專利名稱：編碼具有腈水化酶活性的多肽的dna片段、含該基因的轉(zhuǎn)化株和用該轉(zhuǎn)化株生產(chǎn)酰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由玫瑰色紅球菌J-1(RhodococcusrhodochrousJ-1)產(chǎn)生的并編碼具有將腈水化為酰胺的腈水化酶活性的多肽的DNA片段。本發(fā)明還涉及含該DNA片段的重組DNA和用該重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用該轉(zhuǎn)化株生產(chǎn)腈水化酶和用該腈水化酶生產(chǎn)酰胺的方法。
公眾已知腈水化酶是一種將腈水化為酰胺的酶。產(chǎn)生腈水化酶的微生物包括屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、桿菌屬(Bacteridium)、微球菌屬(Micrococcus)和短桿菌屬(Brevibacterium)(參閱JP-B-62-21517.1989，USPNo.4001081)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和諾卡氏菌屬(Nocardia)(參閱JP-B-56-17918/1989，USPNo.4248968)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(參閱JP-B-59-37951/1984，USPNo.4637982)、紅球菌屬(Rhodococcus)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)和微桿菌屬(Microbacterium)、(參閱JP-A-61-162193/1986，EP-A-0188316)和玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)(參閱JP-A-2-470/1990，EP-A-0307926)。
腈水化酶已經(jīng)用于將腈水化為酰胺。在本發(fā)明中，根據(jù)重組DNA技術(shù)，采用遺傳工程方法使微生物含有編碼腈水化酶的更多拷貝重組DNA。與常規(guī)所用的微生物相比，重組體產(chǎn)生顯著高水平的腈水化酶。
本發(fā)明人先前公開了由Rhodococcussp.N-774(FERM-BP-1936)產(chǎn)生的DNA片段，該片段編碼具有腈水化酶活性的多肽(JP-A-2-119778/1988)。
可是本發(fā)明人由玫瑰色紅球菌J-1產(chǎn)生的DNA片段用于產(chǎn)生腈水化酶。我們分離到編碼腈水化酶的基因，并將該基因插入到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體中，再用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募闹鳎瑥亩晒Φ孬@得產(chǎn)生對芳腈具有高活性的腈水化酶的轉(zhuǎn)化株。
本發(fā)明涉及如下幾個方面。
(1)編碼具有腈水化酶活性的多肽的DNA(H)片段，所述多肽含有下列氨基酸順序的α(H)-和β(H)-亞單位α(H)-亞單位51015MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr202530LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro354045AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly505560ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro657075GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla808590SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal95100105PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys110115120SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr125130135LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly140145150ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu155160165ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrIleValIle170175180ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu185190195ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla200LeuThrProGlnGluValIleValβ(H)-亞單位
51015MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro202530ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu354045GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle505560SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn657075GluAsnTyrValAsnGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp808590LeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValAlaAspLysIleIleThr95100105GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleLeuGluGlyArg110115120TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnIle125130135GluLysAlaIleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu140145150ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLysIleLysVal155160165LysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal170175180ArgAsnLysIleGlyGluIleValAlaTyrHisGlyCysGlnIle185190195TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro200205210LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp215220225GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyrLeuIleSerAla;
(2)編碼具有腈水化酶活性的多肽的DNA(L)片段，所述多肽含有下列氨基酸順序的α(L)-和β(L)-亞單位α(L)-亞單位51015MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn202530GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal354045AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer505560ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal657075AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr808590AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln
