專利名稱：L-抗壞血酸的微生物生產(chǎn)法的制作方法
本申請是1991年3月5日提交的卷號為07/650，886的美國申請的連續(xù)部分。后者是1985年7月1日申請1991年3月19日公布的美國專利5，001，059的連續(xù)申請。
本發(fā)明涉及一種在含有合適碳源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中使用微生物特別是微藻改進L-抗壞血酸產(chǎn)量的異養(yǎng)方法。具體地說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)高濃度的L-抗壞血酸(特別是每單位細胞團中的高濃度)的方法。本發(fā)明還提供了適用于本發(fā)明L-抗壞血酸的生產(chǎn)方法的誘變的微藻新種。
L-抗壞血酸是一種重要的營養(yǎng)補充物，廣泛用于維生素膠囊中和作為一種營養(yǎng)補充物用于人和其它需要維生素C的動物的食物中。L-抗壞血酸是一種疏松性化學物，價格敏感性較高，市場上需要經(jīng)濟有效的產(chǎn)品。因此，開發(fā)使用微生物的方法(該方法提供了營養(yǎng)物的有效轉化)生產(chǎn)有效的L-抗壞血酸產(chǎn)品是有實際價值的。
Loewus，F(xiàn).A.，在L-抗壞血酸新陳代謝，生物合成，功用(The Biochemistry of Plant，vol.3，Academic Press，Inc.，PP.77-99，1980)中對L-抗壞血酸的來源和生物合成進行了綜述。用藻類生產(chǎn)抗壞血酸的描述可參見Vaidya等，Sciencl and Culture(1971)37∶383-384;Subbulakshmi等，Nutrition Repcrts International(1976)14∶581-591;Aaronson等，Arch.Microbiol.(1997)112∶57-59;Shigeoka等，J.Nutr.Sci.Vitaminol(1979)29∶29-307;Shigeoka等，Agric.Biol.Chem.(1979)43∶2053-2058;Bayanova和Trubachev，Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobidogyia(1981)17∶400-407(VDC 582.26∶577.16);和Ciferri，Microbiological Reviews(1983)47∶551-578。
現(xiàn)有技術中的異養(yǎng)方法并不能完全滿足于商業(yè)應用一般生產(chǎn)抗壞血酸中的碳源利用率較低而且維生素以不合乎要求的低濃度被生產(chǎn)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種從碳源中異養(yǎng)生物合成L-抗壞血酸的方法，它能使碳源的利用率提高。另一個目的是提供生產(chǎn)高產(chǎn)量維生素的方法。還有一個目的是提供新的L-抗壞血酸的高產(chǎn)微生物。
因而，本發(fā)明是提供了一種生產(chǎn)L-抗壞血酸的改進方法，它包括在一種含有適合生長和L-抗壞血酸生產(chǎn)所需量的碳源和溶解氧的營養(yǎng)培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長一種生產(chǎn)L-抗壞血酸的微生物細胞，使該微生物從原始狀態(tài)生長到高細胞密度，此過程伴隨著細胞內(nèi)L-抗壞血酸的產(chǎn)生，和碳源基本上完全耗盡，在基本耗盡碳源狀態(tài)下維持這些細胞直到細胞生長基本上停止，然后加入控制量的碳源在細胞密度很少或沒有增加的同時產(chǎn)生額外量的L-抗壞血酸，繼續(xù)加入控制量的碳源直至在細胞密度很少或沒有增加的同時L-抗壞血酸產(chǎn)量達到所需要的增加。
