專利名稱：用于中樞神經系統(tǒng)再生的營養(yǎng)因子的制作方法
背景技術：
本發(fā)明總體上涉及中樞神經系統(tǒng)損傷的治療方法，具體地說，涉及營養(yǎng)因子在脊髓再生方面的應用。
兒童早期之后，中樞神經系統(tǒng)(CNS)損傷會造成幾乎不可逆轉的功能障礙。中風、創(chuàng)傷或其它原因造成的腦或脊髓的損傷，會導致一生失去認知、感覺和運動功能，甚至是維持生命的功能。失去的神經細胞不會被替代，未受傷害的細胞也不會再長出已割斷的連接，盡管損傷處會有少量局部突觸重組。已失去的功能是目前不能治療的。
CNS不能再生是由于以下幾個因素造成的，包括膠質細胞表面的抑制分子阻遏軸突生長；缺乏促進生長的適當底物分子如層粘連素；缺乏適當的用來激活細胞存活和分化所必需的基因表達程序的營養(yǎng)因子。
相反，外周神經系統(tǒng)(PNS)中受傷的神經纖維可重新長出很長距離，最終極好地恢復功能。在過去15年里，神經科學家意識到這不是由于外周與中樞神經系統(tǒng)的神經細胞有內在差別；如果能夠在嫁接的PNS(例如坐骨神經)片段上生長，CNS的神經元能明顯將軸突延伸很長距離。因此，如果從細胞外環(huán)境給予適當的信號，CNS的神經元仍有生長能力。造成CNS和PNS生長潛力不同的因子包括圍繞CNS中神經纖維的少突神經膠質細胞表面上的部分被表征的生長抑制分子，這些分子在PNS的相似細胞群體(Schwann細胞)中數量要少；基膜或其它表面的分子，在PNS中促進生長，但在CNS中不存在(例如層粘連素)；激活細胞存活和分化所需的基因表達程序的可溶性多肽，即營養(yǎng)因子。盡管認為這些營養(yǎng)因子對維持神經細胞的存活和分化是必需的，但哪種特定營養(yǎng)分子誘導CNS中軸突再生尚不清楚。
與人類和其它高等脊椎動物不同，低等脊椎動物終生能夠再生出受傷的CNS通路(Sperry，R.W.(1994)神經生理學雜志(J.Neurophysiol.)，757-69；Sperry，R.W.(1963)美國國家科學院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，50703-710)。金魚中95％視網膜神經節(jié)細胞在視神經受損傷能存活(Meyer等(1985)，比較神經學雜志(J.Comp. Neurol.)23927-43)并能在一兩個月內與視頂蓋(optic tectum)和其它靶區(qū)域的細胞重新形成結構上有組織的功能性連接(綜述見Grafstein (1986)，作為再生器官的視網膜，在R.Alder和B.D.Farber編的《視網膜細胞生物學研究模型II》，學術出版社，紐約，275-335；Jacobson，(1991)，《發(fā)育神經生物學》，第三版(Plenum出版公司，紐約))。已深入地研究了伴隨這一過程的細胞與分子變化。視網膜神經節(jié)細胞經歷大量的新陳代謝與形態(tài)學的變化，包括核仁明顯變大，游離核糖體增多，細胞直徑增大(Murray和Grafstein，(1969)，實驗神經學(Exp.Neurol.)23544-560；Murray和Forman，(1971)，腦研究(Brain Res.)，32287-298)。觀察到以下物質的基因的表達明顯增加編碼細胞骨架某些組分的基因(Burrell等(1978)，神經化學雜志(J.Neurochem.)，31289-298)；Heacock和Agranoff，(1982)，神經化學研究(Neurochem.Res.)7771-788；Giulian等(1980)，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，2556494-6501；Quitschke和Schechtel(1983)，腦研究，25869-78；Glasgow等(1994)，歐洲分子生物學組織雜志(EMBO J.)13297-305；Glasgow等，(1992)，神經元(Neuron)，9373-381)，細胞表面粘連分子(Vielmetter等(1991)，神經科學雜志(J.Neurosci)，113581-3593；Bastmeyer等(1990)發(fā)育(Development)，108299-311；Paschke等(1992)，細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)，117863-875；Blaugrund等，1990；Baettisti等(1992)，神經細胞學雜志(J.Neurocytol.)21557-73)，幾種加入到生長中的神經未鞘膜的蛋白，尤其是GAP-43(Benowitz等(1981)，神經科學雜志，1300-307；Heacock和Agranoff(1982)；Perrone-Bizzozero等(1987)，神經化學雜志，48644-652；Perry等(1987)，神經科學雜志，7792-806；LaBate和Skene(1989)，神經元，3299-310；Wilmot等(1993)，神經科學雜志，13387-401)。其它物種視神經的發(fā)育與再生也與同樣變化相聯(lián)系(Skene和Willard(1981)，細胞生物學雜志，8986-95，細胞生物學雜志，8996-103；Moya等(1988)，神經科學雜志，84445-4454；Doster等，(1991)，神經元，6635-647)。
通常神經元損傷后再生軸突的能力受其周圍非神經元因素的強烈影響(Aguayo等(1991)，Phil.Trans.Royal Soc.London Series B，331337-343)。金魚視網膜離去通路中視神經膠質鞘細胞好象能提供強烈誘導軸突生長的環(huán)境(Bastmeyer等(1993)，膠質細胞(Glia)，81-11，Bastmeyer等(1991)，神經科學雜志，11626-640)。這部分是由于特定細胞表面和細胞外基質蛋白，包括類L1細胞粘連分子(Blaugrund等(1990)，腦研究，530239-244；Bastmeyer等(1993)；Bastmeyer等(1991)；Vielmetter等，1991；Battisti等，(1992))，層粘連素(Hopkins等(1985)，神經科學雜志，53030-3038)和硫酸軟骨素蛋白多糖(Battisti等，1992)的表達。同時，金魚視神經膠質細胞在表面表達生長抑制蛋白的水平好象比哺乳動物CNS少突神經膠質細胞要低(Caroni和Schwab(1988)，細胞生物學雜志，1061281-1288；Schwab和Caroni(1988)，神經科學雜志，82381-2393；Bastmeyer等，1991；Sivron等(1994)，魚類視神經髓鞘質中生長抑制物的存在損傷后的變化，比較神經學雜志，343237-246)。
除了細胞表面組分，金魚視神經細胞也分泌促進軸突從金魚視網膜外植體(Mizrachi等(1986)，神經化學雜志，461675-1682)，哺乳動物胚胎神經元(Finkelstein等(1987)，腦研究，413267-274；Caday等，1989)和成熟兔視網膜(Schwartz等(1985)，科學，228600-603)長出的可溶因子。膠質細胞和視神經小噬細胞分泌的蛋白包括載脂蛋白A(apolipoprotein A)(Harel等(1989)，神經化學雜志，521218-1228)，血纖維蛋白溶酶原激活物(Salles等(1990)，歐洲分子生物學組織雜志，92471-2477)，白介素-2(Eitan等，1992)，一種轉谷酰胺酶(Eitan和Schwartz(1993)，科學， 261106-108)，和血小板來源的生長因子(Eitan等(1992)，美國國家科學院院刊，895442-5446)。
盡管有這些發(fā)現，引發(fā)軸突從視網膜神經節(jié)細胞生長的因子仍然未知。這方面的研究通常在體內進行或是利用從已通過有條件(conditioning)損傷在體內引發(fā)了再生的動物中得到的視網膜外植體(Landreth和Agranoff(1976)，腦研究，118299-303；Landreth和Agranoff(1979)，腦研究，16139-53；Turner等(1981)腦研究，204283-294；Turner等(1982)，腦研究進展(Dev.Brain Res.) 459-66；Schwatz等1985；Yip和Grafstein(1982)，腦研究，238329-339；Hopkins等，1985；Lima等(1989)，國際發(fā)育神經科學雜志(lnt.J.Devl.Neuroscience)，7375-382)。除非體內再生過程已經開始，否則許多受檢測的藥劑都不能加大生長，這一事實提示引發(fā)再生必需的因子的來源不在外植體培養(yǎng)物，例如視神經膠質細胞，循環(huán)系統(tǒng)或其它腦組織(Johnson和Turner，(1982)，神經科學研究雜志(J.Neurosci.Res.)8315-329)中。營養(yǎng)因子的一般性綜述見《(發(fā)育神經生物學》M.Jacobson(第三版，Plenum出版公司，紐約，1991，第8章和第11章)；《分子神經生物學》，Z.Hall編(Sinauer出版公司，Sundeland，麻省，1992，第11和12章)。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種方法，用于得到引發(fā)哺乳動物神經連接再生的分子信號。
本發(fā)明進一步的目的是提供引發(fā)哺乳動物神經組織再生的因子。
本發(fā)明另一目的是提供治療脊髓和其它中樞神經系統(tǒng)組織損傷的方法。
發(fā)明概述研究出細胞培養(yǎng)條件能在成分確定無血清的條件下維持視網膜神經細胞。激活軸突再生的分子因子由圍繞神經纖維的膠質細胞釋放。從金魚神經元和哺乳動物中樞神經系統(tǒng)(CNS)膠質細胞中分離出這些因子并表征。圍繞金魚視神經軸突的膠質髓鞘細胞釋放兩種激發(fā)并維持神經再生的分子。一種分子被稱為軸突生成因子1(AF-1)，是小分子量多肽，大小約1000Da，質譜顯示為707Da。另一種分子AF-2是大小約12,000Da的較大蛋白。AF-1在CM中的濃度比在視神經勻漿中的濃度大得多，表明它被有效地分泌；AF-2的細胞內和細胞外濃度相似。