95100105GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn110115120MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu125130135GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg140145150AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr155160165ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu170175180LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn185190195PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu200205IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAlaβ(L)-亞單位51015MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro202530IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu354045ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla505560PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro657075HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla808590MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu95100105LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr110115120ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln125130135LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu140145150AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla155160165SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg170175180ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp185190195ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr200205210ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
215220225AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuProAla(3)含有編碼所述α(H)-和β(H)-亞單位的核苷酸順序的(1)的DNA(H)片段，包括α(H)-亞單位的DNA順序153045GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC607590AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC105120135GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC150165180CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT195210225GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG240255270TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC285300315TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT330345360TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC375390405AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA420435450GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG465480495GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC510525540CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG555570585ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG600CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTAβ(H)-亞單位的DNA順序153045ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG607590GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG105120135GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA150165180TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC195210225GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG240255270CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC285300315GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG
330345360TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC375390405GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT420435450CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTGGGTGACAAGATCAAAGTG465480495AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG510525540CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC555570585TATCCCGAGAGCAGCTCCGGGCGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG600615630CTCTACACGGTCGCGTTTTCGGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC645660675GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTACCTGATCTCTGCG(4)含有編碼α(L)-和β(L)-亞單位的核苷酸順序的(2)的DNA(L)片段,包括:
α(L)-亞單位的DNA順序:
