專利名稱：利用微生物生產(chǎn)酰胺化合物的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及利用微生物生產(chǎn)酰胺化合物的方法，該微生物具有把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的水合作用活性。
近年來，生物催化劑(如微生物)已廣泛應用于化學反應中。例如人們所熟悉的，可利用芽孢桿菌屬、芽孢不動菌屬、微球菌屬或短桿菌屬(USP4，001，081)、棒狀桿菌屬或奴卡氏菌屬(USP4，248，968)、假單胞菌屬(USP4，555，487)、紅球菌屬或微桿菌屬(EP-188，316)或鐮刀菌屬(JP-A-64-86889/1989)的某個菌株，通過水合作用把腈化合物轉(zhuǎn)變成酰胺化合物。
不過，所有這些微生物均屬嗜常溫性細菌，它們在55℃或更高溫度下不能生長。
此外，在高于室溫的溫度范圍內(nèi)，嗜常溫性細菌把腈化合物轉(zhuǎn)為成其相應的酰胺化合物的水合作用活性也是不穩(wěn)定的。由于這個原因，利用這種嗜常溫性細菌生產(chǎn)酰胺化合物通常是在較低溫度下進行的。在這種情況下，需要有冷卻設備使反應器維持在較低溫度，而且因冷卻消耗了大量能量，這些都導致生產(chǎn)成本的極大上升。
在這些情況下，本發(fā)明人極力尋找某些微生物，它們具有可在高于室溫的溫度條件下把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的水合作用活性。結(jié)果發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，從(日本)岡山縣某個溫泉土壤中分離出的嗜熱性微生物符合這樣的要求，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)酰胺化合物的方法，其包括在細菌細胞培養(yǎng)液(內(nèi)含完整的細菌細胞、破裂的細菌細胞或酶)存在下或在經(jīng)固定內(nèi)含的完整細菌細胞、破裂細菌細胞或酶而形成的固定化制劑存在下，通過水合腈化合物把該腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物，其中的細菌細胞是具有把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的水合作用活性的嗜熱性微生物的生物純培養(yǎng)物的細胞。
本發(fā)明還提供了一種新型嗜熱性微生物的生物純培養(yǎng)物，該微生物具有把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的水合作用活性，將其命名為史密斯芽孢桿菌(B.smithii)SC-J05-1(FERMBP-4935)。
依照本發(fā)明的方法，可把許多腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物。腈化合物的實例有脂族腈，如正丁腈、正戊腈、異丁腈、乙腈和新戊腈；含鹵素的腈，如2-氯丙腈;不飽和脂族腈，如丙烯腈、丁烯腈和甲基丙烯腈;羥基腈化合物，如乳腈和扁桃腈；氨基腈化合物，如2-苯基甘氨酸腈；芳族腈化合物；如苯并腈和氰基吡啶；二腈化合物，如丙二腈、丁二腈和已二腈。優(yōu)選的是正丁腈、正戊腈、異丁腈、乙腈、新戊腈、2-氯丙腈、丙烯腈、丁烯腈、甲基丙烯腈、苯并腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、丙二腈、丁二腈和已二腈。
在細菌細胞培養(yǎng)液(內(nèi)含完整的細菌細胞、破裂的細菌細胞或酶)存在下或在經(jīng)固定內(nèi)含的完整細菌細胞、破裂的細菌細胞或酶而形成的固定化制劑存在下，通過水合腈化合物實現(xiàn)了腈化合物向酰胺化合物的轉(zhuǎn)變。細菌細胞是嗜熱性微生物的生物純培養(yǎng)物的細胞，該微生物具有把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的水合作用活性。
