專(zhuān)利名稱(chēng)：表達(dá)人蛋白c糖基化突變體的載體和化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼新酶原型人蛋白C的新DNA化合物和重組DNA克隆載體。這些酶經(jīng)原基因工程改造后，其糖基化作用方式與野生型人蛋白C酶原相比完全不同。糖基化作用，特別是當(dāng)糖類(lèi)部分含唾液酸水平較高時(shí)，可在蛋白質(zhì)分泌和功能方面起重要作用。本發(fā)明的新酶原已經(jīng)構(gòu)建，因此每一個(gè)糖基化作用位點(diǎn)都已分別改變。所述表達(dá)載體提供了在重組寄主細(xì)胞中表達(dá)這些人蛋白C酶原的簡(jiǎn)單而有效的方法。本發(fā)明提供產(chǎn)生酶原型人蛋白C方法，所述酶原型人蛋白C經(jīng)活化后，具有比天然形式更高的酰胺解活性和抗凝活性。所述新酶原型人蛋白C在各種糖基化作用位點(diǎn)的氨基酸殘基順序上不同于本領(lǐng)域已知的順序。這些新酶原型蛋白C在治療涉及凝固的血液障礙方面有特別的優(yōu)點(diǎn)。
蛋白C是一種依賴(lài)于維生素K的血漿蛋白，在控制止血作用方面具有重大的生理作用。蛋白C作為一個(gè)無(wú)活性分子被合成，此處稱(chēng)之為“初生蛋白C”。初生蛋白C經(jīng)復(fù)雜的處理，產(chǎn)生很多不同的無(wú)活性分子。如同下面所作出的更加充分的敘述。此處將蛋白C的無(wú)活性分泌形式稱(chēng)作為“酶原蛋白C”。在血液中，通過(guò)涉及凝血調(diào)變蛋白一凝血酶復(fù)合物的反應(yīng)，發(fā)生蛋白C的活化作用。經(jīng)活化的蛋白C及其輔助因子蛋白S一起，是一種具有重要生理學(xué)意義的抗凝劑?；罨牡鞍證能防止血管內(nèi)血栓癥，并控制原有血塊的擴(kuò)大?；罨问降鞍證的作用機(jī)理以及無(wú)活性酶原活化成活性蛋白酶的機(jī)理在近些年內(nèi)已被闡明(文獻(xiàn)綜述見(jiàn)J.E.Gardiner and J.H.Griffin，Progress in Hematology，Vol.ⅩⅢ，PP.265-278，ed.Elmer B.Brown，Grune and Stratton，Inc，1983和Esmon，N.L.，1989，Prog.Hemost.Thromb.929-55)。
蛋白C的活化作用涉及凝血酶、凝血鏈鎖反應(yīng)最終的絲氨酸蛋白酶、以及稱(chēng)之為凝血調(diào)變蛋白的與內(nèi)皮細(xì)胞膜相聯(lián)的糖蛋白。凝血調(diào)變蛋白與凝血酶形成一個(gè)牢固緊密的化學(xué)計(jì)量復(fù)合物。當(dāng)凝血調(diào)變蛋白與凝血酶復(fù)合時(shí)，顯著地改變了凝血酶的功能性質(zhì)。在正常情況下，凝血酶將纖維蛋白原凝成塊，使血小板活化，并將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉(zhuǎn)變成它們的活化形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶使蛋白C活化，但是很慢，效能不高，而且該活化作用進(jìn)一步受到生理Ca2+的抑制。相反，與凝血調(diào)變蛋白復(fù)合的凝血酶并不使纖維蛋白原凝成塊，不使血小板活化，或不將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉(zhuǎn)變成它們的活化相應(yīng)物Ⅴa和Ⅷa，但是在生理Ca2+的存在下卻成為非常有效的蛋白C酶原的活化劑。通過(guò)凝血調(diào)變蛋白-凝血酶活化蛋白C酶原的速率常數(shù)比單獨(dú)用凝血酶時(shí)高1000倍以上。
