專(zhuān)利名稱(chēng)：新抗生素波拉霉素(Polaramycin)A，B及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于兩個(gè)新的多羥基內(nèi)酯(Polyhydroxyl lactone)抗生素，波拉霉素(Polaramycin)A，B及其制造方法，并涉及其在醫(yī)藥及農(nóng)藥方面的用途。
迄今已發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于微生物的抗生素已近萬(wàn)種，其中許多已作為醫(yī)藥、農(nóng)藥得到廣泛應(yīng)用，但至今仍然缺乏毒性低、效果好的醫(yī)用抗真菌抗生素。另外，隨著化學(xué)農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，由此造成的公害及環(huán)境污染也日益嚴(yán)重，因此對(duì)高效低毒的生物農(nóng)藥的要求也日益迫切。
本發(fā)明是在從放線菌中篩選抗真菌抗生素的過(guò)程中，由吸水鏈霉菌LP93(Streptomyces hygroscopicus LP93)的培養(yǎng)物中分離到具有很高抗真菌活性的多羥基內(nèi)酯抗生素，波拉霉素A，B，基于光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析確定，波拉霉素A，B具有如式(1)所示結(jié)構(gòu)式(波拉霉素A，R＝H；B，R＝CH3)，該結(jié)構(gòu)式可將波拉霉素A，B與迄今已知結(jié)構(gòu)的所有抗真菌多羥基內(nèi)酯抗生素相區(qū)別1，2，4，5，6，波拉霉素A雖與抗生素MH850B37性質(zhì)相近，但亦有區(qū)別，且后者結(jié)構(gòu)至今尚不清楚，故認(rèn)定波拉霉素A，B為新抗生素。
(該產(chǎn)生菌已保藏在″中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心″，地址北京中關(guān)村，100080，保藏日期1995年1月25日，編號(hào)CGMCC NO.0220)
式(1)，波拉霉素A(R＝H)，B(R＝CH3)參考文獻(xiàn)1. MalolactomycinA J.Antibiotics 46(12)1912-1915，19932. Malolactomycins A and B，Tetrahedron 49(39)8227-8836，19933.抗生素MH850A，B日本公開(kāi)特許公報(bào)平4-1876934.抗生素MBA028-24A日本公開(kāi)特許公報(bào)平4-2880835.抗生素MBA028-24B日本公開(kāi)特許公報(bào)平4-2817946. Guanidylfungin B日本公開(kāi)特許公報(bào)昭61-10595
本發(fā)明的目的在于提供如式(I)所示新結(jié)構(gòu)的抗生素波拉霉素(Polaramycin)A，B及其制造方法。
本發(fā)明的內(nèi)容與要點(diǎn)如下1)波拉霉素A，B的結(jié)構(gòu)及理化數(shù)據(jù)A)波拉霉素A的結(jié)構(gòu)及理化數(shù)據(jù)波拉霉素A具有如式(I)所示結(jié)構(gòu)(R＝H)，其UV，IR，F(xiàn)ABMS，元素分析，分子式，1HNMR及13CNMR，DEPT數(shù)據(jù)如下，其結(jié)構(gòu)式(I)是根據(jù)這些數(shù)據(jù)及1H-1H相關(guān)譜(COSY)，1H-13C異核相關(guān)譜(HETCOR)以及反向檢測(cè)遠(yuǎn)程1H-13C異核多鍵相關(guān)譜(HMBC)的分析確定的。
UVλmaxEtoHnm 222.8(圖譜見(jiàn)附圖1)IR(KBr)3330，2905，1670(寬，強(qiáng))，1595，1375，1265，1130(肩)，1090(肩)，1060，970，835cm-1(圖譜見(jiàn)附圖2)元素分析C，59.95；H，9.17；N，3.99FABMS(M/Z)1090(M＋H)+，1072，1045，987，324，306，296，266，240，228，212，198，170，156，142，128，114(圖譜見(jiàn)附圖3)分子式C55H99N3O18HNMR(500MH2，CD3OD1δin ppm，J in