153045ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC607590GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC105120135GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG150165180GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC195210225GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC240255270GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG285300315GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC330345360ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC375390405GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC420435450GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC465480495CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA510525540CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC555570585TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC600615ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC
β(L)-亞單位的DNA順序153045ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG607590ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG105120135CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG150165180TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG195210225CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG240255270ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA285300315CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG330345360ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA375390405CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG420435450GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC465480495TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT510525540GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC555570585ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC600615630GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG645660675AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCGGCC(5)重組DNA，包括載體中(1)-(4)的DNA(H)或DNA(L);
(6)用(5)的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株;
(7)生產(chǎn)腈水化酶的方法，該方法包括培養(yǎng)(6)所述轉(zhuǎn)化株，并由其培養(yǎng)物回收腈水化酶;
(8)生產(chǎn)酰胺的方法，該方法包括用(7)所述腈水化酶將腈水化成酰胺;
(9)生產(chǎn)酰胺的方法，該方法包括培養(yǎng)(6)所述轉(zhuǎn)化株并用生成的培養(yǎng)物將腈水化成酰胺，所述培養(yǎng)物系經(jīng)過分離的細(xì)菌細(xì)胞、其經(jīng)過處理的或其固定的材料。
本發(fā)明詳述如下。
本發(fā)明按以下(1)-(8)步驟進(jìn)行(1)腈水化酶的分離和純化及其部分氨基酸順序的編排由玫瑰色紅球菌J-1(FERMBP-1478)(CCTCCNo.M88091)(CGMCC0143)分離并純化H型和L型兩種腈水化酶，用HPLC將其分離為α和β亞單位。測定該兩種亞單位的部分氨基酸順序(圖1)。
(2)制備用于腈水化酶基因的DNA探針由于日本專利公報(bào)中所述的Rhodococcussp.N-774的腈水化酶β亞單位與玫瑰色紅球菌J-1之間的腈水化酶β亞單位在氨基酸順序上具有高度的同源性，因此由JP-A-2-119778/1990中所述的JM105/pYUK121(FERMBP-1937)制備DNA探針。含有由Rhodococcussp.N-774產(chǎn)生的腈水化酶基因的質(zhì)粒pYUK121是由JM105/pYUK121培養(yǎng)制備的。用SphI和SalⅠ消化pYUK121DNA。SphⅠ-SalⅠ片段含有Rhodococcussp.N-774的腈水化酶基因(圖2)。用放射性同位素標(biāo)記DNA片段。
(3)檢測含由玫瑰色紅球菌J-1的染色體產(chǎn)生的腈水化酶基因的DNA片段由玫瑰色紅球菌J-1的培養(yǎng)物制備染色體DNA后，用限制酶對其進(jìn)行消化，并按Southern雜交方法(Southern，E.M.，J.Mol.Biol，98，503，1975)將其與(2)所述探針雜交。篩選出不同長度的兩個DNA片段。
(4)重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒的構(gòu)建是將(3)所制備的染色體DNA片段插入質(zhì)粒載體。
(5)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株的轉(zhuǎn)化和篩選。
用(4)所述的重組質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)化株。按菌落雜交方法(R.BruceWallaceet.al.，Nuc.Aci.Res.9，879，1981)，用(2)所述探針選擇含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株，并再用Southern雜交方法確認(rèn)重組質(zhì)粒中是否存在腈水化酶基因。由此選出的質(zhì)粒命名為pNHJ10H和pNHJ20L。
(6)質(zhì)粒DNA的分離和純化以及限制性圖的構(gòu)建分離和純化(5)所制備的pNHJ10H和pNHJ20L的質(zhì)粒DNA，構(gòu)建DNA的限制性圖(圖3)，以測定含腈水化酶基因的區(qū)域。
(7)DNA順序的編排用適當(dāng)?shù)南拗泼盖谐迦朐趐NHJ10H和pNHJ20L中的DNA片段的多余片段，然后將插入的DNA片段用于順序編排。DNA片段的核苷酸順序(圖4和5)顯示其含有由(1)所述氨基酸順序推導(dǎo)得到的順序。
(8)用轉(zhuǎn)化株生產(chǎn)腈水化酶并將腈轉(zhuǎn)化為酰胺培養(yǎng)(8)所述的轉(zhuǎn)化株，將細(xì)菌細(xì)胞與作為腈水化酶底物的腈混合，生產(chǎn)酰胺。
玫瑰色紅球菌J-1保藏在日本工業(yè)科學(xué)技術(shù)廳發(fā)酵研究所(FERM)，保藏號為FERMBP-1478。含(5)所述pNHJ10H的轉(zhuǎn)化株TG1/pNHJ10H和含(5)所述pNHJ20L的轉(zhuǎn)化株TG1/pNHJ20L也都保藏在該所，保藏號分別為FERMBP-2777和FERMBP-2778。
任何載體都可用于本發(fā)明，包括質(zhì)粒載體(例如pAT153，pMP9，pHC624，pKC7等)和噬菌體載體(例如λgtll(Toyobo)，Charon4A(Amersham)等)。可用的酶包括SphI，SalI，SacI，BamHI和EcoRI等，它們均可通過商業(yè)途徑得到(TakaraShuao)。各種宿主都可用于轉(zhuǎn)化，包括但不限于大腸桿菌JM105和大腸桿菌TG1。用于轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)基系本領(lǐng)域常用的培養(yǎng)基。