本發(fā)明中所使用的微生物并沒有特殊限制，只要其是具有將腈化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠湎鄳孽０坊衔锏乃献饔没钚缘氖葻嵝约毦纯伞＿@里所用的術(shù)語“嗜熱性微生物”是指具有在55℃或更高培養(yǎng)溫度下生長能力的微生物。
例如，所需的微生物可通過下列程序得到。首先，采集自然界中的土壤，把適量的采集土壤或?qū)⑼寥劳耆珣腋∮谒兴玫降纳锨逡杭尤氲绞熘奈⑸锷L培養(yǎng)基(例如含有甘油、多胨、酵母膏和麥芽汁主要成分的液體培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基)中，然后在55℃或更高的溫度下培養(yǎng)24小時到3個月不等。把用這種方法得到的培養(yǎng)液或所分離的部分細菌細胞鋪覆在含有同上成分的瓊脂平板培養(yǎng)基上，隨后進一步培養(yǎng)形成一些菌落，由此可分離出嗜熱性微生物。
由自然界中得到的各種微生物保藏機構(gòu)保藏的嗜熱性微生物通過在含有上述培養(yǎng)基成分和腈化合物或酰胺化合物(如異戊腈、丁烯腈或丁烯酰胺)的液體培養(yǎng)基的試管或燒瓶中，在55℃或更高的溫度下培養(yǎng)適當?shù)臅r間，例如12小時到7天不等而得以生長。把培養(yǎng)液加入到腈化合物(如丙腈或丙烯腈)的水溶液中，在例如30℃的溫度下進行反應，時間約為10-60分鐘。然后，檢查反應混合物以確定酰胺化合物是否生成，這樣可能容易地找到具有把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的水合作用活性的嗜熱性微生物。為了檢測酰胺化合物，例如可使用如下所述的氣相色譜分析方法。
作為一個典型的實例，史密斯芽孢桿菌SC-J05-1可應用于本發(fā)明的方法中。這個菌株是芽孢桿菌屬的嗜熱性微生物，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)它具有水合腈化合物的腈基團的較高活性，該菌株于1993年12月24日被寄存在日本工業(yè)科學技術(shù)會社的國立生物科學與人類技術(shù)研究所中，登記號為FERM P-14037，后于1994年12月14日轉(zhuǎn)存于布達佩斯條約國際收藏中心，登記號為FERM BP-4935。
史密斯芽孢桿菌SC-J05-1的細菌學特性如下(a)形態(tài)學1.細胞形態(tài)與大小形狀桿狀大小0.5-0.8μm×0.8-2μm
2.多形性無3.游動性靈活、周毛性鞭毛4.孢子形成已發(fā)現(xiàn)有5.革蘭氏染色多變6.抗酸性無(b)生長特性1.營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)圓、凸、無光澤、淡褐色2.營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)無光澤、淡褐色3.營養(yǎng)液體培養(yǎng)均勻性混濁生長4.營養(yǎng)液體明膠穿刺培養(yǎng)未液化5.石蕊牛乳無變化(c)生理學特性1.硝酸鹽還原-2.反硝化作用-3.甲基紅試驗+4.VP試驗-5.吲哚形成-6.硫化氫形成+7.淀粉水解作用-8.檸檬酸利用科澤氏培養(yǎng)基±
9.無機氮源利用NaNO3-(NH4)2SO4+10.色素形成金氏培養(yǎng)基A-金氏培養(yǎng)基B-11.脲酶-12.氧化酶+13.觸酶-至±14.生長條件pH值4.1-7.5溫度30-60℃15.對氧氣的反應略為好氧16.氧化-發(fā)酵試驗發(fā)酵17.糖中的酸及氣體形成酸 氣體L-阿拉伯糖: - -D-木糖: + -D-葡萄糖: + -D-甘露糖: + -D-果糖: + -