Hz)6.82(1H，t，J＝7)，5.50(1H，dd，J＝15.5，6.0)，5.48(1H，dd，J＝15.5，8.0)，5.31(1H，m)，4.83(1H，dd，J＝8.1，3.9)，4.43(1H，dd，J＝5.5，2.0)，4.14(1H，m)，4.12(1H，m)，3.96(1H，m)，3.94(1H，m)，3.92(1H，m)，3.89(1H，m)，3.85(1H，ddd，J＝7.5，7.5，4)，3.80(1H，ddd，J＝7.5，7.5，2.7)，3.67(1H，m)，3.4(1H，d，J＝9.0)，3.24(2H，s)，3.20(2H，t，J＝7.0)，2.56(1H，m)，2.35(1H，m)，2.18(1H，m)，1.95(1H，m)，1.87(3H，s)，1.046(3H，d，J＝7.0)，0.995(3H，d，J＝6.7)，0.970(6H，d，J＝6.8)，0.950(3H，d，J＝7.0)，0.840(3H，d，J＝7.0)(圖譜見(jiàn)附圖4)
13CNMR(125MHz)，CD3OD，δin ppm)及DEPT174.11(C)， 171.79(C)， 169.54(C)， 158.69(C)，144.16(CH)，134.25(CH)，134.11(CH)，128.94(C)，99.73(C)， 80.3(CH)， 77.13(CH)， 77.08(CH)，76.30(CH)， 73.43(CH)， 72.35(CH)， 72.29(CH)，71.76(CH)， 70.55(CH)， 69.69(CH)， 66.22(CH)，65.62(CH)， 65.36(CH)， 46.51(CH2)，46.07(CH2)，45.82(CH)， 44.74(CH2)，44.37(CH)， 43.64(CH2)，42.48(CH2)，41.99(CH2)，41.49(CH2)，41.20(CH2)，40.93(CH)， 40.66(CH)， 40.18(CH)， 37.72(CH2)，35.31(CH)， 34.93(CH2)，33.98(CH2)，32.06(CH2)，30.83(CH2)，30.63(CH2)，30.37(CH2)，30.12(CH2)，29.90(CH2)，27.92(CH2)，27.65(CH2)，27.57(CH2)，17.74(CH3)，15.52(CH2)，14.53(CH3)，14.37(CH3)，12.60(CH3)，11.12(CH2)，10.30(CH3)(圖譜見(jiàn)附圖5)B)波拉霉素B的結(jié)構(gòu)及理化數(shù)據(jù)波拉霉素B具有如式(I)所示結(jié)構(gòu)(R＝CH3)，其分子量比A大14，同時(shí)13CNMR譜中比A多出了28.31ppm的信號(hào)，質(zhì)譜中與側(cè)鏈相關(guān)的碎片峰均比A大14個(gè)質(zhì)量單位，說(shuō)明波拉霉素B為A的NCH3衍生物[式(1)，R＝CH3]，波拉霉素B雖與抗生素MHB50A3性質(zhì)相近，具有相同的分子量，但MH850A無(wú)1HNMR譜中2.88ppm的信號(hào)，二者為不同物質(zhì)，波拉霉素B的理化數(shù)據(jù)如下UVλmaxEtoH223nm(圖譜見(jiàn)附圖6)FABMS(M/Z)1104(M＋H)+，1086，338，320，310，280，254，242，226，212，184，170，142，128(圖譜見(jiàn)附圖7)分子式C56H101N3O181HNMR(500MHz，CD3OD，δin ppm，J in Hz)6.82(1H，t，J＝7)，5.53(1H，dd，J＝15.0，6.0)，
5.49(1H，dd，J＝15.0，8.0)，5.32(1H，m)，4.83(1H，m)，4.42(1H，m)，4.12-4.14(2H，m)，3.89-3.96(4H，m)，3.85(1H，m)，3.80(1H，m)，3.68(1H，m)，3.40(1H，d，J＝9.0)，～3.3(2H，與甲醇信號(hào)重疊)，3.20(2H，t，J＝7.2)，2.88(3H，s)，2.57(1H，m)，2.37(1H，m)，2.20(1H，m)，1.93(1H，m)，1.87(3H，s)，1.045(3H，d，J＝6.8)，0.995(3H，d，J＝6.5)0.965(6H，d，J＝7.0)，0.951(3H，d，J＝7.0)，0.841(3H，d，J＝7.0)(圖譜見(jiàn)附圖8)13CNMR(125MHz，CD3OD，δin ppm)174.08，171.80，169.55，158.31，144.19，134.17，134.17，128.95， 