專利名稱：減毒病毒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的完成獲得了政府的支持，從國立癌癥研究所(NationalCancer Institute)取得了授權(quán)號為R01 CA47217的政府基金。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
本申請涉及可用作疫苗的單重或多重減毒的病毒，其中，所使用的減毒方法是在特定病毒的基因組中形成額外的DNA甲基化位點(diǎn)，這些額外位點(diǎn)(1)不影響該病毒的氨基酸序列，(2)使宿主細(xì)胞對該病毒基因組表達(dá)的控制得到改善。
目前，尚沒有能有效抗人逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的疫苗，僅有的一種只能用于動物(貓白血病病毒)?，F(xiàn)在正對各種方法進(jìn)行研究，以期開發(fā)出能有效抗病毒的疫苗，包括亞單位疫苗和完整或部分病毒疫苗，所述病毒如人免疫缺損病毒(HIV)和猴免疫缺損病毒(SIV)。潛在HIV-1疫苗的臨床試驗(yàn)幾乎全部失??；用肽疫苗(HIV-1蛋白的小片段，通常為糖蛋白包殼)或滅活的變性病毒在很多受試對象上所做的試驗(yàn)也均告失敗。
對人以外的靈長目動物所做的研究表明，從SIV上除去nef基因后可用于對猴進(jìn)行免疫，免疫以后可以抗SIV的二次攻擊。一個自然實(shí)驗(yàn)似乎表明，除去nef基因可以生成用于人體的有效的活的減毒疫苗。有一類人已被確診感染HIV長達(dá)10年以上，但仍未出現(xiàn)發(fā)展成AIDS的跡象。提取感染這些人的病毒并進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種特殊的HIV菌株在nef基因座位上發(fā)生了自發(fā)突變；就是說，nef基因發(fā)生了自發(fā)缺失。我們在本文中披露了一種對用于疫苗中的病毒進(jìn)行減毒的方法，所述病毒的基因組是宿主細(xì)胞DNA甲基化的目標(biāo)。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)與其它二核苷酸相比，在HIV-1進(jìn)化過程中DNA甲基化位點(diǎn)優(yōu)先丟失，其丟失速度遠(yuǎn)高于宿主基因的丟失速度。在DNA病毒和某些RNA病毒中也會出現(xiàn)甲基化位點(diǎn)的丟失。DNA甲基化的過程是這樣的DNA上特定胞嘧啶上的5位碳原子被甲基化，生成5-甲基胞嘧啶。在動物細(xì)胞中，大部分甲基化作用發(fā)生在CpG二核苷酸上，即緊鄰鳥嘌呤5’端的胞嘧啶上。一般，基因在被甲基化以后，其在轉(zhuǎn)錄時就保持“沉默”-無信使RNA，因此，不能由其產(chǎn)生蛋白質(zhì)。本發(fā)明以活性形式將沉默突變(即不影響氨基酸序列的突變)引入病毒基因組，這種突變可產(chǎn)生正常狀態(tài)下并不存在的甲基化位點(diǎn)，這種甲基化作用能夠阻止病毒的作用。
因此，本發(fā)明的第一方面是一種自然界所沒有的減毒病毒(或“改性病毒”)，與相應(yīng)的野生型病毒相比其帶有至少一個額外的甲基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)是通過突變引入所述病毒的基因組的。
本發(fā)明的第二方面是一種編碼上述病毒的DNA(例如，編碼一種病毒的cDNA)，以及帶有該DNA的一種載體(如一種表達(dá)載體)。
本發(fā)明的第三方面是一種藥物配方，包括一種如上文所述的病毒及一種可以藥用的載體。該配方既可用于在動物體內(nèi)產(chǎn)生能與所述病毒特異結(jié)合的抗體，又可用于在人和動物上檢測所述病毒的診斷分析和其它方法；該配方還可用作疫苗配方，用于在動物或人的受治對象上產(chǎn)生抗該病毒的保護(hù)性免疫。
本發(fā)明的第四個方面是一種在受治對象上產(chǎn)生免疫反應(yīng)(例如，產(chǎn)生抗體和/或產(chǎn)生保護(hù)性免疫)的方法。該方法包括給受治對象服用如上所述的病毒，服用量能在受治對象體內(nèi)有效產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的第五個方面是將上述病毒用于制備一種藥品的用途，該藥品可用于在受治對象體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，如上文所述。
本發(fā)明的第六個方面是一種制備如上所述的減毒病毒的方法。該方法包括提供一種含有一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體含有編碼所述減毒病毒的DNA，該宿主細(xì)胞不能充分把所述DNA甲基化，以阻止該病毒DNA的表達(dá)；還包括在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述減毒病毒。一般，所提供的所述宿主細(xì)胞是在合適的培養(yǎng)基中，表達(dá)以后再從培養(yǎng)基中收集病毒(必要時裂解宿主細(xì)胞)，要么將所述培養(yǎng)基直接用于在受治對象上產(chǎn)生免疫反應(yīng)，要么將從培養(yǎng)基中收集和/或純化的病毒與其它成分混合后制成藥物配方。
在以下說明中將對本發(fā)明的以上及其它目的和方面作詳細(xì)說明。


圖1表示CpG插入的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組生活周期的中斷。
圖2表示HIV-1菌株HIVHX2CG的CpG含量(F.Wong-Staal等，Nature 313，277-284(1985))。
圖3表示本發(fā)明的菌株HIV-1CpG1的HIV-1基因組(序列1)的CpG含量。