因此，可觀察到與L-抗壞血酸的產(chǎn)生有關的碳源利用率的提高，因而獲得提高的產(chǎn)率，這可被用毫克L-抗壞血酸/升溶液表示的總L-抗壞血酸的增加和最好用每克細胞干重中的L-抗壞血酸毫克數(shù)表示的L-抗壞血酸特異形成的增加來證實。
本發(fā)明還提供了一種新的L-抗壞血酸高產(chǎn)誘變微藻，尤其是源于Chlorella Pyreniodosaisolate UTEX1663的Chlorella PyrenoidosaUV101-158(于85年6月27日保藏于美國典型培養(yǎng)物收藏中心。保藏號為53170);源于C.regularisUTEX1808R的Chlorella regularisUV5-280;源于Prototheca zopfiiUTEX1438的P.zopfiiUV3-132;源于Ankistrodesmus brauniiATCC12744的Ankistrodesmus brauniiUV2-370。UTEX是在Austin的Texas大學的藻類培養(yǎng)物收藏處。
下面更為詳細地描述本發(fā)明方法中這些新的微藻類的產(chǎn)生和它們對L-抗壞血酸生產(chǎn)的有效作用。
總的來說，本發(fā)明方法包括三個主要階段(1)初始細胞培育階段，是在含有初始濃度的有效碳源和溶解氧(二者用量足以滿足伴隨細胞內(nèi)產(chǎn)生L-抗壞血酸和基本完全耗盡碳源的同時把微生物培育到高細胞密度)的發(fā)酵罐中異養(yǎng)培育能異養(yǎng)生產(chǎn)L-抗壞血酸的一種微生物，優(yōu)選微藻類;(2)碳源幾乎完全耗盡的階段，是把這種微生物的細胞維持在這種碳源耗盡的狀態(tài)下直到細胞生長基本停止;和(3)控制碳源加入階段，是在發(fā)酵罐中加入碳源并維持低于初始濃度的第二濃度，以便在溶解氧存在下，有效地產(chǎn)生額外量的L-抗壞血酸而不引起細胞密度的實質上的增加。
繼續(xù)加入低濃度的碳源，此時L-抗壞血酸的產(chǎn)生優(yōu)于細胞的生長，直到該微生物產(chǎn)生L-抗壞血酸的能力大體上用盡。這個終點能用在整個過程中隨時監(jiān)測L-抗壞血酸濃度和細胞密度的方法測定。
該方法的其它階段包括按照現(xiàn)有技術的已知方法收集細胞并分離和回收幾乎不含細胞物的L-抗壞血酸。
從細胞(生物量)中回收的L-抗壞血酸能被這樣應用換句話說，被載入生物量的抗壞血酸本身能用作富含維生素C的動物飼料組合物或飼料補充物(包括用于水養(yǎng)殖魚)。
本發(fā)明所用的微生物可廣泛地變化，只要它們是L-抗壞血酸的產(chǎn)生者，尤其是能異養(yǎng)產(chǎn)生細胞內(nèi)的L-抗壞血酸的這類生物體。優(yōu)選微生物是產(chǎn)生L-抗壞血酸的綠色微藻類，特別出于經(jīng)濟的原因所稱的高產(chǎn)者，有時稱作為超產(chǎn)者?？梢杂冒橛挟a(chǎn)生L-抗壞血酸的細胞生長的標準發(fā)酵法來分辨出具有高產(chǎn)L-抗壞血酸的潛能生物體。最好再把它們用物理或化學誘變處理方法如紫外光，X-光，N-甲基-N′-亞硝基胍，硫酸二甲酯或現(xiàn)有技術中已知的類似試劑進行誘變處理。用氧化還原染色能明顯測定用這類方法處理產(chǎn)生的誘變處理后的L-抗壞血酸超產(chǎn)者。而且，可通過使用抗壞血酸代謝中間體或抗壞血酸合成的抑制劑的類似物來選擇能夠在化學干擾物存在下保持或增加L-抗壞血酸產(chǎn)生的微生物。
上述過程優(yōu)選的子代是提供改進的L-抗壞血酸特異形成的微生物(以每克細胞(干重為準)中L-抗壞血酸的毫克數(shù)測量)。然后進一步把這些子代分為單個克隆，并且進一步進行上述過程。