99.76， 80.29， 77.22， 77.06，76.36， 73.55， 72.42， 72.30， 71.66， 70.60，69.71， 66.32， 65.67， 65.42， 46.48， 46.10，45.76， 44.73， 44.28， 43.58， 42.56， 42.01，41.57， 41.19， 40.91， 40.66， 40.18， 37.76，35.37， 34.95， 33.96， 32.07， 30.80， 30.66，30.36， 30.14， 29.95， 28.31， 27.92， 27.67，27.58， 17.75， 15.51， 14.59， 14.37， 12.60，11.17， 10.32(圖譜見(jiàn)附圖9)2)波拉霉素的生物活性波拉霉素(Polramycin，其中A占90％以上)，除對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有一定作用外，特別對(duì)一些致病真菌及一些引起植物病害的真菌具有較高活性，分別示如表1及表2。
表1波拉霉素的抗真菌譜<
波拉霉素1000ug/ml，紙片法，紙片直徑5mm；培養(yǎng)條件酵母樣真菌為35℃，24小時(shí)，絲狀真菌為28℃，48-72小時(shí)。＋ Papulacandin B耐藥株艸 Ampholericin B耐藥株 天然 Amphotericin B耐藥株表2波拉霉素對(duì)引起植物病害的真菌的抗菌譜
3)波拉霉素的制造方法A)菌種及培養(yǎng)條件波拉霉素(Polaramycin)由吸水鏈霉菌LP93(Streptomyceshygroscopicus LP93)產(chǎn)生。菌種特征為在葡萄糖-天門(mén)冬素培養(yǎng)基(磷酸氫二鉀0.05％，天門(mén)冬素0.05％，葡萄糖1％，洋菜1.2％)上，25-28℃培養(yǎng)10～4天，基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)豐富，顏色微黃轉(zhuǎn)灰，孢子灰黑，氣生菌絲吸水，孢子橢圓形，表面光滑，孢子絲呈螺旋狀。
將菌種斜面用挖塊法接種于種子培養(yǎng)基(黃豆餅粉2-4％，葡萄糖2％，(NH4)2SO40.3％，CaCO30.15％)，25-28℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，以5-10％接種量種入發(fā)酵培養(yǎng)基(黃豆餅粉2-3％，葡萄糖3-5％，(NH4)2SO40.5％，KH2PO40.1％，CaCO30.3％)25℃培養(yǎng)96小時(shí)。B)波拉霉素A，B的分離發(fā)酵培養(yǎng)物中，加入草酸調(diào)節(jié)P到4-4.5，并加入培養(yǎng)物體積1％(W/V)的硅藻土過(guò)濾，濾液棄去，濾餅于40℃以下風(fēng)干，干燥菌體用甲醇或乙醇等低級(jí)醇浸泡，或?qū)⒕w裝于柱中用上述溶劑滲漉，將活性滲漉液或浸泡液減壓濃縮至干或只余水液，干殘余物或從水液中分離，干燥的水不溶物用乙酸乙酯反復(fù)洗滌，乙酸乙酯不溶物用于分離波拉霉素，可用下述兩法純化。(1).不溶物溶于甲醇，通過(guò)用甲醇溶脹的Sephadex LH-20柱純化，用甲醇展開(kāi)，收集活性部分，濃縮至1/5體積，用濃縮液5倍體積的乙酸乙酯沉淀，收集沉淀物，通過(guò)C-18反相硅膠柱純化，用85％甲醇作流動(dòng)相，用UV 220nm監(jiān)測(cè)，收集活性峰，濃縮至只余水液，分離形成的沉淀，從含水醇中結(jié)晶，即可得到波拉霉素。(2).上述(1)中之LH-20柱活性洗脫物，通過(guò)硅膠柱層析純化，先后用甲醇∶乙酸乙酯(3∶1)，(5∶1)，(7∶1)混合物展開(kāi)，用活性檢測(cè)追蹤分離過(guò)程，其中甲醇∶乙酸乙酯(7∶1)混合物可將活性物質(zhì)洗脫，將活性洗脫物干燥后，再用(1)法相同條件經(jīng)C-18反相硅膠柱層析純化，得到波拉霉素，用上述兩法所獲之波拉霉素，經(jīng)制備薄層分離[Kieselgel 60 F254，20×20cm TLC板，用2-丁醇∶H2O(4∶1)展開(kāi)]，從含水甲醇中重結(jié)晶，分別得到波拉霉素A，B的白色晶形粉末，其中波拉霉素A占波拉霉素復(fù)合物的90％以上，B占5-10％。