專利名稱：儲(chǔ)存真菌培養(yǎng)物和分生孢子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改良的儲(chǔ)存和再活化昆蟲病原真菌，特別是綠僵菌屬(Metarhizium)真菌培養(yǎng)物及分生孢子的工具和方法。
本申請(qǐng)是1992年5月27日提交的David W.Miller，Paul Perry和CarolAnn Johnson的名稱為“昆蟲感染室的保存條件”的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)07/889，594的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
有許多種昆蟲可造成嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，并可在人和其他動(dòng)物群間傳播疾病。近來(lái)，已使用了不同的化學(xué)殺蟲劑來(lái)控制這些昆蟲。但不幸的是，殺蟲劑價(jià)格很高而且會(huì)不斷地對(duì)環(huán)境造成危害，特別是這種危害性可長(zhǎng)期存在。另外，還有可能產(chǎn)生殺蟲劑抗性昆蟲，以致需要使用大量殺蟲劑并需用不同的殺蟲劑再次處理。使用化學(xué)殺蟲劑還可導(dǎo)致非靶昆蟲的傷亡。
可使用常用高毒性化學(xué)殺蟲劑以外的昆蟲病原體來(lái)控制有害昆蟲?？墒褂眉?xì)菌如蘇云金桿菌噴灑在對(duì)昆蟲如舞毒蛾感染敏感的植物上，并獲得了一定的成功。真菌是另一類適于作為控制昆蟲的生物殺蟲劑的有希望的昆蟲病原體。真菌的最常見的生長(zhǎng)和繁殖方式是植物性或無(wú)性繁殖，包括孢子形成，然后是孢子發(fā)芽。無(wú)性孢子，包括分生孢子，在菌絲上造孢細(xì)胞的頂端和兩側(cè)形成多細(xì)胞菌絲體的絲狀結(jié)構(gòu)。在適宜環(huán)境中，分生孢子發(fā)芽，變大，并產(chǎn)生芽管。一定時(shí)間后芽管發(fā)育或菌絲，繼而形成菌絲體。當(dāng)通過(guò)與昆蟲病原真菌的活繁殖體接觸而接種昆蟲時(shí)，即發(fā)生感染同時(shí)建立起真菌與靶昆蟲間的寄生關(guān)系。隨著感染過(guò)程的發(fā)展，真菌便逐漸殺死昆蟲。
美國(guó)專利5，057，316和5，057，315號(hào)公開了控制和消滅包括
蠊、家蠅等飛行昆蟲以及其他昆蟲如玉米根蟲的成蟲在內(nèi)的昆蟲的方法。借助感染室，用以足夠高的濃度使用時(shí)即可對(duì)昆蟲有致病性的真菌感染昆蟲，從而達(dá)到控制昆蟲和消滅昆蟲的目的。小室中保留有對(duì)昆蟲有致病力的活的真菌孢子，防止真菌受到環(huán)境(包括雨、紫外光和風(fēng))的破壞，或作為昆蟲的引誘物以便用大量孢子接種昆蟲。真菌培養(yǎng)物可在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)連續(xù)提供孢子。孢子附著在昆蟲上，并有芽管穿入昆蟲體內(nèi)，從而使昆蟲在3到4天內(nèi)死亡。小室的設(shè)計(jì)，如其形狀和顏色可使之成為昆蟲的獨(dú)特引誘劑。另外，食物或誘餌也可用來(lái)提高小室對(duì)昆蟲的吸引力。雖然主要感染是通過(guò)外部接觸，但也可通過(guò)昆蟲彼此接觸或攝食孢子來(lái)感染昆蟲。在某些情況下，被攝食的真菌分生孢子也是有毒性的。
昆蟲病原真菌取得商業(yè)成功的一個(gè)歷史性限制是它們?nèi)鄙倭己玫谋４嫣匦?。雖然已證明美國(guó)專利5，057，316和5，057，315號(hào)中所描述的小室在實(shí)驗(yàn)室和真正田野試驗(yàn)條件下都是很有效的，但它們必須能夠經(jīng)受長(zhǎng)途運(yùn)送，并且能夠在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)保持穩(wěn)定或能成為活的商品。
兩種最可取的昆蟲病原性真菌是綠僵菌(Metarhizium aniso-pliae)和白僵菌(Beauveria bassiana)。然后，由于在真菌繁殖體如分生孢子的穩(wěn)定化、儲(chǔ)存及儲(chǔ)存后再活化中所遇到的限制，迄今為止這兩種真菌產(chǎn)品的商業(yè)化只取得了很有限的成功。
分生孢子的生活史包括有6個(gè)階段形成、成熟、成熟后、活化、休眠和發(fā)芽。在休眠階段中，隨著靜止 期間的延長(zhǎng)，孢子處于不斷降低的生理活性狀態(tài)，并對(duì)外部環(huán)境條件有最大的耐受性。有兩種類型的休眠結(jié)構(gòu)休眠包括不能簡(jiǎn)單地通過(guò)提供適于生長(zhǎng)的條件得以克服的內(nèi)在強(qiáng)制性休眠;外因性休眠是由環(huán)境施予的，當(dāng)出現(xiàn)適于生長(zhǎng)的條件時(shí)即終止休眠?？赏ㄟ^(guò)不給予發(fā)芽所需的特定營(yíng)養(yǎng)素或存在抑制劑來(lái)抑制外因性休眠，并可在某些環(huán)境條件下保持。
此前已了解到，干燥的微生物孢子、細(xì)胞及其他類型繁殖體可比新鮮的保存更長(zhǎng)時(shí)間。但大多數(shù)科學(xué)家都接受這樣一個(gè)觀點(diǎn)，即活細(xì)胞脫水可導(dǎo)致膜的整體隆起，不可逆地喪失結(jié)構(gòu)和功能的完整性(Croωe&Croωe，Stabilization of Membranes in Anhydro-biotic Orga nisms，Membranes，Metabolism and Dry Organism-s，A..C.Leopold，Comstock Publishing Co.，Ithica，NY，pp.188-209(1986);Beker&Rapoport，Conservation of Yeast by Dehydra-tion，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Vol.35，Biotechnology Methods，ed.A.Fiechper，Springer Verlag，pp.127-171(1987)。這一觀點(diǎn)得到了當(dāng)孢子或其他類型微生物繁殖體干燥時(shí)發(fā)芽速率明顯降低這一事實(shí)的支持。有關(guān)由脫水引起結(jié)構(gòu)損害的大多數(shù)研究工作集中在酵母上(Beker&Rapoport，1987)。絲狀真菌可產(chǎn)生不同類型的繁殖體，分生孢子則是一種可在短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生的繁殖體。但分生孢子都不能耐受脫水。已以發(fā)現(xiàn)，各種昆蟲病原真菌的分生孢子對(duì)干燥處理是很敏感的，而且會(huì)很快喪失其存活力(Eyal等人的歐洲專利申請(qǐng)92100010.5號(hào))。已為開發(fā)菌絲體配制品作了很多努力(Andersch等人的澳大利亞專利申請(qǐng)AU-8-81286/87;歐洲專利申請(qǐng)92100019.5號(hào))，但因?yàn)榫z體配制品在高溫度下不穩(wěn)定，而限制了它們的應(yīng)用。