對HIV-1基因組(HIV-1CpG1)按本文所述方法進(jìn)行修飾，僅示出了其一條鏈的核苷酸序列，從左至右為5’→3’方向。本文中所給出的核苷酸和氨基酸是以IUPAC-IUB生化命名協(xié)會(BiochemicalNomenclature Commission)推薦的方法書寫的，見37 CFR § 1.822和已確立的用法，或以3字母密碼形式出現(xiàn)(用于氨基酸)。例如，參見Patent In User Manual，99-102(1990年11月)(美國專利商標(biāo)局)。在核苷酸序列中，核苷酸間的磷酸鍵有時用“p”表示，其位于表示核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)單個大寫字母之間，如“CpG”表示5’-CG-3’。1.病毒本發(fā)明病毒一般是表達(dá)缺陷型病毒。就是說為了生產(chǎn)這種病毒，可將該病毒基因組或編碼該病毒基因組的DNA引入一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞不會充分將所述病毒DNA甲基化以使其失活。因此，該病毒基因組可以在這樣的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成RNA，該RNA又被翻譯成病毒蛋白，并產(chǎn)生包殼的病毒基因組(病毒顆粒)。為了在動物或人的受試對象上產(chǎn)生免疫反應(yīng)，靶細(xì)胞在這種情況下對病毒基因組進(jìn)行甲基化，以便抑制該病毒基因組的甲基化敏感過程，如轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明可用任何病毒進(jìn)行，包括DNA病毒、RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中，所用病毒的基因組在服用了該病毒的受治對象的細(xì)胞內(nèi)被甲基化。特別推薦逆轉(zhuǎn)錄病毒。在圖1中示出了一種逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期的示意圖，并說明CpG插入的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組是如何中斷其生活周期的。如圖1所示，由粗線表示的生活周期的各個時期在CpG插入的逆轉(zhuǎn)錄病毒中中斷。
可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括動物和人的逆轉(zhuǎn)錄病毒。這組逆轉(zhuǎn)錄病毒既包括簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒，也包括復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄病毒。簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒包括B型逆轉(zhuǎn)錄病毒、C型逆轉(zhuǎn)錄病毒和D型逆轉(zhuǎn)錄病毒的亞組。B型逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子之一是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C型逆轉(zhuǎn)錄病毒包括亞組C型組A(包括Rous肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMV)和C型組B(包括小鼠白血病病毒(MLV)、貓白血病病毒(FeLV)、小鼠肉瘤病毒(MSV)、長臂猿白血病病毒(GALV)、脾壞死病毒(SNV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(RV)和猴肉瘤病毒(SSV))。D型逆轉(zhuǎn)錄病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和l型猴逆轉(zhuǎn)錄病毒(SRV-1)。復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄病毒包括慢病毒(lentiviruses)、T細(xì)胞白血病病毒和起泡病毒(foamy viruses)的亞組。慢病毒包括HIV-1，還包括HIV-2、SIV、綿羊髓鞘脫落病毒、貓免疫缺損病毒(FIV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)。T細(xì)胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猴T細(xì)胞白血病病毒(STLV)，和牛白血病病毒(BLV)。起泡病毒包括人起泡病毒(HFV)、猴起泡病毒(SFV)和牛起泡病毒(BFV)。上述病毒是說明性的，其目的并非是要限定可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其它RNA病毒的例子包括，但不限于以下成員呼腸病毒科的成員，包括正呼腸病毒屬(哺乳動物和禽逆轉(zhuǎn)錄病毒的多種血清型)、環(huán)狀病毒屬(藍(lán)舌病毒、Eugenangee病毒、Kemerovo病毒、非洲馬病病毒、和科羅拉多蜱熱病毒)、輪狀病毒屬(人輪狀病毒、內(nèi)布拉斯加牛腹瀉病毒、鼠輪狀病毒、猿輪狀病毒、?；蜓蜉啝畈《?、禽輪狀病毒)；微小RNA病毒科的成員，包括腸病毒屬(脊髓灰質(zhì)炎病毒、Coxsackie病毒A和B、人腸道致細(xì)胞孤(ECHO)病毒、甲型肝炎病毒、猴腸病毒、鼠腦炎髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛腸病毒、豬腸病毒)、心臟病毒屬(腦心肌炎病毒(EMC)、門果病毒)、鼻病毒屬(人鼻病毒-至少有113個亞型；其它鼻病毒)、Apthovirus屬(口碲疫病毒(FMDV))；鈣化病毒科(Calciviridae)，包括豬泡囊疹病病毒、San Miguel海獅病毒、貓微小RNA病毒和Norwalk病毒；披膜病毒科，包括α病毒屬(東方馬腦炎病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒、Chikungunya病毒、O’Nyong-Nyong病毒、Ross河病毒、Venezuelan馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒)、黃病毒屬(蚊傳黃熱病毒、Dengue病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、Murray