研究表明這些因子積極參與CNS再生，因而可用于治療視神經、腦、脊髓和其它神經組織的損傷。例如在解離的細胞培養(yǎng)物中，金魚視網膜神經節(jié)細胞能響應兩種來自視神經鞘細胞的因子再生出軸突。沒有這些因子，解離的視網膜細胞在無血清的組成確定的培養(yǎng)基中存活至少一個星期，用活性染料5，6-二乙酸羧基熒光素(5，6-CFDA)顯色，顯示生長很少。加入AF-1誘導培養(yǎng)物中多達25％的細胞在6天內突起伸展長于75μm；AF-2效果較小但也很明顯。為了驗證軸突生長來自視網膜神經節(jié)細胞本身，將親脂性染料4-Di-10-ASP加到視頂蓋，使其沿視神經擴散若干天，再培養(yǎng)視網膜。與整個細胞群體中的相比，含有染料的細胞表現出軸突生長的百分比例要高得多，表明神經節(jié)細胞是這些因子的選擇性靶。AF-1或AF-2的作用并非存活率升高的結果，因為總體細胞存活與6天后培養(yǎng)物中剩下的視網膜神經節(jié)細胞數目均不受這些因子影響。在濃度變化很大的范圍內，檢測了幾種特定的因子，包括神經生長因子，BDNF，NT-3，CNTF，?；撬幔暬撬?，酸性和堿性成纖維生長因子，它們均不能模仿AF-1和AF-2的活性。在視網膜神經節(jié)細胞培養(yǎng)物中檢測哺乳動物脊髓的速率(rate)和神經元時，金魚細胞的AF-1有活性。用相同試驗觀察到分離自新生鼠腦的AF-1有與分離自金魚細胞的AF-1相似的活性。
附圖簡述

圖1a是軸突生長量的直方圖用CM以指定的0％、5％、10％和15％濃度培養(yǎng)神經細胞5天后測量軸突長度分布。突起長度為1-5個細胞直徑的細胞數目(淺陰影)；突起長度大于5個細胞直徑的細胞數目(暗陰影)。數值是每個CM濃度4個小孔的平均值；誤差條(errorbar)給出平均值標準差(SEM)。
圖1b是兩個獨立實驗的劑量效應曲線，顯示軸突生長(軸突長大于5個細胞直徑的百分比)對CM濃度增加(0％、5％、10％和15％)的響應。數據顯示突起長度超過5個細胞直徑(截點基于圖1a中的直方數據選出)的細胞百分比。兩個實驗中都是對10％濃度的CM有最大的生長響應(即，總蛋白濃度約10μg/ml)。誤差條在小于1％時不畫出。
圖1c是兩個獨立實驗中細胞存活與CM濃度的關系圖(在14個連續(xù)的顯微視場中記數5，6-CFDA標記的細胞，對4個小孔取平均，用L-15對照值歸一化)。
圖2a和2b是軸突生長促進活性相對于CM分子量分數(sizefraction)的圖。圖2a中CM得自未受損傷的視神經(第0天)或得自已損傷了3或7天的視神經，用超速離心(3,000Da為截點)分成高分子量和低分子量級分。所有情況下，低分子量(淺陰影)和高分子量(深陰影)級分均有高水平的軸突生長促進活性，圖2b比較了對照，CM和用分子量1000Da為截點分離得的CM。圖2c是用體積排阻高效液相色譜(光密度OD280nm處讀數)分離得的CM高分子量級分的色譜圖。高分子量級分濃縮70倍再分成1ml的小份(帶數字的橫線)。箭頭示出分子量校準標準(BSA，牛血清白蛋白；Ova，卵白蛋白；Cyto c，細胞色素C)的保留時間。圖2d是軸突生長相對于25％濃度試驗時柱級分的圖(在起始材料基礎上計算)。對各級分首先成對地生物檢測；若檢測到活性，則再單獨檢測，否則再成對檢測。只有12和13級分有明顯的軸突生長促進活性。
圖3是軸突生長圖，顯示低分子量因子AF-1可用雙相溶劑萃取系統(tǒng)分離。陰性對照是培養(yǎng)基本身；陽性對照，泳道2，是膠質鞘細胞分泌到培養(yǎng)基中的分子的低分子量部分，CM小于3,000Da，誘導高水平的軸突生長。將此材料于pH7.5同有機溶劑異丁醇混合，水相只剩很少活性(水相pH7.5)。然后有機相與低pH緩沖液(水相pH2)混合，生物活性分子進入水相，有機相沒有留下任何東西(有機相pH2)。
圖4是軸突生長圖，顯示含有低分子量營養(yǎng)因子AF-1的部分純化提取物，用反相HPLC分離，活性成分出現在特定柱級分(FC，FD，FE)中。如圖3，陰性對照(L-15)是組織培養(yǎng)基本身；陽性對照是視神經膠質分泌的分子中未分離的低分子量組分(lCM小于3,000Da，10％濃度)；FA-FI顯示出HPLC分離的柱級分。
圖5a和5c是對照以及在神經基本(Neurobasal)培養(yǎng)基(圖5a)或加血清的Dulbecco’s基本培養(yǎng)基(圖5c)中培養(yǎng)的大鼠胚胎期第15天的脊髓中AF-1處理后解離的神經元之中軸突大于10個細胞直徑的細胞所占分數的圖。圖5b和5d是對照以及在神經基本培養(yǎng)基(圖5b)或加血清的Dulbecco’s基本培養(yǎng)基(圖5d)中培養(yǎng)的大鼠胚胎期第15天的脊髓中AF-1處理后解離的神經元之中在1個顯微視場×1個小孔半徑的柱中可存活細胞的圖。實驗在盲視化的一式四份的樣本中進行。條棒顯示平均值±平均值標準差(SEM)。
圖6a是顯示軸突生長的圖，顯示用MEM或GCM-D中2％的AF-1溫育的大鼠視網膜神經節(jié)細胞中具有某些指定的長度(以細胞直徑為單位)的細胞的分數。圖6b是顯示細胞存活能力的圖，顯示用MEM或GCM-D中2％AF-1溫育的大鼠視網膜神經節(jié)細胞在14個顯微視場中的可存活細胞數。實驗在盲視化的一式四份樣本中進行，條棒顯示平均值±平均值標準差(SEM)。
圖7是顯示哺乳動物膠質細胞分泌一種類似AF-1的因子的圖，對來自金魚視網膜神經節(jié)細胞培養(yǎng)物的對照膠質培養(yǎng)物，以及用來自在含血清培養(yǎng)基(“MGCM”)中長到接近匯合的新生鼠腦培養(yǎng)物的部分分級分離的膠質調節(jié)過的培養(yǎng)基溫育的培養(yǎng)物，顯示軸突生長長度超過5個細胞直徑的細胞百分比。用超濾將MGCM分成高分子量和低分子量組分，檢測分子量小于1000D(MGCM＜1kDa (20％)的級分，該級分的不結合疏水性反相C-18柱(4，5和6，7級分)的次級級分也要檢測。陽性對照是含有金魚AF-1的高度活性的樣本。
發(fā)明詳述I.引發(fā)神經再生的分子信號的發(fā)現許多研究涉及低等脊髓動物再長出受損的視神經的能力，目的是了解CNS發(fā)育與可塑性。為了搞清誘發(fā)視網膜神經節(jié)細胞再生出軸突的內源因子的性質，開發(fā)了一種在無血清的成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的金魚視網膜解離模型。在這種條件下，視網膜神經節(jié)細胞響應兩種來自金魚視神經的可溶因子，伸出長的類似軸突的突起。一種因子，被稱為軸突生成因子1(AF-1)，是熱穩(wěn)定的，蛋白酶敏感的小分子。能穿過1kDa截斷濾膜，質譜鑒定質量為707Da；另一種因子，AF-2，是熱不穩(wěn)定蛋白，大小約12kDa。
這些研究如下進行。破壞眼窩后視神經，三天后，取出視神經和視束，切成0.5到1mm的小片，在HEPES緩中的L15培養(yǎng)基中溫育3到4小時。過濾該條件培養(yǎng)基，經過離子交換、HPLC反相以及體積排阻色譜，純化那些在培養(yǎng)基中誘導解離的視網膜長出軸突的因子。切下正常金魚的視網膜，用木瓜蛋白酶處理45分鐘，溫和研磨，沉淀去除大塊組織，得到培養(yǎng)物。每種條件下取3到6個小孔，根據培養(yǎng)5天后軸突長于或等于5個細胞直徑的大約存活細胞的分數隨機地對軸突生長打分，用5(6)-二乙酸羧基熒光素評價存活力。
一種對胰蛋白酶敏感的熱穩(wěn)定堿性蛋白，Mr＝10至15kDa，誘導軸突生長增長若干倍。另一不同的軸突生長促進活性峰處的Mr小于1000kDa。這些研究顯示金魚視神經分泌多種可能分別對軸突生長有貢獻的營養(yǎng)因子。
本文，在基線條件下，用活性染料5，6-二乙酸羧基熒光素(5，6-CFDA)評價，細胞可存活至少一周，但生長很少。加入含有視神經支持細胞分泌的分子(AF-1和/或AF-2)的條件培養(yǎng)基(CM)能誘導最多可達25％的神經元5到6天后突起伸長大于等于5個細胞直徑。某些情況下，伸長超過300μm。為了證實該生長是來自視網膜神經節(jié)細胞(RGC)本身，在切下視網膜前5到7天在視蓋區(qū)加上親脂性染料4-D-10Asp。培養(yǎng)6天后用4-Di-10Asp逆行標記的細胞與整個群體相比，神經生長多一倍，顯示CM選擇性地作用于RGC?？磥鞢M的效果并非由于存活率增加而引起，因為整個群體中4-Di-10Asp標記的細胞的百分比和整個細胞的存活率均不受CM影響。
AF-1和AF-2不象是任何一種以前從金魚視網膜神經的CM中鑒定出的分子。Mizrachi等(1986)描述視神經CM中的一種10kDa蛋白，在中性pH下結合DEAE并能吸附上多聚賴氨酸底物。該蛋白能增強已經在體內開始再生出軸突的視網膜外植體的軸突生長，但不能誘導未激活的視網膜生長。AF-2除了誘導未激活的視網膜神經節(jié)細胞生長外，甚至在pH8.4時也不結合DEAE，也不吸附于底物。其它不同于本文描述的分子的CM組分包括載脂蛋白A，一種28kDa蛋白，結合硫酸酐素蛋白多糖，可能參與脂類運輸(Harel等，1989)；一種60-65kDa血纖維蛋白溶酶原激活物，可能參與細胞外基質的蛋白水解，因而允許生長的軸突向前延伸(Salles等，1990)；一種類似白介素-2(IL-2；Eitan等，1992)的28kDa蛋白；一種轉谷酰胺酶，可參與IL-2二聚化，使其對少突神經膠質細胞有毒(Eitan和Scnwartz，1993)；血小板來源的生長因子(Eitan等，1992)；一種酸性26kDa蛋白，其結合多聚賴氨酸底物，并且誘導胚胎期哺乳動物神經元伸展出長的不分叉的軸突(Caday等(1989))分子腦研究(Mol.Brain Res.)545-50)；以及層粘連素，一種106kDa糖蛋白，細胞外基質的主要組成部分(Hopkins等(1985)；Battisti等，1992；Reichardt和Tomaselli(1991)神經科學年度綜述(Ann.Rev.Neurosci)，14531-70)；Giulian等(1986a)，細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)102803-811；Giulian和Young(1986b)，細胞生物學雜志，102812-820描述了3、6、9和125kDa多肽，在視神經損傷后由頂蓋區(qū)分泌，參與某些大神經膠質細胞群體增殖。最后，一組分子量大于或等于37kDa的糖蛋白(室管膜蛋白或X-EP)，由脈絡叢細胞分泌(Thormodsson等(1992)，實驗神經學(Exp.Neurol.)，118275-283)和室管膜下層(Shashoua(1985)，細胞分子神經生物學(Cell.Mol.Neurobiol.)，5183-207)細胞分泌，已表明在激活的外植體中促進軸突生長(Schmidt等，1991)。并未發(fā)現具有這些性質的分子在本文描述的系統(tǒng)中有活性，這一事實表明(a)其對于RGC的作用太小，本試驗檢測不到，(b)它們僅對先在體內激活的RGC起作用，或(c)其首先作用于另一類細胞，后者再作用于REC。II.營養(yǎng)因子的表征體積分離研究顯示CM含有兩種活性組分。第一種分子，被稱為軸突生成因子1(AF-1)，能通過1KD截斷濾器。它是熱穩(wěn)定的，但對蛋白酶K消化敏感。第二種分子，AF-2，大小為12KD，熱不穩(wěn)定，對胰蛋白酶敏感。AF-1在CM中比在視神經勻漿中濃度要高，表明它是被活躍分泌的；AF-2在胞內和胞外的濃度相似。