將腈轉(zhuǎn)化酰胺是用腈水化酶，粗制腈水化酶和轉(zhuǎn)化株、分離的細(xì)菌細(xì)胞或其經(jīng)處理過的材料等的培養(yǎng)物，它們均由轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物制備。
本發(fā)明適用的腈如歐洲專利公報(bào)No.0307926中所述，包括在芳族部分具有4-10個碳原子的芳族腈和具有2-6個碳原子的脂族腈。所述腈的典型例子是4-，3-和2-氰基吡啶，芐腈，2，6-二氟芐腈，2-噻吩腈，2-糠腈，氰基吡嗪，丙烯腈，甲基丙烯腈，巴豆腈，乙腈和3-羥丙腈。
本發(fā)明已經(jīng)公開了由玫瑰色紅球菌J-1產(chǎn)生的兩種腈水化酶的α和β亞單位的氨基酸順序和核苷酸順序，插入表達(dá)載體編碼腈水化酶的DNA片段，重組載體用于轉(zhuǎn)化。與常規(guī)用的微生物相比，轉(zhuǎn)化株含有更多的基因拷貝數(shù)和產(chǎn)生更大量的腈水化酶。


如下圖1表示由玫瑰色紅球菌J-1產(chǎn)生的兩種腈水化酶的α和β亞單位的N端氨基酸順序;
圖2表示用作DNA探針的Rhodococcussp.N-774的腈水化酶基因的DNA順序;
圖3表示重組質(zhì)粒pNHJ10H和pNHJ20L的限制性圖;
圖4表示在由玫瑰色紅球菌J-1產(chǎn)生的pNHJ10H中的DNA片段的DNA順序推導(dǎo)得到的氨基酸順序。
圖5表示在由玫瑰色紅球菌J-1產(chǎn)生的pNHJ20L中的DNA片段的DNA順序和推導(dǎo)得到的氨基酸順序。
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例予以詳細(xì)說明，但決不是以此來限制本發(fā)明。
在實(shí)施例中使用了以下省略符號TETris-HCl(10mM，pH7.8)，EDTA(1mM，pH8.0)TNETris-HCl(50mM，pH8.0)，EDTA(1mM，pH8.0)，NaCl(50mM)STETris-HCl(50mM，pH8.0)，EDTA(5mM，pH8.0)，蔗糖(35mM)2×YT培養(yǎng)基1.6%胰蛋白胨，1.0%酵母膏，0.5%NaCl。
實(shí)施例(1)腈水化酶的分離和純化及其部分氨基酸順序的編排在28℃下，將玫瑰色紅球菌J-1在培養(yǎng)基中培養(yǎng)80小時。培養(yǎng)基含有酵母膏3g/l，KH2PO40.5g/l，K2HPO40.5g/l，MgSO4·4H2O 0.5g/l，CoCl20.01g/l和巴豆酰胺3g/l(pH7.0)。收集細(xì)菌細(xì)胞，取其50g用硫酸銨破碎和分級分離。將樣品進(jìn)行透析，并離心透析物。取其上清液裝載在DEAE-Cellulofine色譜、Octyl-Senharose

色譜、Phenyl-Sapharose CL-4B色譜和Sephadex G-150色譜上。收集和透析具有酶活性的兩部分，將透析物用反向柱裝載在HPLC(Senshu Pak VP-304-1251，Senshu Kagaku)，得到兩個亞單位(α和β)。用Applied Biosystems model 470A蛋白順序儀測定α(H)-，β(H)-，α(L)-和β(L)-亞單位的N端氨基酸順序。氨基酸順序示于圖1。
(2)用于腈水化酶基因的DNA探針的制備在30℃下將含pYUK121的大腸桿菌JM105(FERMBP-1937)培養(yǎng)在100ml含50μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(12小時)。收集細(xì)胞細(xì)胞，加入TNE，離心該細(xì)胞懸浮液。將8mlSTE和10mg溶菌酶加到細(xì)胞碎片沉淀物中，該混合物在0℃下溫育5分鐘后加入4ml0.25MEDTA，然后再在室溫下加入2ml的10%SDS和5ml的5MNaCl。生成的混合物在0-4℃下溫育3小時后進(jìn)行超速離心。以1/2體積的30%PEG6000加到上清液中，混合物在0-4℃下溫育過夜(12小時)后離心。然后將TNE加入細(xì)胞碎片沉淀物中，使體積達(dá)到7.5ml，再將CsCl加到懸浮液中。混合物經(jīng)離心去除蛋白質(zhì)。將300-500mg/ml溴乙錠加到上清液中，并將混合物轉(zhuǎn)移到離心管中，離心管經(jīng)熱封閉后進(jìn)行超速離心，并用蠕動泵抽提cccDNA。將略多于等量的水飽和異丙醇加到提取液中，去除溴乙錠。樣品經(jīng)TE透析，得到約3ml純化的pYUK121。
pYUK121 DNA用SphI和SalI消化，形成含由Rhodococcus sp.N-774產(chǎn)生的腈水化酶基因的2.07kb DNA片段。該片段用32P進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記，產(chǎn)生探針。探針的核苷酸順序示于圖2。
(3)含染色體腈水化酶基因的DNA片段的制備將玫瑰色紅球菌J-1培養(yǎng)在100ml培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有葡萄糖10g/l，KH2PO40.5g/l，K2HPO40.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨7.5g/l，CoCl20.01g/l，尿素7.5g/l，甘氨酸1%或氨芐青霉素0.2μg/ml，水11(pH7.2)。收集細(xì)菌細(xì)胞，細(xì)胞碎片經(jīng)TNE洗滌后懸浮于10ml TE中，加4ml 0.25M EDTA，10-20mg溶菌酶，10-20mg非染色體蛋白酶(achro-moprotease)和10ml 10×SDS。懸浮液在37℃下溫育3小時，再加15ml苯酚。該混合物在室溫下溫育15分鐘后離心。取上層將0.7ml的2.5M乙酸鈉和乙醚加到上清液中，然后再離心。潷去上層，向底層加二倍體積的乙醇，用玻璃棒取出DNA。該DNA依次用2∶8、1∶9和0∶10(V/V)的TE乙醇各沖洗5分鐘，然后再將DNA懸浮在2-4ml的TE(37℃)中。將10μl RNA酶A和T1的混合物加到懸浮液中，在37℃下溫育，加入等量苯酚，離心。將多于等量的乙醚加到上清液中，離心。離心后，潷去上層，底層用21含少量氯仿的TE透析過夜后，再用新鮮的TE透析3-4小時。得到4ml粘制染色體DNA。然后按如下所述對染色體DNA進(jìn)行酶消化將10μlTE，3μl反應(yīng)緩沖液(10X)和2μlSacI加到15μl粗制染色體DNA中，該混合物在37℃下溫育1小時后，在60V的瓊脂糖上電泳3小時，用(2)所述探針進(jìn)行染色體DNA的Southern雜交，得到約6.0kb和9.4kb片段，顯示雜交情況極其良好。
15ml的染色體DNA按如上所述用SacⅠ消化，在瓊脂糖上進(jìn)行電泳。從凝膠上切下6.0kb和9.4kb DNA片段后置于3倍體積的8M NaClO4中。經(jīng)加溶作用后，將各溶液點(diǎn)在GF/C(Whatman)濾紙(直徑6mm)上，再在濾紙上先后滴加10滴(≌100ml)含6M NaClO4的TE和10滴(≌10ml)95%乙醇。濾紙經(jīng)空氣干燥3分鐘后置于0.5ml Eppendorf管中，加40μl TE，在37℃下溫育30分鐘，離心。得到約40μl上清液，其中6.0kb和9.4kb DNA片段含有染色體DNA的腈水化酶基因。
按如下所述方法將6.0kbDNA片段插入載體中，以同樣方法將9.4KbDNA片段插入載體中。
(4)將染色體DNA片段插入載體將2μlSacⅠ、3μl反應(yīng)緩沖液(10X)和10μlTE加到10μl的pUC19DNA中，在30℃下溫育1小時，加2μl的0.25MEDTA，終止反應(yīng)。然后再加7μl1MTris-HCl(pH9)和3μlBAP(細(xì)菌堿性磷酸酶)，在65℃溫育1小時，將TE加到該混合物中，使總體積達(dá)到100μl，再用等量苯酚提取3次，在提取液中加等量的醚。取出底層，將10μl3M乙酸鈉和250μl乙醇加到該底層液中，在-80℃下溫育30分鐘，離心，干燥。再懸浮在TE中。