Valley腦炎病毒、West Nile病毒、Kunjin病毒、中歐蜱傳病毒、遠(yuǎn)東蜱傳病毒、Kyasanur森林病毒、Louping III病毒、Powassan病毒、Omsk出血熱病毒)、風(fēng)疹病毒屬(風(fēng)疹病毒)、瘟疫病毒屬(粘膜病毒、豬瘟病毒、Border病病毒)；布尼亞病毒科，包括布尼病毒屬(布尼奧羅病毒及相關(guān)病毒、加利福里亞腦炎組病毒)、Phlebovirus屬(白蛉熱西西里亞病毒、Rift Valley熱病毒)、Nairovirus屬(Crimean-Congo出血熱病毒、內(nèi)羅比綿羊病病毒)和Uukuvirus屬(Uukuniemi及相關(guān)病毒)；正粘液病毒科，包括流感病毒屬(甲型流感病毒(很多種人的亞型)；豬流感病毒，和禽及馬流感病毒；和丙型流感病毒(可能為另一屬)；副粘液病毒科，包括副粘液病毒屬(1型副流感病毒、Sendai病毒、血吸病毒、2-5型副流感病毒、新城病病毒、流行性腮腺炎病毒)、麻疹病毒屬(麻疹病毒、亞急性硬化性全腦炎病毒、瘟熱病毒、牛瘟病毒、肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；棒狀病毒科，包括囊炎病毒(VSV)屬、Chandipura病毒、Flanders-Hart Park病毒)、狂犬病毒屬(狂犬病毒)、魚棒狀病毒的兩個屬、和兩種可能的棒狀病毒(Marburg病毒和Ebola病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LMC)病毒、Tacaribe病毒復(fù)合體，和拉沙病毒；冠狀病毒科，包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒、人腸冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒(豬冠狀病毒)。
可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的DNA病毒的例子包括，但不限于以下成員痘病毒科，包括正痘病毒屬(重型天花、輕型天花、猴牛痘、牛痘、水牛痘、兔痘、缺肢畸形)、Leporipoxvirus屬(粘液瘤、纖維瘤)、禽痘病毒屬(鳥痘、其它禽痘)、羊痘病毒屬(綿羊痘、山羊痘)、Suipoxvirus屬(豬痘)、類痘病毒屬(接觸型繼發(fā)皮炎病毒、假牛痘、牛丘疹口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲豬熱病毒、蛙病毒2和3、魚淋巴囊腫病毒)；皰疹病毒科，包括α皰疹病毒(1型和2型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、馬流產(chǎn)病毒、馬皰疹病毒2和3、假狂犬病毒、傳染性牛角膜結(jié)膜炎病毒、傳染性牛鼻氣管炎病毒、貓鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒)；β皰疹病毒(人巨細(xì)胞病毒和豬、猴及嚙齒動物巨細(xì)胞病毒)；γ皰疹病毒(EB病毒、Marek’s病病毒、Herpes Saimiri、Herpesvirus ateles、Herpesvirus sylvilagus、豚鼠皰疹病毒、Lucke腫瘤病毒)；腺病毒科，包括乳腺病毒屬(人的A、B、C、D、E亞組及未分組的乳腺病毒)；猴腺病毒(至少23個血清型)，傳染性犬肝炎，和牛、豬、綿羊、蛙和其它種的腺病毒、禽腺病毒屬(禽腺病毒)；和不可培養(yǎng)的腺病毒；乳多空病毒科，包括乳頭瘤病毒屬(多種亞型的人乳頭瘤病毒、牛乳頭瘤病毒、Shope兔乳頭瘤病毒、和其它種的各種病原性乳頭瘤病毒)、多瘤病毒屬(多瘤病毒、猴病毒40(SV-40)、兔空泡形成劑(RKV)、K病毒、BK病毒、JC病毒，及其它靈長類多瘤病毒，如親淋巴性乳頭瘤病毒；細(xì)小病毒科，包括腺病毒相關(guān)病毒屬，細(xì)小病毒屬(貓Panleukopenia病毒、牛細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒、Aleutian水貂病病毒等)。最后，DNA病毒還可以包括不屬于上述各科的病毒Kuru，克雅氏病病毒和慢性傳染性神經(jīng)病病毒(CHINA病毒)。2.引入減毒突變本文所說的“減毒病毒”是指受該病毒感染的易感宿主發(fā)病的可能性降低(喪失毒力)，符合本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)命名法。例如，參見B.Davis，R.Dulbecco，H.Eisen，和H.Ginsberg，Microbiology，132(第3版，1980)。減毒突變是指使一種病毒成為不再能致病的減毒病毒的突變。本發(fā)明病毒是減毒病毒，在易感宿主中該病毒的生活周期在逆轉(zhuǎn)錄病毒和DNA病毒的轉(zhuǎn)錄水平上受到抑制。對非逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA病毒來說，病毒的生活周期被認(rèn)為是因RNA基因組功能的喪失而受到抑制的，RNA基因組功能的喪失是因CpG甲基化所致。
額外甲基化位點(diǎn)是通過上述病毒基因組的突變而引入的，這種突變能產(chǎn)生本發(fā)明的改性病毒，額外甲基化位點(diǎn)的數(shù)目取決于突變的位點(diǎn)、病毒的性質(zhì)、有或無其它減毒突變(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒nef基因的缺失)等，可以較少(如1，2，或3個)，或至少為10個、50個、100個或500個或更多。通常，將足夠數(shù)量的甲基化位點(diǎn)引入病毒基因組，以使該基因組內(nèi)實(shí)測的與預(yù)期的CpG二核苷酸的比例(CpGo/e)比野生型病毒高出1、2、3、4、5、6、7或8倍或更高，不過，當(dāng)采用很少、但具有特別強(qiáng)的減毒突變效果的甲基化位點(diǎn)時，CpGo/e不必提高這么多。