一種優(yōu)選生物是綠色微藻類小球藻屬的微生物，特別是Chlorella Pyrenoidosa藻株，UV101-158，一種由藻株UTEX16-63經(jīng)紫外光誘變處理轉變而來的高產(chǎn)L-抗壞血酸突變體。C.PyrenoidosaUV101-58已保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為53170。另一個優(yōu)選的C.Pyrenoidosa藻株是UV232-1，為目前細胞內(nèi)L-抗壞血酸最高產(chǎn)生者。其它典型的和適合的小球藻屬的品種有Chlorella regularis藻株UTEX1808;和C.regularisUV5-280，一種藻株UTEX1808的由紫外光產(chǎn)生的L-抗壞血酸的高產(chǎn)突變株。還有其他也能異養(yǎng)生長產(chǎn)生L-抗壞血酸的適當微藻類是那些屬于Prototheca和Ankistrodesmus屬微藻。典型的Prototheca品種是P.zopfii藻株UTEX1438和P.zopfi-iUV3-132，一個UTEX1438的由紫外光產(chǎn)生的L-抗壞血酸的高產(chǎn)突變株。典型的Ankistrodesmus品種是A.brauniiATCC12744和A.brauniiUV2-370，一個ATCC12744的由紫外光產(chǎn)生的L-抗壞血酸的高產(chǎn)突變體。
還應注意到上述情況的每一誘變子代是比它的親代生物體較高的L-抗壞血酸的產(chǎn)生者。而且，如下所示，每一個生物在如上述所定義的本發(fā)明條件下比現(xiàn)有技術的常規(guī)條件下能產(chǎn)生更高的L-抗壞血酸的最大濃度(以毫克L-抗壞血酸/升營養(yǎng)性培養(yǎng)液表示)。
在該方法的實施中，是把一種生長活躍的微生物培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基上，接種量足以在適當生長期后引起高細胞密度，通常伴隨的首先是低濃度的L-抗壞血酸。典型的初始細胞密度范圍一般是0.15到0.4g/L(以細胞干重為準)。該培養(yǎng)基包括碳源，各種鹽還常有微量金屬。它還包括分子氧源，一般為空氣，加入的量是與促進生長的碳源用量一起促進生長的量。換句話說，有效的碳源和氧二者必須用來使微生物生長到高細胞密度。
碳源一般是L-半乳糖或D-葡萄糖源，由于經(jīng)濟原因，優(yōu)選的是葡萄糖。葡萄糖源可以是任一能原位轉化為葡萄糖的糖類，如糖漿，玉米糊等。所用葡萄糖源的總量隨特殊微生物和所要求的結果的不同而廣泛變化。一般地，對高產(chǎn)L-抗壞血酸的生物體，例如C.PyrenoidosaUV232-1來說，所用葡糖源總量，如果沒有代謝，提供大約65到90，更常用大約為75到85，最佳為80g/L左右(按葡萄糖計)的濃度。通常最初大約加入總葡萄糖量的15到30%，更為常用的是總葡萄糖量的20到25%。一般葡萄糖是在開始和發(fā)酵期間與以后所指的其它添加物一起加入的。在開始加入葡糖源和發(fā)酵期間(細胞生長不受抑制)，為未限定細胞生長期。細胞生長到相當高的細胞密度，常伴有一個相當?shù)偷臐舛鹊腖-抗壞血酸的形成。
發(fā)酵罐中葡糖源的量應當是非阻遏/非限制的用量，也就是說，它應最令人滿意地促進而不是抑制或過分限制細胞的生長。葡萄糖源的非生長限制的最佳濃度可隨生物體不同而變化，并且對任一特殊生物用實驗很容易測得。例如，對C.Pyrenoi-dosaUV101-158來說，及時添加使葡糖源濃度維持在15-30g/L范圍，可以足夠促進細胞生長的同時避免葡萄糖抑制生長。
最好的是，其它添加物開始就與葡萄糠源一起存在，它們在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度通常也是靠連同續(xù)加的葡糖源依次加入相同的添加物來持續(xù)提供。這些添加物的濃度與葡糖源的濃度比在整個發(fā)酵中可以相同也可以不同。
添加物添加量與加入到發(fā)酵罐中的總量的比例與葡萄糖不同，這些添加物是堿金屬磷酸鹽，例如磷酸鈉和磷酸鉀，優(yōu)選磷酸二氫鈉和磷酸氫二鉀。磷酸二氫鈉的總用量一般大約是1到2g/L，常用量大約1到1.5g/L，最好大約為1.3g/L，存在于發(fā)酵罐中的磷酸二氫鈉起始量一般大約為所加磷酸二氫鈉總量的35到50%，更常用的大約是40到45%。磷酸氫二鉀的總量一般大約為1.5到3g/L，最常用的大約為到2.5g/L。起始存在量一般大約為總量的40到50%，最常用的大約為總量的45到50%。