已就儲(chǔ)存溫度和相對(duì)濕度(R.H.)對(duì)分生孢子穩(wěn)定性和綠僵菌與白僵菌的效能影響進(jìn)行了一些研究(Bell，1975;Clerk&Madelin，1965;Daoust&Roberts，Effect of formulation on the Viabili-ty of Metarhiziun anisopliae Conidia，J.of Invertebrate Patholo-gy，Vol.41，pp.151-160(1983);Kaωakami，1960;Kaωakami&Kikuni，1965;Steinhaus，1960;Walstad，J..D.，“Effects of Envi-ronmental Conditions on Tωo Species of Muscardine Fungi(Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae)”，J.of Inver-tebrate Pathology，Vol.16，221-226(1970))。這些研究的結(jié)果表明，綠僵菌的分生孢子于有高R.H.的中等溫度下(26℃±97%R.H.或19℃+97%R.H.)存活時(shí)間最長(zhǎng)。但在37℃下分生孢子可在短時(shí)間內(nèi)失去其發(fā)芽能力。發(fā)芽是長(zhǎng)成昆蟲病原真菌中的第一個(gè)階段。
在運(yùn)輸和倉(cāng)庫(kù)儲(chǔ)存期間，溫度可高達(dá)37℃?，F(xiàn)有技術(shù)并沒有仔細(xì)研究沒有發(fā)芽的分生孢子的狀態(tài)。雖然已使用新鮮分生孢子材料研究了加速和同時(shí)造成綠僵菌分生孢子發(fā)芽的技術(shù)，但還需要在蒸餾水中浸漬10-44小時(shí)，并提供適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)素源(Dillon&Charn-ley，1985)。綠僵菌和白僵菌等昆蟲病原真菌的分生孢子是天然疏水的。當(dāng)將它們懸浮于水中時(shí)，水和分生孢子表面間的介面上存在高的表面張力，阻止分生孢子吸收發(fā)芽所必需的水。通過(guò)仔細(xì)檢查不同的表面活性劑，有可能緩和這一問(wèn)題。表面活性劑的特征是其分子結(jié)構(gòu)可在不同的清楚程度上分為不同的部分。一個(gè)部分是親水的，另一個(gè)是疏水的。用于定量表面活性劑之親水-疏水性質(zhì)的方法是親水物-親脂物平衡(HLB)法。該方法中，HLB數(shù)值是分配于各表面活性劑的，并通過(guò)換算而與適當(dāng)?shù)貞?yīng)用表面活性劑相關(guān)聯(lián)。設(shè)計(jì)比例，以使更親水的表面活性劑具有更高的HLB數(shù)值。雖然已將篩選表面活性劑的HLB方法用于化學(xué)殺蟲劑配制，但將用于篩選適當(dāng)表面活性劑的HLB方法應(yīng)用于干燥并儲(chǔ)存后的再活化微生物繁殖體即是一個(gè)新的領(lǐng)域。另外，有關(guān)當(dāng)在不同溫度-R.H.并存條件下儲(chǔ)存分生孢子時(shí)O2水平對(duì)分生孢子存活性影響所知甚少。氧對(duì)于真菌孢子發(fā)芽是十分重要的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種增加在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的病原性真菌，特別是綠僵菌的貯存期限的方法和工具。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供改良的用于病原性真菌的昆蟲感染小室的包裝。
本發(fā)明的再一個(gè)的目是提供在較高溫度下儲(chǔ)存昆蟲病原性真菌之分生孢子以增加其貯存期限的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供儲(chǔ)存后重新活化分生孢子的適用方法。
本發(fā)明介紹了包裝含有真菌培養(yǎng)物或昆蟲病原性真菌特別是綠僵菌屬真菌之分生孢子的感染小室的方法。這些方法可以在高達(dá)37℃的溫度下長(zhǎng)期儲(chǔ)存分生孢子，并可有繼后使之重新活化以控制蟑螂、蒼蠅、螞蟻、軟體昆蟲、草場(chǎng)害蟲，毛蟲等昆蟲，而沒有或很少喪失真菌感染和引起敏感昆蟲死亡的能力。
研究證明，綠僵菌的分生孢子在于大氣氧含量(20%O2)和室溫及高相對(duì)濕度(90-100%R.H.)條件下保存時(shí)有良好的存活性，但在37℃下其他R.H.和氧含量條件下則喪失存活能力。在低含氧水平(0-5%O2)，1-10%R.H.水平條件下，分別有56%和26%的分生孢子能在25℃和37℃下儲(chǔ)存2個(gè)月后發(fā)芽。當(dāng)將綠僵菌的分生孢子浸漬在適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┗旌衔?，如親水物-親脂物平衡(HLB)數(shù)為10的乙氧基化醇中時(shí)，在25℃和37℃下的發(fā)芽率分別從56%增加到77%和從26%增加到74%。用控制蠟蛾，大蠟暝(Galleria mellonella)幼蟲的生物檢測(cè)法試驗(yàn)在三種不同環(huán)境條件下儲(chǔ)存兩個(gè)月的分生孢子。儲(chǔ)存條件分別是(1)25℃，90-100%R.H.和大氣氧水平;(2)25℃，0-10%R.H.和0-5%O2;(3)37℃，0-10%R.H.和0-5%O2。用這三組不同的分生孢子處理的活幼蟲的百分率顯示，儲(chǔ)存的分生孢子與新鮮的分生孢子差不多或更好些。在低相對(duì)濕度下包裝，給分生孢子提供一個(gè)迅速脫水并呈現(xiàn)休眠狀態(tài)的環(huán)境。將脫水的分生孢子儲(chǔ)存于低氧環(huán)境中使之在儲(chǔ)存期間保持體眠，因而在升高的溫度下仍可存活。然而，隨著脫水而導(dǎo)致的表面張力增加，在儲(chǔ)存后降低了發(fā)芽率。使用適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣﹦t降低了分生孢子的表面張力并有利于再水化而中斷休眠。
因此，在包裝含分生孢子之感染小室的一優(yōu)選實(shí)施方案中，包裝是用不透氣的，不透水蒸汽的，柔韌的袋材料如鋁箔和低密度聚乙烯涂層的鋁箔制成的。包裝可確保在儲(chǔ)存期間有始終不變的氧和R.H.水平。可使用干燥劑以產(chǎn)生0-10%的低R.H.環(huán)境?？砂b某種能與干燥劑一起加入各小袋中的氧吸收劑以造成低氧環(huán)境。可用含水瓊脂片來(lái)保持90-100%R.H.。可在含有35-40%R.H.空氣的包裝內(nèi)密封分生孢子以提供35-40%的R.H.。
可在例如感染小室這樣的裝置中以所需的氧和R.H.條件包裝分生孢子。也可在適當(dāng)條件下大批量包裝分生孢子，然后懸浮在適當(dāng)噴霧使用以殺滅害蟲的混合罐中。在此實(shí)施方案中，可望包括用于降低真菌分生孢子的表面張力的表面活性劑，以有利于其在施用載體中發(fā)芽而又不影響真菌分生孢子的存活率。將分生孢子與施用載體混合后，即可使用常規(guī)裝置和方法將此配制好的真菌劑噴灑在欲進(jìn)行昆蟲控制的植物上和其他地方。
在包裝含真菌培養(yǎng)物之感染小室的優(yōu)選實(shí)施方案中，所提供的柔韌的袋材料是不透水蒸汽和水的，并且在高濕度條件下包裝真菌培養(yǎng)物。


圖1α顯示四批綠僵菌在非控制的條件下在感染小室內(nèi)保溫不同時(shí)間(天數(shù))后的百分存活率。