為了了解活化蛋白C如何下調(diào)血液凝固，下面對(duì)凝固酶系統(tǒng)進(jìn)行簡(jiǎn)略的敘述。最好把凝固系統(tǒng)作為包括各酶原依次連續(xù)活化成為各種活性的絲氨酸蛋白酶的鏈鎖反應(yīng)來(lái)考察。該鏈鎖反應(yīng)最終產(chǎn)生凝血酶，它經(jīng)過(guò)有限的蛋白分解，將血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的凝膠纖維蛋白。在凝固鏈鎖反應(yīng)中，兩件關(guān)鍵的事情是一、通過(guò)凝血因子Ⅸa使凝血因子Ⅹ轉(zhuǎn)變成Ⅹa;二、通過(guò)凝血因子Ⅹa，使凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶。這兩種反應(yīng)在細(xì)胞表面發(fā)生，最顯著地在血小板表面，同時(shí)兩種反應(yīng)均需輔助因子。主要的輔助因子(因子Ⅴ和Ⅷ)在系統(tǒng)中作為相應(yīng)的無(wú)活性前體流通，但當(dāng)開(kāi)頭幾個(gè)凝血酶分子形成時(shí)，凝血酶便返回來(lái)通過(guò)有限的蛋白分解使輔助因子活化。被活化的輔助因子Ⅴa和Ⅷa加速了凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶，也加速了因子Ⅹ轉(zhuǎn)變成因子Ⅹa，速率大約提高5個(gè)數(shù)量級(jí)。活化蛋白C優(yōu)先作用于蛋白的降解和水解，并不可逆地破壞凝血輔助因子Ⅴa和Ⅷa(無(wú)活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式)。反之，凝血因子Ⅴ和Ⅷ在體內(nèi)對(duì)活化的蛋白C來(lái)說(shuō)是非常差的底物。
活化蛋白C的一個(gè)重要輔助因子是蛋白S，它是另一種依賴(lài)維生素K的血漿蛋白。蛋白S使活化蛋白C介導(dǎo)的因子Ⅴa和Ⅷa的水解增加25倍。
蛋白C被公認(rèn)為一種有價(jià)值的治療劑(例如1988年10月4日公開(kāi)的見(jiàn)Bang等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4，775，625，此處作為參考文獻(xiàn))。經(jīng)活化的蛋白C是一種比常用的抗凝劑(如肝素及口服羥基香豆精抗凝劑)具有更大治療指數(shù)的新抗血栓劑，在凝血酶再生之前，酶原蛋白C和活化蛋白C兩者均無(wú)效，因?yàn)閷⒛蜃英鹾廷D(zhuǎn)變成Ⅴa和Ⅷa需要凝血酶;這兩種輔助因子的活化形式對(duì)活化蛋白C來(lái)說(shuō)是較好的底物。活化酶原蛋白C時(shí)也需要凝血酶，因?yàn)闆](méi)有凝血調(diào)變蛋白-凝血酶復(fù)合物，蛋白C酶原是不能有效地轉(zhuǎn)變成其活性相應(yīng)物的。
活化蛋白C是一種符合要求的抗凝劑，因?yàn)榛罨鞍證是通過(guò)使輔助因子Ⅴa和Ⅷa失活而起作用的。因?yàn)橐蜃英跫阿D(zhuǎn)變成它們的活化的相應(yīng)物Ⅴa和Ⅷa時(shí)需要凝血酶，蛋白C僅僅在凝血酶再生之后才起到抗凝劑作用。與活化蛋白C相反，常規(guī)的抗凝劑只要給予病人在整個(gè)循環(huán)中維持恒定的抗凝狀態(tài)，因此，大大增加了并發(fā)出血癥的危險(xiǎn)，這種危險(xiǎn)性超過(guò)了蛋白C或活化蛋白C所引起的危險(xiǎn)性。所以，活化蛋白C是一種符合要求的、在臨床上廣泛作為肝素和羥基香豆精的代用品使用的抗凝劑。
在某些疾病狀態(tài)中(例如遺傳性的蛋白C缺乏)，蛋白C酶原具有重大治療意義。在先天性純合(homozgous)蛋白C缺乏情況下，患者在童年早期因暴發(fā)性紫癜而死亡，這是一種常見(jiàn)的彌散性血管內(nèi)凝血異常致死形式。在雜合(heterozygous)蛋白C缺乏情況下，患者忍受劇烈的周期性的血栓栓塞發(fā)作。臨床上充分證實(shí)設(shè)計(jì)用來(lái)治療血友病B或凝血因子Ⅸ缺乏的血漿蛋白濃縮物(含蛋白C作為雜質(zhì))，對(duì)防治雜合蛋白C缺乏的血管內(nèi)凝塊有作用。在血栓狀態(tài)下(如彌散性血管內(nèi)凝固)以及在易發(fā)生血栓病的狀態(tài)下(如嚴(yán)重創(chuàng)傷，大外科手術(shù)和癌癥)，也已注意到蛋白C的濃度出現(xiàn)反常的偏低。
為了能對(duì)本發(fā)明蛋白C活化作用的理解，下面給出初生人蛋白C的編碼順序及相應(yīng)的氨基酸殘基順序。該氨基酸殘基順序及其相關(guān)部分也表示出“天然蛋白C”的特性。