除上述添加的外，可有利地加入一種生物相容的螯合劑，如檸檬酸三鈉，其總量大約為0.8到1.2g/L，通常大約為1g/L。通常存在的磷酸氫二鈉是大約0.8到1g/L，優(yōu)選的是約0.95到1g/L。加入一種生物相容的無機酸來保持溶液中的微量金屬，同時也用來中和常用作氮源的氨。用于這種目的較為方便的是濃硫酸，其用量大約為1到2，最常用的量大約為1.2到1.5ml/L。在微量金屬中，鎂存在量大約為0.1到0.2g/L，優(yōu)選0.1到0.15g/L，特別是以一種生理上可接受的鹽，例如硫酸鹽的形式。所用鐵和銅的量是被限制的，因為這些金屬抑制抗壞血酸的形成。鐵的初始存在量大約為5到7mg/L，優(yōu)選的大約為5.5到6mg/L，并且不再后續(xù)加入。銅的存在量相對微小，一般大約為1到50μg/g葡萄糖。
下面描述的微量金屬溶液常用總量大約為10到15ml/L，更常用的大約為12到14ml/L。依據(jù)葡萄糖，該微量金屬溶液相應為0.1到0.2ml/g。
根據(jù)需要，制備在發(fā)酵過程中加入的合適溶液，該溶液具有下列組分。
表1 培養(yǎng)基配方組分 濃度(相對于葡萄糖)葡萄糖 1.0枸櫞酸三鈉二水合物 0.0125無水硫酸鎂 0.0082磷酸氫二鈉 0.0116
磷酸氫二鉀 0.0238磷酸二氫鈉 0.0121微量金屬混合物 0.1675ml/g98%硫酸(W/W) 0.0329用無水氨補充氮，它也用作PH調節(jié)劑。培養(yǎng)基中實際氮的含量是用培養(yǎng)基的酸度和培養(yǎng)基的緩沖能力來測定。
該微量金屬混合物和溶液含有下列組分表2 微量金屬溶液組分 濃度(濃縮的存放液)mg/L二氯化鈣二水合物 3102硫酸鎂一水合物 400硫酸銅一水合物 0.4二氯化鈷五水合物 40硼酸 160硫酸鋅七水合物 400鉬酸鈉二水合物 19硫酸氧釩鹽二水合物 20硝酸鎳六水合物 8亞硒酸鈉 18微量金屬存放液的制備是把適量的各種化合物溶于含微量鹽酸的蒸餾水中使最后容量為1升并含有20ml濃Hcl。蒸餾水是用來保證微量金屬組分的適當比例的。
當一些鹽提到是一元或二元時，應當理解為這是為了方便而不是必需的。這些化合物作為緩沖液，它們的質子化程度將隨培養(yǎng)基的PH值變化。
在發(fā)酵進行中，把磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉溶于大約總培養(yǎng)基的75到90%，通常大約為總培養(yǎng)基的80到90%中，加入到發(fā)酵罐中。
制備在發(fā)酵過程中增加的溶液是按適當比例把單個成分組合起來。把葡萄糖溶于大約75到85%，優(yōu)選大約為80%的備用的水中。在含有大約5到15%，常用的大約10%水的含水培養(yǎng)基中把枸櫞酸鹽，鎂和硫酸組分組合在一起，同時把磷酸鹽溶解在大約5到15%，常用的大約為10%備用水中，然后把微量金屬溶液加入到含備用水的大約5到15%，常用的大約為8到10%中。在含有一定比例的磷酸鹽的發(fā)酵罐中加入鐵鹽和大約20%上述制備的葡萄糖鹽濃縮液。加入過程是無菌的，避免引入任何外界微生物。
然后把營養(yǎng)培養(yǎng)基加熱到所需溫度。該溫度是隨微生物而變化的，但一般在大約30到40℃范圍內(nèi)，優(yōu)選35℃左右。用接種物給發(fā)酵罐接種，一般給出大約0.1到0.4g/L的初始細胞密度。在發(fā)酵過程中可以加入少量的消沫劑。
在發(fā)酵的第一階段，細胞生長到高細胞密度為最后有較高L-抗壞血酸的總產(chǎn)量提供基礎，細胞繼續(xù)生長直到碳源幾乎完全被耗盡，即其葡萄糖當量濃度一般少于0.1g/L溶液(即，無細胞上清液)。所需要的時間隨微生物變化，但一般包含在大約35到50小時期間，常用的大約為40到45小時之間，其生長率大約為0.1到0.15/小時。