圖1b顯示與含有真菌的感染小室接觸的蟑螂的百分存活率，其中真菌已在有氧(-黑色菱形-)或缺氧(-O-)條件下保存不同時(shí)間(天)。未與真菌接觸的蟑螂的存活率標(biāo)示為(-空正方形-。
圖2是感染小室內(nèi)于不同相對(duì)濕度下保溫之真菌的存活率的三維圖百分存活率對(duì)百分相對(duì)濕度對(duì)時(shí)間作圖。
圖3圖解顯示與含有綠僵菌培養(yǎng)物的感染小室接觸不同時(shí)間(天)后蟑螂(Blatella germanica)的百分存活率，其中真菌分別儲(chǔ)存在22℃和0%R.H.(黑正方形)、33%R.H.(黑圓圈)、100%R.H.(黑菱形)和對(duì)照R.H.(空?qǐng)A圈)條件下。
圖4a，4b和4c圖解顯示綠僵菌菌株ESF53(圖4a)，綠僵菌菌株ESF1(圖4b)和白僵菌菌株ESF2(圖4c)在22℃(黑正方形)、27℃(空正方形)、32℃(黑菱形)和37℃(空菱形)下儲(chǔ)存不同時(shí)間(周)后的百分存活數(shù)。
圖5是相對(duì)于造成不同儲(chǔ)存條件的包裝系統(tǒng)，綠僵菌在25℃和37℃下儲(chǔ)存1和2個(gè)月后的百分發(fā)芽率的關(guān)系曲線。包裝系統(tǒng)是單用箔、箔+DrieriteTM，箔+水瓊脂，箔+AgelessTM，箔+DrieriteTM+AgelessTM，箔+水瓊脂+AgelessTM條件(從左到右)是25℃，40%R.H.+20%O2;37℃，40%R.H.+20%O2;25℃，0%R.H.+20%O2;37℃，0%R.H.+20%O2;25℃，40%R.H.+0%O2;37℃，40%R.H.+0%O2;25℃，0%R.H.+0%O2;37℃，0%R.H.+0%O2;25℃，100%R.H.+0%O2，和37℃，100%R.H.+0%O2。
圖6是綠僵菌分生孢子的百分發(fā)芽率對(duì)包裝系統(tǒng)的關(guān)系曲線，所說(shuō)的包裝系統(tǒng)在25℃和37℃下2個(gè)月時(shí)間內(nèi)造成不同的儲(chǔ)存條件，其中確定于儲(chǔ)存后用或不用表面活性劑處理。包裝系統(tǒng)是單用箔片、箔+DrieriteTM，箔+水瓊脂，箔+AgelessTM，箔+DrieriteTM+AgelessTM，箔+水瓊脂+AgelessTM。所用的表面活性劑是乙氧基化的十三醇。儲(chǔ)存條件同圖5中所述。
圖7顯示用在兩個(gè)月的不同環(huán)境條件下儲(chǔ)存的綠僵菌的分生孢子處理的蠟蛾，大蠟暝(Galleria mellonella)幼蟲所處的外部條件。分生孢子是(1)新鮮的;(2)用水瓊脂片包裝以保持100%R.H.，并儲(chǔ)存于25℃下，(3)用DrieriteTM+AgelessTM包裝，并儲(chǔ)存于25℃或(4)37℃下。將在其軀體上有新形成的分生孢子的幼蟲鑒定為有分生孢子形成的幼蟲。所有處理組的死亡率為100%。
本發(fā)明描述了為儲(chǔ)存昆蟲致病性真菌，特別是綠僵菌菌屬及其分生孢子所需的包裝方法。使用這些方法得以長(zhǎng)期儲(chǔ)存真菌分生孢子，并在繼后用于控制蟑螂、蒼蠅、螞蟻、軟體昆蟲、草場(chǎng)害蟲及毛蟲等昆蟲。
在生物學(xué)控制系統(tǒng)的商業(yè)開發(fā)中，一個(gè)基本要素是制劑必須有合理的貯存期限。用于確保合理貯存期限的包裝系統(tǒng)必須是經(jīng)濟(jì)的，并且易于組裝、運(yùn)輸和儲(chǔ)存。包裝必須保持所需真菌繁殖體如分生孢子能在合理的溫度范圍內(nèi)存活并有毒力。
在保持存活性中，表現(xiàn)有最大重要性的因素是相對(duì)濕度(R.H.)、氧和溫度。本文中所說(shuō)的“低”R.H.是指R.H.小于10%，或?yàn)?-10%;“高”R.H.是指R.H.大于90%，或?yàn)?0-100%。中度R.H.是指35-40%。氧水平一般是在大氣氧含量范圍內(nèi)，即20%;低氧水平為0-5%;高氧水平為90-100%。
真菌培養(yǎng)物的儲(chǔ)存條件美國(guó)專利5，057，315和5，057，316號(hào)描述了使用如包括綠僵菌和白僵菌在內(nèi)的昆蟲致病性真菌，控制和消滅
蠊及其他昆蟲的方法。使用由關(guān)閉的有昆蟲入口并含有對(duì)昆蟲有致病性之真菌活培養(yǎng)物的小室組成的污染小室，對(duì)待處理的環(huán)境施用真菌。該裝置的幾何形狀是使昆蟲進(jìn)入小室后即與有效劑量的致病真菌的培養(yǎng)物接觸。已發(fā)現(xiàn)，不管小室或儲(chǔ)存容器的結(jié)構(gòu)如何，用在該昆蟲感染小室內(nèi)的昆蟲在室溫和無(wú)氧條件下儲(chǔ)存能力很差。在沒有連續(xù)得到氧的情況下，真菌喪失其存活力，致使小室不能有效地致死性感染昆蟲，雖然真菌有可能降低到分生孢子的1%存活率并且仍然是有效的。真菌還需要高的濕度。當(dāng)儲(chǔ)存溫度從室溫即22-25℃增加到42℃時(shí)，即需要增大相對(duì)濕度。
為了適應(yīng)這些要求，已設(shè)計(jì)了能提供足夠氧和高濕度，以及真菌培養(yǎng)物的昆蟲儲(chǔ)存小室的包裝材料，這樣的材料可保持大多數(shù)水蒸汽，同時(shí)允許包括氧和二氧化碳在內(nèi)的氣體交換。所用材料最好可以透過(guò)包括真菌孢子，細(xì)菌和病毒在內(nèi)的微生物體。
現(xiàn)對(duì)得以延長(zhǎng)綠僵菌之貯存期限的條件敘述如下。這些條件是通過(guò)在大氣和100%R.H.下包裝而達(dá)到的。所選用的包裝材料能使氣體達(dá)到平衡，同時(shí)可保持100%R.H.。
包裝材料就其屏障性質(zhì)來(lái)說(shuō)具有限定之特征的各種材料都可從市場(chǎng)上購(gòu)得;即，它們能夠保留并使之不同的氣體通過(guò)一層材料運(yùn)動(dòng)。這些材料可以堅(jiān)硬和可揉曲的兩種規(guī)格得到?？珊苋菀椎刂频糜懈鞣N不同的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的柔韌屏障膜的袋。
用于包袋小室的最可取的材料是可以熱封的2至8密耳厚的低密度和高密度聚乙烯(指聚合物分支的程度)。其他材料包括比聚乙烯有較低空氣通透性的聚丙烯。如下所示，這些市售材料的特征在于有低水蒸汽傳輸能力和高氣體通透性。
表1真菌培養(yǎng)物包裝材料的性質(zhì)材料水蒸汽傳輸a氣體通透性b水吸收O2N2CO2聚乙烯(低密度) 1.3 550 180 2900 低聚乙烯(高密度) 0.3 600 70 4500 低聚丙烯 0.7 240 60 800 低a.在95°F，90%R.H.條件下丟失克數(shù)/24小時(shí)/100平方英寸/密耳;
b.在77°F，50%R.H.條件下的CC數(shù)/24小時(shí)/100平方英寸/密耳;ASTM D1434-63。
可用市售的其他材料代替聚乙烯和聚丙烯，用以提供等值的氣體和水蒸汽傳遞能力。這些材料可得自D&B Plastics，F(xiàn)air-mouth，MN或其他塑料膜供應(yīng)商。
真菌分生孢子的儲(chǔ)存條件真菌孢子、分生孢子并不是“惰性”的，而是要消耗足夠量的氧。但所消耗的氧的量比活性生長(zhǎng)的真菌菌落所消耗的量少得多。在高R.H.條件下，分生孢子得不到氧就會(huì)失去存活力。但于25℃，高R.H.和大氣氧含量條件下包裝的分生孢子，在于37℃下儲(chǔ)存2個(gè)月后將失去其發(fā)芽能力?，F(xiàn)已研究證明，如果直接環(huán)境是幾乎沒有氧的(0-5%)，則分生孢子可在低R.H.(小于10%)條件下保持其存在活力。為了適應(yīng)低氧和低相對(duì)濕度的要求，可使用不透過(guò)任何氣體或水蒸汽的包裝材料并合用干燥劑，并且可在使用除去氧的化合物或方法的同時(shí)使用之。