其中A為脫氧腺苷酸，G為脫氧鳥(niǎo)苷酸、C為脫氧胞苷酸，T為胸苷酸，ALA為丙氨酸，ARG為精氨酸，ASN為天冬酰胺，ASP為天冬氨酸，-COOH為羧基端，CYS為半胱氨酸，GLN為谷氨酰胺，GLU為谷氨酸，GLY為甘氨酸，HIS為組氨酸，H N-為氨基端，ILE為異亮氨酸，LEU為亮氨酸，LYS為賴(lài)氨酸，MET為甲硫氨酸，PHE為苯丙氨酸，PRO為脯氨酸，SER為絲氨酸，THR為蘇氨酸，TRP為色氨酸，TYR為酪氨酸及VAL為纈氨酸。
上面給出的DNA順序得自由編碼人蛋白C的人肝mRNA制備的cDNA克隆。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會(huì)意識(shí)到由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性會(huì)使人們構(gòu)建出許多編碼同一種氨基酸殘基順序的不同DNA順序，因此上面給出的初生人蛋白C的cDNA順序僅僅是許多可能的人蛋白C的編碼順序中的一種。在構(gòu)建cDNA克隆時(shí)，將5′poly G順序、3′poly C順序以及5′和3′Pst Ⅰ限制性酶識(shí)別順序構(gòu)建在編碼蛋白C的cDNA順序的兩端。將這些cDNA克隆的兩個(gè)進(jìn)行操作以構(gòu)建一個(gè)DNA分子，它既含有初生人蛋白C的編碼順序又含有編碼編碼區(qū)的5′和3′端不轉(zhuǎn)譯的mRNA的DNA部分。將該DNA分子插入質(zhì)粒pBR322的Pst Ⅰ位點(diǎn)，以構(gòu)建質(zhì)粒pHC7。因此質(zhì)粒pHC7既含有上面所示的編碼順序，又分別在所述初生人蛋白C編碼順序的編碼鏈的5′和3′端含有以下附加順序(也只給出分子的一條鏈)
由于DNA堿基對(duì)的互補(bǔ)性質(zhì)，雙鏈DNA分子的一條鏈的順序足以確定相對(duì)鏈的順序。質(zhì)粒pHC7可按常規(guī)方法從E.coli K12 RR1/pHC7菌株中分離，該菌株已保藏在北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(the Northern Regional Research Laboratory(NRRL)，Peoria Illinois)并成為NRRL保藏永久性原種培養(yǎng)物的一部分。E.coli K12 RR1/pHC7可以從NRRL得到，保藏號(hào)為NRRL B-15926。質(zhì)粒pHC7的限制性位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖2。
初生蛋白C也可圖解說(shuō)明如下
pre-pro-初生人蛋白C的氨基酸殘基1-42，它編碼人蛋白C的信號(hào)肽及前肽，對(duì)指導(dǎo)蛋白C的分泌和r-羧基化十分重要。
LC-初生蛋白C的氨基酸殘基43-197，它一旦經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾，就構(gòu)成雙鏈酶原(由單鏈酶原除去KR二肽而形成，如下所討論)和活化形式蛋白C的輕鏈(LC)。
KR-初生人蛋白C的氨基酸殘基198-199;這些殘基確信要被除去(基于與牛蛋白C的同源性)，可能通過(guò)包括先裂解(在殘基197-198之間或在199-200之間)然后與羧肽酶或氨酞酶作用形成雙鏈蛋白C的兩步程序。
AP-初生蛋白C的氨基酸殘基200-211，它構(gòu)成活化肽，它從蛋白C的酶原形中除去后便得到活化蛋白C。
AHC-初生蛋白C的氨基酸殘基212-461，一旦經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾，組成活化蛋白C的活化重鏈(AHC)。
HC-蛋白C酶原的二鏈形式的重鏈，一旦經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾，組成氨基酸殘基200-461，即AP和AHC。