按需要，加入無水氨調節(jié)培養(yǎng)基的PH值在所要限制的范圍內(nèi)，一般大約6.5到8.0之間。
在這種生長期間振蕩培養(yǎng)基和通氣都是有益的。振蕩率一般大約為200到1000轉/分，同時通氣率一般在大約為0.2到0.6L空氣/分范圍內(nèi)。盡管這些隨微生物和其他發(fā)酵條件而有所改變。通氣給培養(yǎng)基提供了分子氧(O2)，它是細胞生長和產(chǎn)生L-抗壞血酸所必需的。也能用其它氧源，包括用除N2外的惰性氣體稀釋或沒有稀釋的氧氣。不管什么氧源，在發(fā)酵過程中都應控制培養(yǎng)基中溶解氧的含量以保證細胞較快生長和細胞內(nèi)較高的L-抗壞血酸的含量。用普通方法(方便的是用一種氧探測電極)來監(jiān)控營養(yǎng)培養(yǎng)基中氧的含量。
用常規(guī)方法如葡萄糖氧化酶試驗，HPLC，或其它已知方法在上清液(即，無細胞的培養(yǎng)基組分)中監(jiān)控在初始生長階段可被微生物利用的葡萄糖。當葡萄糖濃度下降時，按需要通過加入等分試樣，然而要保證總的葡萄糖濃度維持在低于抑制生長的水平，如上所述一般低于大約30g/L。保持葡萄糖的可利用度直到達到所要求的高細胞密度，如對C.PyrenoidosaUV101-158來說大約為35到45g/L，優(yōu)選40g/L左右。細胞密度按細胞干重計算。為此，如果還沒有達到這個狀態(tài)，可使培養(yǎng)基中的葡萄糖含量幾乎完全耗盡。
當所要求的高細胞密度達到和培養(yǎng)基中葡萄糖含量幾乎完全耗盡時，保持這種葡萄糖耗竭狀態(tài)，即，在這個期間生物體處于饑餓狀態(tài)，細胞生長幾乎停止，L-抗壞血酸的產(chǎn)生也幾乎停止。盡管這樣，細胞一般能利用貯存的淀粉來維持細胞功能包括產(chǎn)生一些少量的L-抗壞血酸。
持續(xù)幾乎耗盡的葡萄糖和沒有生長的階段，直到又給生物體提供葡萄糖源為止，但控制葡萄糖源用量，開始在很少或沒有增長細胞密度下產(chǎn)生額外量的L-抗壞血酸。這種饑餓期可從幾分鐘或更短延伸到幾小時或更長，一般大約1到4小時，更常用的是2到4小時。對任何特殊生物體的量佳饑餓時間和給發(fā)酵罐中加入葡萄糖源的最佳用量和比例可以用加入小實驗量的葡萄糖并監(jiān)測其隨時間對L-抗壞血酸含量和細胞密度的影響來測定。在生長期間當L-抗壞血酸的增長與任何時候細胞密度的增長比例大于L-抗壞血酸與細胞密度的比例的最大值時，一般用按相同時間增長量，利于L-抗壞血酸的形成超過利于細胞密度增長的用量和比例來飼喂葡萄糖源來繼續(xù)提高的L-抗壞血酸產(chǎn)生階段。對任何特殊微生物來說，理想用量和飼喂率都能用試驗容易地測定。一般地，拿C.PyrenoidosaUV101-158來說，飼喂率在大約0.005到0.05克葡萄糖/小時/克細胞(以細胞干重計)葡萄糖的含量維持在低于促進生長的濃度，例如，低于大約0.1g/L溶液。
本主題方法高產(chǎn)率地生產(chǎn)細胞內(nèi)的L-抗壞血酸，遠高于其他自然生產(chǎn)源象玫瑰薔薇果所生產(chǎn)的。能達到超過3.5%生物量物質水平到4.0%水平和更高。L-抗壞血酸的濃度能夠超過1.45g/L能夠是3.3g/L或更高。以消耗的基質為準，得到至少約0.01左右的摩爾產(chǎn)率。
提供以下實施例用于進一步說明而不用作限定。
實施例1在1升的發(fā)酵罐中滅菌0.6升蒸餾水，0.23克磷酸二氫鈉和0.27克磷酸氫二鉀。然后向磷酸鹽溶液無菌加入11.2毫克硫酸鐵(七水合物)的5毫升蒸餾水和20毫升無菌葡萄糖鹽濃縮液(用下列各營養(yǎng)組分別滅菌，再冷卻后混合制備)
組156克葡萄糖，食物級一水合物(無水基質)(80g/L)在80毫升水中。
組20.7克枸櫞酸三鈉二水合物(1.0g/L)無水硫酸鎂(0.6g/L)1毫升硫酸(1.4g/L)在10毫升水中。
組30.65克磷酸氫二鈉(0.97g/L)1.3克磷酸氫二鉀(1.9g/L)0.6克磷酸二氫鈉(0.97g/L)在10毫升水中。