無論是否已通過激活性損傷在體內引發(fā)了再生應答，這兩種因子均能從RGC中誘導出強烈的軸突生長。而且，由條件性損傷激活生長的神經節(jié)細胞在沒有這兩種因子時基本不生長。因此，在本實驗條件下，需要AF-1和/或AF-2來誘導和維持軸突再生。
金魚視神經包括幾種細胞類型，如少突神經膠質細胞，星形細胞，巨噬細胞，小膠質細胞和上皮細胞(Battisti等，1992)。營養(yǎng)因子可由上述任一種細胞分泌或可選地，只由破壞神經或切割培養(yǎng)物等損傷的細胞的細胞質釋放。為澄清這一點，比較條件培養(yǎng)基(CM)中的和制備自視神經勻漿中的細胞漿組分中的兩種因子的濃度。發(fā)現AF-1在CM中的濃度比在視神經細胞漿中的高得多，表明它是被活躍分泌的。而AF-2在細胞內和細胞外濃度相近。如果CM中絕大多數蛋白是由細胞裂解而來，則在細胞內外等濃度的蛋白僅存在于細胞內，盡管生理上該蛋白在神經損傷后可出現在胞外。然而，若絕大多數細胞外蛋白是由活躍分泌機制而來，則AF-2可能一般地生理性地分泌。與C.Stormier博士(康斯坦茨大學，德國)合作的研究表明，含有由解離的金魚視神經膠質分泌的因子的培養(yǎng)基含有相當高水平的小于3,000Da的一種營養(yǎng)因子，以及水平較低的另一種大于3,000Da的營養(yǎng)因子。這些發(fā)現表明視神經膠質細胞是AF-1和AF-2的來源，受損的軸突或血都不是。由于被多種其它組織調節(jié)的培養(yǎng)基中均無促進軸突生長活性，也表明后一種來源不太可能。
AF-1和AF-2的表征起初通過在物質通過分子量濾器或特定分子篩后檢測是否存在營養(yǎng)活性來表征AF-1和AF-2。可用幾種方法確定活性因子的大小。首先用截斷分子量分別為10，100和1000kDa的濾器通過超濾離心分離CM。用生物試驗檢測濾過物和滯留物。下一步，將CM通過一個6,000Da的脫鹽柱，用280nm吸收(對蛋白)和測量電導性(對于含鹽的小分子量級分)來監(jiān)測各級分。用生物試驗評價含有高分子量和低分子量組分的級分，發(fā)現兩者都具有活性。收集大于6,000Da的級分，用截斷值為3,000Da的濾器濃縮10到100倍，再用高效液相色譜(HPLC)分離。小于6,000Da的小分子量物質通過1,000Da截斷分子量的濾器進一步表征。
然后進行營養(yǎng)因子的陰離子交換色譜，例如上二乙基氨基乙基纖維素柱。首先用25mM HEPES洗柱，然后用溶于25mM HEPES中的0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl分步洗脫。
本文描述的用分子量和陰離子交換色譜純化AF-1和AF-2，足以得到可用來生成寡聚核苷酸探針的氨基酸序列，所述探針可以從基因文庫中篩選出編碼營養(yǎng)因子的克隆。
例如，純化的AF-1樣本被交給哈佛大學微化學機構(Microchemistry Facility)以便以最低的費用用質譜來確定其氨基酸組成和確切的分子量。該機構可以用最低的費用對多肽微測序(microsequence)。由于純化的級分含有游離氨基酸，優(yōu)選地在分析前將其除去。兒童醫(yī)院(Children’s Hospital)有一套裝置，可以生成編碼該肽序列的多個寡聚核苷酸，并容許遺傳密碼簡并。這些寡聚核苷酸可被放射性標記，用來篩選cDNA文庫，分離編碼產生AF-1的多肽的基因。然后對該基因測序，確定是否編碼正確的AF-1序列。
測序后，可通過在細胞培養(yǎng)物中表達重組序列，分離天然存在的營養(yǎng)因子，或在AF-1情況下優(yōu)選地用合成手段，得到蛋白。這些方法均為本領域專業(yè)人員所熟知。一個實施例為固相合成法，描述見J.Merrifield，美國化學學會雜志，85，2149(1964)，用于美國專利4,792,525號，也被描述于美國專利4,244,946號。其中受保護的α-氨基酸被偶聯(lián)到適當的樹脂上，從肽的C末端開始合成。其它合成方法的描述見于美國專利4,305,872號和4,316,891號。這些方法可用來合成與本文描述的營養(yǎng)因子序列相同或替換或添加氨基酸的肽，再如上述或下列實施例所述篩選活性。III.在診斷、篩選和分離營養(yǎng)因子中的應用進化保守性和其它營養(yǎng)因子的分離過去十幾年的研究清楚地表明，作為神經系統(tǒng)發(fā)育和功能基礎的分子元件在系統(tǒng)發(fā)育上十分古老，在脊椎動物進化過程中高度保守。控制基因表達程序的轉錄因子，即營養(yǎng)因子、細胞識別分子、遞質及其受體等分子在過去幾億年間引入注目地保持不變，因此可預計AF-1和AF-2的同源等價物也存在于包括人在內的高等脊椎動物的神經系統(tǒng)中，并可根據本文前面描述的魚和大鼠營養(yǎng)因子的相似結構和序列來鑒定。而且，雖然是在視覺系統(tǒng)中研究這些分子，但在個體發(fā)育上視網膜和視神經是中腦的延伸，因而與中樞神經系統(tǒng)的其它部分基本相同。因而可預計，AF-1和AF-2也將作用于除視網膜神經節(jié)細胞外的其它神經元群體，特別是哺乳動物的脊髓和大腦皮層。用下述實施例可表明這一點。大腦皮層神經元受損是中風的主要因素，而脊髓神經元不能再生出受損的軸突是導致多種因事故而造成的癱瘓的主要因素。
用解離的大鼠脊髓神經元的初級培養(yǎng)物系統(tǒng)，例如描述于G.Banker和K.Goslin編《培養(yǎng)神經細胞》(MIT出版社，1991)中的，證實這些因子有廣泛的特異性。該系統(tǒng)也可用來研究AF-1或AF-2是否影響培養(yǎng)物中所有細胞類型的軸突生長，基本上與下述實施例中用視網膜神經節(jié)細胞的方法相同。
用體內模型，例如哺乳動物骨髓損傷模型，來研究AF-1和AF-2的作用，可證實這些結果。骨髓經背柱橫斷，然后用微泵或用緩釋膠囊施用AF-1和AF-2，詳述如下。
本文除非特別說明，術語“AF-1”和“AF-2”指本文描述的純化蛋白，其簡并變異體，它們在其它來源的物種(尤其是人和其它哺乳動物)中的等價物，以及不顯著改變上面表征的神經營養(yǎng)因子功能活性的，有氨基酸添加、缺失或替換的功能等價變異體。
診斷和篩選應用對本文描述的營養(yǎng)因子、編碼這些蛋白的cDNA和可與其進行免疫反應的抗體的結構和功能的了解有許多用途。具體地說，這些蛋白及其DNA不但可如下述用于治病，還可用于篩選調節(jié)這些營養(yǎng)因子的活性和/或表達的藥物，篩選患者樣本中功能性營養(yǎng)因子是否存在；用DNA構建探針，可用于從文庫中篩選其它營養(yǎng)因子，包括人類等價物，以及控制這些和其它營養(yǎng)因子表達的調節(jié)序列。
例如，本文鑒定的編碼707Da(AF-1)和12,000Da(AF-2)營養(yǎng)因子的核苷酸序列可用作探針，篩選文庫以尋找相關的營養(yǎng)因子。用所需物種的細胞或組織(如人腦)構建文庫，然后用編碼AF-1或AF-2的核苷酸序列的全部或部分來篩選。令人感興趣的特定區(qū)域是編碼不同營養(yǎng)因子間保守蛋白區(qū)域的核苷酸序列部分；編碼不同物種的相同營養(yǎng)因子之間保守區(qū)域的核苷酸序列部分；以及編碼營養(yǎng)因子不同區(qū)域間保守區(qū)域的核苷酸序列部分，這些區(qū)域用結構分析確定，采用的是本領域常規(guī)方法。這些方法包括電泳分析、電子顯微術和基于預計的氨基酸序列的計算機輔助結構分析。
氨基酸序列和編碼氨基酸序列的核苷酸序列也可用于分離和表征那些在基因組中決定神經營養(yǎng)因子在細胞中表達程度的調節(jié)序列，以及篩選能改變營養(yǎng)因子表達的藥物。
篩選患者樣本尋找營養(yǎng)因子表達編碼本文公開的蛋白的序列對于利用患者樣本(包括血液和組織)的雜交試驗來篩選患者樣本的營養(yǎng)因子是有用的。也可用典型地被熒光素標記、放射性標記或酶標的抗體，或通過分離靶細胞并篩選其結合活性，利用本領域已知的方法進行篩選。典型地，可在定性或定量基礎上篩選表達，篩選功能性營養(yǎng)因子的表達。
雜交探針寡聚核苷酸探針或引物與核酸序列的雜交反應條件隨著寡聚核苷酸不同而不同，這依賴于寡聚核苷酸長度，G和C核苷酸的數目以及雜交緩沖液的組成等因素。中等嚴謹雜交條件在本領域專業(yè)人員中一般理解為溫度比完全殘基配對的雙鏈DNA的熔解溫度低約25℃。采用溫度較高的溫育條件，即更嚴謹的條件，一般可得到更高的特異性。通常序列越長或G和C含量越高，需要的溫度和/或鹽濃度越高。著名的實驗手冊《分子克隆實驗指南》(Sambrook等，第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約(1990)，在此引入作為參考)的第11章詳細地描述了寡聚核苷酸探針和引物的雜交條件，包括保證特異性雜交所涉及的因素和必需的嚴謹水平的有關描述。
雜交探針的大小優(yōu)選地是長度從10到10,000個核苷酸。小于10個核苷酸。雜交系統(tǒng)不穩(wěn)定，20℃以上開始變性。大于10,000個核苷酸，雜交(復性)過程很慢且不完全，詳述見《分子遺傳學(MolecularGenetics)》Stent，G.S.和R.Calender，213-219頁(1971)。理想地，探針長20到10,000個核苷酸。小的核苷酸序列(20-100)可用自動有機合成技術制備。100到10,000個核苷酸序列可用適當的限制性內切核酸酶處理得到。用相對大體積的化學發(fā)光基元標記小探針，在某些情況下會干擾雜交過程。
制備AF-1或AF-2的抗體可用足以引起免疫應答的一定量的免疫原免疫小鼠之類的動物。由于這些蛋白典型地表現出高度的進化保守性，產生與要檢測或利用的物種不同的物種的蛋白的抗體，尋找對進化最保守的區(qū)域有免疫反應性的抗體，這樣做可能更有利。
所用方法是本領域熟知的。例如，在小鼠背部皮下注射100mg抗原，三個星期后腹膜內注射100mg可卡因免疫原和佐劑，最優(yōu)選的是福氏完全佐劑?？赡苡斜匾績蓚€星期用佐劑進行額外的腹膜內注射，優(yōu)選的是用福氏不完全佐劑，直到小鼠血液達到適當的效價。為了將小鼠用于融合和生產雜交瘤，優(yōu)選至少1∶5000的效價，更優(yōu)選的是1∶100,000或更高的效價。
如果蛋白不是好的免疫原，可用本領域熟知方法將其偶聯(lián)到適當的載體上，注射入哺乳動物，誘發(fā)免疫應答。優(yōu)選的載體包括白蛋白，白喉類毒素和傷寒類毒素，但本領域專業(yè)人員可方便地確定其它適當的載體。
