并按照Zhang等人(細(xì)胞科學(xué)雜志，1995；108323-331)的方法培養(yǎng)之。將細(xì)胞鋪敷在標(biāo)準(zhǔn)6孔組織培養(yǎng)板中，以于次日達(dá)到50％匯合的密度。將細(xì)胞培養(yǎng)5天，然后以每孔60,000個(gè)細(xì)胞的密度重新鋪敷在24孔平板中。第2天用DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物(DNA/LC)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。按下述方法制備轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染方法材料Lipofect AMINE(Gibco Catalogue No.18324-012)，Opti-MEMI(Gibco Catalogue No.51985-018)24孔培養(yǎng)器Zhang等人(文獻(xiàn)同上)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基由DMEM/HEPES、10％FCS、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物(Sigma CatalogueNo.E-2759)(30μg/ml)、肝素(Sigma Catalogue No.H-3149)(90μg/ml)、慶大霉素(Sigma Catalogue No.G-1272)(5μg/ml)和兩性霉素B(Gibco Catalogue No.15290-018)(1μg/ml)組成。另外還使用無Mg++、Ca++PBS和2ml Eppendorf管。
使用兩種含不同報(bào)導(dǎo)基因的不同的質(zhì)粒構(gòu)建體。pc DNA 3CAT得自Invitrogen公司，并會(huì)有編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的報(bào)導(dǎo)基因。第二種質(zhì)粒pc DNA3luc含有同樣載體，但以編碼熒光蟲熒光素酶的基因代替CAT基因。使用Qiagen中型制備系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模DNA制備。使用不含有報(bào)導(dǎo)基因的pcDNA3作為陰性對(duì)照。
DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的制備1)溶液A將1μg DNA稀釋到裝在Eppendorf管中的100μl Opti-MEMI中。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中所用的DNA終濃度為1μg/ml。
2)溶液B將4μl Lipofect AMINE稀釋劑加于Eppendorf管內(nèi)的100μl Opti-MEMI中。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中所用Lipofect AMINE的終濃度為8μg/ml。
3)將溶液A和B合并到一個(gè)新的試管中并輕輕混合之。
4)室溫下溫育15分鐘。
細(xì)胞洗滌1)轉(zhuǎn)染前，在不含血清的新鮮PBS中將細(xì)胞單層粗略精洗3次。
2)再用Opti-MEMI將細(xì)胞單層洗兩次。
轉(zhuǎn)染1)向含有DNA-脂質(zhì)混合物的各管中加入800μl(總計(jì)1.0ml)Opti-MEM。DNA終濃度為1μg/ml，Lipofect AMINE濃度為8μg/ml。
2)除去細(xì)胞單層中的Opti-MEM。
3)輕輕混合DNA/LC混合物并在洗過的細(xì)胞上覆蓋以稀釋的復(fù)合溶液，0.5ml/24孔。
4)在CO2培養(yǎng)箱中將細(xì)胞單層37℃溫育3小時(shí)。
進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)1)3小時(shí)后，除去轉(zhuǎn)染混合物，向各孔內(nèi)加入2ml Zhang培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)。
定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24至48小時(shí)時(shí)提取細(xì)胞，并根據(jù)需要檢測(cè)CAT或熒光素酶報(bào)導(dǎo)基因活性。
1，在PBS中將細(xì)胞洗3次。