用于耗盡或除去氧的材料有多種氧消耗劑(如氧吸收劑)可以與分生孢子一起包裝。用于除去袋中或任何其他類型容器中氧的氧吸收劑必須是對(duì)真菌分生孢子無(wú)毒性的。例如可使用購(gòu)自Mitsubishi International Cor-poration，F(xiàn)ood division“B”，520Madison Avenue，New York，N.Y.10022的AgelessTM。AgelessTM的主要成分是粉末狀活性氧化鐵，其可在吸收氧后變成鐵氧化物和氫氧化物。在氣密容器中，AgelessTM可使氧降低到0.01%(100ppm)或更少。所選用的氧吸收劑還必須是與干燥劑相容的。Z型AgelessTM特別適合與干材料一起使用，并可與干燥劑一起使用。氧吸收劑除去密閉容器內(nèi)氧的容量是應(yīng)考慮的另一個(gè)因素。一袋AgelessTM-Z300具有吸收300ml氧的容量，此相當(dāng)于空氣體積1500ml。
另外，可在密封時(shí)借助真空抽吸或在密封前向包裝內(nèi)充氮而從包裝中除去氧。
用于耗盡或除去濕氣的材料可用各種干燥劑如購(gòu)自W.A.Hammond Drierite Company，P.O.Box 60，Xenia，Ohio 5385的DrieriteTM(無(wú)水硫酸鈣)，從包裝中除去濕氣。DrieriteTM是一種可用于微生物殺蟲包裝系統(tǒng)的適宜的干燥劑，因?yàn)楫?dāng)其暴露于高室溫條件下時(shí)，將不能釋放任何被其吸收的水份。水被牢固地保持在半水合化形式的硫酸鈣中;如從中去掉水份則需超過(guò)350°F(177℃)的溫度。對(duì)于在可變的氣候條件下運(yùn)送微生物產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)重要的特征。為了干燥氣體，DrieriteTM具有10-14%(重量)的水容量。一個(gè)DrieriteTM干燥劑袋可在大約10小時(shí)或更少時(shí)間內(nèi)使密封的包圍物中的濕度降低到-100°F(-73℃)露點(diǎn)。24cm×14cm體積約200-250cm3的容器使用一個(gè)袋。也可使用硅膠，某些粘土、聚丙烯酸衍生物等其他化合物和其他干燥劑來(lái)造成低R.H.環(huán)境。
包裝材料與用來(lái)包裝真菌培養(yǎng)物的材料相反，用于包裝分生孢子的材料應(yīng)該是不透氣的。用于包裝分生孢子的優(yōu)選材料是可從Laminated Foil and Packaging，Portsmouth，N.H.購(gòu)得的厚度至少為0.003英寸，最好0.007英寸的聚乙烯-鋁箔-聚乙烯。
也可使用氧傳輸速率小于0.005cc/100平方英寸/天，水蒸汽傳輸速度低于0.005cc/100平方英寸/天的其他材料。在這里，將具有這些傳輸特性的材料看作是“不透過(guò)”水和氣體的。
表2包裝分生孢子的聚乙烯-鋁箔-聚乙烯袋的性質(zhì)厚度 氧通透性 水蒸汽通透性O(shè)2CC/100平方英寸/ g/m2/24小時(shí)24小時(shí)0.003″或3密耳 0.005 00.005″或5密耳 0.000 00.007″或7密耳 0.000 0
可用市售的相似材料替代板層箔，以提供等值的氣體和水蒸汽通透性?？捎晒?yīng)商處得到這些材料。
包裝待儲(chǔ)存的真菌培養(yǎng)物和分生孢子的方法使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法如熱封法將真菌培養(yǎng)物或分生孢子密存在袋材料內(nèi)?？墒褂贸暡芊夥?，但這不是優(yōu)選的方法。盡可能地將分生孢子封裝在可容納它們的最小的袋內(nèi)，且在封口時(shí)不使另外的空氣或水加入進(jìn)去。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，裝在不透氣材料內(nèi)的分生孢子可與足夠量的干燥劑和氧吸收劑一起包裝，以在袋內(nèi)造成小于10%R.H.和少于5%O2的條件。另外，在一有用但不是優(yōu)選的實(shí)施方案中，將裝在不透氣材料內(nèi)的分生孢子與有限量的干燥劑一起包裝，而不包裝氧吸收劑，以在袋內(nèi)產(chǎn)生小于10%R.H.的條件。
此包裝可包含多個(gè)分隔空間和用于將各空間之內(nèi)容物混合在一起的工具。例如，為形成施用于待處理之地域的真菌繁殖體懸浮液，第一個(gè)分隔空間可含有表面活性劑，而第二個(gè)分隔空間含有真菌繁殖體。相似地，為形成干真菌繁殖體配制物，第一個(gè)分隔空間可含有干燥的表面活性劑，而第二個(gè)分隔空間含有真菌繁殖體。
表面活性劑可用表面活性劑(亦稱為潤(rùn)濕劑)重新活化儲(chǔ)存后的分生孢子。表面活性劑可分為五大類(1)陰離子的，(2)陽(yáng)離子的，(3)非離子的，(4)兩性的，和(5)非水溶性的。在大多數(shù)情況下，優(yōu)選陰離子和非離子型表面活性劑。各種非離子型表面活性劑均在尺度內(nèi)指定一個(gè)HLB數(shù)值，其中更親水的表面活性劑具有更高的HLB數(shù)值。HLB方法大多適用于非離子型表面活性劑，如HLB為10的I-conol TDA，即乙氧基化的十三醇(BASF Corporation，Persippany，N.J.07054)，其似乎可使儲(chǔ)存的綠僵菌的分生孢子得以最好的再活化?？蓪conol TDA6(HLB＝11)和Iconol TDA3(HLB＝8)按2∶1(W/W)的比例混合，以達(dá)到HLB為10。為此目的，也可單獨(dú)或混合使用HLB在8-13之間，具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的其他非離子型表面活性劑，如嵌段共聚物、乙氧基化的醇，乙氧基化的烷基酚、乙氧基化的胺和/或酰胺、乙氧基化的脂肪酸、乙氧基化的脂肪族酯和油(動(dòng)物和植物的)、脂肪族酯;甘油醇、甘醇酯、羊毛脂基衍生物、單甘油酯及衍生物、聚合物(多糖、丙烯酸、丙烯酰胺)、丙氧基化和乙氧基化的脂肪酸、醇或烷基酚、脫水山梨醇衍生物、蔗糖和葡糖酯及衍生物。還可使用HLB在8-14之間的某些陰離子和陽(yáng)離子型表面活性劑。在陰離子型或其他類別中，也有某些適于再活化分生孢子的表面活性劑，如磺基琥珀酸的鹽如二辛烷基磺基琥珀酸鈉、磺酸的鹽如十二烷基苯磺酸鹽、萘磺酸的鹽及酒石酸鹽(Igepon T-77)。這些表面活性劑的例子包括嵌段聚合物如Pluronic 25R4;乙氧羰基化的醇如Tergitol 15 S-5、乙氧基化的烷基酚如Triton N-57，乙氧基化的胺和酰胺如Ethomid 0-17、乙氧基化的脂肪酸如PEG油酸、乙氧基化的脂肪酸和油如Alkamuls EL-L20、甘油酯如Emerest 2421、甘醇酯如Ethox DO-9、聚多糖、多聚丙烯酸和丙烯酰胺如APG325 Glycoside、丙氧基化和乙氧基化的脂肪酸、醇或烷基酚、脫水山梨醇衍生物如Span60，以及蔗糖和葡糖酯及衍生物如Crodesta F-50。陰離子表面活性劑的例子包括磺基琥珀酸的鹽(如二辛基磺基琥珀酸鹽)、磺酸的鹽(如十二烷基苯磺酸的鹽、烷基苯磺酸的鈉鹽)、磷酸酸及酒石酸鹽。