體外免疫人類淋巴細胞的技術常用于產生許多種人類單克隆抗體，見例如T.Inai等(1993年5月)，組織化學(德國)，99(5)335-362；A.Mulder等(1993年3月)，人類免疫學(Hum.Immunol.)，36(3)186-192；H.Harada(1993年4月)等，口腔病理醫(yī)學雜志(J.Oral Pathol.Med.)(丹麥)，22(4)145-152；N.Stauber等(1993年5月26日)，免疫學方法雜志(J.Immunol.Methods)(荷蘭)，161(2)157-168；和S.Venkateswaran等(1992年12月)，雜交瘤(Hybridoma)，11(6)729-739，均在此引入作為參考。
單克隆抗體技術可用來得到與AF-1或AF-2有免疫反應性的Mab；它們可用于純化營養(yǎng)因子。制備單克隆抗體的技術現在對本領域專業(yè)人員是常規(guī)操作。見例如Galfré，G.和Milstein，C.(1981)，酶學方法(Methods Enzymol.)，733-46，在此引入作為參考。簡言之，用特定的營養(yǎng)因子免疫小鼠脾細胞生產雜交瘤。每種被免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤Sp 2/0細胞，例如用Galfré，G.和Milstein，C.(1981)，酶學方法，733-46的聚乙二醇融合法來融合。用標準方法(Galfré，G.和Milstein，C.(1981)，酶學方法，733-46)來生長雜交瘤，在HAT培養(yǎng)基中篩選，克隆并篩選針對抗原的克隆。
HAT篩選的克隆被注射入小鼠，在腹水中生產出大量MAb，描述見Galfré，G.和Milstein，C.(1981)，酶學方法，733-46，再用蛋白A柱色譜(BioRad，Hercules，加州)純化。根據其(a)對特定蛋白的特異性，(b)高結合親和性，(c)同型物(isotype)和(d)穩(wěn)定性，來篩選Mab?？捎迷S多標準方法篩選或檢驗Mab的特異性，包括Western印跡法(Koren，E.等(1986)，生物物理和生物化學學報，87691-100)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)(Koren，E.等(1986)，生物物理和生物化學學報，87691-100)。
重組營養(yǎng)因子的表達如本文所述，可通過分離天然存在的蛋白得到營養(yǎng)因子。但優(yōu)選地在適當的重組宿主系統(tǒng)，如哺乳動物、酵母、細菌或昆蟲細胞中表達蛋白，尤其是大蛋白AF-2。如上述，將重組蛋白的抗體固定到用于純化其他營養(yǎng)因子的基物上，可促進分離。適當的載體和表達系統(tǒng)可購自，例如Invitrogen和Stratagene。
某些情況下將增強子或多拷貝的調節(jié)序列或蛋白編碼序列插入表達系統(tǒng)中，可促進篩選用于操縱表達和蛋白表達的方法與藥劑。
篩選修飾或改變營養(yǎng)因子功能或表達程度的藥物。
營養(yǎng)因子可用作某些開、關或用其它方式調節(jié)這些因子的表達的化合物的靶。上述試驗清楚地提供了檢驗一個化合物是否有神經營養(yǎng)活性的常規(guī)方法。然后用動物試驗來確證看來具有神經營養(yǎng)活性的化合物的體外研究。由于這些分子應當進化保守，因此有可能在實驗動物例如大鼠上進行研究，并預測它們對人類的作用。原始數據證實AF-1促進大鼠神經元(視網膜神經節(jié)細胞)軸突的生長。
可選地，試驗可基于編碼營養(yǎng)因子的基因序列的相互作用來進行，優(yōu)選地是指導營養(yǎng)因子表達的調節(jié)序列。例如，結合調節(jié)序列的反義寡聚核苷酸能阻止營養(yǎng)因子在完全分化的成熟細胞中表達，這些核苷酸可用標準寡聚核苷酸化學合成法合成。用標準醫(yī)藥方法穩(wěn)定反義分子(脂質體或微球體包裹；引入抗降解的修飾核苷酸或增加對內切核酸酶的抗性的基團，例如硫代磷酸酯化和甲基化)，再在表達營養(yǎng)分子的轉染細胞或天然存在細胞中初步篩選營養(yǎng)因子活性的改變，再在實驗動物體內作同樣實驗。典型地，反義分子通過阻遏“關閉”合成的序列而開啟表達。
含有營養(yǎng)因子基團5’調節(jié)序列的核酸分子可用于在體內調節(jié)基因表達?？筛鶕I(yè)人員的傾向與判斷在細胞中用載體，包括質粒和真核病毒載體，表達特定的重組5’包圍區(qū)域(flanking region)基因構建體，例如見Sambrook等，第16章。進一步，研究出一系列能在體內引入核苷酸序列的病毒和非病毒載體，描述見Mulligan(1993)，科學，260，926-932；美國專利4,980,286號；美國專利4,868,116號；在此引入作為參考。已研制出一種傳遞系統(tǒng)，其中核酸被包裹于陽離子脂質體中，可靜脈注射或注射入哺乳動物的CNS液中。該系統(tǒng)已被用于將DNA導入成體小鼠的多種組織(包括內皮組織和骨髓)的細胞中，見Zhu等(1993)，科學，261，209-211；在此引入作為參考?？捎米詣雍铣蓛x(例如Milligen-Biosearch，Burlington，麻省的8700型自動合成儀或ABI 380B型)合成寡聚核苷酸。另外，反義脫氧寡聚核酸能有效抑制基因轉錄和病毒復制，見Zamecnik等(1978)，美國國家科學院院刊，75，280-284；Zamecnik等(1986)，美國國家科學院院刊，83，4143-4146；Wickstrom等(1988)，美國國家科學院院刊，85，1028-1032；Crooke等(1993)，FASEB雜志，7，533-539。近期工作顯示若反義寡聚核苷酸含有修飾核苷酸，結果會有改善，報道見Offensperger等(1993)，EMBO雜志，12，1257-1262(用反義硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸體內抑制鴨乙肝病毒復制和基因表達)；Rosenberg等，PCT WO 93/01286(合成硫代硫酸酯寡聚核苷酸)；Agrawal等，(1988)，美國國家科學院院刊，857079-7083(合成反義寡聚核苷酸氨基磷酸酯(phosphoramidate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)，抑制人類免疫缺損病毒-1的復制)；Sarin等(1989)，美國國家科學院院刊，85，7448-7794(合成反義磷酸甲酯寡聚核苷酸)；Shaw等(1991)，核酸研究，19，747-750(合成對3’外切核酸酶有抗性的含有3’末端氨基磷酸酯修飾的寡聚核苷酸)；在此引入作為參考。寡聚核苷酸通常長于14個核苷酸，以保證靶序列特異性(Maher等，(1989)；Grigoriev等，(1992))。許多細胞能活躍地攝入長度小于50個核苷酸的寡聚核苷酸(Orson等(1991)；Holt等，分子細胞生物學，8，963-973；Wickstrom等，(1988)，美國國家科學院院刊，85，1028-1032)。為了降低，例如被3’外切核酸酶的細胞內降解的敏感性，可在寡聚核苷酸的3’末端羥基引入游離胺，而不會失去序列結合的特異性(Orson等，1991)。進而，若寡聚核苷酸中胞嘧啶完全甲基化或嵌合劑如吖啶衍生物共價地結合5’末端磷酸(通過戊亞甲基(pentamethylene)橋)，可以形成更穩(wěn)定的三聯(lián)體，而不失去序列特異性(Maher等(1989)；Grigoriev等(1992))。
制備或合成寡聚核苷酸的方法在本領域內是已知的。這些方法可以是標準的酶促消化，然后分離核苷酸片段，描述見例如Sambrook等，第5，6章，或是純合成法，例如用Milligen或Beckman系統(tǒng)1Plus DNA合成儀用氰乙基氨基磷酰酯法(也可見Ikuta等(1984)，生化年度綜述(Ann.Rev.Biochem.)53.323-356(磷酸三酯或亞磷酸三酯法)；Narang等(1980)，酶學方法，65，610-620(磷酸三酯法))。IV. 治療神經系統(tǒng)損傷和失調營養(yǎng)因子可用于激活神經組織重新生長和/或再生。近期工作表明，營養(yǎng)因子加上阻遏CNS少突神經膠質細胞表面的生長抑制蛋白的抗體的組合物，能促進成體哺乳動物中軸突生長增多(Schnell等(1994)，自然(Nature)，367170-173)。相應地，AF-1和AF-2，或其人類同源物，結合上阻止自由基形成的藥劑如LaZaroid，一種21-氨基甾醇，或自由基清除劑，如苯基丁基硝酮(phenylbutylnitrone)及衍生物，以及抗生長抑制分子，會有臨床應用價值。
神經系統(tǒng)損傷和失調神經細胞，或神經元，典型地包括含有核和大多數細胞器的細胞體；許多樹突，它們是接受刺激的突起；一個軸突，它是產生神經沖動或將神經沖動傳導到其它細胞，如肌肉、腺體和其它神經元的突起。神經纖維是由特殊的細胞鞘包裹的軸突。成組的神經纖維形成腦、骨髓和外周神經的各種束。成體神經組織中大多數軸突的鞘細胞在外周神經中是施旺(Schwann)細胞，在中樞神經纖維中是少突神經膠質細胞。直徑小的軸突通常無鞘，被稱為無髓神經纖維。由細胞鞘包裹的粗軸突被稱為有髓神經纖維。在外周神經系統(tǒng)中，神經纖維組成束，形成神經。大多數外周神經含有有髓纖維。
中樞神經系統(tǒng)(腦和脊髓)的神經突起只要細胞維持生存，在細胞體的合成能力范圍內能有限地再生。但是，一個明顯的問題是，突起通常再生得不夠快，故被星形膠質瘢痕組織阻斷。因此再生尚未發(fā)生就被物理障礙阻斷。外周神經系統(tǒng)的突起只要細胞體不死也可再生。退化和再生步驟已見于報道，但其機理還不清楚。在外周神經被切斷后，靠近切口的軸突片段沿著原先包裹切口遠端的軸突片段的髓鞘方向生長。只有與鞘完全匹配的軸突才會再生長并到達效應細胞。因此，在瘢痕組織形成之前生長的突起，其再生更成功。
軸突退化或損失常見于中毒、遺傳、創(chuàng)傷或局部缺血疾病。它也可與脫髓鞘疾病并發(fā)，后者可能是遺傳或自體免疫炎癥失調。退化與脫髓鞘相結合合，導致軸突損失，這可發(fā)生于例如糖尿病。
創(chuàng)傷對神經突起，尤其是軸突的損傷可出現在中樞和外周神經系統(tǒng)，包括腦，顱神經，脊髓和外周神經。創(chuàng)傷造成的損傷包括直接切割，腫脹和壓迫、淤血等造成的損傷，它們均可造成受影響的軸突部分或全部失去。創(chuàng)傷也可能使微生物或空氣進入或切斷神經的血液供應。由于神經軸突破壞而喪失功能的效應細胞包括骨臍?。谎芎土馨凸艿钠交?；主要器官系統(tǒng)，包括呼吸、生殖泌尿和消化系統(tǒng)的平滑??；內分泌腺和外分泌腺的腺細胞；和其它神經細胞。因此，涉及軸突損失的神經損傷可以改變體內幾乎任何系統(tǒng)的生理功能。
創(chuàng)傷的一個例子是切斷連通骨胳肌的運動神經。幾天后，切口遠端的軸突退化。與神經系統(tǒng)不再相連的肌肉纖維成束狀，若無其它神經支配，以后會高度去神經支配萎縮。除非其神經支配再生，這些肌肉將失去功能。