2，用300μl溶胞緩沖液(Promega Catalogue No.E-3871)提取細(xì)胞，將細(xì)胞徹底刮到Eppendorf管中。
3，于-70℃下迅速冷凍提取物并儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 4，為了檢測(cè)，融化提取物并以13,000g離心5分鐘。
5，將冷凍/融化/離心過程再重復(fù)一次。
6，使用購自Tropix的熒光素酶檢測(cè)存盒(Catalogue No.BC 100L)檢測(cè)熒光素酶報(bào)導(dǎo)基因活性。每管使用40μl每種提取物。
7，使用購自Amersham的Quan-t-CAT藥盒(Catalogue No.TRK 1012)檢測(cè)CAT報(bào)導(dǎo)基因活性。
結(jié)果按上述方法在24孔平板中轉(zhuǎn)染原始子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。以一式三份分別用pcDNA3(作為對(duì)照)、pcDNA CAT和pc DNA3 LUC進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后收獲細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶或CAT活性。
CAT酶催化乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶A向氯霉素的轉(zhuǎn)移。使用氚化的乙酰CoA導(dǎo)致放射標(biāo)記向氯霉素的轉(zhuǎn)移。樣品中的CAT活性直接與所產(chǎn)生的氚化氯霉素的量成正比例。因此結(jié)果以每管cpm數(shù)表示?？墒褂煤幸阎考兓腃AT的溶胞緩沖液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
結(jié)果示于圖3中，該條線圖顯示典型實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)檢測(cè)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。下面給出數(shù)字形式的結(jié)果，用pcDNA3CAT處理的細(xì)胞中的CAT活性約比對(duì)照樣品高6倍，證明已成功地轉(zhuǎn)染了子宮內(nèi)膜細(xì)胞。
pcDNA3pcDNA3CAT710 4480616 4134662 3234均值662±271均值3951±372在熒光素酶的檢測(cè)法中，將含有熒光素酶的細(xì)胞提取物與其底物熒光素混合，導(dǎo)致光發(fā)射。光信號(hào)強(qiáng)度與提取物中存在的熒光素酶活性成正比，并可用發(fā)光計(jì)檢測(cè)之。初始結(jié)果以相對(duì)光單位給出。
結(jié)果示于圖4中，該條線解顯示典型實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)檢測(cè)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。結(jié)果以數(shù)字形式顯示如下。從用pcDNA 3LUC處理的細(xì)胞發(fā)出的信號(hào)比對(duì)照樣品的本底信號(hào)高30倍以上，再次證明成功地轉(zhuǎn)染了子宮內(nèi)膜細(xì)胞。
子宮內(nèi)膜基因轉(zhuǎn)移的可能的應(yīng)用實(shí)例可將至少七種不同類型的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到子宮內(nèi)膜中，以達(dá)到各種不同的效果。現(xiàn)對(duì)這些不同的類型依次描述如下。
1)細(xì)胞因子和生長因子的過表達(dá)從概念上說，將要設(shè)計(jì)的最簡單類型的構(gòu)建體是用于在子宮上皮細(xì)胞中過表達(dá)細(xì)胞因子或生長因子的。用于這種過表達(dá)的適當(dāng)?shù)腸DNA可包括編碼LIF、VEGF、EGF、CSF、TNF、雙調(diào)蛋白及各種白細(xì)胞介素和集落刺激因子的DNA。已證明子宮內(nèi)膜中天然表達(dá)這些因子，并且認(rèn)為它們?cè)谡{(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜功能中是十分重要的(Stewart等人，1992，自然359，76-79；Charnock-Jones等人，1994，生殖和生育力雜志101，421-426；Charnock-Jones等人，1993，生殖生物學(xué)48，1120-1128；Das等人，1995，分子內(nèi)分泌學(xué)9，691-；Tabibzadeh(1994)，人類生殖現(xiàn)代化9，947-967)已發(fā)表了該領(lǐng)域的廣泛評(píng)述文章)。這些因子各自影響生殖功能的不同方面，其中包括植入、血管發(fā)育及白細(xì)胞生物學(xué)。因此投用這類構(gòu)建體的可能指征應(yīng)是在希望改善生育力(特別是家畜生育力)，或阻止人和動(dòng)物的妊娠，以及治療人的各種月經(jīng)紊亂時(shí)。