D-半乳糖: + -麥芽糖: + -蔗糖: + -乳糖: - -海藻糖: + -D-山梨糖醇: - -D-甘露糖醇: + -肌醇: + -甘油: + -淀粉: - -(d)其它特性1.DNA的Mol%G+C40.6%人們對表現(xiàn)出上述特性的微生物文獻進行了廣泛的檢索，L.K.Nakamura等人在國際系統(tǒng)細菌學雜志(38期，63-73頁，1988年)上報導了史密斯芽孢桿菌表現(xiàn)出同上所述的特性。根據(jù)這些結(jié)果，由本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的菌株SC-J05-1被鑒定為史密斯芽孢桿菌的一個菌株。
有關史密斯芽孢桿菌微生物具有把腈化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠湎鄳孽０坊衔锏乃献饔没钚赃@方面的信息尚不得而知。在這方面，可以認為史密斯芽孢桿菌SC-J05-1(FERM BP-4935)是一個新菌株。另外，從史密斯芽孢桿菌SC-J05-1(FERM BP-4935)得到的菌株變種(即突變體、細胞融合菌株或重組菌株)也可用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明方法中所用的微生物培養(yǎng)物可以在多種含碳和氮源、有機和(或)無機鹽等的培養(yǎng)基中加以制備。這些培養(yǎng)基都已廣泛應用于制備普通細菌的培養(yǎng)物。
碳源的實例有葡萄糖、甘油、糊精、蔗糖、有機酸、動、植物油和糖漿。
氮源的實例為有機和無機氮源，如肉湯、胨、酵母膏、麥芽汁、大豆粉、玉米漿、棉籽粉、干酵母、酪蛋白氨基酸、硝酸鈉和尿素。
有機和無機鹽的實例有諸如鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷及鋅等元素的氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。其具體實例有氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸-氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸-氫鈉和磷酸二氫鈉。
在本發(fā)明的方法中，最好在培養(yǎng)基中加入腈化合物(如異戊腈和丁烯腈)和酰胺化合物(如丁烯酰胺)，旨在提高所用微生物的腈水合作用活性。例如，這些化合物用量可在每100ml培養(yǎng)基中約為10mg-1g。
本發(fā)明方法中所用微生物的培養(yǎng)物可依據(jù)用于制備普通細菌培養(yǎng)物的常規(guī)方法進行制備，如使用試管、往復或旋轉(zhuǎn)振蕩器的固體或液體振蕩培養(yǎng)，以及使用發(fā)酵罐的其它培養(yǎng)。
微生物的培養(yǎng)物通常是在有氧條件下進行培育的。特別是使用發(fā)酵罐時，有必要導入無菌氣體，導入速度通常為每分鐘大約0.1-2倍的培養(yǎng)體積。
培養(yǎng)溫度可在所用微生物能在培養(yǎng)中存活的溫度范圍內(nèi)變化。例如，培養(yǎng)溫度約為30℃-100℃。要對pH值加以控制，例如控制在大約2-11。
特別是在培養(yǎng)史密斯芽孢桿菌時，培養(yǎng)溫度應在約30℃-100℃范圍內(nèi)，最好為約40℃-55℃，培養(yǎng)基的pH值范圍約為5-7。
培養(yǎng)時間可依據(jù)不同培養(yǎng)條件而定，通常約為1-7天。
例如，本發(fā)明的方法可按下述進行。
把細菌細胞、完整細菌細胞或經(jīng)處理按上述方法制備的細菌細胞而得到的材料在水或水溶液(如磷酸鹽緩沖液)中懸浮，然后把該懸浮液加入到腈化合物中進行反應。
這里所用的術(shù)語“經(jīng)處理細菌細胞而得到的材料”是指所含的破裂的細菌細胞或酶，是由諸如超聲波分解、用法國壓榨機進行的均化作用或破裂作用等常規(guī)技術(shù)而得到的;或者是指依據(jù)固定化方法(如載體載帶方法，其中這些材料通過共價鍵、離子鍵、吸附等載于適當?shù)妮d體上)或者包含方法(其中這些材料被包含在聚合體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中)，通過固定其中所含的完整或破裂細菌細胞或酶使其在不能溶解之后處于易除去狀態(tài)而得到的固定化制劑。