通常，本發(fā)明的改性病毒是包括病毒衣殼的病毒顆粒，衣殼中含有包括病毒基因組的核酸材料(DNA或RNA)，所述病毒顆粒與服用了該病毒的受治對象體內(nèi)的靶細(xì)胞結(jié)合，并將其基因組導(dǎo)入所述細(xì)胞。因此，所述改性病毒至少含有2個或3個減毒突變(通過上述方法引入甲基化位點(diǎn)或通過其它機(jī)理)，以降低所述病毒自發(fā)恢復(fù)毒力的可能性。
可以用任何合適的方法將本發(fā)明的減毒CpG突變引入編碼病毒的cDNA，如直接合成，PCR誘變或定點(diǎn)誘變(例如，可參見Kunkel的美國專利US 4,873,192)(申請人特別申明，本文所引用的所有專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容都作為本發(fā)明的參考)。
本發(fā)明的減毒病毒直接在一臺DNA合成儀上生產(chǎn)，這種儀器的應(yīng)用在本領(lǐng)域廣為人知。具體地講，靶病毒(如HIV-1)的核酸序列是經(jīng)過選擇的。然后，對不含CpG的密碼子進(jìn)行掃描，可將這種密碼子改變成含CpG的密碼子，同時又不含改變翻譯后的氨基酸序列。這樣，用CpG二核苷酸置換了不會CpG的密碼子。例如，編碼脯氨酸的CCT、CCC或CCA被轉(zhuǎn)換為CCG?；蛘撸淖兿噜彽拿艽a子，以使在其相鄰區(qū)域含有CpG。例如，可將相鄰的密碼子GCA GTG(丙氨酸-纈氨酸)改變?yōu)镚CC GTG，它仍然編碼丙氨酸-纈氨酸，但現(xiàn)已含有可被甲基化的CpG(第一個密碼子的最后一個C和第二個密碼子的第一個G)。
當(dāng)然，某些密碼子的種特異性優(yōu)于其它密碼子的。理想的是，通過篩選可用的最佳密碼子的方式產(chǎn)生改變了的基因組(即生產(chǎn)病毒的宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)選密碼子，和服用該病毒以便產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受治對象的優(yōu)選密碼子)。
如上所述，本發(fā)明的病毒除了包括本文所述的沉默CpG突變之外，還可包括其它減毒方法。例如，如果必要的話可以包括常見的置換突變，這種突變可以在其所編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生減毒性的氨基酸置換。作為應(yīng)用HIV-1的另一種例子，nef基因和其它基因或這些基因的一部分可以缺失，以產(chǎn)生其減毒突變。
對于諸如HIV-1之類的逆轉(zhuǎn)錄病毒來說，該病毒有很多種株，通過CpG插入對多種HIV-1株進(jìn)行改性是理想的，同時使用這些改性的株生產(chǎn)有效的疫苗。
下文披露一種用無義的或“沉默的”CpGs過度取代的新型HIV-1基因組?！盁o義的”是指向該基因組中增加CpGs后不會改變所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列。CpGs的過度取代，使得這種新的合成基因組成為宿主細(xì)胞甲基化酶的目標(biāo)。因此，盡管由該基因組所編碼的病毒能夠感染宿主細(xì)胞，但該原病毒基因組易因?yàn)榧谆Щ睿⒂谰帽３中菝郀顟B(tài)。就是說，達(dá)到該基因組能被宿主細(xì)胞甲基化的程度，仍保持轉(zhuǎn)錄沉默。
盡管本發(fā)明的目的主要在于使用所謂“活”病毒疫苗，但也可以使用滅活病毒疫苗，包括甲醛和加熱滅活的病毒疫苗。本發(fā)明可用于這種疫苗的制備，因?yàn)榛畈《九既惶用摐缁钐幚聿⒛軐?dǎo)致感染。因此，本發(fā)明可結(jié)合任何其它減毒方法一起使用，以提供進(jìn)一步的減毒作用。3.在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)病毒表達(dá)載體是一種可復(fù)制的DNA結(jié)構(gòu)，其中，編碼一種或幾種蛋白質(zhì)的DNA序列可操作地同合適的調(diào)節(jié)序列連接，該調(diào)節(jié)序列能控制所述DNA在合適宿主中的表達(dá)。可將一種復(fù)制載體用于在無須表達(dá)所述DNA時產(chǎn)生額外的DNA。針對特定載體的宿主細(xì)胞選擇取決于如下因子如是否需要表達(dá)或復(fù)制。
轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是指用通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞通常能表達(dá)DNA，但是為克隆或擴(kuò)增靶蛋白目的而轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不需要表達(dá)這種蛋白質(zhì)。
合適的宿主細(xì)胞通常包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。來自多細(xì)胞生物的細(xì)胞特別適于作為重組甲基化病毒的宿主，而昆蟲細(xì)胞特別理想。這種細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中的繁殖已成為一種常規(guī)方法(Tissue Culture，Academic Press，Kruse和Patterson著，1973)。有用的宿主細(xì)胞系的例子有CD4+T淋巴細(xì)胞，如MOLT4，VERO和HeLa細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，和WI138、BHK、COS-7、CV、和MDCK細(xì)胞系。用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括(必要的話)一個復(fù)制起點(diǎn)，一個啟動子(位于編碼待表達(dá)的甲基化病毒的DNA上游并與其可操作地連接)，以及一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個RNA剪接位點(diǎn)(如果使用含有內(nèi)含子的基因組DNA的話)，一個聚腺苷酸化位點(diǎn)，和一段轉(zhuǎn)錄終止序列。