為改善家畜生育力而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)的實(shí)例已證明LIF對(duì)于植入過程是不可缺少的(Stewart等人，1992，文獻(xiàn)同上)。該因子是在植入時(shí)由子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的。因此在胚胎喪失率高的物種中，提高植入時(shí)子宮內(nèi)膜的LIF表達(dá)水平或許能降低胚胎喪失率。因此為了指導(dǎo)在植入時(shí)由子宮內(nèi)膜合成LIF而設(shè)計(jì)的基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染，可改善該種動(dòng)物的生育率。轉(zhuǎn)染到子宮內(nèi)膜中的構(gòu)建體須含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，以確保在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間產(chǎn)生LIF蛋白質(zhì)。為此，有可能使用得自所研究的這種動(dòng)物的LIF基因的啟動(dòng)子達(dá)到這一目的。
也可設(shè)想利用子宮內(nèi)膜基因轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)行處理，以緩解婦女的月經(jīng)失調(diào)。其中一個(gè)例子是轉(zhuǎn)染編碼血管生成性生長因子例如VEGF的基因，以改變子宮內(nèi)膜內(nèi)的血管發(fā)育。局部VEGF生成量的增加可望增進(jìn)毛細(xì)血管生長，并因而促使子宮內(nèi)膜增厚。同樣，增加VEGF的水平可有利于月經(jīng)后毛細(xì)血管的修復(fù)，從而改變用這種類型的構(gòu)建體處理的患者的出血特征。
2)受體的過表達(dá)可以預(yù)料，增加由子宮上皮表達(dá)的受體的數(shù)目和類型將會(huì)具有顯著的生物學(xué)重要性。可希望過表達(dá)的受體類型包括但不限于生長因子和細(xì)胞因子受體，例如EGF、TGFα、VEGF和各種集落刺激因子及白細(xì)胞介素受體。類固醇激素受體也適合在上皮細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)希望改善生育力、阻止妊娠、治療月經(jīng)紊亂以及希望闡明孤獨(dú)受體(孤獨(dú)受體是目前尚未鑒定出配體的受體)的功能時(shí)，預(yù)期這種轉(zhuǎn)染作用將是有用的。因?yàn)殍b定配體的特征可能導(dǎo)致新藥物的產(chǎn)生，所以孤獨(dú)受體代表了一個(gè)醫(yī)藥工業(yè)十分感興趣的領(lǐng)域。
人們已逐漸深入地了解到，子宮內(nèi)膜的發(fā)育是由許多細(xì)胞因子和其受體間的相互作用介導(dǎo)的復(fù)雜過程，而且卵巢類固醇的刺激作用常常是通過這些細(xì)胞因子介導(dǎo)的。具體地說，已證明(Nelson等人，1992，內(nèi)分泌學(xué)，131，1657-1644)TGFα是小鼠子宮中雌激素作用的潛在介導(dǎo)物。因此，指導(dǎo)該因子合成之構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染作用有可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長，并因而可在子宮內(nèi)膜未有充分發(fā)育的情況下提高生育力。同樣，可預(yù)期這種因子能夠促進(jìn)月經(jīng)后的上皮表面修復(fù)，并因而可用于治療月經(jīng)過多。
目前對(duì)類固醇激素受體總科幾個(gè)成員的配體尚不明了。將這些cDNA轉(zhuǎn)染到子宮內(nèi)膜可有利于闡明這些受體的生物學(xué)功能，因此可將其應(yīng)用于尋找作用于這些受體的新的藥劑(Evans 1988，科學(xué)240，889-895).