細菌細胞或經(jīng)處理細菌細胞而得到的材料的通常使用濃度約為0.01-20%(重量)，最好約為0.01-10%(重量)。就酶或固定化制劑而言，其濃度可依其純度或所用的固定化方法而變化;例如，優(yōu)選的是使制得的酶和固定化制劑具有與細菌細胞或經(jīng)處理細菌細胞而得到的材料水合腈基團之活性相似的活性。在加入腈化合物之前，細菌細胞的培養(yǎng)液可在不進行任何進一步處理的條件下加以使用。優(yōu)選的是稀釋或濃縮細菌細胞培養(yǎng)液使其具有與細菌細胞或經(jīng)處理細菌細胞而得到的材料水合腈基團之活性相似的活性。
反應條件通常為溫度約為0-70℃，最好約為0-50℃，pH值約為5-10，最好約為6-9，時間約為10分鐘到72小時。當把pH值控制在上述范圍內(nèi)時，細菌細胞能儲集所生成的酰胺化合物，得到高濃度的反應混合物。
這樣生成的酰胺化合物可利用任何本領域內(nèi)已知的常規(guī)方法從反應混合物中加以回收。例如，可通過離心從反應混合物中分離出細菌細胞或經(jīng)處理細菌細胞而得到的材料，繼而利用活性炭或離子交換樹脂進行處理以除去雜質(zhì)。純化的混合物經(jīng)在減壓條件下蒸餾或蒸發(fā)加以濃縮，把析出的晶體在有機溶劑(如甲醇)中進行重結(jié)晶，得到所需要的酰胺化合物。
以下實施例將進一步說明本發(fā)明，但不應被看作是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1細菌細胞的分離在(日本)岡山縣某處溫泉采集土壤，把所采土樣加入到含有1.0%的甘油、0.5%的多胨、0.3%的酵母膏和0.3%的麥芽汁(以上均為重量比)的培養(yǎng)基(pH值7.2)中，隨后在約55℃條件下往復振蕩培養(yǎng)21天。將部分培養(yǎng)液鋪覆在其組分同上所述的瓊脂培養(yǎng)基上，再次進行培養(yǎng)以形成一些菌落。
從這些菌落中分離出細菌細胞，把一菌環(huán)分離出的細菌細胞接種到一液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基除含同上組分外，還含0.1%(重量)的異戊腈，然后在55℃條件下培養(yǎng)24小時，得到的培養(yǎng)物作為樣品。然后，把1ml培養(yǎng)液加入到9ml2.78%(重量)的丙烯腈溶液(0.05M磷酸鹽緩沖液，pH值為7.7)中。在10℃下開始反應。10分鐘后，加入1ml2NHCl停止反應。取反應混合物的等分試樣，用氣相色譜法進行分析檢查所產(chǎn)生的丙烯酰胺，以便篩選某些具有水合腈基團活性的細菌菌株。這樣，就得到了史密斯芽孢桿菌SC-J05-1，它作為一種嗜熱性微生物，具有把腈化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠湎鄳孽０坊衔锏乃献饔没钚浴?br> 氣相色譜條件柱填充柱載體Porapak型Q(網(wǎng)眼80-100)長度1.1m柱溫度210℃載體氣體的流速50ml/分鐘樣品注入體積2μl實施例2用于檢查嗜熱特性的細菌細胞的培養(yǎng)把從實施例1中得到的史密斯芽孢桿菌SC-J05-1的細菌細胞和在JP-B62-21519/1987)中描述的嗜溫性細菌(芽孢桿菌種細菌，貯藏于法國Ecole Nationale Superieure des Agriculture的遺傳學實驗室收藏中心，貯藏號為R332;也貯藏于日本工業(yè)科學技術(shù)會社的國立生物科學及人類技術(shù)研究所，登記號為FERM P-2717;下文中被稱做芽孢桿菌種細菌R332)的細菌細胞分別鋪覆在一營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，在不同溫度條件下加以培養(yǎng)以檢查其生長能力。結(jié)果見表1。

標準(-)不生長(+)生長(++)大量生長從表1中可以看出，本發(fā)明的史密斯芽孢桿菌SC-J05-1是不同于作為對照的芽孢桿菌種細菌R332的一種嗜熱性微生物。