人蛋白C酶原是在肝中合成的絲氨酸蛋白酶前體，并存在于血液中以表達(dá)完整的生物活性，蛋白C需要進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后的修飾，該修飾過(guò)程需要維生素K。雙鏈的、由二硫鍵連接的蛋白C酶原，由一個(gè)單鏈酶原通過(guò)限制性蛋白水解作用而產(chǎn)生。這種限制性蛋白水解作用被確信包括裂解和除去。將該雙鏈酶原活化成活性絲氨酸蛋白酶的過(guò)程包括ARG-LEU肽鍵(殘基211和212)的蛋白水解裂解。后一裂解釋放出構(gòu)成雙鏈酶原分子較大鏈(重鏈)氨基末端的十二肽(殘基200-211)，即活化肽。蛋白C受到明顯地糖基化作用，血漿中成熟的酶含約15-23%碳水化合物。蛋白C也含有若干不平常的氨基酸，包括r-羥基谷氨酸和β-羥基天冬氨酸(赤-L-β羥基天冬氨酸)。r-羧基谷氨酸(gla)由谷氨酸殘基經(jīng)r-谷氨酰基羧化反應(yīng)而形成，該反應(yīng)借助于需要維生素K作為輔助因子的肝微粒體羧化酶。
人蛋白C的活化作用也能用圖解表示并說(shuō)明如下。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該明白，圖解中所示的步驟順序不一定反映體內(nèi)途徑的步驟順序。
pre-pro-LC-KR-AP-AHC初生蛋白C
本發(fā)明提供新的化合物、載體、轉(zhuǎn)化體和重組表達(dá)新蛋白C酶原的方法。
為了本發(fā)明的目的，在此處所公開(kāi)的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，下列術(shù)語(yǔ)定義如下。
Ad2LP表示腺病毒-2的較大晚期啟動(dòng)子。
本發(fā)明描述的蛋白質(zhì)或肽鏈中的氨基酸殘基縮寫(xiě)如下三字母縮寫(xiě) 氨基酸殘基 一字母縮寫(xiě)PHE 苯丙氨酸 F
LEU 亮氨酸 LILE 異亮氨酸 IMET 甲硫氨酸 MVAL 纈氨酸 VSER 絲氨酸 SPRO 脯氨酸 PTHR 蘇氨酸 TALA 丙氨酸 ATYR 酪氨酸 YHIS 組氨酸 HGLN 谷氨酰胺 QASN 天冬氨酰胺 NLYS 賴(lài)氨酸 KASP 天冬氨酸 DGLU 谷氨酸 ECYS 半胱氨酸 CTRP 色氨酸 WARG 精氨酸 RGLY 甘氨酸 GApR-抗氨芐青霉素表型或授予該表型的基因。
BK-得自BK病毒的DNA。
Enh或增強(qiáng)子-BK病毒的增強(qiáng)子。
ep或SV40ep-含有T-抗原基因的SV40早期啟動(dòng)子、T-抗原結(jié)合位點(diǎn)、SV40增強(qiáng)子和SV40復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。
r-羧化反應(yīng)-在谷氨酸r碳原子上加上一個(gè)羧基的反應(yīng)。
r-羧化蛋白-某些谷氨酸殘基已經(jīng)過(guò)羧基化的蛋白。
GBMT轉(zhuǎn)錄單位-一種修飾性轉(zhuǎn)錄控制單位，包括在空間上緊靠腺病毒較大晚期啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元素上游的BK病毒P2增強(qiáng)子、腺病毒-2較大晚期啟動(dòng)子、一種定位激活所述啟動(dòng)子的poly-GT元素和一種含有腺病毒拼接三重先導(dǎo)順序的DNA順序。GBMT轉(zhuǎn)錄單位是在質(zhì)粒pGT-h的約900個(gè)堿基對(duì)的HindⅢ限制性片段上。
IVS-編碼內(nèi)涵子的DNA，也稱(chēng)間插順序。
MMTpro-小鼠金屬硫因-I基因的啟動(dòng)子。
初生蛋白-未經(jīng)任何轉(zhuǎn)譯后修飾剛從mRNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的多肽。然而諸如谷氨酸殘基的r-羧基化以及天冬氨酸殘基的羥基化這樣的轉(zhuǎn)譯后修飾可以在蛋白從mRNA轉(zhuǎn)錄本全部被轉(zhuǎn)譯之前發(fā)生。
NeoR-一種新霉素抗性授予基因，該基因也可用于授予對(duì)抗生素G418的抗性。
pA-編碼多聚腺苷酸信號(hào)的DNA順序。
啟動(dòng)子-引導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA順序。