3)用所設(shè)計(jì)的構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以封閉或阻斷細(xì)胞因子、生長因子及其他激素的作用轉(zhuǎn)染針對(duì)細(xì)胞因子和生長因子的天然拮抗劑開啟了調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜功能的可能性。這種拮抗劑的一個(gè)例子應(yīng)是白細(xì)胞介素1受體拮抗體(Hannum等人，1990自然343，336)。已顯示投用這種蛋白質(zhì)可阻斷小鼠妊娠(Simon等人，1994內(nèi)分泌學(xué)，134，521-528)。細(xì)胞因子和生長因子的其他天然拮抗劑包括天然可溶性受體。已描述了各種生長因子/細(xì)胞因子系統(tǒng)中的可溶性受體。例如TNF(Engelmann等人，1990，生物化學(xué)雜志，265，14497-14504)、FGF(Givol等人，1992，F(xiàn)ASEB雜志，6，3362-3369)、PDGF(Tiesman & Hart，1993，生物化學(xué)雜志268，9621-9628)和IL-6(Novick等人，1989，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志170，1409-1414)。它們的共同特征是，受體的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)域是作為游離的可溶性因子由細(xì)胞中釋放的。為此可通過蛋白水解作用或剪接方法借以產(chǎn)生缺少跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的截短的蛋白質(zhì)分子。Kendall和Thomas(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，10705-10709)描述了VEGF受體flt的可溶性變異體。該蛋白質(zhì)能夠在體外阻斷VEGF的作用。我們已分離了另外三種編碼其他可溶性變異體的cDNA(參見PCT/GB 95/01213)。與其他拮抗劑(例如抗VEGF抗體)相比這些天然拮抗劑具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)樗鼈冋４嬖谟谏眢w內(nèi)，所以可以預(yù)料到它們不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，而應(yīng)被充分耐受。另外，因?yàn)樗鼈兌佳苌谀そY(jié)合的受體，所以其結(jié)合特征很相似并因此會(huì)很有效地競爭配體。有可能天然存在其他一些可溶性受體，或者可對(duì)它們進(jìn)行體外基因工程改造。再者，如果來自類固醇激素受體家庭成員的配體結(jié)合區(qū)域得以表達(dá)，則其可起到優(yōu)勢(shì)負(fù)性受體的作用，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)以足夠高的水平表達(dá)時(shí)便可競爭結(jié)合配體?；蛘?，亦可使用某種未激活的但與DNA結(jié)合的“受體”未阻斷基因轉(zhuǎn)錄。本申請(qǐng)可用于拮抗天然素固醇，包括那些迄今尚未鑒定的孤獨(dú)受體之配體的作用(Pemridc等人，1994，白血病8，1797-1806)。也可對(duì)來自七個(gè)跨膜區(qū)域受體家族的信號(hào)缺陷性受體進(jìn)行工程改造和轉(zhuǎn)染。
已證明可溶性白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(Eisenbery等人，1990自然343，341)可與體內(nèi)拮抗IL-1的作用(Simon等人，1994內(nèi)分泌學(xué)134，521-528)?？赏ㄟ^用指導(dǎo)拮抗劑合成的cDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜來阻斷小鼠妊娠。
Kendall和Thomas(1993，文獻(xiàn)出處同上)，以及Boocock等人(1995J.Natl.Cancer Ins.87，506-516)已描述了其他一些可能拮抗生長因子或細(xì)胞因子作用的因子，其中包括天然受體的可溶性變異體，例如VEGF受體的可溶性變異體。預(yù)期局部產(chǎn)生這些因子可用來拮抗VEGF的作用，并可望在子宮內(nèi)膜細(xì)胞過度增殖的情況下發(fā)揮有益的治療作用，例如在各種月經(jīng)紊亂情況下可望以期降低子宮內(nèi)膜中的毛細(xì)血管密度。其中還應(yīng)包括治療惡性疾病。
4)反義方法用于阻止特異性蛋白質(zhì)(或酶)的局部生成阻斷細(xì)胞因子、生長因子和激素作用的一種可選用的方法應(yīng)是使用反義或核酶技術(shù)阻斷適當(dāng)細(xì)胞內(nèi)配體的產(chǎn)生，或者受體的產(chǎn)生(James，1991抗病毒化學(xué)和化學(xué)治療，2，191-214；Albert & Morris，1994藥物科學(xué)趨向15，250-254)。