實施例3細菌細胞的培養(yǎng)在容積500ml的坂口燒瓶中加入100ml滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH值為7.2，含有1.0%的蔗糖、0.5%的多胨、0.3%的酵母膏、0.3%的麥芽汁、0.001%的硫酸亞鐵、0.001%的硫酸錳、0.001%的氯化鈷和0.001%的硫酸鋅(以上均為重量比)。把0.1ml已在同上培養(yǎng)基中培養(yǎng)過的史密斯芽孢桿菌SC-J05-1培養(yǎng)液接種到該燒瓶中。然后把這個燒瓶在55℃條件下往復振蕩培養(yǎng)1天，振蕩速度為135次/分鐘，這樣就得到了史密斯芽孢桿菌SC-J05-1細菌細胞的培養(yǎng)液。
參考實施例1細菌細胞的培養(yǎng)在容積500ml的坂口燒瓶中加入100ml滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH值為7.2，含有1.0%的甘油、0.5%的多胨、0.3%的酵母膏、0.3%的麥芽汁、0.001%的硫酸亞鐵、0.001%的硫酸錳、0.001%的氯化鈷和0.001%的硫酸鋅(以上均為重量比)。把0.1ml已在同上培養(yǎng)基中培養(yǎng)過的芽孢桿菌種細菌R332培養(yǎng)液接種到這個燒瓶中。然后把該燒瓶在30℃條件下往復振蕩培養(yǎng)2天，振蕩速度為135次/分鐘，這樣就得到了芽孢桿菌種細菌R332細菌細胞的培養(yǎng)液。
對比實施例1耐熱性從400ml實施例3中得到的史密斯芽孢桿菌SC-J05-1細菌細胞培養(yǎng)液中，以10，000×g離心10分鐘收集細菌細胞。在用0.05M磷酸鹽緩沖液(pH值7.7)沖洗后，把這些細菌細胞懸浮在100ml的上述緩沖液中。檢查這樣制備出的細菌細胞懸浮液把腈化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠湎鄳孽０坊衔锏乃献饔没钚?。另外，為了檢查其耐熱性，把同樣的細菌細胞懸浮液在恒溫條件下保持一段恒定時間。
用下述程序來測試其把腈化合物轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳孽０坊衔锏乃献饔没钚?。?ml2.78%丙烯腈溶液(0.05M磷酸鹽緩沖液，pH值為7.7)中加入1ml測試溶液，在10℃下開始反應。10分鐘后，加入1ml2NHCl停止反應。
取反應混合物的等分試樣，在與實施例1所述的相同條件下進行氣相色譜分析以確定所生成的丙烯酰胺量。
關于下文中所用的酶活性單位，把每分鐘將1μmol丙烯腈轉(zhuǎn)變?yōu)楸０返幕钚远x為一個單位(U)。
然后，從400ml參考實施例1中得到的芽孢桿菌種細菌R332細菌細胞培養(yǎng)液中，以10，000×g離心10分鐘收集細菌細胞。在用0.05M磷酸鹽緩沖液(pH值7.7)沖洗后，將這些細菌細胞懸浮在10ml的同上緩沖液中。用上述方法檢查這樣制備的細菌細胞懸浮液把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的水合作用活性。另外，為了確定其耐熱性，把同樣的細菌細胞懸浮液在恒溫下保持一段恒定時間，然后檢驗其活性。活性的檢測方法同上所述。根據(jù)檢測結(jié)果，計算每一菌株處理前后的相對活性(下文中被稱做剩余活性)，將芽孢桿菌種細菌R332的剩余活性定為100，據(jù)此換算出史密斯芽孢桿菌SC-J05-1的剩余活性。

對比實施例2反應穩(wěn)定性從實施例3中得到的史密斯芽孢桿菌SC-J05-1細菌細胞培養(yǎng)液中，以10，000×g離心10分鐘收集細菌細胞。在用0.05M的磷酸鹽緩沖液(pH值7.7)沖洗后，把這些細菌細胞懸浮在同上的緩沖液中，得到20U/ml的細菌細胞懸浮液。
另外，從芽孢桿菌種細菌R332細菌細胞培養(yǎng)液中，以10，000×g離心10分鐘收集細菌細胞。在用0.05M的磷酸鹽緩沖液(pH值7.7)沖洗后，把這些細菌細胞懸浮在100ml的上述緩沖液中，得到20U/ml的細菌細胞懸浮液。