脫髓鞘疾病也與軸突損失有關。這些疾病可能由自體免疫和/或病毒感染以及遺傳缺陷引起，包括多種硬化(multiple sclerosis)，急性傳播腦脊髓炎，和急性致死出血腦脊髓炎。脫髓鞘和軸突損失也可能由毒素如一氧化碳造成。
軸突損失也可能由于神經系統(tǒng)退化疾病，例如肌萎縮側硬化和進行性脊肌肉萎縮；某些運動神經??；由例如嚴重中毒或砷，病毒感染(Guillain-Barre綜合癥，皰疹，細胞肥大病毒，Epstein-Barr)，手術創(chuàng)傷，淋巴瘤，狼瘡，糖尿病，血內蛋白異常及凍傷造成的急性、慢性脫髓鞘和其它類型多發(fā)性神經病。
軸突退化后的再生依嚴重程度及需要再生的距離，需要兩個月到一年多。
藥物組合物蛋白可以以藥用的酸或堿加成鹽形式施用，可以與無機酸如鹽酸，氫溴酸，高氯酸，硝酸，硫氰酸，硫酸和磷酸，有機酸如甲酸，乙酸，丙酸，羥乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸和延胡索酸，或與無機堿如氫氧化鈉，氫氧化銨，氫氧化鉀，有機堿如單、二、三烷基胺和芳基胺和取代的乙醇胺反應制取這些鹽。
營養(yǎng)因子可以通過氨基酸的化學修飾或連上載體分子或惰性底物來修飾，以延長體內半衰期。例如，可以用標準操作方法，如Pierce化學公司的Imject藥劑盒，通過N末端半胱氨酸將肽結合到蛋白(如匙孔血藍蛋白)上或以融合蛋白形式表達，可以提高效率和體內半衰期。
也可用含有環(huán)丙基氨基酸或以相似方式衍生的氨基酸的肽。這些肽保留其原來的活性但體內半衰期變長。修飾氨基酸的方法及其應用為本領域專業(yè)人員所熟知，例如授予Stammer的美國專利4,629,784號。
對患者給藥。
基于體外研究，IC50，營養(yǎng)因子影響或促進軸突生長的所需劑量，通常為皮摩爾量。該劑量部分依賴于用一種或幾種蛋白給藥。
營養(yǎng)因子優(yōu)選地用藥用載體給藥。適當的藥用載體為本領域已知。例如，通常將化合物溶解或懸浮于無菌水或鹽水中。也可將溶液局部應用而局部地施用化合物。
可選地，化合物在脂質體或微球體(或微粒)中給藥。制備用于對患者給藥的脂質體或微球體的方法為本領域專業(yè)人員所熟知。
美國專利4,789,734號描述了將生物材料包裹到脂質體內的方法?；旧?，將材料溶于水溶液，加入適當的磷脂和脂，必要時加入表面活性劑，將材料透析或必要時超聲處理?，F有方法的綜述見G.Gregoriadis《生物學和醫(yī)學中的藥物載體》，第14章，“脂質體”，287-341頁(學術出版社，1979)。
聚合物或蛋白形成的微球體為本領域專業(yè)人員所熟知。將微球體或其組合物植入，以緩慢釋放一段時間，從幾天到幾個月。見例如美國專利4,906,474號，4,925,673號和3,625,214號。
聚合物組件(device)優(yōu)選地用一種能將麻醉劑均勻分布于組件中的方法，例如溶劑噴射法(casting)，噴射干燥或熱熔，或壓縮成形制造。組件可是厚片(slab)、微珠、小片、微粒，包括微球和微膠囊，或形成膏體。微粒、微球和微膠囊這里統(tǒng)稱為“微?！薄Ｔ摻M件可用另一聚合物或其它材料包裹以改變釋放特性或提高生物相容性。微粒可以以懸液，明膠膠囊中的組件或膏體形式給藥。
在優(yōu)選實施方案中，組件為微粒形式。用釋放速率不同的聚合物微球混合物可得到所需的釋放方式，例如聚合物在一天內，三天內和一周內釋放，于是即使每種聚合物本身在同一時間段不能線性釋放，在整個過程中也可得到線性釋放。
在另一優(yōu)選的脂質體、微?；蚝衿o藥方法中，通過注射將組件施用到需要產生效果的位點?？蛇x地，組件通過手術植入所需位點。組件的植入在臨床實踐中可用外科手術區(qū)(surgical field)或用針來完成。
用微泵持續(xù)輸注，例如用于硬膜外(epidural)釋放鎮(zhèn)痛藥的那種微泵，亦可實現受控釋放。
參照下述非限制性實施例，本發(fā)明可被進一步理解。實施例1. 用于確定內源神經營養(yǎng)因子的模型的建立一種用于確定誘導視神經再生的內源因子的實驗模型被建立起來。目的是建立一個細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)，系統(tǒng)中富集了維持在低細胞濃度的視網膜神經節(jié)細胞，使得能客觀地將軸突生長定量，并將其它類型細胞介導的間接效應最小化；而且重要的是，要在無血清條件下培養(yǎng)“幼稚”(naive)動物的視網膜來確定引發(fā)生長的因子。
結果表明，解離的視網膜神經節(jié)細胞在本文建立的成分確定的無血清條件下能很好的存活，但只有在接觸金魚視神經膠質細胞分泌的兩種因子之一時才有明顯軸突生長。這些因子是(a)一種對蛋白酶敏感的耐熱的分子，分子量看上去小于1,000Da，和(b)一種大小為8到15kDa的對熱和蛋白酶敏感的分子。逆行標記實驗顯示視網膜神經節(jié)細胞是這些因子的主要的靶，增加了這些分子在體內引發(fā)視神經再生中發(fā)揮主要作用的可能性。
方法條件培養(yǎng)基彗星金魚(Comet goldfish，3到4英寸長，Mt.Parnell漁業(yè)公司，Ft.Loudon，賓州)被用于制備條件培養(yǎng)基(CM)和解離的視網膜培養(yǎng)物。將動物迅速冷凍至4℃麻醉，頸橫切處死。分兩步將視神經(ON)和視束與骨和結締組織分離在2倍放大下橫切，得到的視神經和視束不帶眼球和視蓋區(qū)，但仍連著一些結締組織和骨，第二步，用桌面解剖顯微鏡(Wild)在12倍放大下進行，依據Schwartz等(1985)描繪和Finkelstein等(1987)修正的方法，將6個ON放入3ml HEPES緩沖的Liebovitz L-15培養(yǎng)基(Gibco/BRL，Gaithersburg，馬里蘭州)中，切成1到2mm的片段。于37℃在5％CO2氛下將這些片段溫育3到4小時，然后用0.2μm小孔低蛋白結合注射濾器過濾除菌(Acrodisc，Gelman Sciences，AnnArbor，MI)。CM通常等分成小份，制備后立即貯于-80℃，但某些情況下將其貯于4℃1到5天再分成小份或用于生物試驗。用幾批CM確定蛋白(Bradford藥劑盒，BSA標準；BioRad，Richmond，加州)，表明得到的蛋白濃度為約100μg/ml。
在解剖前進行視神經手術的情況下，將動物用0.5mg/ml 3-氨基苯甲酸乙酯(Sigma化學公司，圣路易，密蘇里州)麻醉后，置于PlexiglassTM固著器上固定頭部，用加氧的池水持續(xù)流過鰓。在眼窩上緣切兩個相距3mm的切口，卸去骨瓣，切除眼窩軟組織和外膜，暴露視神經。用曲形4′眼科鑷(jeweler′s forcep)在眼球后1到2mm兩側破壞神經。若眼球出血或神經橫斷，則研究中不用該動物。
解離視網膜培養(yǎng)物用Landreth和Agranoff(1976，1979)和Dowling等(1985)，腦研究，360331-338描述的一種修正方法制備培養(yǎng)物。金魚在處死前在遮光的池中暗適應至少30分鐘。迅速取出眼球，用滅菌L-15，70％乙醇，和L-15迅速依次洗滌。用虹膜剪除去晶狀體、角膜和虹膜。在25倍放大下用微型解剖剪和眼科鑷從鞏膜和色素上皮撕下視網膜。將4個視網膜放入超凈臺中的5ml無菌消化液中，在其中進行培養(yǎng)物制備的其余步驟。為制備消化液，將100單位的木瓜蛋白酶(Worthington)和2.5mg L-半胱氨酸(Sigma)加入5ml HEPES緩沖的L-15中，用NaOH調至pH7.4，然后過濾除菌。45分鐘后，用5ml滅菌L-15替換消化液，將組織輕研5下，使視網膜搗成小片。溶液再換成5ml滅菌L-15，將組織用力研5下使視網膜碾成細碎片，除去光受體細胞。這一步在新鮮L-15中重復，得到單一細胞的懸液。接下來的研磨除去大多數光受體細胞和間質組織從而富集神經節(jié)細胞。
細胞鋪在用聚L-賴氨酸(MW大于300,000，Sigma)覆蓋的24孔組織培養(yǎng)皿(Costar，Cambridge，麻省)中。每一小孔先加入200μl 2×培養(yǎng)基E，該培養(yǎng)基根據如下出版物完成Bottenstein(1983)，現代細胞神經學方法，第四卷，模型系統(tǒng)，J.L.Barker和J.F.McKelvy編，107-130(John Wiley&Sons，紐約)；Dichter腦研究，149279-293(1978)；Walicke等，神經科學雜志，6114-121(1986)；和Aizenman和devellis，腦研究，40632-42(1987)。終濃度的培養(yǎng)基E含有20nM氫化可的松，1mM kainurinate，100μM腐胺，20nM孕酮，30nM硒，0.3nM 3，3′5-三碘-L-甲狀腺原氨酸，50μg/ml轉鐵蛋白，150U/ml過氧化氫酶，60U/ml超氧化物歧化酶，1％牛血清白蛋白(V型)，10μg/ml慶大霉素，5μg/ml胰島素，15mM HEPES1(所有藥劑均購自Sigma)。培養(yǎng)基E被滴定至pH7.4，在加到培養(yǎng)皿上之前過濾滅菌。為幫助制備及保證可重復性，前6種組分一起制備，以25×濃度的0.5ml小份-20℃貯存。加入培養(yǎng)基E后每一小孔加入50μl細胞懸液，用L-15將實驗或對照樣本添加至150μl。除非另有說明，實驗樣本由實驗室另外一個人盲視地、隨機地安排，研究者不知道每個小孔內的條件。在給定的實驗中，每個實驗條件用4到8個小孔，每個實驗也包括至少4個陽性對照(先確認CM濃度為5％到15％)和至少4個小孔的只有L-15和培養(yǎng)基E的陰性對照。在進行評價前，在室溫下定濕的暗箱中溫育平板5到6天。大多數實驗用2到5個單獨制備的材料重復。對4到8個重復測定用平均值±標準差來表示數據。應注意，有些結果已減去陰性對照的生長再除以陽性對照的凈生長而被歸一化。
軸突生長試驗5到6天后將軸突生長定量。培養(yǎng)基換成磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.1mg/ml 5，6-二乙酸羧基熒光素(CFDA；Sigma)。室溫溫育10分鐘?；钚匀玖螩FDA被活細胞攝取并代謝得到均勻分布于整個細胞的熒光產物，我們才能評價細胞活性和軸突生長。用綠濾光膜在熒光照明下100×放大(Nikon AF-BS倒置顯微鏡)檢查培養(yǎng)物。從小孔頂部開始記錄14個連續(xù)顯微鏡框(即單個孔半徑)內的活細胞總數。符合由逆行標記試驗確定的視網膜神經節(jié)細胞(RGC)形態(tài)標準(即形態(tài)與突起數目)的細胞根據其軸突長度，即軸突長1到5個細胞直徑，5到10個細胞直徑，10到20個細胞直徑，大于20個細胞直徑，進行評分，不過大多數情況下后三項合起來作為軸突生長的一項衡量指標，即([軸突長過5個細胞直徑的細胞數]+[活細胞總數]×100)。