反義技術(shù)依賴于所謂反義寡核苷酸或多核苷酸與細(xì)胞mRNA的結(jié)合。這種結(jié)構(gòu)可阻止所說的mRNA的翻譯，并因而可降低細(xì)胞產(chǎn)生之適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的量。已將合成寡核苷酸或多核糖核苷酸成功地用于這一方法。預(yù)期脂質(zhì)體介導(dǎo)的寡核苷酸轉(zhuǎn)染作用或脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA構(gòu)建體(用于指導(dǎo)較長反義多核苷酸的合成)轉(zhuǎn)染作用可特異地和選擇性地降低被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。核酶也可通過選擇性切割編碼特定蛋白質(zhì)的RNA來阻止蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這些反義分子都可作為多核糖核苷酸或指導(dǎo)這類多核苷酸合成的DNA構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(有關(guān)綜述參見James 1991，和Albert &Morris 1994的上述文獻(xiàn))。反丈核酶用于阻止生育的一個(gè)例子如下所述。已經(jīng)表明LIF對(duì)于哺乳動(dòng)物妊娠的植入過程是必不可少的(Stewart等人，1992，文獻(xiàn)如前所列)。因此可期望借助寡核苷酸或指導(dǎo)反義多核苷酸合成的DNA構(gòu)建體，或抗LIF mRNA的核酶的轉(zhuǎn)染作用來阻止該因子的合成。缺少這種因子則導(dǎo)致植入失敗并因而阻斷妊娠。
可使用相似的方法阻止血管形成性生長因子如VEGF的產(chǎn)生，進(jìn)而阻止腫瘤生長的必需的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。因此這種類型的療法可特別適于治療惡性疾病。
5)免疫球蛋白和其片段的局部產(chǎn)生有可能使用現(xiàn)代重阻DNA技術(shù)產(chǎn)生與原完整單克隆抗體有著幾乎完全相同的結(jié)合特征的單鏈抗體。已在細(xì)菌中成功地表達(dá)了這樣的單鏈抗體(He等人，1995免疫學(xué)84，662-668)。原則上有可能按照需要來設(shè)計(jì)將指導(dǎo)上皮細(xì)胞中單鏈抗體表達(dá)的構(gòu)建體。如果在體內(nèi)子宮內(nèi)膜中完成這一表達(dá)便可預(yù)料抗類固醇激素的單鏈抗體將與類固醇結(jié)合并抑制其在上皮細(xì)胞中的作用。這樣一種抗體的例子是衍生于抗孕酮單克隆抗體DB3的單鏈抗體(He等人，1995，文獻(xiàn)出處同上)。如果這一抗體被分泌到子宮腔內(nèi)，其也可與孕酮結(jié)合并可在子宮區(qū)域內(nèi)發(fā)揮作用。如果已知在子宮內(nèi)膜中有活性的抗生長因子和細(xì)胞因子的抗體能夠以這種方式在局部產(chǎn)生，則它們同樣地可阻斷所說因子的功能。
局部產(chǎn)生的單鏈抗體的其他應(yīng)用在于預(yù)防或治療性傳染病。在這種情況下，抗所研究的致病因子(例如乳頭狀瘤病毒、HIV、衣原體)的抗體可被分泌到子宮腔內(nèi)并阻止由這些因子引起的感染?？深A(yù)計(jì)抗精子或卵母細(xì)胞抗原的抗體將在避孕中起作用。
6)獲得粘膜免疫力的主動(dòng)免疫可用于獲得局部免疫力的另一種方法是設(shè)計(jì)可指導(dǎo)抗原向子宮腔內(nèi)分泌的構(gòu)建體。其可引發(fā)局部免疫反應(yīng)并因此而獲得位點(diǎn)特異性粘膜免疫力。許多年來就已經(jīng)知道(Howe，1967，生殖和生育力雜志13，563-566)子宮腔內(nèi)包含許多白細(xì)胞。這些白細(xì)胞攝取由被轉(zhuǎn)染的子宮內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生的抗原并繼而引發(fā)粘膜免疫反應(yīng)。將抗原輸送到腸腔中已產(chǎn)生了這種免疫力，并已顯示在某些情況下是很有效的(例如抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗接種)。
7)阻斷病原體附著位點(diǎn)病原體附著于粘膜表面上常常是感染確立的一個(gè)必要條件。因此阻止病原體在這些位點(diǎn)上的附著提供了一種對(duì)抗人或動(dòng)物疾病，特別是對(duì)抗性傳染病的方法。這種方法不僅適用于細(xì)菌病原體(例如E.coli和N.gonorrhoea的某些病原菌株)，而且也適用于病毒病原體。當(dāng)感染細(xì)胞時(shí)，許多病毒被細(xì)胞表面“受體”結(jié)合?？赏植慨a(chǎn)生的可溶性受體能競爭與細(xì)胞表面分子結(jié)合并因而阻止病毒感染。同樣，用病毒模擬物(其作用如同病毒“配體”)來飽和結(jié)合細(xì)胞表面受體也可以阻止感染，因?yàn)橥瑯右部稍诰植慨a(chǎn)生特異性免疫球蛋白或其有效結(jié)合部分。
權(quán)利要求
1.將核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物個(gè)體之生殖道的至少某些細(xì)胞中，以改變所說細(xì)胞的一種或多種特征的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中核酸被導(dǎo)入子宮內(nèi)膜細(xì)胞中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中核酸被導(dǎo)入子宮內(nèi)膜的腺上皮中。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中被導(dǎo)入的核酸是DNA。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中核酸是在排卵后期間，直到并包括血液內(nèi)孕酮水平達(dá)到峰值時(shí)被導(dǎo)入的。