組49.4毫升微量金屬溶液把溫度升至35℃，開始以200轉/分攪拌。以0.2升/分鐘(1pm)的速率給培養(yǎng)基通入空氣，加入50毫升濃度約0.3g細胞/1的Chlorella PyrenoidosaUV101-158。五小時后攪拌速度增至400轉/分，空氣流速為0.41pm。16小時后，攪拌速度增至550轉/分，空氣流速為0.61pm。以后如表3所示把攪拌速度增到700，然后800轉/分，而在剩下的操作中將空氣流速穩(wěn)定在0.61pm。
下表描述了發(fā)酵條件和分析結果。
表3時間 細胞密度 抗壞血酸PH 注釋(小時) G/L mg/L0 6.9 -5 6.6 0.7 400轉/分;空氣0.41pm16 6.9 3.8 550轉/分;空氣0.61pm21 7.0 9.5 700轉/分;加20ml24 6.9 14.2 800轉/分;加20ml36 葡萄糖耗盡40 7.1 38.6 538 加4ml+45 7.2 38.6 65448 加4ml+51 7.6 38.1 775 加2ml+65 7.7 37.8 96668 7.8 1050 加4ml+92 7.6 37.2 1292101 7.3 36.1 1459**＊葡萄糖/鹽濃縮液+20%葡萄糖，在發(fā)酵過程中周期性地重復加入。
＊＊相當于0.04克L-抗壞血酸/克細胞干重或4%生物量干重。
所用的測定L-抗壞血酸的方法已由Gun和Loewus，在Analytical Biochemistry(1983)130191-198中描述。該方法是一種離子交換方法，使用了一支7.8×300mm有機酸分析柱，HPX-87(Bio-Rao Laboratories，Richmond，(A)。條件為流動相，0.013M硝酸，流速0.8ml/分，壓力1500磅/英寸2，檢測，UV245-254NM。用上述條件可以分離L-抗壞血酸和異抗壞血酸。
用以下方法來測定每升細胞克數(shù)。把一個生物量的試樣(5ml)移到一只稱量盤上并把5ml上層清液移到第二只稱量盤上。離心上層清液。在對流烘箱干燥這兩只稱量盤(105℃3小時)。在干燥器中冷卻后，稱出稱量盤的含量。每升細胞克數(shù)按(試樣重-上層清液重)×200測得。
基于以上述結果，使以每克細胞中抗壞血酸克數(shù)計的特定形成至少達到0.04并且以消耗每摩爾的葡萄糖形成L-抗壞血酸的摩爾數(shù)定義的摩爾產(chǎn)率至少為0.01或更高。另外，抗壞血酸的濃度至少提高至1.5g/L左右。
實施例2-10基本上重復實施例1的方法使用以下所描述的微生物Chlorela Pyrenoidosa藻株UTEX1663，藻株UV101-158(如上所述紫外光引起的藻株1663的突變體)和藻株UTEX343;Chlo-rella regularis藻株UTEX1808和藻株UV5-280(由紫外光引起的藻株1808的突變體)，Prototheca zopfii藻株UTEX1438和藻株UV3-132(由紫外光引起的藻株1438的突變體);Ankistrodesmus braunii藻株ATCC12744和藻株UV2-370，(由紫外光引起的藻株12744的突變體)。
應當注意到在這些實施例中選來詳細說明本發(fā)明的三個微藻屬(即，Chlorella，Prototheca和Ankistrodesmus)在分類學上是有廣泛分叉的并且被認為是有代表性的產(chǎn)生L-抗壞血酸的異養(yǎng)性微藻。
上述種類的每一個都被在一個分批飼喂的帶攪拌的一升發(fā)酵罐中培育到大約40g/L細胞密度(以干重為淮)。加入氨來提供營養(yǎng)氮并調節(jié)PH。在細胞耗盡葡萄糖基質營養(yǎng)物后，細胞進入一個1到3小時不加葡萄糖的階段，然后每3小時給每克干重細胞加入0.3克葡萄糖(下表給出了生長后加入的葡萄糖)，直到每天兩次的分析顯示出抗壞血酸的合成已達到最高值和正在下降。在下列表中小標題“生長后加入葡萄糖”欄下的“有”來表示。
用相同藻株在相同分批飼喂條件下進行對照實驗直到葡萄糖耗盡;但在葡萄糖耗盡后不加入營養(yǎng)物。在“生長后加入葡萄糖”欄下用“沒有”來表示。