然后，將每種細菌細胞懸浮液1ml和2.78%(重量)丙烯腈溶液(0.05M的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.7)9ml相混合，分別在30℃、40℃、50℃或60℃條件下進行反應。10分鐘后加入1ml2NHCl停止反應。取反應混合物的等分試樣，在如實施例1所述的相同條件下進行氣相色譜分析以確定所生成的丙烯酰胺量。根據(jù)從芽孢桿菌種細菌R332得出的數(shù)值(定為100)分別換算出在不同溫度下所生成的丙烯酰胺的量。換算的數(shù)值如表3所示。

實施例4利用細菌細胞培養(yǎng)液的反應在100ml實施例3中得到的史密斯芽孢桿菌SC-J05-1細菌細胞培養(yǎng)液中加入2.5g(47.2mmol)的丙烯腈，反應在20℃下進行并用磁力攪拌器加以攪拌。3小時后，取1.0ml的反應混合物，在其中加入0.1ml的2NHCl停止反應。在如實施例1所述的同樣條件下對反應混合物的等分試樣進行氣相色譜分析。結(jié)果所有部分的丙烯腈都完全轉(zhuǎn)變成了丙烯酰胺，并且沒有發(fā)現(xiàn)諸如丙烯酸等副產(chǎn)物的形成。
實施例5利用細菌細胞的反應從150ml實施例3中得到的史密斯芽孢桿菌細菌細胞培養(yǎng)液中，以10，000×g離心10分鐘收集細菌細胞。在用0.05M的磷酸鹽緩沖液(pH值7.7)沖洗后，把這些細菌細胞懸浮在50ml的相同緩沖液中。在該懸浮液中分三部分加入3.0g(56.6mmol)的丙烯腈反應在20℃下進行并用磁力攪拌器加以攪拌。4小時后，取1.0ml的反應混合液，在其中加入0.1ml的2NHCl停止反應。對該反應混合物的等分試樣在如實施例1中所述的相同條件下進行氣相色譜分析。結(jié)果所有三部分丙烯腈都完全轉(zhuǎn)變成了丙烯酰胺，并且沒有發(fā)現(xiàn)諸如丙烯酸等副產(chǎn)物的形成。
另外，以10，000×g離心10分鐘把細菌細胞從剩余的反應混合物中除去，并在低于50℃的條件下蒸餾濃縮上清液使晶體析出，然后在甲醇中進行重結(jié)晶，得到3.7g(52.1mmol，92%產(chǎn)率)的無色片狀晶體。由熔點測定、元素分析、紅外光譜和核磁共振光譜證實了這些晶體是丙烯酰胺。
實施例6使用酶溶液的反應從8ml實施例3中得到的史密斯芽孢桿菌SC-J05-1細菌細胞培養(yǎng)液中，以10，000×g離心10分鐘收集細菌細胞。沖洗后，把細菌細胞懸浮于300ml0.05M的HEPES-KOH緩沖液(pH值7.2)，用法國壓榨機以20，000磅/平方英寸破碎兩次。將破裂細胞以10，000×g離心30分鐘以除去殘留的細菌細胞。使用透析管(Wako純化學品有限公司生產(chǎn))，在4℃、4次更換10mM HEPES-KOH緩沖液(pH值7.2)條件下，透析上清液24小時。使透析液濾過作為陰離子交換樹脂的DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)柱(50mmΦ×200mm)(事先用0.05M的HEPES-KOH緩沖液(pH值7.2)加以平衡)，從而使酶吸附到柱上。
然后，把0.05M的HEPES-KOH緩沖液(pH值7.2)過柱進行沖洗，用0.05M的HEPES-KOH緩沖液(pH值7.2，含0-1.0M的氯化鉀)進行梯度洗脫。對表現(xiàn)出把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物之水合作用活性的級分加以回收，在4℃、4次更換10mM HEPES-KOH緩沖液(pH值7.2)條件下，用透析管(Wako純化學品有限公司生產(chǎn))透析24小時。用陰離子交換色譜法對透析液進行純化，操作條件同上，只是用0.05mM的HEPES-KOH緩沖液(pH值7.2，含0.2-0.8M的氯化鉀)進行梯度洗脫。用如上所述的方法對洗脫液進行透析，得到一種粗酶溶液。
可據(jù)下述方法確定其把腈化合物轉(zhuǎn)變成其相應的酰胺化合物的活性首先，把1ml粗酶溶液加入到9ml100mM的丙腈水溶液(pH值7.7)中，在10℃下開始反應。10分鐘后，加入1ml2NHCl停止反應。取反應混合液的等分試樣，用氣相色譜法加以分析以確定所生成的丙酰胺量。
關于下文中所用的酶活性單位，把每分鐘將1mmol丙腈轉(zhuǎn)變?yōu)楸０返幕钚远x為一個單位(U)。