C)實(shí)施例發(fā)酵培養(yǎng)物10立升，加草酸20g，PH4-4.5，加硅藻土150g，過(guò)濾，濾液棄去，菌體于40℃以下干燥后，得干菌體490g，置于5×60cm玻璃柱中，用95％乙醇滲漉，漉出液每500ml收集一份，1-3份活性較高，合并濃縮至干，得粽色干燥殘余物43g，用乙酸乙酯洗滌殘余物，每次200ml，乙酸乙酯不溶部分干燥后得干粉末20g，取上述乙酸乙酯不溶物2g，用甲醇10ml溶解，甲醇溶液經(jīng)Sephadex LH-20柱(3×80cm)純化，用甲醇展洗，收集流出液，每份25ml，活性物質(zhì)集中在12-14份，合并活性洗脫液，濃縮至15ml，用乙酸乙酯75ml沉淀，干燥后得沉淀物280mg，此沉淀物再經(jīng)硅膠柱層析(青島海洋化工廠層析用硅膠，120-140目，3×40cm)，柱子用甲醇∶乙酸乙酯(3∶1)，(5∶1)混合物展洗后，以甲醇∶乙酸乙酯(7∶1)混合物洗脫活性物質(zhì)，濃縮干燥后得活性洗脫物75mg，此洗脫物再經(jīng)反相OD柱(2×70cm)層析，85％甲醇展開(kāi)，用UV220nm監(jiān)測(cè)，收集活性峰，濃縮干燥后，得到白色波拉霉素粉末8mg，波拉霉素經(jīng)制備TLC[Merck Kieselgel 60 F254，20×20cm硅膠板，展開(kāi)劑2-丁醇∶水(4∶1)]分離，可分別得到波拉霉素A(Rf0.34)，B(Rf0.27)]，從10立升發(fā)酵液中可用上述方法分別得到波拉霉素A55mg，波拉霉素B5mg。


圖1波拉霉素A的紫外光譜圖2波拉霉素A的紅外光譜圖3波拉霉素A的FAB質(zhì)譜圖4波拉霉素A的1HNMR譜圖5波拉霉素A的13CNMR譜圖6波拉霉素B的紫外光譜圖7波拉霉素B的FAB質(zhì)譜圖8波拉霉素B的1NMR譜圖9波拉霉素B的13CNMR譜
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式如下的波拉霉素A，B 其特征是式中R＝H時(shí)，為波拉霉素A；R＝CH3時(shí)，為波拉霉素B。
2.一種如權(quán)利要求1所示波拉霉素A，B結(jié)構(gòu)式化合物的制備方法，其特征是用吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus LP93)進(jìn)行深層發(fā)酵、溶媒提取和層析分離，得到兩種多羥基內(nèi)酯類(lèi)新抗生素。
3.一種如權(quán)利要求1所示波拉霉素A，B結(jié)構(gòu)式化合物的抗真菌作用，其特征是用平板法或試管稀釋法進(jìn)行檢測(cè)，所說(shuō)化合物對(duì)一些致病真菌及引起植物病害的植物真菌具有較強(qiáng)活性。
4.按照如權(quán)利要求2所說(shuō)的波拉霉素A，B的制備方法，其特征是將菌種在葡萄糖-天門(mén)冬素培養(yǎng)基上，25-28℃培養(yǎng)10-14天，將菌種斜面接種到種子培養(yǎng)基(黃豆餅粉2-4％，葡萄糖2％，(NH4)2SO40.3％，CaCO30.15％，25-28℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，以5-10％接種量種入發(fā)酵培養(yǎng)基(黃豆餅粉2-3％，葡萄糖3-5％，(NH4)2SO40.5％，KH2PO40.1％，CaCO30.3％)25℃培養(yǎng)96小時(shí)。
5.按照如權(quán)利要求2所說(shuō)的波拉霉素A，B的制備方法，其特征是將發(fā)酵培養(yǎng)物酸化至PH4-4.5，過(guò)濾，菌體用乙醇或其它低級(jí)醇以浸泡法或滲漉法提取，干提取物用乙酸乙酯洗滌，乙酸乙酯不溶物甲醇溶液經(jīng)Sephades LH-20柱純化，甲醇作展開(kāi)劑，再經(jīng)硅膠柱層析，用甲醇∶乙酸乙酯混合物作流動(dòng)相，最后用C-18反向硅膠柱層析，以85％甲醇展開(kāi)得到波拉霉素，波拉霉素A，B用制備薄層析，以2-丁醇∶H2O(4∶1)作展開(kāi)劑進(jìn)行分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及從吸水鏈霉菌LP
文檔編號(hào)C12P17/18GK1131193SQ95100949
公開(kāi)日1996年9月18日 申請(qǐng)日期1995年3月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月13日
發(fā)明者金文藻, 孟偉, 王以光, 朱昌雄, 張維西 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所