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中核酸是在脂質(zhì)體、病毒、或其他載體顆粒內(nèi)被導(dǎo)入的。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中核酸是作為質(zhì)?；蚱渌麡?gòu)建體被導(dǎo)入的。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中被導(dǎo)入的核酸包括被可操縱地連接到將在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的序列上的啟動(dòng)子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中被導(dǎo)入的核酸序列包括一個(gè)以反義方向可操縱地連接到啟動(dòng)子上的部分，從而抑制多肽在導(dǎo)入了所說序列的細(xì)胞中的表達(dá)。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中因?qū)牒怂嵝蛄卸桓淖兊奶卣鲗?dǎo)致了個(gè)體之生育力的改變。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)細(xì)胞因子或生長因子的至少一個(gè)有效部分的表達(dá)。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)下列因子之一的至少一個(gè)有效部分的表達(dá)白細(xì)胞介素、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、肝素結(jié)合的表皮生長因子(HBEGF)、胰島素結(jié)合的生長因子I和II(IGF-1和IG-II)、雙調(diào)蛋白、集落刺激因子(CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)，和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)細(xì)胞因子拮抗劑或生長因子拮抗劑的至少一個(gè)有效部分的表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)白細(xì)胞介素-1受本拮抗劑或下列因子之一的可溶性受體的表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)α、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、白細(xì)胞介素-6、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、或肝細(xì)胞生長因子(“Met”受體)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)生長因子、細(xì)胞因子或類固醇激素受體的至少一個(gè)有效部分在細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞上的表達(dá)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中被導(dǎo)入的核酸序列指導(dǎo)下列因子之一的受體的至少一個(gè)有效部分的表達(dá)EGF、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)α，或VEGF。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)具有局部免疫原效應(yīng)之多肽的至少一個(gè)有效部分的表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)來自病原體之抗原的至少一個(gè)有效部分的表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)來自下列病原體之一的至少一個(gè)免疫原性部分的表達(dá)HIV、乳頭狀病瘤病毒、衣原體或淋病奈瑟代球菌(N.gonorrhoea)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中被導(dǎo)入的核酸指導(dǎo)免疫球蛋白或其有效部分的表達(dá)。
22.含有核酸的，用于根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法的組合物。
23.含有核酸的組合物按照權(quán)利要求1至21中任何一項(xiàng)的應(yīng)用。
24.含有核酸的組合物在制備用于改變哺乳動(dòng)物個(gè)體之生殖道的至少某些細(xì)胞的一種或多種特征的物質(zhì)中的應(yīng)用。
25.制造用于權(quán)利要求1至21中任何一項(xiàng)之方法中的組合物的方法，該方法包括將核酸與生理上可接受的載體物質(zhì)相混合。
全文摘要
公開了在哺乳動(dòng)物個(gè)體之生殖道的至少某些細(xì)胞中導(dǎo)入核酸,以改變所說細(xì)胞的一種或多種特征的方法,同時(shí)提供了用于該方法的含核酸的組合物。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1174508SQ9519746
公開日1998年2月25日 申請(qǐng)日期1995年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月24日
發(fā)明者D·S·查諾克一瓊斯, S·K·史密斯, A·M·夏基, R·B·希普 申請(qǐng)人:劍橋大學(xué)技術(shù)服務(wù)有限公司