將由此得到的5μlpUC19DNA與(3)所述40μl的6.0kbDNA片段混合后，加入6μl連接緩沖液、6μlATP(6mg/ml)和3μlT4DNA連接酶。該混合物在4℃溫育過夜(12小時)，產(chǎn)生的重組質(zhì)粒含有編碼pUC19的SacⅠ位點(diǎn)上所需酶的6.0kbDNA片段。
(5)轉(zhuǎn)化株的轉(zhuǎn)化和篩選將大腸桿菌TG1(Amersham)接種到10ml的2×YT培養(yǎng)基后，在37℃下溫育12小時。溫育后，將生成的培養(yǎng)物加到濃度為1%的新鮮的2×YT培養(yǎng)基中，該混合物在37℃下溫育2小時后離心，將碎片沉淀物懸浮在5ml冷卻的50mM CaCl2中。懸浮液在冰上下放置40分鐘后離心，再將0.25ml冷卻的50mM CaCl2和60μl的按(4)所述的重組DNA加到碎片沉淀物中。該混合物在0℃下溫育40分鐘，在42℃下熱休克2分鐘，置于冰上5分鐘，然后將其加到10ml的2×YT培養(yǎng)基中，在37℃搖動培育90分鐘，離心。將碎片沉淀物懸浮在1ml 2×YT培養(yǎng)基中，取10μl懸浮液兩份分別置于含50μg/ml氨芐青霉素的2×YT瓊脂板上，在37℃下溫育。用菌落雜交方法挑選生長在瓊脂板上的菌落，將菌落轉(zhuǎn)移到硝基纖維濾膜上進(jìn)行消化。將DNA固定在濾膜上并與(2)所述探針雜交，濾膜經(jīng)放射自顯影后，選出重組菌落，再按Southern雜交方法確認(rèn)轉(zhuǎn)化株中是否存在腈水化酶基因。
(6)重組質(zhì)粒的分離和純化以及插入DNA片段限制性圖的構(gòu)建在37℃下將按(5)選擇的轉(zhuǎn)化株在100ml含50μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(12小時)，收集細(xì)菌細(xì)胞，并將TNE加到細(xì)胞中。再離心收集細(xì)胞，并將8mlSTE和10mg溶菌酶加到細(xì)胞中。該混合物在0℃下溫育5分鐘后，加入4ml的0.25MEDTA、2ml的10%SDS(室溫)和5ml的5MNaCl，在0-4℃下溫育3小時后進(jìn)行超速離心。將1/2體積的30%PEG6000加到上清液中，在0-4℃下溫育過夜(12小時)，再進(jìn)行離心。將TNE加到碎片沉淀物中，使體積達(dá)高至7.5ml。將CsCl加到懸浮液中，除去蛋白質(zhì)。然后將300-500mg/ml溴化錠加到上清液中，并將混合物轉(zhuǎn)移到離心管中，離心管經(jīng)熱密封后進(jìn)行超速離心。用蠕動泵移取cccDNA，加入略多于等量的水飽和異丙醇，以除去溴化錠。DNA樣品經(jīng)TE透析，生成約3ml純化的重組DNA。由此得到的重組質(zhì)粒，含有6.7kbDNA片段，命名為pNHJ10H(重組質(zhì)粒含有9.4kbDNA片段，命名為pNHJ20L)。
上述質(zhì)粒DNA用EcoRI、BamHI，PstⅠ，SacⅠ和SalⅠ消化。構(gòu)建的限制性圖示于圖3。
(7)DNA順序的編排根據(jù)構(gòu)建的限制性圖和Southern雜交方法，測定腈水化酶基因在pNHJ10H的片段中的位置。用PstI和SalI切下pNHJ10H中的多余部分即在1.97Kb中形成的6.0KbDNA片段。并且EcoRI和SacI切下pNHJ20L中的多余部分即在1.73Kb中形成的9.4KbDNA片段。
采用Sanger方法(Sanger，F(xiàn).，Science2141205-1210，1981)和M13噬菌體載體，將上述DNA片段編排順序。1.97KbDNA片段(pNHJ10H)和1.73KbDNA片段(pNHJ20L)的核苷酸順序分別示于圖4和5。
由核苷酸順序推導(dǎo)得到的氨基酸順序與(1)所測定的氨基酸順序完全一致。順序分析還證明，該DNA片段含有編碼α和β亞單位的順序。
(8)用轉(zhuǎn)化株生產(chǎn)腈水化酶并用該酶將腈轉(zhuǎn)化為酰胺將TG 1/pNHJ10H和TG l/pNHJ20L接種到10ml含50μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，于30℃下溫育過夜(12小時)。將1μl生成的培養(yǎng)物加到100ml的2×YT培養(yǎng)基中(50μg/ml氨芐青霉素，0.1g CoCl2·6H2O/l)。該混合物在30℃下溫育4小時，將IPTG加到該合物中，使其最終濃度為1mM，再在30℃下溫育10小時。將細(xì)胞收集后，懸浮在5ml的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中。懸浮液經(jīng)超聲波破碎5分鐘，在12000×g下離心30分鐘。生成的上清液用于酶測定。酶測定是在含50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)、6mM芐腈和適量酶的反應(yīng)混合物(12ml)中進(jìn)行的。該反應(yīng)在20℃下進(jìn)行30分鐘，加0.2ml的1 M HCl使反應(yīng)終止。通過HPLC測定反應(yīng)混合物中形成的苯甲酰胺的量。按上述同樣方法但用由大腸桿菌TG1得到的混合物用作對照。當(dāng)培養(yǎng)在有CoCl2和IPTG存在下的2×YT培養(yǎng)基中時，在含pNHJ10H和pNHJ20L的大腸桿菌無細(xì)胞提取液中腈水化酶活性分別為1.75×10-3和6.99×10-3單位/毫克。在TG l/pNHJ10H和pNHJ20L的反應(yīng)混合物中獲得了苯甲酰胺，而在TG1反應(yīng)混合物中則無苯甲酰胺。
權(quán)利要求
1.編碼具有腈水化酶活性的多肽的DNA(H)片段，所述多肽含有下列氨基酸順序的α(H)-和β(H)-亞單位α(H)-亞單位5 10 15MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr20 25 30LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro35 40 45AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly50 55 60ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro65 70 75GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla80 85 90SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal95100105PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys110115120SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr125 130135LysSerMettGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly140145150ValLeuLysArgAspPheGlyPheAsplleProAspGluValGlu155160165ValArgValTrpAspSerSerSerGlulleArgTyrIleVallle170175180ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu185190195ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla200LeuThrProGlnGlnValIleValβ(H)-亞單位5 10 15MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro20 25 30ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu35 40 45GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle5055 60SerTrpTrpAspLySerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn65 70 75GluAsnTyrValAsnGluLleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp80 