對(duì)于綠僵菌來(lái)說(shuō)，表面活性劑的HLB數(shù)最好在9-11范圍內(nèi)。對(duì)于白僵菌來(lái)說(shuō)，表面活性劑的HLB最好在9-14范圍內(nèi)。
根據(jù)所用表面活性劑的不同，為再活化分生孢子所需的一種或多種混合表面活性劑的量可低至分生孢子的0.01%，并高至100%(W/W)(即比例范圍從1∶1000到100∶1)。在篩選表面活性劑時(shí)最好仔細(xì)了解HLB值，因?yàn)橐坏┐_定了某一適當(dāng)?shù)腍LB數(shù)值，便也可以在再活化分生孢子中使用具有對(duì)相應(yīng)類型真菌繁殖體、細(xì)菌細(xì)胞或其他微生物無(wú)害之同一HLB數(shù)值的其他不同的表面活性劑。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將分生孢子包裝在有足夠在包裝內(nèi)產(chǎn)生低R.H.量的干燥劑，以及足夠在包裝內(nèi)造成低氧環(huán)境量的氧吸收劑的箔片內(nèi)。然后將此包裝與含有表面活性劑混合物或混合物懸浮液的第二包裝的內(nèi)容物混合，以在應(yīng)用前再活化分生孢子。另外，必要時(shí)可將優(yōu)選的表面活性劑與分生孢子及某些惰性材料混合，作為最后的配制品并按上述方法儲(chǔ)存?？蓪⒑髞?lái)與表面活性劑混合的分生孢子，或配制好的含分生孢子及表面活性劑的材料制成噴霧劑、粉劑、片劑、顆粒劑或凝膠使用。例如，可分別包裝分生孢子和表面活性劑這兩種最后配制品的成分，并在應(yīng)用前混合之。然后可將完全配好的真菌劑制成噴霧劑、藥水或粉劑施用，以對(duì)抗蟑螂、家蠅、蚜蟲、白蟻或螞蟻。
現(xiàn)借助下列證明本方法及包裝材料之各種特征的重要性的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
下列實(shí)施例中使用下述材料和方法來(lái)確定各種儲(chǔ)存條件對(duì)真菌培養(yǎng)物的存活性和效力的影響。
存活性使用馬鈴薯右旋糖凝膠(Potato Dextrose Agar，PDA)平板按下述程序測(cè)定綠僵菌分生孢子的百分存活率(發(fā)芽)。
制得新鮮、無(wú)菌的PDA平板。用小的無(wú)菌漆刷的尖端輕輕接觸分生孢子菌苔以收集分生孢子。使刷子頂端接觸到無(wú)菌平皿的內(nèi)部以除去過(guò)多的分生孢子。只需要小量分生孢子。將分生孢子小心并輕輕地刷到PDA平板的四分之一部分上，使用得自不同地區(qū)來(lái)源的綠僵菌重復(fù)刷其他四分之三部分。每四分之一刷一或兩刷即可。將平皿于28℃下保溫11-13小時(shí)。保溫13小時(shí)后，在復(fù)合顯微鏡下于200倍放大檢查各接種區(qū)域的表面。找到可以檢查單個(gè)分生孢子的視野。至少計(jì)數(shù)200個(gè)分生孢子并記錄存活和不存活之分生孢子的數(shù)目。存活分生孢子具有一個(gè)長(zhǎng)度至少如分生孢子直徑的芽管。計(jì)數(shù)每個(gè)四分之一接種部分的存活分生孢子/總分生孢子數(shù)，求四次計(jì)數(shù)的平均值并乘以100以確定存活分生孢子的百分?jǐn)?shù)。
效力在實(shí)施例1至6中，使用德國(guó)蠊(Blatella germanica)以鞋狀盒生物檢測(cè)法(Shoe box bioassay)確定效力。
材料聚苯乙烯鞋狀儲(chǔ)存盒(12.5×6.75×3.6英寸)，在蓋有聚酯蚊蟲網(wǎng)篩的頂部有氣孔。
成年德國(guó)蟑螂(德國(guó)蠊;JK-Consulting，Amherst，MA)，飼以Purina Lab Chow(Purina ＃5001，Purina Mills，Inc.，St.Louis，MO)，可在用織物塞住的試管內(nèi)自由得到蒸餾水。
在帶有溫度和濕度(128℃和75%R.H.)制及連續(xù)數(shù)據(jù)記錄器的環(huán)境室內(nèi)放入鞋狀盒。
方法用薄層礦脂涂敷鞋狀盒的垂直側(cè)面。向各鞋狀盒中加入高壓滅菌的Purina Lab Choω團(tuán)塊和水管。各盒內(nèi)放入20個(gè)蟑螂。將放有蟑螂的鞋狀盒置于環(huán)境室中。四個(gè)蟑螂的鞋狀盒內(nèi)各放一個(gè)如美國(guó)專利5，057，315和5，057，316號(hào)所述的感染小室。用另外四個(gè)鞋狀盒作為對(duì)照組。
將鞋狀盒置于28±3℃和75±15%R.H.環(huán)境和10小時(shí)光周期下保溫。每周記錄蟑螂死亡率，共觀察6周。當(dāng)用鈍器戳昆蟲時(shí)看不出昆蟲運(yùn)動(dòng)即認(rèn)為已死亡。
實(shí)施例1當(dāng)小室在室溫和未受控制的濕度下不受保護(hù)地放置時(shí)真菌存活力的喪失情況將四批不同的真菌小室于室內(nèi)溫度和濕度下放入盒內(nèi)。以數(shù)日間隔取樣檢查真菌的存活性。
圖1a中所示結(jié)果表明，當(dāng)在任何較長(zhǎng)時(shí)間未受保護(hù)地儲(chǔ)存時(shí)，真菌失去其存活力。
實(shí)施例2當(dāng)在無(wú)氧條件下儲(chǔ)存小室時(shí)對(duì)真菌存活性的影響。
將5個(gè)感染小室放在一系列配有氣密蓋/夸脫陶瓷罐內(nèi)。作為對(duì)照的小室暴露于大氣環(huán)境，將罐蓋松開。暴露于無(wú)氧條件的小室內(nèi)引入AgelessTM(Mitsubishi)氧清除劑包，并將罐蓋塞緊。AgelessTM包由細(xì)碎的、未氧化的鐵填料組成，當(dāng)后者與空氣接觸時(shí)即開始氧化。當(dāng)此過(guò)程發(fā)生在密封的環(huán)境如這些罐中時(shí)，即除去了所有的氧而造成無(wú)氧環(huán)境。
表3和圖1b所示數(shù)據(jù)顯示了在這些條件下儲(chǔ)存42天后的平均存活率及感染小室的效力。結(jié)果證明，為在室溫和正常大氣濕度下為成功地長(zhǎng)期儲(chǔ)存真菌需要有氧氣存在。
表3感染小室內(nèi)真菌的存活率百分存活率14天 對(duì)照組 72.06Ageless 69.9442天 對(duì)照組 81.54Ageless 7.00實(shí)施例3確定在允許氧流動(dòng)情況下真菌培養(yǎng)物的適當(dāng)包裝材料試驗(yàn)幾種材料，以確定感染小室內(nèi)活真菌如何消耗氧，以及當(dāng)包裝真菌時(shí)，不同包裝材料如何因允許氧通過(guò)而能或不能減緩對(duì)氧供入的要求。
進(jìn)行兩項(xiàng)研究1)將6個(gè)有真菌的小室放入(a)RubkermaidTM容器(7.5×7.5×2.75英寸)，(b)4密耳(0.004英寸)低密度聚乙烯袋(LDPE)(D&B Plastics，F(xiàn)airmouth，MN)或(c)8密耳LDPE袋。其中各有兩份樣品，稱為“A”和“B”。雖然RubbermaidTM容器是用厚聚丙烯低氧通透材料制成的，但可在容器蓋口部分的周圍發(fā)生氧轉(zhuǎn)移。如表1所示，LDPE的特征主要在于它的低水蒸汽通透性，和其高氧和二氧化碳通透性。
將包裝的小室置于30℃儲(chǔ)存14天。在此時(shí)間結(jié)束時(shí)，使用ServomexTMCompany，Norωood，MA氣體分析儀取樣分析包裝內(nèi)部的氧和二氧化碳含量。然后檢查小室內(nèi)真菌的平均存活率。結(jié)果示于表4中。