當(dāng)宿主細(xì)胞帶有以其它方式將病毒基因組甲基化的甲基化系統(tǒng)時，該甲基化系統(tǒng)必須失活到足于在其中產(chǎn)生病毒的程度。這種失活可用任何合適方法實(shí)現(xiàn)，如使細(xì)胞培養(yǎng)基中含有一種脫甲基化劑或甲基化酶抑制劑，如5-氮胞苷或5-氮脫氧胞苷，其用量足于抑制該甲基化系統(tǒng)(如1～10μM)；以足于使該甲基化系統(tǒng)失活的量將一種反義寡核苷酸加入所述培養(yǎng)基中；或通過遺傳工程技術(shù)使所述細(xì)胞表達(dá)一種能使所述甲基化系統(tǒng)失活的反義劑。當(dāng)通過遺傳工程方法將所述反義系統(tǒng)引入該細(xì)胞時，最好使用一種可誘導(dǎo)的表達(dá)載體，例如，將該反義寡核苷酸插在一個啟動子如小鼠金屬硫蛋白啟動子的下游，向組織培養(yǎng)基中添加一種金屬(如鎘)，該啟動子即可啟動寡核苷酸的表達(dá)。有眾多的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
在一種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)型活病毒是特別可行的，該系統(tǒng)用昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，并使用昆蟲所固有的病毒載體(參見授予Smith等人的美國專利US4,745,051和4,879,236)。桿狀病毒是桿狀病毒科、桿狀病毒屬的成員。該屬包括3個亞組的病毒核型多角體病毒(NPV)、顆粒體病毒(GV)、和無包含體病毒。NPVs包括苜蓿銀紋夜蛾(Autographica californica)NPV(AcNPV)、棉鈴蟲(Heliothis zea)NPV(HzNPV)和家蠶(Bombyx mori)NPV(BmNPV)。將重組桿狀病毒載體用于在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物或幼蟲中表達(dá)外源蛋白的應(yīng)用是已知的。例如，見Luckow & Summers，Bio/Technology，6，47(1988)；Tomalski & Miller，Nature，352，82(1991)。將桿狀病毒用于本發(fā)明中特別有用，因?yàn)槔ハx宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)的草地夜蛾細(xì)胞)不具有DNA甲基化酶，因此，不能在轉(zhuǎn)錄水平上使病毒的原病毒DNA失活。一般，桿狀病毒表達(dá)載體包括一個桿狀病毒基因組，其帶有待表達(dá)的DNA，該DNA被插入多角體蛋白基因中，位于能受桿狀病毒多角體蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄控制的位置。
用上述組織培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的改性病毒，可用諸如超濾之類的技術(shù)視需要進(jìn)行提純和/或純化，然后再與其它成分混合，以形成包含于可以藥用的載體中的改性病毒。4.藥物配方這里披露一種組合物，其含有由本發(fā)明的細(xì)胞系所產(chǎn)生的減毒病毒顆粒。該組合物可以包含任何可以藥用的載體(如滅菌的無熱原生理鹽水溶液，或滅菌的無熱原磷酸緩沖鹽溶液)。一般，該組合物是通過將以上所生產(chǎn)的病毒顆粒與一種可以藥用的載體接觸并混合而制成的。視最終用途，該組合物的病毒顆?？梢圆捎没畹摹缁畹?、固定的或凍干的形式中最適用的一種。該組合物中含有免疫劑量的病毒顆粒，這一劑量視用途而定。特定數(shù)量本發(fā)明病毒的免疫活性，可以用本領(lǐng)域多種公知方法中的任一種測定。服用后，抗一種特定病毒抗原的抗體效價的增加可以作為免疫活性的指標(biāo)。
可以服用本發(fā)明所披露的活的減毒病毒和配方的對象包括人體對象和動物對象(例如，用于靈長目，如梟猴(owl monkey)、絨猴和黑猩猩的獸醫(yī)治療，和用于其它哺乳動物種，如狗、貓、豬和馬，及非哺乳動物種，如鳥類(雞、火雞等)的治療)。
本發(fā)明的藥用組合物包含有免疫劑量的、在本發(fā)明中所披露的活的減毒病毒，該病毒與一種可以藥用的載體結(jié)合在一起?！懊庖邉┝俊笔侵缸阋约ぐl(fā)服用對象的免疫反應(yīng)的所述減毒病毒的量。所用的具體劑量并不重要，它取決于對象的類型和狀態(tài)、服用途徑等。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，確定本發(fā)明病毒顆粒的具體免疫劑量的技術(shù)是顯而易見的。例如，所述活性劑(病毒顆?；蚱渲苿?的用量可以為0.01～100μg/kg體重(例如0.5或1.0μg/kg)。
可以用任何合適方法服用本文所披露的活的減毒病毒，包括腸胃外注射(如腹膜內(nèi)注射、皮下注射、或肌內(nèi)注射)、口服、和用表面使用的方式將該病毒(通常含于藥用配方中)用于氣道表面。將病毒用于氣道表面的表面使用方法是通過鼻內(nèi)使用法(例如，用貯有鼻內(nèi)使用的藥物的滴管、藥簽或吸入器)實(shí)現(xiàn)的。將病毒用于氣道表面的表面使用方法還可以通過吸入法實(shí)現(xiàn)，如通過制備含有病毒的可吸入的藥物顆粒(包括固定顆粒和液體顆粒)作為氣溶膠懸浮液，然后讓對象吸入這種可吸入的顆粒。用于服用可吸入的藥物顆粒的方法和裝置眾所周知，而且任何常見技術(shù)均可使用。例如，見授予D.Leith的美國專利US5,304,125；授予C.Davis和R.Snyder的美國專利US 5,299,566；授予R.Fisher和W.Metzger的美國專利US 5,290,550；以及授予R.Boucher的美國專利US 5,292,498。