85 90LerSerAlaAlaGluArglleLcuValAlaAspLysLielleThr95100105GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluLieLeuGluGlyArg110115120TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnlle125130135GluLysAlalleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu140145150ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLyslleLysVal155160165LysSerMetAsnProleuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal170175180ArgAsnLyslleGlyGlulleValAlaTyrHisGlyCysGlnlle185190195TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro200205210LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp215220225GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyrLeuLlSerSla
2.編碼具有腈水化酶活性的多肽的DNA(L)片段，所述多肽含有下列氨基酸順序的α(L)-和β(L)亞單位α(L)-亞單位5 10 15MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn20 25 30GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal35 40 45AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer50 55 60ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal65 70 75AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr80 85 90AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln95 100 105GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn110 115 120MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu125 130 135GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg140 145 150AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr155 160 165ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu170 175 180LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn185 190 195PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu200 205IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAlaβ(L)-亞單位:5 10 15MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro20 25 30IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu35 40 45ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla50 55 60PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro65 70 75HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla80 85 90MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu95 100 105LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr110 115 120ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln125 130 135LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu140 145 150AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla155 160 165SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg170 175 180ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp185 190 195ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr200 205 210ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro215 220 225AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuProAla
3.按權(quán)利要求1的DNA(H)片段，其含有α(H)-和β(H)-亞單位的核苷酸順序，包括α(H)-亞單位的DNA順序15 30 45GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC60 75 90AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC105 120 135GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC150 165 180CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT195 210 225GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG240 255 270TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC285 300 315TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT330 345 360TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC375 390 405AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA420 435 450GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG465 480 495GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC510 525 540CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG555 570 585ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG600CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA和β(H)-亞單位的DNA順序15 30 45ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG60 75 90GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG105 