表4感染小室在30℃儲(chǔ)存14天后包裝內(nèi)的條件%O2%CO2%存活率Rubbermaid TM A 16.0 5.5 95.0B 11.4 10.4 92.24密耳LDPE A 12.5 2.2 86.3B 12.3 2.3 86.18密耳LDPE A 5.9 3.8 93.0B 5.0 4.0 94.12)在幾個(gè)鋁箔層壓袋內(nèi)各密封20個(gè)小室(Laminated Foil and Packaging，Portsmouth，NH)。層壓制品是聚乙烯-鋁箔(0.0007英寸)-聚乙烯;該包裝材料被看作是完全不透任何氣體或蒸汽的。儲(chǔ)存袋并在其后檢測(cè)其中的氧和二氧化碳含量。每個(gè)取樣點(diǎn)均測(cè)重復(fù)的兩個(gè)袋。
如表5所示的結(jié)果證明已消耗了所有的氧并富集了二氧化碳。然后確定真菌的平均存活率。
表5三個(gè)月后箔袋內(nèi)的條件
%O2%CO2%存活率22℃ A 0.3 23.4 15.0B 0 22.9 11.1530℃ A 0 23.7 0.0B 0 22.0 0.25這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了真菌消耗氧的程度;并且與其他實(shí)施例結(jié)合起來(lái)看，還證明提供適宜包裝的重要性。得到氧的真菌仍是活的。
實(shí)施例4高濕度對(duì)真菌之儲(chǔ)存穩(wěn)定性的重要作用將5個(gè)有真菌的感染小室放入一系列RubbermaidTM容器內(nèi)，以確定容器內(nèi)相對(duì)濕度(R.H.)對(duì)真菌的長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。一個(gè)容器系列的內(nèi)部已放入濕海綿以確保容器內(nèi)保持100%R.H.，另一個(gè)容器系列中已放入飽和的氯化鎂(MgCl2)溶液以保持30%R.H.。最后一個(gè)容器系列內(nèi)部則放入大量硅膠以保持0%R.H.。所有容器均儲(chǔ)存于室溫下，且定時(shí)從容器內(nèi)感染小室中取樣檢查真菌存活率和延長(zhǎng)時(shí)間后小室的效率。
結(jié)果示于表6和圖2中。這些結(jié)果以表格和圖形形式顯示在儲(chǔ)存14個(gè)月期間測(cè)得的平均存活率。表3中還示出了9個(gè)月時(shí)感染小室的效率。
結(jié)果證明，為成功地長(zhǎng)期儲(chǔ)存真菌，100%R.H.顯著地好于其他濕度。
表6在各相對(duì)濕度條件下的百分存活率相對(duì)濕度時(shí)間 100% 33% 0%1周 81 61.1 69.12周 69 74 513周 68.5 73.1 19.21個(gè)月 67.3 30.5 12.76周 58.4 11.4 0.542個(gè)月 53.5 28 23.93個(gè)月 78.3 15.3 29.86個(gè)月 82.33 0.08 0.749個(gè)月 80.54 2.33 0.7514個(gè)月 84.29 0 0實(shí)施例5比較不同商品包裝材料為真菌提供適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)期儲(chǔ)存條件方面的能力。
在兩系列袋中各放入20個(gè)感染小室。一個(gè)袋系列為8密耳LDPE。另一個(gè)系列為如實(shí)施例3所述的箔層壓制品。將袋儲(chǔ)存于22℃或30℃。由真菌發(fā)育后留在小室內(nèi)的真菌瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基提供袋內(nèi)所需的100%R.H.。定期從有不同儲(chǔ)存條件的系列中取袋并作為測(cè)定氣體含量的樣品。每個(gè)樣品均用重復(fù)的兩個(gè)袋(A和B)。所得結(jié)果與實(shí)施例3中獲得的數(shù)據(jù)相符;即，在短期內(nèi)箔層壓袋中沒有保留氧，但LDPE袋內(nèi)則有相當(dāng)量的氧。然后打開袋，從其內(nèi)的小室中取樣檢查真菌存活率。結(jié)果顯示，在3個(gè)月時(shí)，透氧(LDPE)袋和不透氧(箔)袋之間出現(xiàn)明確的不同。
可得出這樣的結(jié)論，即真菌培養(yǎng)物需要氧，而且LDPE袋能進(jìn)行足夠的氣體交換以長(zhǎng)期保持真菌的存活力。
表7A3個(gè)月時(shí)箔袋內(nèi)的條件%O2%CO2%存活率22℃ A 0.3 23.4 15.00B 0 22.5 11.1530℃ A 0 23.7 0.00B 0 22.0 0.00表7B3個(gè)月時(shí)LDPE袋內(nèi)的條件%O2%CO2%存活率22℃ A 8.5 3.0 92.1B 8.8 2.5 90.930℃ A 8.7 3.0 86.0B 4.5 4.2 87.8
實(shí)施例6比較包裝條件對(duì)不同真菌存活率的影響圖4a，b和c證明在實(shí)施例3所述的條件下儲(chǔ)存的三種不同真菌在不同時(shí)間的百分存活率。菌株ESF2是白僵菌菌株，菌株ESF1和ESF53是綠僵菌菌株。
在同樣條件下，使用保存綠僵菌菌株的同樣包裝材料，白僵菌菌株并不能很好地存活。這些結(jié)果表明，就包裝在增進(jìn)真菌存活中的效率來(lái)說(shuō)，不可能將基于包裝其他類型微生物的數(shù)據(jù)外延到真菌。
實(shí)施例7確定各種儲(chǔ)存條件對(duì)真菌分生孢子之存活力和效力的影響使用下述材料和方法確定各種儲(chǔ)存條件對(duì)真菌分生孢子存活力和效力的影響。
將在各袋中儲(chǔ)存的分生孢子劃痕在上述的馬鈴薯右旋糖瓊脂(Potato Dexztrose Agar)(PDA)平板上，以檢測(cè)白僵菌或綠僵菌分生孢子的存活率。將PDA平板上的白僵菌分生孢子于22℃保溫18小時(shí)，并將綠僵菌的分生孢子于25℃保溫15小時(shí)。保溫后，計(jì)數(shù)各PDA平板上發(fā)芽的分生孢子數(shù)目。各復(fù)制袋內(nèi)分生孢子的存活率以百分發(fā)芽率表示。然后根據(jù)四個(gè)復(fù)制組的數(shù)值計(jì)算各處理組的平均百分發(fā)芽率，并給出數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差。
使用綠僵菌的ESC-1菌株和白僵菌的ESC-170菌株，且所用的真菌繁殖體類型是保持在小稱重盤中的分生孢子。此類型由已刷掉了菌絲體層并放在稱重盤中的分生孢子組成。使用AgelessTM產(chǎn)生直接的低氧(＜5%)環(huán)境。使用Z-300型AgelessTM是因?yàn)樗貏e適于干燥材料并可與干燥劑一起使用。1袋AgelessTM-Z300具有吸收300ml氧的容量，此相當(dāng)于空氣體積1500ml。箔袋的體積約為250ml。在實(shí)驗(yàn)期間，由沒有真菌的水瓊脂平板中產(chǎn)生并且沒有與分生孢子直接接觸的水蒸汽保持某些袋內(nèi)的高R.H.。用DrieriteTM裝入需要提供低R.H.環(huán)境的袋內(nèi)。在這樣的箔袋中沒有氣體交換。
所有處理組均在25℃和37℃下保溫4或8周。各處理組均重復(fù)4份，結(jié)果用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。