表4抗壞血酸濃 特定形成最生長后加實施例 微生物 度最大值 大值(mg/g入葡萄糖(mg/l) 細胞)Chlorella pyrenoidosa對照 UTEX1663 沒有 38 1.072 UTEX1663 有 54 1.24
對照 UV101-158 沒有 570 12.93 UV101-158 有 753 17.0對照 UTEX343 沒有 38 0.74 UTEX343 有 38 0.66Chlorella regularis對照 UTEX1808 沒有 15 0.345 UTEX1808 有 28 0.38對照 UV5-280 沒有 26 0.546 UV5-280 有 32 0.65Prototral zopfii對照 UTEX1438 沒有 24 0.77 UTEX1438 有 56 2.1對照 UV3-132 沒有 50 2.58 UV3-132 有 57 6.8Ankistrodesmus braunii對照 ATCC12744 沒有 25 0.569 ATCC12744 有 30 0.40對照 UV2-370 沒有 49 1.410 UV2-370 有 65 1.2
表列結果表明四個種和它相應衍生的抗壞血酸高產(chǎn)藻株中的每一個單獨的藻株在本發(fā)明加入葡萄糖條件下生長能引起抗壞血酸產(chǎn)率的提高以抗壞血酸濃度mg/L的最大值表示，與生長后不加葡萄糖的簡單分批飼喂條件下的生長相對應。這個結果也表明C.PyrenoidosaUTEX1663和它的L-抗壞血本的高產(chǎn)突變株UV5-280，以及P.zopfiiUTEX1438和它的L-抗壞血酸高產(chǎn)突變株UV3-132都在本發(fā)明條件下提高了特定抗壞血酸形成(mg/g細胞)也表明產(chǎn)生抗壞血酸的碳源利用率的提高(與在初始生長和葡萄糖耗盡狀態(tài)后不加葡萄糖獲得的碳源利用率相比)。
還應注意到C.Pyrenoidosa藻株343，與其它C.Pyrenoidosa藻株不同在兩種條件下都不能引起抗壞血酸的產(chǎn)率增加;而且盡管每一Ankistrodesmus braunii藻株在本發(fā)明條件下都產(chǎn)生較高濃度的抗壞血酸，但沒有一個能引起抗壞血酸特定形成的改進。然而，在這一點上應注意到，在初始生長和葡萄糖耗盡階段后所用的這套特定條件對C.Pyrenoidosa藻株UTEX1663是最佳的，沒有試圖控制條件以提高C.PyrenoidosaUTEX343或A.brau-niiATCC12744或UV2-370之一的抗壞血酸的產(chǎn)量。同樣可以相信用這些微生物也可能得到改進的結果。
實施例11(最佳方式)除以下幾點外重復實施例1的方法(a)5.6ml硫酸亞鐵，替代11.2mg用于初始0.6升蒸餾水裝料中;(b)營養(yǎng)液組成28克葡萄糖在40ml蒸餾水中;0.53克枸櫞酸三鈉二水合物加0.2克硫酸鎂，在20ml蒸餾水中;0.65克磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉在20ml蒸餾水中;和4.7ml微量金屬液加1ml硫酸在15ml蒸餾水中;和(c)表1的UV232-1藻株的活性生長培養(yǎng)物。
把溫度升到35℃，開始以350轉/分攪拌，空氣通入培養(yǎng)基的流速為0.2升/分(1pm)，用加到空氣流中的無水氨調PH到6.9，把UV232-1藻株加入培養(yǎng)基中。在整個操作中飼喂氨作為營養(yǎng)氮源和PH調節(jié)劑。6.2小時后把空氣流速增加到0.41pm，攪拌速度為400轉/分。11.8小時后把空氣流速增加到0.61pm，后續(xù)實驗中保持不變，攪拌速度增到650轉/分。12.4小時后，把40多ml含葡萄糖的營養(yǎng)液加到發(fā)酵罐中，以后在24.4小時加入20多ml，在26.3小時加入15ml多;同時，在22.8小時攪拌速度增至750轉/分，然后在34.8小時調到900轉/分，其后實驗中速度不變。