鑒定視網膜神經節(jié)細胞將魚麻醉，在顱骨視蓋區(qū)上方用解剖刀作一系列切割。卸去骨瓣，將親脂性染料4-(4-二癸基氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物(4-di 10 ASP分子探針公司，Portland，俄勒岡州)晶體直接置于視蓋區(qū)。放回骨瓣，用Aron Alpha(Ted Pella公司)封合。用5到9天使染料運至神經節(jié)細胞，解剖視網膜，如上述在10％CM或僅有對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，用熒光顯微鏡對4-di-10 ASP逆行標記的細胞進行軸突生長定量。這些研究除了提供了關于神經節(jié)細胞本身軸突生長的資料，還為在標準異源培養(yǎng)物中確定RGC建立了標準。實施例2確定營養(yǎng)因子的來源營養(yǎng)因子的來源為研究營養(yǎng)因子是活躍分泌的還是僅僅由于解剖中的損傷從視網膜中釋放出來，比較了CM和視神經細胞質中高分子量和低分子量級分的活性。將10個視神經在25mM HEPES，pH7.4或L-15中勻漿制備細胞質級分。該提取物的高速離心上清用BioRadTM蛋白試驗使之與整個CM中蛋白濃度相匹配。然后用Centriprep-3TM濾膜將視神經細胞質和CM分成高分子量和低分子量級分。各級分用生物試驗篩選。通過將標準CM與其它金魚組織分泌的因子調節(jié)的培養(yǎng)基比較來檢驗各級分，確定其是否由視神經選擇性分泌。用于制備3ml CM的視神經先稱重再切碎。如上述，用等質量的取自金魚骨骼肌、肝和鰓的組織制備條件培養(yǎng)基。
為了評價先前發(fā)現的影響視網膜外植體培養(yǎng)物生長的分子的效應，在生物試驗中檢測濃度為10-9至10-3M的?；撬?Sigma)，視黃酸(10-9～10-4MSigma)和NGF(β-亞基，100nMCollaborativeResearch，Bedford，麻省)的效果。做另外的實驗以確定RGC對CM的響應是否依賴于培養(yǎng)物涂平板的密度。除了整個實驗研究用的標準細胞密度，細胞還用該密度的1/3，1/9和1/27鋪平板。最后，做實驗來比較在體內已開始再生出軸突的“受激”的視網膜神經節(jié)細胞與從先前未處理過的魚解剖下的“天然”視網膜的軸突生長。激發(fā)視網膜的方法是在解離和鋪平板前10天在體內開始再生過程，該段時間能最大程度地促進視網膜外植體的軸突生長(Landreth和Agranoff，1976)，將神經又一次破壞并在體內再生(McQuarrie和Grafstein(1981)，腦研究，216253-264)。各條件的比較全部基于雙尾t檢驗。
結果解離的視網膜細胞響應來自視神經的因子用染料5，6-CFDA確定解離的視網膜細胞對視神經分泌的因子的響應。在基線條件下，細胞存活但很少生長。加入含有視神經分泌的因子的CM后，直徑10-17μm的細胞伸展出一個或兩個粗細均一的長突起，它們有時終止于一個明顯的生長錐。在軸突生長定量時不計入大的多邊形細胞。
僅用L-15和培養(yǎng)基E鋪板后6天，視網膜細胞存活但很少生長。用5，6-CFDA染色顯示密度約70細胞/mm2。計數14個顯微視場(即小孔半徑)，其中有200-300個細胞/小孔。加入由視神經分泌的因子調節(jié)的培養(yǎng)基，誘導細胞伸展出了與軸突相似的長突起。
劑量效應特征圖1給出視網膜細胞對CM濃度遞增的響應。圖1a是在指定濃度用CM培養(yǎng)5天后軸突長度分布的直方圖。雖然伸展出長1到5個細胞直徑的突起的細胞數隨CM濃度遞增的變化很少，但突起長超過5個細胞直徑的細胞數增長很大。圖1b是兩個獨立實驗中顯示軸突生長響應CM濃度遞增的劑量效應曲線。數據顯示突起長度超過5個細胞直徑的細胞百分比，選該分割點是依據圖1a的直方圖數據。在兩個實驗中，最大的生長均在CM濃度為10％時獲得(即總蛋白濃度約為10μg/ml)。圖1c是兩個獨立實驗中細胞生存與CM濃度的函數關系圖。
如圖1a直方圖顯示，無CM時，4％細胞的軸突范圍為1到5個細胞直徑，突起更長的細胞少于1％。加入濃度為5％的CM，突起長度分布明顯變化7％的細胞軸突長5到10個細胞直徑，20％的細胞突起更長。CM濃度更高(15％)，軸突長1到5個細胞直徑的細胞很少。跟所有后續(xù)實驗一樣，給出的結果是每個樣本大于等于4孔的平均值±標準差。基于這里發(fā)現的分布模式，所有后續(xù)結果均被表示為軸突長度大于5個細胞直徑的細胞百分比，該分割點能很好地區(qū)分有響應組和無響應組。
圖1b顯示用不同CM和視網膜制備物的兩個連續(xù)實驗的劑量效應曲線。CM濃度一直增加到10％，軸突長度大于5個細胞直徑的細胞數總是先增加后穩(wěn)定(對5％CM的生長響應對應僅有L-15+培養(yǎng)基E，兩個實驗均p＜0.001；10％CM對5％CM的生長，二者均p＜0.02，誤差條若小于1％，則不顯示出誤差條；這兩個實驗之一在研究早期做，沒有盲視化(blinded)。產生響應的最大細胞數目在兩個實驗中有些區(qū)別，這可能反映出兩種制備物中RGC百分比的差別。附圖顯示CM對細胞存活能力影響很小。這些數據取自兩項研究，給出了14個連續(xù)顯微視場(即一個小孔直徑)計數的存活細胞數，在CM濃度遞增的每種條件下對四個小孔取平均。數據根據陰性對照中存活細胞數作了均一化(以抵銷兩個實驗中鋪板密度的差別)。盡管在一個實驗中存活能力好像響應15％CM而有所提高。但這沒有統(tǒng)計意義(15％CM對L-15，p＝0.21)，而且在其它實驗中未見到這種情況。
鑒定視網膜神經節(jié)細胞用逆行標記研究視網膜神經節(jié)細胞自身的生長。將4-Di-10 ASP加到視蓋區(qū)這一小區(qū)域上，在培養(yǎng)物中逆行標記到4-5％的存活細胞。這些細胞呈橢球狀，8-10×16-18μm，與Schwartz和Agranoff(1981)，腦研究，206331-343報道的RGC大小相似。用4-di-10ASP標記的細胞在僅有L-15和培養(yǎng)基E時很少自生長；加了10％CM，則在整個細胞群體中觀察到二倍水平的軸突生長，CM不影響RGC的存活。對每組視網膜，無論是否有CM，培養(yǎng)物中逆向標記的細胞數除以總的活細胞數總是4-5％。對于RGC相對總體細胞的生長，兩組視網膜均為P＜0.005。
在培養(yǎng)前7天將親脂性染料4-di-10ASP加到視蓋區(qū)來標記視網膜神經節(jié)細胞。培養(yǎng)6天后，標記的細胞響應CM而伸出一到兩個突起。這些細胞通常形成一或兩個長的細突起。對于兩組視網膜，加入CM后，逆行標記細胞相對于整個細胞群體的存活能力無變化。因此，CM選擇性地激活RGC的軸突生長，并且該效應不是增加了這類細胞的存活造成的。該研究也為從混合的5，6-CFDA染色的培養(yǎng)物中識別神經節(jié)細胞提供了標準(直徑，突起數)。在混合培養(yǎng)物中僅對符合RGC標準的細胞的軸突生長計數。發(fā)現整個群體的15-25％軸突伸展長度超過5個細胞直徑。由于從逆行標記研究確定約1/3被鑒定為RGC的神經元在這種條件下活躍生長，得出RGC占混合培養(yǎng)物中細胞數的45-75％。
條件培養(yǎng)物的組織特異性與金魚視神經調節(jié)的培養(yǎng)基不同，用等質量的金魚骨胳肌、鰓或肝調節(jié)的培養(yǎng)基的軸突生長促進活性很小(所有樣本均與視神經CM不同，p＜0.01；實驗未盲視化)。實施例3神經營養(yǎng)因子的分離與表征視神經CM含有兩種營養(yǎng)因子用超濾初步分離顯示所有的營養(yǎng)活性均通過截斷分子量為100和1000kDa的超濾裝置；并且大部分活性通過截斷分子量為10,000和3,000Da的濾器。用截斷分子量為6kDa的體積排阻柱(即，脫鹽柱，BioRad)，發(fā)現在含蛋白的級分(用光度計OD280檢測)和低分子量級分(含鹽，測電導)均存在軸突生長促進活性?；谶@些觀察，用來自正常金魚或兩側視神經被破壞3或7天后的金魚的視神經制備條件培養(yǎng)基，然后用超濾法將CM樣本分成小于3,000Da和大于3,000Da的兩個級分。由未受損或受損的視神經得到的CM均有高分子量和低分子量軸突生長促進因子(所有樣本生長均高于L-15對照，p＜0.002)。為簡化附圖，先減去僅用培養(yǎng)基E和L-15生長的陰性對照的生長水平(該特定實驗中為3±0.2％(平均值±標準差))，再用以未分級的CM處理的陽性對照中的凈生長(這里為21.3±2.3％)歸一化得到數據。圖2a中數據表明未分級的CM中大部分活性可歸于小的因子，但這在受損3天后收集的物質中不這樣明顯。定性地，在用未受損與受損的視神經制備的CM中重復地觀察到高分子量和低分子量營養(yǎng)因子的存在。
分子量分級用幾種方法確定活性因子的大小。首先用截斷分子量為10、100和1000kDa的濾器(Amicon，Beverly，麻省)超濾離心分離CM。用生物試驗檢驗濾過物與滯留物(retentate)。下一步，將CM過6kDa的脫鹽柱(BioRad.)，用280nm吸收(蛋白)和電導(含鹽的小分子量級分)監(jiān)測各級分。用生物試驗評價含有高分子量和低分子量組分的級分，均發(fā)現有活性，如圖2a所示。收集大于6kDa的級分，用截斷值為3kDa的Centriprep-3TM濾器(Amicon)濃縮10到100倍。然后用高效液相色譜(HPLC，Beckman儀器公司)用Biosep SecTM-S3000 N-加帽鍵合硅膠柱(Phenomenex，Torrance，加州)分離該物質。用生物試驗篩選柱級分，如圖2c所示。低分子量物質(小于6kDa)進一步通過1kDa截斷值的Centriprep-3TM濾器(Amicon)或MicrosepTM(Filtron，Northborough，麻省)離心濾器來表征。凍干濃縮15倍后，進一步用體積排阻HPLC(BiosepuTMSec S-2000，Phenomenex)進一步分析小分子量級分。基于幾種小肽(leu-腦啡呔，[leu，Mw＝556]，met-腦啡呔[met，Mw＝877]，血管緊張素I[angio，Mw＝1297]；均得自Sigma)的洗脫時間，活性因子的表觀大小為600-900Da。
熱處理和蛋白酶處理為確定CM中軸突生長促進因子是多肽，將高分子量和低分子量級分加熱到95℃15分鐘或接觸0.1％的胰蛋白酶。與胰蛋白酶同時或用胰蛋白酶溫育1或2小時后加入0.125％的大豆胰蛋白酶抑制物。然后用生物試驗篩選樣本。另外，小于3kDa的級分接觸10U/ml的鏈霉蛋白酶(pronase)(Sigma)8小時(49℃)或接觸蛋白酶K(Pk，寶靈曼公司，Indianapolis，印第安納州50μg/ml，56℃，1小時)。溫育后，用Centriprep-3TM濾器從低分子量組分中分離出酶，對濾過物進行生物試驗。對照包括無酶的熱穩(wěn)定級分以證實熱本身不引起變性，將酶本身溫育56℃1小時，過濾，然后將濾過物加入小于3kDa的級分，證實蛋白酶不產生可能影響細胞生長的自溶片段。