120 135GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA150 165 180TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC195 210 225GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG240 255 270CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC285 300 315GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGACATCCTTGAGGGTCGG330 345 360TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC375 390 405GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT420 435 450CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG465 480 495AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG510 525 540CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC555 570 585TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG600 615 630CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC645 660 675GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTACCTGATCTCTGCG
4.按權(quán)利要求2的DNA(L)片段，其含有α(L)-和β(L)-亞單位的核苷酸順序包括α(L)-亞單位的DNA順序15 30 45ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC60 75 90GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC105 120 135GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG150 165 180GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC195 210 225GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC240 255 270GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG285 300 315GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC330 345 360ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC375 390 405GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC420 435 450GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC465 480 495CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA510 525 540CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC555 570 585TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC600 615ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC和β(L)-亞單位的DNA順序15 30 45ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG60 75 90ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG105 120 135CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG150 165 180TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG195 210 225CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG240 255 270ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA285 300 315CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG330 345 360ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA375 390 405CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG420 435 450GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC465 480 495TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT510 525 540GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC555 570 585ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC600 615 630GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG645 660 675AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCGGCC
5.重組DNA，包括在載體中的權(quán)利要求1-4的DNA(H)或DNA(L)。
6.用權(quán)利要求5的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株。
7.生產(chǎn)腈水化酶的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化株和由該培養(yǎng)物回收腈水化酶。
8.生產(chǎn)酰胺的方法，該方法包括用由權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)物得到的腈水化酶將腈水化。
9.生產(chǎn)酰胺的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化株和用其生成的培養(yǎng)物、分離的細(xì)菌細(xì)胞、以及其經(jīng)過處理的材料，或其固定的材料，將腈水化為酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了由玫瑰色紅球菌J-1產(chǎn)生的兩種腈水化酶的α-和β-亞單位的氨基酸順序和核苷酸順序。將編碼腈水化酶的DNA片段插入表達(dá)載體并將該重組載體用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株與常規(guī)用的微生物相比含有基因的更多拷貝和能生產(chǎn)更大量的腈水化酶。
文檔編號C12N9/34GK1054616SQ9110132
公開日1991年9月18日 申請日期1991年2月28日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月28日
發(fā)明者別府輝彥, 山田秀明, 長澤透, 堀之內(nèi)末治, 西山真 申請人:日東化學(xué)工業(yè)株式會社, 別府輝彥, 山田秀明