把這樣得到的粗酶溶液用0.05M的磷酸鹽緩沖液(pH值7.7)加以稀釋。在100ml的這種稀釋液中加入2.5g(47.2mmol)的丙烯腈，反應在20℃下進行并用磁力攪拌器加以攪拌。3小時后，取1.0ml反應混合物，加入0.1ml2NHCl停止反應。對該反應混合物的等分試樣進行氣相色譜分析，操作條件同實施例1所述。結(jié)果，所加入的所有部分的丙烯腈完全轉(zhuǎn)變成了丙烯酰胺，并且沒有發(fā)現(xiàn)諸如丙烯酸等副產(chǎn)物的形成。
實施例7多種腈化合物的轉(zhuǎn)化在這個實施例中，檢查了史密斯芽孢桿菌SC-J05-1中所含的腈水合酶把多種腈化合物轉(zhuǎn)化成其相應的酰胺化合物的能力。在60個單位的實施例5中得到的粗酶溶液中，加入20ml0.05M的磷酸鹽緩沖液(pH值7.7)和1mmol表4中所示的每一種被測試的腈化合物(作為底物)，在30℃下反應3小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)由史密斯芽孢桿菌SC-J05-1制備的粗酶溶液具有把所有被測試的腈化合物轉(zhuǎn)化成其相應的酰胺化合物的水合作用活性。用氣相色譜法或液相色譜法對反應混合物進行分析以確定所生成的酰胺化合物的量或所消耗的腈化合物的量。
表4
<p>根據(jù)本發(fā)明，即使在高于室溫的條件下也能把多種腈化合物穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化為其相應的酰胺化合物，與通常在低溫下進行的常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法使得在一個較寬溫度范圍內(nèi)高效生產(chǎn)高純度酰胺化合物成為可能。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)酰胺化合物的方法，該方法包括在細菌細胞培養(yǎng)液(內(nèi)含完整細菌細胞、破裂細菌細胞或酶)存在下或在經(jīng)固定內(nèi)含的完整細菌細胞、破裂細菌細胞或酶而得到的固定化制劑存在下，通過水合腈化合物，把所說的腈化合物轉(zhuǎn)化為其相應的酰胺化合物，所說的細菌細胞是具有把腈化合物轉(zhuǎn)化為其相應的酰胺化合物的水合作用活性的嗜熱性微生物的生物純培養(yǎng)物的細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中嗜熱性微生物是史密斯芽孢桿菌的一個菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中嗜熱性微生物是史密斯芽孢桿菌SC-J05-1(FERM-BP-4935)。
4.嗜熱性微生物的生物純培養(yǎng)物，該嗜熱性微生物具有把腈化合物轉(zhuǎn)化為其相應的酰胺化合物的水合作用活性。
5.史密斯芽孢桿菌SC-J05-1(FERM-BP-4935)或其變種的生物純培養(yǎng)物，其具有把腈化合物轉(zhuǎn)化成其相應的酰胺化合物的水合作用活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)酰胺化合物的方法，該方法包括在細菌細胞培養(yǎng)液(內(nèi)含完整細菌細胞、破裂細菌細胞或酶)存在下或在經(jīng)固定內(nèi)含的完整細菌細胞、破裂細菌細胞或酶而得到的固定化制劑存在下，通過水合腈化合物，把該腈化合物轉(zhuǎn)化為其相應的酰胺化合物，細菌細胞是具有把腈化合物轉(zhuǎn)化為其相應的酰胺化合物的水合作用活性的嗜熱性微生物的生物純培養(yǎng)物的細胞，例如史密斯芽孢桿菌SC-J05-1(FERM BP-4935)。
文檔編號C12P13/02GK1111677SQ9510148
公開日1995年11月15日 申請日期1995年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月1日
發(fā)明者高島喜樹, 椋本藤夫, 光田賢 申請人:住友化學工業(yè)株式會社