可以通過已知方法用能產(chǎn)生活病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物制備口服疫苗，所述病毒含有想要的減毒突變?？山o對象服用所述培養(yǎng)物本身；可有選擇地過濾和/或澄清該培養(yǎng)物；可將蔗糖、MgCl2等之類的穩(wěn)定劑加入培養(yǎng)基中?？捎糜诳诜乃幱幂d體可以是糖漿、酏劑、錠劑等?？砂凑找阎夹g(shù)制備所述疫苗配方，如由R.Purcell等所述的方法(Vaccine AgainstHepatitis A Virus，US 4,894,228)。
盡管上文中對本發(fā)明病毒、方法和配方的說明是結(jié)合通過服用疫苗配方以產(chǎn)生保護(hù)性免疫的形式進(jìn)行的，但也可以用于使動物免疫，僅僅使動物產(chǎn)生抗體，然后收集抗體，用于按照常規(guī)診斷技術(shù)檢測和/或診斷各種病毒感染或生物樣品中病毒顆粒的存在。一般參見E.Maggio，Enzyme Immunoassay(1980)；同樣參見US 4,659,678,US4,376,110,US4,275,149，US4,233,402和US 4,230,767。5.寡核苷酸探針本發(fā)明的一個優(yōu)點(diǎn)是，可用于檢測野生型病毒的感染，即使在已接種之后也行。例如，使用了一種完整或接近完整病毒的疫苗可以產(chǎn)生對該病毒的免疫反應(yīng)，從而不能用標(biāo)準(zhǔn)的免疫或核酸檢測方法檢測隨后的感染。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)由于代表了在DNA水平上的全新創(chuàng)造，因此，可用分子探測法方便地加以區(qū)分。因此，可以制備對野生型病毒有專一性但不會與本發(fā)明的病毒雜交的探針，而且可以制備特異地結(jié)合本發(fā)明的病毒但不能與野生型病毒結(jié)合的探針。
因此，本發(fā)明的另一方面是一種寡核苷酸探針，可將其用于區(qū)分(i)一種自然界所沒有的減毒病毒，與相應(yīng)的野生型病毒相比，其基因組中含有至少一個額外的甲基化位點(diǎn)，和(ii)相應(yīng)的野生型病毒。所述寡核苷酸探針選自(a)在相同的雜交條件下，能選擇性地與上述(i)的減毒病毒的核酸雜交，但不能與上述(ii)的野生型病毒的核酸雜交的寡核苷酸探針；和(b)在相同的雜交條件下，能選擇性地與上述(ii)的野生型病毒的核酸雜交，但不能與上述(i)的減毒病毒的核酸雜交的寡核苷酸探針。所述探針可以為任何合適的長度，只要具有想要的結(jié)合特異性就行。所述探針的長度通常至少為8～12個核苷酸，也可以高達(dá)20～40個核苷酸或更多。所述探針可以是任何合適的核酸，包括DNA和RNA。可以通過各種技術(shù)，包括直接共價鍵用一種可檢測到的基團(tuán)(例如，諸如32P、125I、131I、3H、14C或35S之類的放射性同位素；諸如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶之類的酶)標(biāo)記或綴合所述探針。所述探針可以是一個探針或是一對探針中的一員，可用于核酸擴(kuò)增方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、或鏈置換擴(kuò)增(SDA)。使用這種探針的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，參見授予Falkow和Mosley的美國專利US4,358,535；授予Wahl和Stark的美國專利US 4,302,204；授予Stavrianopoulos的美國專利US 4,994,373；授予Walker等的美國專利US,5,270,184；而對于PCR，參見US4,683,195,US 4,683,202,US4,800,159和US 4,965,188。
下面的非限定性實(shí)施例將對本發(fā)明做更詳細(xì)的說明。
例1在HIV-1基因組中引入CpG位點(diǎn)HIV-1菌株HIVHXB2CG(見F.Wong-Staal等，Nature，313，277-284，(1985))的基因組序列獲自GENBANK(保藏號K03445)。確定該序列上可以加入沉默置換突變，以便將額外的CpG片段引入該基因組的位點(diǎn)，并按以下方法合成一種編碼所述HIV-1基因組的非天然衍生物的新DNA。
通過亞磷酰胺化學(xué)法在一臺Applied Biosystems Model 394DNA/RNA合成儀(Applied Biosystem公司，850 Lincoln Centre Drive.Foster City，加利福里亞，94404，美國)上合成長度為75個堿基的單鏈DNA片段。在55℃溫度下對每個75bp的雙鏈DNA片段進(jìn)行脫保護(hù)12小時，并進(jìn)行干燥，以除去氫氧化銨。在脫保護(hù)步驟中保留了三苯甲游基。然后通過NENSORBTM層析將完整長度的75bp片段同制劑中較短的“殘缺”片段分開。這樣可以起到避免將較短的殘缺片段加在較長的片段上。
制備互補(bǔ)片段，并一起退火，使重疊末端有4個堿基，以產(chǎn)生長度為75個堿基的雙鏈DNA片段。接著，將每個新的75bp的雙鏈DNA片段與先前的片段連接，以組成延長的雙鏈DNA片段，其最終成為序列1所示的完整的修飾HIV-1基因組(HIV-1CpG-1)。
用常規(guī)技術(shù)將合適的剪接片段加在所述完整基因組的每個末端，并將該基因組插入一種表達(dá)載體。
比較例A比較HIV-1菌株HIVHXB2CG和菌株HIV-1CpG1中的CpG位點(diǎn)HIVHXB2CG基因組中的CpG含量在圖2中以曲線形式表示。為清楚起見，將HIV的基因結(jié)構(gòu)也示于該曲線圖中。