在31.7小時，培養(yǎng)基中的葡萄糖含量耗盡，在這時細胞密度(C、D)是19.5，L-抗壞血酸濃度是322mg/L。在41.7到94.8小時中每3小時一次把葡萄糖(10%溶液2毫升)喂給發(fā)酵罐中。隨時間改變的細胞密度和L-抗壞血酸濃度以及計算出的生物量的L-抗壞血酸列于下列表中。
表5L-抗壞時間 C、D L-抗壞PH 血酸 注釋(小時) (g/l) 血酸(mg/L)0 6.9 -6.2 6.911.8 6.9 在12.4小時有40ml葡萄糖
22.8 在24.4小時有20ml在26.3小時有15ml31.7 6.9 葡萄糖耗盡34.8 7.0 19.5 32246.9 7.7 18.7 42922.953.6 7.8 52858.6 7.8 17.9 61334.270.8 7.9 69477.7 7.9 17.3 81947.382.8 7.8 91594.8 7.6 17.6 94553.7＊在41.7小時加入2ml10%葡萄糖以后每3小時一次直到94.8小時。
上述方法重復4次多，基本上如上所述。在5次實驗以上L-抗壞血酸百分含量平均為5.2%生物量干重。
基于本發(fā)明的這些描述和某種特定程度的實施例應認為以上權利要求將不應太受限制的，而將是與權利要求及其等同物各個要素所表達的范圍相適應。
權利要求
1.一種L-抗壞血酸的生產(chǎn)方法，包括以下步驟(a)在一個含有適當碳源和溶解氧(每一種用量足以滿足細胞生長和L-抗壞血酸的生產(chǎn))的促生長營養(yǎng)培養(yǎng)基中異養(yǎng)培育能異養(yǎng)產(chǎn)生L-抗壞血酸的微生物細胞。(b)在初始階段讓微生物生長到高細胞密度，伴有初始量的抗壞血酸的形成和導致碳源幾乎完全耗盡。(c)把細胞保持在幾乎完全沒有碳源有溶解氧的條件下直到(i)細胞生長幾乎停止和(ii)隨后加入控制量的碳源使在細胞密度幾乎不增加的同時形成額外量的L-抗壞血酸和(d)在氧存在下繼續(xù)控制碳源加入直到在細胞密度幾乎不增加的情況下達到所需要的L-抗壞血酸的產(chǎn)量增加。
2.權利要求1的方法，其中在步驟(d)中所產(chǎn)生的L-抗壞血酸的總量與總細胞密度的比例遠大于在細胞生長幾乎停止和細胞密度停止增長的步驟(c)中這種比例。
3.權利要求1的方法，其中抗壞血酸從基本上不含細胞內(nèi)物質的細胞中收集。
4.權利要求1的方法，其中碳源以非抑制性用量存在。
5.權利要求4的方法，其中的碳源是一種葡萄糖源。
6.權利要求5的方法，其中的碳源是在發(fā)酵過程中在培養(yǎng)基中原位轉化為葡萄糖的一種糖或多糖。
7.權利要求5的方法，其中的葡萄糖源包括葡萄糖。
8.權利要求1的方法，其中的微生物是一種綠色微藻。
9.權利要求8的方法，其中的微藻是小球藻屬的一種。
10.權利要求9的方法，其中的種名為Pyrenodosa。
11.權利要求10的方法，其中的微生物是被一株指定為UV101-158的C.Pyrenoidosa藻株，它是C.Pyrenoi-dosaUTEX1663的一個突變株，具有A.T.C.C.保藏號53170。
12.具有A.T.C.C保藏號53170的Chlorella Pyrenoidosa藻株。
13.Chlorella Pyrenoidosa藻株UV232-1，它是用紫外線照射從C.Pyrenoidosa突變來的。
全文摘要
用產(chǎn)生抗壞血酸的微藻(特別是小球藻屬)作為微生物源在控制碳源供給模式下培育獲得了改良的抗壞血酸異養(yǎng)生物合成產(chǎn)物。也獲得了抗壞血酸與供給的總碳源比率的極大提高以及發(fā)酵罐中抗壞血酸濃度的提高。C.pyrenoidosa UV101-158已于1985年6月27日保藏在A.T.C.C，保藏號為53170。
文檔編號C12P17/04GK1083110SQ9310465
公開日1994年3月2日 申請日期1993年3月18日 優(yōu)先權日1992年3月18日
發(fā)明者羅納德·J·赫斯, 杰弗里·A·朗寧, 托馬斯·J·斯卡特魯?shù)?申請人:生物技術資源L.P.