蛋白C的活性-人蛋白C的任何性質(zhì)蛋白水解，酰胺解，酯解以及生物(抗凝固或纖維蛋白溶解)活性。測(cè)定蛋白抗凝活性的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，參見(jiàn)文獻(xiàn)(Grinnell等，1987，Biotechnology 51189)。
重組DNA克隆載體-包括(但不限于)染色體整合試劑、自主復(fù)制質(zhì)粒和噬菌體在內(nèi)的任何試劑，它包含一個(gè)可以添加或已經(jīng)添加了一個(gè)或幾個(gè)DNA片段的DNA分子。
重組DNA表達(dá)載體-啟動(dòng)子已被摻入并已定位驅(qū)動(dòng)基因產(chǎn)物表達(dá)的任何重組DNA克隆載體。
重組DNA載體-任何重組的DNA克隆或表達(dá)載體。
復(fù)制子-控制并允許質(zhì)?；蚱渌d體自主復(fù)制的DNA順序。
限制性片段-由一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶的作用而產(chǎn)生的任何線(xiàn)性DNA順序。
敏感型寄主細(xì)胞-沒(méi)有DNA片段授予其抗性就不能在一定的抗生素或其它毒性化合物存在下生長(zhǎng)的寄主細(xì)胞。
TcR-抗四環(huán)素表型或授予該抗性的基因。
轉(zhuǎn)化作用-將DNA引入受納寄主細(xì)胞從而改變受納寄主細(xì)胞的基因型。
轉(zhuǎn)化體-經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的受納寄主細(xì)胞。
轉(zhuǎn)譯活化順序-包括編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)譯起始密碼子(如5′-ATG-3′)的任何DNA順序，它使mRNA轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)譯成肽或多肽。
酶原-蛋白水解酶的無(wú)酶活性的前體。此處所用蛋白C酶原是指蛋白C的分泌的、無(wú)活性形式，無(wú)論是單鏈還是雙鏈。


圖1是質(zhì)粒pLPC-Q097的限制性位點(diǎn)和功能圖譜。為本發(fā)明公開(kāi)之目的，這些圖沒(méi)有嚴(yán)格按比例畫(huà)出。
圖2是質(zhì)粒pLPC-Q248的限制性位點(diǎn)和功能圖譜。
圖3是質(zhì)粒pLPC-Q313的限制性位點(diǎn)和功能圖譜。
圖4是質(zhì)粒pLPC-Q329的限制性位點(diǎn)和功能圖譜。
圖5是質(zhì)粒pGTC的限制性位點(diǎn)和功能圖譜。
圖6是質(zhì)粒pGT-d的限制性位點(diǎn)和功能圖譜。
圖7是質(zhì)粒pGT-h的限制性位點(diǎn)和功能圖譜。
本發(fā)明提供編碼表達(dá)新酶原形式的人蛋白C的DNA化合物。文獻(xiàn)(見(jiàn)Bang等人的美國(guó)專(zhuān)利4，775，624，1988年10月4日公開(kāi)，和歐洲專(zhuān)利公開(kāi)215548，系本文參考文獻(xiàn))中已描述了一些產(chǎn)生天然人蛋白C酶原和天然人蛋白C的若干方法。這些先有技術(shù)方法提供了表達(dá)在氨基酸順序上與人血液中存在的酶原形式?jīng)]有差別的酶原型人蛋白C的方法。當(dāng)在某種真核細(xì)胞系如人腎293細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)天然人蛋白C酶原以一種新的糖基化形式分泌，它不同于人血液中的酶原形式。
本發(fā)明提供具有改變的糖基化作用方式的酶原形式人蛋白C，這種改變的糖基化作用方式是由于在氨基酸殘基順序上直接定位突變而造成的。當(dāng)這些酶原被活化時(shí)，與天然人蛋白C相比增加了酰胺解活性和抗凝活性。本發(fā)明還提供了DNA化合物、重組DNA表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系和重組表達(dá)這些新酶原形式人蛋白C的方法。產(chǎn)生這些酶原形式人蛋白C的方法包括(A)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化一種真核寄主細(xì)胞，所述載體包括(ⅰ)編碼一種氨基酸殘基順序的DNA順序，所述氨基酸殘基順序從氨基端到羧基端包括以下的氨基酸殘基順序