HIV-1CpG1基因組的CpG含量由圖3中的曲線表示?？梢钥闯?，與圖2所示的野生型基因組相比，其CpG含量顯著提高。與HIVHXB2CG相比，HIV-1CpG1有948個新的CpG位點(diǎn)(表明其CpG片段增加了10倍以上HIVHXB2CG中有97個；HIV-1CpG1中有1045個)。實(shí)測的與預(yù)期的CpG二核苷酸的比例(CpGo/e)由HIVHXB2CG的CpGo/e值0.22，提高到HIV-1CpG-1的CpGo/e值1.68。這表明CpGo/e提高了大約8倍。在極端情況下(例如，有幾百個新的CpG甲基化位點(diǎn)被插入病毒基因組，如實(shí)施例中改性的基因組HIV-1CpG-1)，這將導(dǎo)致GC/CT之比高于野生型病毒中的GC/CT比。因此，HIV-1CpG-1的GC/AT比為1.05，而野生型基因組HIVHXB2CG中這一比例為0.74。HIV-1CpG-1與HIVHXB2CG的堿基數(shù)的比較如下
可以看出，與HIVHXB2CG相比，HIV-1CpG-1少了615個腺嘌呤和211個胸腺嘧啶，但多了424個胞嘧啶和402個鳥嘌呤。在改性的基因組中，GC/AT之比無顯著增加，在這些改性的基因組中僅需插入少量(如，少于10個)的CpGs以中斷其病毒生活周期。HIVHXB2CG的GC/AT比為0.74；而HIV-1CpG-1的GC/AT比為1.05。
例2HIV-1基因組在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)從Clontech公司(其在美國的電話號碼是415-424-8222)獲取BACKPACKTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。將上述例1中的基因組DNA片段連接在pBacPAK8TM(或PBacPAK9TM)的多克隆位點(diǎn)上，形成一種重組載體，使該基因組DNA的表達(dá)受載體上的強(qiáng)AcMNPV多角體蛋白啟動子的控制。用上述重組載體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的草地夜蛾細(xì)胞，并按生產(chǎn)商的說明在培養(yǎng)的細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明的病毒。
以上實(shí)施例是用于說明本發(fā)明的，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。本發(fā)明由以下的權(quán)利要求進(jìn)行限定，與這些權(quán)利要求相當(dāng)?shù)膬?nèi)容也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人Nyce，Jonathan W.(ii)發(fā)明名稱減毒病毒及其制備方法(iii)序列數(shù)1(iv)相關(guān)地址(A)收件人Kenneth D.Sibley(B)街道郵政信箱34009(C)市Charlotte(D)州North Carolina(E)國家美國(F)郵編28234(v)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0 Version#1.30(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/319，974(B)申請日07-10-1994(C)分類號(viii)律師/代理人信息(A)姓名Sibley，Kenneth D.(B)注冊號31,665(C)文件/檔案號5218-27(ix)電信信息(A)電話919-881-3140(B)傳真919-881-3175(C)電傳575102(2)序列1的信息(i)序列特征(A)長度9718bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列表達(dá)序列1TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAACGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 60CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGATC AGATATCCAC 120TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGAGAAGTTA GAAGAAGCCA 180ACAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGAATG GATGACCCGG 240AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC ATGGCCCGAG 300AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GACATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 360CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG 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權(quán)利要求
1.一種自然界所沒有的減毒病毒，與相應(yīng)的野生型病毒相比，該病毒的基因組中至少含有一個額外的甲基化位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1的減毒病毒，所述病毒包括一個含有所述基因組的病毒衣殼。
3.如權(quán)利要求1的減毒病毒，與相應(yīng)的野生型病毒相比，其含有至少10個額外的甲基化位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1的減毒病毒，與相應(yīng)的野生型病毒相比，其含有至少100個額外的甲基化位點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述甲基化位點(diǎn)是CG片段。
6.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述病毒是DNA病毒。
7.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