兩種因子對熱和蛋白酶的敏感性表明兩種因子均是多肽，95℃加熱15分鐘后，未分級的CM(5％)失去其一半活性；高分子量級分本身(20％濃度)失去幾乎全部活性。低分子量因子56℃加熱1小時或95℃加熱15分鐘僅失去30％的活性。
接觸胰蛋白酶1或2小時使未分級的CM活性減少約60％，盡管低分子量級分本身在胰蛋白酶消化后活性減少很小。在對照中，與胰蛋白酶同時添加的大豆胰蛋白酶抑制物能阻止活性損失。用鏈霉蛋白酶(8小時，40℃)或蛋白酶K(1小時，56℃)處理低分子量因子來進一步確定其蛋白酶敏感性。溫育后，超濾將低分子量組分與酶分開，再用生物試驗檢測。對照不加酶溫育。
鏈霉蛋白酶與胰蛋白酶相似，對低分子量因子活性影響很小。但蛋白酶K能將其活性減少80％(56℃用與不用蛋白酶K處理，顯著性p＝0.004)。因此大和小因子均象是多肽。
陰離子交換色譜用二乙氨基乙基纖維素柱(DE-52，Whatman，Hillsboro，俄勒岡州)進行陰離子交換色譜。DE-52微珠用pH8.4的25mM HEPES平衡，然后按0.5ml水化珠10ml CM的比例加入(CM已用6kDa截斷值的體積排阻柱脫鹽)。溫育(4℃)過夜后，將混合物移至5mm內徑的玻璃Econo柱(BioRad)。收集未結合級分和用25mM HEPES第一次洗柱液，然后用25mM HEPES中0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl每步3ml連續(xù)洗脫結合蛋白。各級分被分成小份，-80℃貯存用于生物試驗。pH10時也對CM高分子量級分作離子交換色譜。
小營養(yǎng)因子通過1,000Da濾器用1,000Da截斷值的MicrosepTM濾器進一步將CM分級，得到的濾出物中有高水平活性，如圖2b所示，小于1,000Da級分對L-15對照，p＝0.01；小于1,000Da的級分對全部CM，p＝0.06。由于分子通過這樣大小的濾孔的能力既依賴其形狀又依賴其大小，故這不僅僅由大小決定。用HPLC進一步研究顯示該因子大小為600到900Da。
用哈佛微化學機構進行的質譜分析確定該肽含有游離氨基酸污染物，質量大小約為707Da。氨基酸分析顯示沒有疏水性氨基酸，這與HPLC上觀察到的親水行為一致。
估計大營養(yǎng)因子的大小圖2c繪出用體積排阻HPLC分離時CM的大分子量級分的洗脫圖。由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Caday等，1989)和本色譜圖看出，CM含有復雜的蛋白混合物。各級分先是分成兩組作生物試驗，如果收集的級分有活性，則對其再單獨篩選，否則成對再篩選。在首輪和第二輪篩選中在級分12和13中均觀察到高水平活性(圖2d；級分12對L-15，p＝0.01；級分13對L-15，p＝0.053；其它均無明顯統(tǒng)計意義(無置信度))?；钚砸蜃优c細胞色素C(12kDa，圖2d)的滯留時間(retention time)相同，故大小估計在8,000和15,000Da之間。
某些實驗中，在7,000到100,000Da之間觀察到另一活性峰，但該峰不能重現。這個大分子可能不穩(wěn)定，降解成12,000Da的因子或者是多聚體復合物，在某種實驗條件下解離。
電荷和與底物結合用離子交換色譜進一步純化大因子。用DEAE陰離子交換色譜分離CM的高分子量組分。pH8.4時，從未結合級分回收到軸突生長促進活性，而pH10時，活性因子結合在柱上，并被0.2M NaCl洗脫。CM的任一組分均不是底物結合營養(yǎng)因子。超濾(3,000Da截斷值)將CM分成高分子量和低分子量級分。大蛋白長時間接觸高pH值好象顯著降低其活力。
在多聚賴氨酸包被的平板上過夜溫育CM的高分子量或低分子量級分，原濃度(full strength)溫育或1∶10稀釋后溫育。洗滌小孔除去未結合的材料后，用L-15洗板，則不留下任何軸突生長促進活性。因此，大小分子均不是與底物結合的生長因子。
CM的雙相提取。
圖3是軸突生長圖，顯示低分子量因子AF-1可用雙相溶劑提取系統(tǒng)分離出。陰性對照是培養(yǎng)基本身；泳道2的陽性對照是膠質鞘細胞分泌到培養(yǎng)基中的分子中的低分子量級分，即小于3,000Da的CM，誘導高水平軸突生長、當該物質在pH7.5時與有機溶劑異丁醇混合，水相(pH7.5 Aq)留下很少的活性。然后將有機相與低pH值緩沖液(pH2 Aq)混合，生物活性分子進入水相，有機相不再留下什么(pH2，Org)。這是一種初步純化低分子量營養(yǎng)因子AF-1的簡便方法。
圖4是軸突生長圖，顯示用反相HPLC分離含有低分子量營養(yǎng)因子AF-1的部分純化提取物，活性組分象是在柱級分FC、FD和FE中。如上述，陰性對照(L-15)是組織培養(yǎng)基本身，陽性對照是視神經膠質分泌的分子中未分級的小分子量組分(1CM小于3,000Da，濃度10％)；FA-FI是高效液相色譜分離的柱級分。
兩種因子的細胞內和細胞外濃度比較CM中與視神經勻漿的高速離心上清部分中兩種軸突生長促進因子的活性，確定其是否被活躍分泌。生物試驗中用的樣本濃度為10％和20％，調整視神經細胞液的蛋白濃度與CM的相配(即，濃度10％，與超濾前每種蛋白約10μg/ml的濃度相當；這是基于這一假設，即CM中的大多數蛋白由細胞裂解而非活躍分泌而來)。
低分子量因子在CM中比在視神經細胞質(ON Cyto)中濃度要高(p＝0.002)。這些數據在另兩個實驗中完全相同，顯示小分子是活躍分泌的。大因子在胞內外濃度相同。
損傷對視神經的影響為研究營養(yǎng)因子的表達在視神經損傷后是否變化，用0.5mg/ml 3-氨基苯甲酸乙酯(Sigma化學公司，圣路易，密蘇里州)麻醉金魚，置于有機玻璃架上，頭部固定，用加氧的池水持續(xù)流過其口部和鰓。為暴露視神經，在眼窩上緣相距3mm作兩個切口，除去骨瓣，切除眼球軟組織和外膜，用曲形4″眼科鑷在眼后兩側1-2mm破壞視神經，若神經橫斷或大量流血則棄去金魚。
用來自正常金魚或兩側視神經損傷3或7天后的金魚的視神經制備CM，然后用體積排阻柱將樣本分成小于6kDa和大于6kDa的級分。從未損傷或損傷的視神經得到的CM均有高分子量和低分子量軸突生長促進因子(所有樣本生長均比L-15對照大得多，p＜0.002)。該數據顯示未分級的CM中大部分活性屬于小因子。分級后，得自視蓋區(qū)的CM含有高分子量和低分子量營養(yǎng)因子，各自水平約為視神經條件培養(yǎng)基的1/3。
細胞密度的影響。
為確定細胞密度是否影響視網膜神經節(jié)細胞對CM的響應，視網膜在本研究通用的標準密度(約70個細胞/mm2)或遞減的密度鋪板。如果另一種細胞是CM的直接的靶，而RGC響應該細胞分泌的二級因子，則隨著這種細胞數量減少以及二級信號濃度減小，預計RGC在低細胞密度時響應減小。在1/3標準細胞密度(約25個細胞/mm2)時，視網膜神經元像是比在標準細胞密度(N.S)時對CM的響應稍大，再稀釋3倍，生長僅比正常鋪板密度時低約30％[p＝0.18，無置信度]。在標準密度的1/27，生長才顯著減少(p＝0.05)。
缺少激發(fā)效應。
從預先未受損的魚或在14天前對視神經作手術以引發(fā)再生應答的魚中分離視網膜，將其離解，在僅有對照(L-15培養(yǎng)基)，濃度10％的未分級CM，或濃度為10％的CM低分子量級分中培養(yǎng)。所有情況下RGC的應答不受“激發(fā)”損傷的影響。
這樣做是為了確定是否CM中軸突生長促進因子會使“幼稚”的視網膜神經節(jié)細胞長到與已在體內引發(fā)了再生過程的“激發(fā)”細胞相同的程度。收集了4個原先未受損傷的魚的視網膜，也收集了4個10天前接受兩側視神經手術的魚的視網膜。與“幼稚”視網膜神經節(jié)細胞相似，“激發(fā)”的RGC在對照培養(yǎng)基中有很少的自發(fā)生長。在全(未分級)CM或僅有低分子量級分(小于3kDa)存在時，“幼稚”和“激發(fā)”的視網膜神經元軸突生長水平相同。實施例3其它分子對解離的視網膜培養(yǎng)物的活性確定已見報道的能改變視網膜外植體培養(yǎng)物生長特性的其它分子在本系統(tǒng)中是否有活性。為研究是否其它分子模擬CM中的活性，檢測了兩種經報道能調節(jié)“激發(fā)”的視網膜培養(yǎng)物生長的小分子和幾種大分子生長因子。
據報道，牛磺酸、視黃酸和NGF均能影響視網膜外植體的軸突生長。Lima等(1989)報道牛磺酸當有層粘連素存在時，促進體內激發(fā)再生的視網膜外植體的軸突再生，但對事先未受損的視網膜影響很小。?；撬徇€對視桿細胞的分化有貢獻(Altschuler等(1993)，發(fā)育，1191317-1328)。
視黃酸(RA)，細胞分化中一種主要因子，能促進金魚視網膜外植體中等纖維蛋白ON1(gefiltin)和ON2的表達，但不影響生長本身(Hall等，1990)。
金魚腦中有NGF活性(Benowitz和Greene(1979)，腦研究，162164-168)，初步Western印跡研究顯示小鼠NGF的抗體與一種12-13 kDa(即β-NGF單體的大小)的蛋白，有交叉反應，這一現象支持視神經CM中有類NGF分子。低濃度(即5ng/ml)的哺乳動物NGFβ亞基促進體內激發(fā)生長的金魚視網膜外植體軸突生長，而NGF的抗體抑制有血清時保持的激發(fā)視網膜外植體的生長(Turner等，1982)。但是NGF對未激發(fā)的視網膜外植體很少有影響(Turaer等，1982)，對體內軸突生長速率影響也很小(Yip和Grafstein，1982)。因此，盡管NGF可能在本系統(tǒng)中有調節(jié)作用，但不象是直接誘導軸突生長。NGF可能激活膠質細胞釋放因子，再作用于神經元。
腦來源的神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經營養(yǎng)因子3(NT-3)、NT-4-5，纖毛神經營養(yǎng)因子(CNTF；均得自Regeneran，Tarrytown，紐約州，試驗濃度1-100ng/ml)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF，R&D系統(tǒng)，Minneapolis，明尼蘇達州，1-100ng/ml)和堿性成纖維細胞生長因子(Patricia D′Amore博士惠贈，1-100ng/ml)也在生物試驗中被檢測。
在該細胞系統(tǒng)中，濃度1μm到10mM的?；撬岣緵]有作用，濃度10-9到10-4的視黃酸也一樣。初步試驗發(fā)現NGF在50nM時對解離的視網膜神經元無影響，在500nM時有弱激活作用；結果顯示NGF在100mM(在激活的外植體培養(yǎng)物中促進軸突生長的劑量的20倍)時沒有活性(Turner等，1982)。