圖5中顯示用綠僵菌在大氣氧水平(20%O2)條件下測(cè)得的結(jié)果。綠僵菌的分生孢子比白僵菌的分生孢子穩(wěn)定性小。雖然它們?cè)?7℃正常大氣氧水平和90-100%R.H.條件下包裝時(shí)有好的存活力，但在37℃的其他R.H.和氧水平條件下則會(huì)喪失存活性。在0-5%氧和0-10%R.H.條件下包袋后，于25℃和37℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，分別有56%和26%的分生孢子可以發(fā)芽。
實(shí)施例8確定適用于再活化儲(chǔ)存之干綠僵菌分生孢子的表面活性劑其于對(duì)百分發(fā)芽率的影響篩選有不同化學(xué)特征的HLB數(shù)值的表面活性劑。
將100ml具有一定HLB數(shù)值或化學(xué)特征的表面活性劑溶液/懸浮液加在250ml燒杯中。將0.01g至0.5g干燥的分生孢子粉灑在表面活性劑溶液或懸浮液的表面上。一旦分生孢子樣品在表面活性劑溶液中潤(rùn)濕，即將溶液轉(zhuǎn)移到100ml量筒中并反復(fù)顛倒(1分鐘內(nèi)30次)以混合之。使分生孢子在室溫下沉到量筒的底部。棄去上清并用無(wú)菌棉拭子取沉淀的分生孢子樣品。然后將含有各分生孢子樣品的PDA平板于25℃保溫25小時(shí)，檢查每100個(gè)總分生孢子中已發(fā)芽之分生孢子的數(shù)目。
結(jié)果示于表8和圖6中。圖6是綠僵菌分生孢子的百分發(fā)芽率相對(duì)在25℃和37℃下2個(gè)月時(shí)間內(nèi)造成各種儲(chǔ)存條件之包裝系統(tǒng)之間的關(guān)系曲線，其中發(fā)芽率是在儲(chǔ)存后用或不用表面活性劑處理而決定的。包裝系統(tǒng)是單用箔、箔+DrieriteTM、箔+水瓊酯、箔+AgelessTM、箔+DrieriteTM+AgelessTM、箔+水瓊脂+AgelessTM。所用的表面活性劑是親水物一親指物平衡(HLB)數(shù)為10的乙氧基化十三醇。將分生孢子旋轉(zhuǎn)10秒種并在該表面活性劑中浸漬15分鐘。
表8在HLB數(shù)為10的0.05%(W/V)乙氧基化十三醇溶液中浸漬分生孢子對(duì)重新活化儲(chǔ)存之綠僵菌干燥分生孢子的影響處理 %發(fā)芽率 標(biāo)準(zhǔn)差干燥分生孢子,對(duì)照 20.6 2.7與Iconol TDA旋轉(zhuǎn)10秒鐘的干燥分生孢子 88.2 2.8與Iconol TDA旋轉(zhuǎn)10秒鐘并加上15分鐘浸漬的干燥分生孢子 85.8 5.3與Iconol TDA旋轉(zhuǎn)10秒鐘并加上6小時(shí)浸漬的干燥分生孢子 84.7 3.5結(jié)果清楚地表明，當(dāng)在適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┖陀H水-親脂物平衡(HLB)數(shù)為10的乙氧基化十三醇中浸漬綠僵菌時(shí)，發(fā)芽率分別從56%增加到77%，和從26%增加到74%。
實(shí)施例9以生物檢測(cè)法確定儲(chǔ)存之分生孢子的效力在生物檢測(cè)法中試驗(yàn)儲(chǔ)存的分生孢子控制蠟蛾，大蠟暝(Galle-ria mellonella)的效力。蠟蛾的末齡幼蟲由Northern Bait，1520Knapp St.，P.O.Box 216，Chetek，Wisconsin 54728供給。
將蠟蛾末齡幼蟲浸在于小燒杯中的預(yù)先攪拌的分生孢子懸浮液中并保持15秒鐘。在茶葉濾網(wǎng)中一起處理10只一組的昆蟲，并放在有用1ml蒸餾水潤(rùn)濕之蛭石的100mm塑料平皿中。分別于4天和11天后記錄死亡率。所有昆蟲均再放一周并記錄外在分生孢子形成情況。
以生物檢測(cè)法試驗(yàn)在三種不同環(huán)境條件下儲(chǔ)存之分生孢子控制蠟蛾，大蠟暝(Galleria mellonella)幼蟲的能力。三種儲(chǔ)存條件是(1)25℃，90-100%R.H.和大氣氧水平;(2)25℃，0%R.H.和0-5%氧;(3)37℃，0%R.H.和0-5%氧，儲(chǔ)存時(shí)間為2個(gè)月。
圖7中顯示了有用這三組不同的分生孢子處理的綠僵菌外在分生孢子形成之幼蟲的百分?jǐn)?shù)，證明它們與新鮮分生孢子差不多或更好些。
表92個(gè)月后綠僵菌存活率與箔袋內(nèi)氣體組成和相對(duì)溫度(R.H.)的關(guān)系封口時(shí)氣體組成 儲(chǔ)存兩個(gè)月后的氣體組成和存活率%O2%CO2%存活率25℃R.H. 0-10%+20% O220.9 0.0 0.0R.H. 0-10%+0% O20.4 0.0 56.1R.H. 35-40%+20% O220.2 0.5 20.1R.H. 35-40%+0% O20.4 0.0 15.2R.H. 90-100%+20% O219.3 1.2 95.0R.H. 90-100%+0% O20.5 0.0 37.137℃R.H. 0-10%+20% O220.5 0.0 0.0R.H. 0-10%+0% O20.4 0.0 26.4
R.H. 35-40%+20% O220.4 0.3 0.0R.H. 35-40%+0% O20.4 0.0 0.0R.H. 90-100%+20% O216.7 3.3 0.0R.H. 90-100%+0% O20.4 0.0 0.0總之，低R.H.包裝為分生孢子提供了一個(gè)迅速脫水并確保進(jìn)入休眠狀態(tài)的環(huán)境。在低氧環(huán)境下儲(chǔ)存的脫水的分生孢子在儲(chǔ)存期間保持在休眠期，因此它們即使在升高的溫度下仍能很好地存活。然而，因脫水而使之表面張力增加，而于儲(chǔ)存后降低了發(fā)芽率。使用適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┛山档头稚咦拥谋砻鎻埩Σ⒂欣谠偎隙袛嘈菝摺?br> 在該優(yōu)選實(shí)施方案中，包裝是用不透氣，不透水蒸汽而且可揉曲的袋材料如鋁箔和包有鋁箔的低密度聚乙烯制成的。包裝可保證儲(chǔ)存期間有恒定不變的氧和R.H.水平。在低氧和0-10%R.H.條件下，白僵菌的分生孢子可在25℃和37℃存活2個(gè)月。但于同樣條件下(25℃和37℃，低氧和0-10%R.H.)儲(chǔ)存的綠僵菌的發(fā)芽率分別只有56%和26%。但將這些分生孢子在表面活性劑如HLB為10的0.05%(W/V)乙氧基化十三醇中浸漬15分鐘，可使發(fā)芽率分別顯著地增加到77%和74%。
根據(jù)上面的詳細(xì)描述對(duì)本發(fā)明包裝昆蟲致病性真菌的方法和材料所作的發(fā)動(dòng)和改變，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見的。這些改動(dòng)和改變亦應(yīng)包括于本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.長(zhǎng)時(shí)期儲(chǔ)存綠僵菌培養(yǎng)物的方法，包括在100%相對(duì)濕度條件下在不透氣、不透水蒸汽的材料內(nèi)密封真菌培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中材料是柔韌的膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中材料選自低密度聚乙烯、高密度聚乙烯和聚丙烯，其中材料厚度在2到8密耳之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中材料是環(huán)繞含真菌培養(yǎng)物之營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的熱封袋。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中真菌培養(yǎng)物包含在昆蟲的感染小室內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中真菌是綠僵菌(Metarhiz-ium anisopliae)。