8.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述病毒選自以下逆轉(zhuǎn)錄病毒B型逆轉(zhuǎn)錄病毒、C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、T細(xì)胞白血病病毒和起泡病毒(foamy virus)。
9.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述病毒是HIV-1。
10.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述病毒是SIV。
11.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述病毒是HTLV-1。
12.如權(quán)利要求1的減毒病毒，其中所述病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中包括一個減毒的缺失突變。
13.一種編碼權(quán)利要求1的病毒的DNA。
14.一種含有權(quán)利要求13的DNA的表達(dá)載體。
15.如權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其中該表達(dá)載體是桿狀病毒。
16.一種宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求13的DNA并能夠表達(dá)所編碼的病毒，該宿主細(xì)胞不會將所述DNA甲基化到足以使其所編碼的病毒基因組的表達(dá)失活的程度。
17.如權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，用一種甲基化抑制劑處理該宿主細(xì)胞可以使其失去將DNA甲基化的能力。
18.如權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述甲基化抑制劑是5-氮脫氧胞苷或5-氮胞苷。
19.一種藥物配方，包括權(quán)利要求1的病毒及一種可以藥用的載體。
20.如權(quán)利要求19的配方，其中該配方是口服配方。
21.如權(quán)利要求19的配方，其中該配方是腸胃外注射用疫苗配方。
22.如權(quán)利要求19的配方，其中該配方是吸入配方。
23.一種在受治對象體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，包括給所述對象服用權(quán)利要求1的病毒，其用量為能在所述對象體內(nèi)有效產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
24.如權(quán)利要求23的方法，其中所述服用步驟是通過給所述對象口服所述病毒而實(shí)現(xiàn)的。
25.如權(quán)利要求23的方法，其中所述服用步驟是通過給所述對象腸胃外注射所述病毒而實(shí)現(xiàn)的。
26.如權(quán)利要求23的方法，其中所述對象是動物。
27.如權(quán)利要求23的方法，其中所述對象是人。
28.一種制備自然界所沒有的減毒病毒的方法，與相應(yīng)的野生型病毒相比，該病毒基因組中含有至少一個額外的甲基化位點(diǎn)；所述方法包括以下步驟提供一種含有一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有編碼所述減毒病毒的DNA，所述宿主細(xì)胞不能將所述DNA甲基化到足以使其所編碼的病毒基因組的表達(dá)失活的程度；以及在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述減毒病毒。
29.如權(quán)利要求28的方法，所述病毒基因組與相應(yīng)的野生型病毒相比含有至少10個額外的甲基化位點(diǎn)。
30.如權(quán)利要求28的方法，其中所述病毒是DNA病毒。
31.如權(quán)利要求28的方法，其中所述病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。
32.如權(quán)利要求28的方法，其中所述表達(dá)載體是桿狀病毒。
33.如權(quán)利要求28的方法，其中所述宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求28的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
35.一種用于區(qū)別(i)一種自然界所沒有的減毒病毒，與相應(yīng)的野生型病毒相比，它含有至少一個額外的甲基化位點(diǎn)；和(ii)所述相應(yīng)的野生型病毒的寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針選自(a)在相同的雜交條件下，能選擇性地與上述(i)的減毒病毒的核酸雜交，但不能與上述(ii)的野生型病毒的核酸雜交的寡核苷酸探針；和(b)在相同的雜交條件下，能選擇性地與上述(ii)的野生型病毒的核酸雜交，但不能與上述(i)的減毒病毒的核酸雜交的寡核苷酸探針。
36.如權(quán)利要求35的寡核苷酸探針，與一種可檢測到的基團(tuán)綴合。
37.如權(quán)利要求35的寡核苷酸探針，其中所述探針是一種PCR延伸引物。
全文摘要
披露了自然界所沒有的減毒病毒，與相應(yīng)的野生型病毒相比，在這種病毒的基因組中含有一個或幾個額外的甲基化位點(diǎn)。最好是通過沉默突變的方式將一個額外的CG片段引入所述病毒的基因組，從而將甲基化位點(diǎn)加入該基因組中。所述減毒病毒可用于產(chǎn)生免疫反應(yīng)，包括在動物體內(nèi)產(chǎn)生用于診斷的抗體，和在受治對象體內(nèi)誘發(fā)保護(hù)性免疫。還披露了制備所述減毒病毒的藥物配方和方法。
文檔編號C12N7/00GK1169161SQ95196131
公開日1997年12月31日 申請日期1995年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月7日
發(fā)明者J·W·尼瑟 申請人:東卡羅來納大學(xué)