雖然神經生長因子(NGF)在這些培養(yǎng)物中未能引發(fā)軸突生長，但它們可能間接地對視神經再生作出貢獻。
其它神經營養(yǎng)因子同樣在相當大的濃度范圍內沒能誘導生長BDNF，NT-3和NT-4/5均在10pg/ml到100ng/ml作了試驗，均未能誘導出任何軸突生長。在1到100ng/ml濃度范圍內檢測了非神經營養(yǎng)因子的生長因子，包括酸性和堿性成纖維細胞生長因子和纖毛神經營養(yǎng)因子。它們同樣沒有作用。實施例4條件培養(yǎng)基的組織特異性將標準CM與含有其它金魚組織分泌的因子的培養(yǎng)基比較，確定活性因子對視神經是否有特異性。將制備3ml CM所需的視神經稱重然后切碎。用等質量的取自金魚肝、鰓和骨骼肌的組織制備其它條件培養(yǎng)基。為了評價其它腦組織，用6個金魚視蓋區(qū)制備條件培養(yǎng)基；進行生物實驗，將視蓋區(qū)條件培養(yǎng)基的蛋白濃度與標準視神經條件培養(yǎng)基的匹配。
與金魚視神經條件培養(yǎng)基不同，用等質量金魚骨骼肌、鰓或肝調節(jié)的培養(yǎng)基顯示很少軸突生長促進活性。所有樣本均與視神經CM不同，p＜0.01。用視蓋區(qū)調節(jié)的培養(yǎng)基，與視神經CM的蛋白濃度(即約10μg蛋白/ml)相匹配后，顯示活性約為視神經條件培養(yǎng)基的1/3。
兩種因子之間的關系現在尚不清楚。在這些試驗中，AF-1和AF-2獨立誘導軸突生長，且其效果不象有協(xié)同性。不過有可能在體內它們互補地起作用。也可能AF-1來源于AF-2的降解。由于培養(yǎng)物含有許多種細胞，有可能AF-1和AF-2不是直接作用于視網膜神經節(jié)細胞，而是作用于另一種起中介作用的細胞。Schwartz和Agranoff(1981)觀察到在如上制備的解離金魚視網膜培養(yǎng)物中RGC為主導細胞類型，支持細胞不多。因此我們不是抑制支持細胞的增殖，而是系統(tǒng)地降低細胞密度，在保持CM濃度恒定的同時降低可能由其它類型細胞分泌的任何二級因子的濃度。由于細胞密度降低9倍時軸突生長并不顯著降低，RGC像是直接響應CM。不過當細胞密度約為3個細胞/mm2時，生長的確顯著降低。這可能是由于培養(yǎng)物中另一種細胞或RGC本身分泌的一種營養(yǎng)因子濃度降低，而這為維持細胞處于響應CM的狀態(tài)所必需。
這些發(fā)現進一步支持了AF-1和AF-2在誘導RGC軸突生長時的特異性。實施例5魚類來源的AF-1激發(fā)哺乳動物視網膜神經節(jié)細胞的軸突再生進行如下研究以確定激活金魚神經元軸突生長的小分子量肽是否激活哺乳動物視網膜神經節(jié)細胞(即視網膜的主要投射神經元)的軸突再生。
在神經基底培養(yǎng)基或補充血清的Dulbecco′s基本培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)15天胚胎的脊髓的解離神經元。
如圖5a-d所示，在一些盲視化的實驗中重復發(fā)現軸突生成因子1(AF-1)在出生后10天大鼠的視網膜解離培養(yǎng)物中誘導相當高水平的軸突生長。在神經基底培養(yǎng)基中加入AF-1，使軸突生長總體增加2.5倍(圖5a)并促進細胞存活率增加75％(圖5b)。在提高了總體細胞存活率的條件下，AF-1對細胞存活能力不再有影響，但仍使軸突生長增加約2.5倍(圖5c和5d)。
結果表明，AF-1對軸突生長的作用不是簡單地使細胞的某特定亞群體存活或是提高總體細胞存活率的結果。實施例6金魚來源的AF-1對大鼠視網膜神經節(jié)細胞的作用研究金魚來源的AF-1是否激發(fā)哺乳動物骨髓神經細胞在培養(yǎng)物中長出軸突。在這些研究中，神經元來源于胎鼠骨髓。用大鼠骨髓解離神經元的初級培養(yǎng)物系統(tǒng)，證實這些因子的廣泛特異性，描述見E.Banker和K.Goslin編，《培養(yǎng)神經細胞》(MIT出版社，1991)。該系統(tǒng)也可用于研究AF-1或AF-2是否影響培養(yǎng)物中所有類型細胞的軸突生長。
產后7到10天的大鼠的視網膜被解離，在DMEM中培養(yǎng)。通過用顆粒藍(granular blue)將視神經軸突預標記，讓染料用三天逆行轉移到視網膜中來鑒定神經細胞。
沒有AF-1時，約5％的視網膜神經節(jié)細胞伸展出的軸突長5到10個細胞直徑，僅有1％的軸突還要長。加入低納摩爾水平的AF-1，軸突長5到10個細胞直徑的細胞數目加倍，軸突長過10個細胞直徑的軸突數增加約10倍。未發(fā)現對細胞存活有任何影響。
結果由圖6a-6b給出。圖6a和6b給出的研究中，培養(yǎng)基用來顯示AF-1對細胞存活和軸突生長的作用。圖6c和6d給出的實驗中，培養(yǎng)基條件被改變了。發(fā)現雖然AF-1對存活無明顯影響，但使軸突生長增大很多。實施例7在得自哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞培養(yǎng)物中確定出與金魚AF-1相似的因子。
研究表明，哺乳動物中樞神經系統(tǒng)膠質細胞分泌的一種因子，在大小和生物活性上與金魚的AF-1相似。
在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)新生大鼠腦膠質培養(yǎng)物至近匯合(near-confluence)。將培養(yǎng)基改換成確定的無血清的培養(yǎng)基，收集膠質分泌的因子24小時。用超濾將膠質調節(jié)的培養(yǎng)基(“MGCM”)分成高分子量和低分子量組分，用標準金魚試驗檢測分子量小于1000Da的級分的活性。用反相高效液相色譜(HPLC)得到該組分的亞級分。不結合疏水性反相C-18柱的亞級分(級分4、5和6、7)也被檢測。
圖7顯示哺乳動物膠質細胞分泌一種與AF-1相似的因子，繪出了不同級分中軸突生長超過5個細胞直徑的細胞百分比。分子量小于1000Da的級分和HPLC洗脫物的兩個級分，尤其是后一級分，與從金魚得到的化合物的活性幾乎相同。
綜上所述，這些研究說明(a)AF-1對哺乳動物神經元及低等脊髓動物神經元均起作用，(b)AF-1除對視網膜神經節(jié)細胞起作用外，還對神經系統(tǒng)其它細胞起作用，和(c)哺乳動物膠質細胞產生一種類似的分子。
權利要求
1.一種神經營養(yǎng)多肽，它選自一種經質譜測定分子量約為700Da的多肽，它可用分子量分離、雙相提取和反相高效液相色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基中，95℃加熱至15分鐘后仍保持活性，用鏈霉蛋白酶和胰蛋白酶消化后保持活性，并且是親水性的；一種分子量約為12,000Da的蛋白，它可用分子量分離和陰離子交換色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基，蛋白在pH10時結合在柱上，在pH8.4時不結合，可用0.2M NaCl洗脫，95℃加熱15分鐘后失活，用胰蛋白酶或蛋白酶K消化后失活。
2.權利要求1的多肽，其進一步包括施用給動物的藥用載體。
3.權利要求2的蛋白，其中載體是選自脂質體、微粒、聚合物厚片和泵的緩釋組件。
4.權利要求2的多肽，其進一步包括選自阻止自由基形成的藥劑、自由基清除劑和抗生長抑制分子的化合物。
5.一種誘導軸突伸長的方法，其包括將神經細胞接觸有效量的在施用給動物的藥用載體中的神經營養(yǎng)蛋白，所述神經營養(yǎng)蛋白選自一種經質譜測定分子量約為700Da的多肽，它可用分子量分離、雙相提取和反相高效液相色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基中，95℃加熱至15分鐘后仍保持活性，用鏈霉蛋白酶和胰蛋白酶消化后保持活性，并且是親水性的；一種分子量約為12,000Da的蛋白，它可用分子量分離和陰離子交換色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基，蛋白在pH10時結合在柱上，在pH8.4時不結合，可用0.2M NaCl洗脫，95℃加熱15分鐘后失活，用胰蛋白酶或蛋白酶K消化后失活。
6.權利要求5的方法，其中載體是選自脂質體、微粒、聚合物厚片和泵的緩釋組件。
7.權利要求5的方法，其進一步包括將一種化合物與神經營養(yǎng)蛋白共同施用，該化合物選自阻止自由基形成的藥劑、自由基清除劑和抗生長抑制分子。
8.一段核苷酸序列，它選自編碼一種經質譜測定分子量約為700Da的多肽的序列，該多肽可用分子量分離、雙相提取和反相高效液相色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基中，95℃加熱至15分鐘后仍保持活性，用鏈霉蛋白酶和胰蛋白酶消化后保持活性，并且是親水性的；和編碼一種分子量約為12,000Da的蛋白的序列，該蛋白可用分子量分離和陰離子交換色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基，蛋白在pH10時結合在柱上，在pH8.4時不結合，可用0.2M NaCl洗脫，95℃加熱15分鐘后失活，用胰蛋白酶或蛋白酶K消化后失活。
9.一種與神經營養(yǎng)蛋白有免疫反應性的抗體，所述神經營養(yǎng)蛋白選自一種經質譜測定分子量約為700Da的多肽，它可用分子量分離、雙相提取和反相高效液相色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基中，95℃加熱至15分鐘后仍保持活性，用鏈霉蛋白酶和胰蛋白酶消化后保持活性，并且是親水性的；一種分子量約為12,000Da的蛋白，它可用分子量分離和陰離子交換色譜法分離自培養(yǎng)過膠質鞘細胞的培養(yǎng)基，蛋白在pH10時結合在柱上，在pH8.4時不結合，可用0.2M NaCl洗脫，95℃加熱15分鐘后失活，用胰蛋白酶或蛋白酶K消化后失活。
全文摘要
本發(fā)明開發(fā)出一種細胞培養(yǎng)條件，能在成分確定的無血清的條件下維持視網膜神經細胞。刺激這些神經元再生出軸突的分子因子已被表征。圍繞視神經軸突的膠質鞘細胞釋放兩種分子，它們引發(fā)并維持神經再生。其中一種分子被稱為軸突生成因子1(AF-1)，它是小分子量多肽，大小約1000Da，由質譜確定約為707Da。另一種分子，AF-2，是大小約12,000Da的較大蛋白。研究表明這些因子積極參與中樞神經系統(tǒng)(CNS)再生，因此可用于治療脊髓和其它神經組織的損傷。
文檔編號C12N15/09GK1164858SQ95195911
公開日1997年11月12日 申請日期1995年8月24日 優(yōu)先權日1994年8月26日
發(fā)明者L·I·貝諾維茲, C·A·艾文, P·杰克森 申請人:兒童醫(yī)療中心有限公司