7.包裝的綠僵菌屬真菌培養(yǎng)物，包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的活的真菌培養(yǎng)物和包裹真菌培養(yǎng)物的包裝材料，其中材料是可透過(guò)O2和CO2但不透過(guò)水蒸汽的，且被包裹的真菌培養(yǎng)物的相對(duì)濕度為100%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的培養(yǎng)物，其中材料是柔韌的膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的培養(yǎng)物，其中材料選自低密度聚乙烯、高密度聚乙烯和聚丙烯，且厚度在2至8密耳之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物被包含在對(duì)昆蟲有吸引力的感染小室內(nèi)，并設(shè)計(jì)成當(dāng)昆蟲進(jìn)入小室時(shí)以致死劑量的真菌感染昆蟲。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的培養(yǎng)物，其中真菌是綠僵菌(Metarhizium anisopliae)。
12.在室溫和較高溫度下在包裝中長(zhǎng)時(shí)期穩(wěn)定地儲(chǔ)存真菌繁殖體的方法，其中包裝具有小于5%的氧含量，小于10%的相對(duì)濕度，且包裝材料是不能透過(guò)氣體和水蒸汽的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中在干燥劑和氧吸收劑的存在下包裝繁殖體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中在密封前應(yīng)用真空或用氮?dú)獬湟绨b來(lái)排盡氧。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中真菌繁殖體是綠僵菌屬的。
16.在室溫和較高溫度下長(zhǎng)時(shí)期穩(wěn)定地儲(chǔ)存真菌繁殖體的配制物，包括氧含量小于5%，相對(duì)濕度小于10%的包裝，其中包裝材料是不能透過(guò)氣體和水蒸汽的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的配制物，其中在干燥劑和氧吸收劑存在下包裝繁殖體。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的配制物，其中真菌繁殖體是綠僵菌屬的。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的配制物，其中包裝材料具有(ⅰ)低于0.005cc O 2 /100平方英寸/天的氧傳輸速率，和(ⅱ)低于0.005cc水蒸汽/100平方英寸/天的蒸汽傳輸速率。
20.在不影響其存活性的情況下改變真菌繁殖體之表面性質(zhì)的方法，特征在于在分生孢子配制物中摻入表面活性劑，并在低相對(duì)濕度和氧的條件下包裝分生孢子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中表面活性劑選自親水-親脂物平衡數(shù)在8-14范圍內(nèi)的非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑及其組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中非離子表面活性劑選自嵌段聚合物、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化胺和酰胺、乙氧基化酯肪酸、乙氧基化脂肪族酯和油、甘油酯、甘醇酯、多糖的聚合物、丙烯酸的聚合物、丙烯酰胺的聚合物、丙氧基化和乙氧基化脂肪酸、醇性苯酚、烷基苯酚、脫水山梨醇衍生物、以及蔗糖和葡萄糖酯及其衍生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，陰離子表面活性劑選自磺基琥珀酸的鹽、磺酸的鹽、磷酸酯、酒石酸鹽和其混合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中表面活性劑與真菌繁殖體以1∶1000至100∶1的比例混合。
25.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中真菌繁殖體是由選自白僵菌和綠僵菌屬的昆蟲致病性真菌得到的。
26.在不影響其存活性的情況下改變真菌繁殖體之表面性質(zhì)的方法，特征在于將含有表面活性劑的溶液與真菌繁殖體混合，以形成施用于待處理之區(qū)域的真菌繁殖體的懸浮液。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其進(jìn)一步包括將懸浮液施用于待處理的區(qū)域。
28.在不影響其存活性的情況下改變真菌繁殖體之表面的性質(zhì)的方法，特征在于使干燥表面活性劑與真菌繁殖體混合，以形成適合施用于待處理區(qū)域或重新懸浮的干燥配制品。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包括將干燥配制品施用于待處理的區(qū)域。
30.形成真菌繁殖體懸浮液的裝置，其包括多個(gè)分隔空間，其中第一個(gè)分隔空間含有表面活性劑且第二個(gè)分隔空間含有真菌繁殖體，以及使分隔空間的內(nèi)容物相混合以形成施用于待處理之區(qū)域的真菌繁殖體懸浮液的工具。
31.形成干燥真菌繁殖體配制品的裝置，其包括多個(gè)分隔空間，其中第一個(gè)分隔空間含有干燥的表面活性劑且第二個(gè)分隔空間含有真菌繁殖體，以及使分隔空間的內(nèi)容物相混合以形成干燥真菌繁殖體配制品的工具。
全文摘要
描述了包裝綠僵菌屬真菌培養(yǎng)物或分生孢子的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在吸引昆蟲的昆蟲感染小室內(nèi)提供真菌培養(yǎng)物，然后以致死劑量的真菌感染之，其中包裝保持小室內(nèi)有高的濕度，允許自由交換氣體，并且不能透過(guò)包括真菌孢子、病毒和細(xì)菌在內(nèi)的微生物。在第二個(gè)實(shí)施方案中，在低相對(duì)濕度和氧含量條件下包裝真菌分生孢子。然后即可重新活化用于控制蟑螂、蒼蠅、螞蟻、軟體昆蟲、草場(chǎng)害蟲和毛蟲等昆蟲的分生孢子。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1095758SQ9311679
公開日1994年11月30日 申請(qǐng)日期1993年8月23日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月27日
發(fā)明者金錫萱, K·E·格里格斯, C·A·約翰遜, P·佩里, D·W·米勒 申請(qǐng)人:艾克科技公司