其中R1選自ASN和GLN，R2選自ASN和GLN，R3選自ASN和GLN，R4選自ASN和GLN;和(ⅱ)位驅(qū)動(dòng)所述DNA順序表達(dá)的啟動(dòng)子。
(B)將步驟(A)中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)在適宜于所述DNA順序表達(dá)的條件下;
(C)從所述培養(yǎng)物中回收所述蛋白C酶原。該方法及該方法中所用的化合物詳述如下。
本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生這些新酶原型蛋白C方法的DNA化合物。這些化合物都編碼含有指導(dǎo)分泌的信號(hào)肽的前肽和得自γ-羧基化(通過(guò)依賴(lài)于維生素K的γ-羧化酶的作用)的蛋白質(zhì)的前肽。這類(lèi)前肽順序在本領(lǐng)域內(nèi)已眾所周知，例如見(jiàn)文獻(xiàn)(Suttie et al.，1987，Proc、Natl、Acad、Sci、84634-637)。為優(yōu)選和構(gòu)建方便，信號(hào)肽編碼順序和前肽編碼順序都將得自γ-羧基化蛋白的前肽的氨基酸殘基順序。這類(lèi)γ-羧基化蛋白的實(shí)例包括(但不限于)因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原、蛋白S、蛋白Z和蛋白C。編碼人蛋白C前肽的DNA順序最為優(yōu)選地用于本發(fā)明的載體。
本發(fā)明的DNA化合物進(jìn)一步包括人蛋白C輕鏈的編碼順序，該順序在轉(zhuǎn)譯讀碼框中緊挨著前肽編碼順序的下游。人蛋白C的輕鏈含有初生蛋白C的氨基酸殘基43到197，如前面背景部分所述，依賴(lài)維生素K的血漿蛋白質(zhì)的氨基端部分如蛋白質(zhì)C輕鏈的氨基端部分具有鈣結(jié)合位點(diǎn)。這些血漿蛋白質(zhì)的鈣結(jié)合區(qū)域如因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原和蛋白S可以以與人蛋白C輕鏈的鈣結(jié)合區(qū)域相當(dāng)?shù)姆绞绞褂?見(jiàn)歐洲專(zhuān)利公告0215548A1號(hào)第12和13頁(yè))。在本發(fā)明的一種新酶原形式(Q097)中，輕鏈中139位的天冬酰胺殘基改成谷氨酰胺殘基，由此除去了糖基化作用位點(diǎn)。
本發(fā)明的DNA化合物進(jìn)一步包括位于輕鏈編碼順序轉(zhuǎn)譯讀碼框內(nèi)在輕鏈順序下游與之緊接的二肽LYS-ARG(KR)的編碼順序。二元堿性二肽如LYS-ARG位于初生蛋白輕鏈的羧基端。LYS-ARG二肽在蛋白質(zhì)表達(dá)中的取向與本發(fā)明無(wú)關(guān)。就本發(fā)明的目的而言，二元堿性二肽如LYS-LYS或ARG-ARG與二肽LYS-ARG相當(dāng)。然而，就本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選LYS-ARG，這是天然人蛋白C中的二肽。
LYS-ARG二肽的密碼子的下游緊接著是活化肽編碼順序。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會(huì)意識(shí)到本發(fā)明的酶原和天然人蛋白C酶原的主要區(qū)別如下所述。
除了輕鏈139位的取代，其它的氨基酸取代也可提高所得酶原的酰胺解和抗凝固活性。術(shù)語(yǔ)“所得酶原”用于指盡管已參照初生人蛋白C中氨基酸的位置描述了取代作用，但初生蛋白C必須首先分泌出來(lái)(除去第1～42個(gè)氨基酸殘基后)才得到酶原形式。在初生人蛋白C139位用谷氨酰胺殘基取代天冬酰胺殘基產(chǎn)生了本發(fā)明的新酶原。在290、355或371的任一位置，用谷氨酰胺殘基(在活化的重鏈中)取代天冬酰胺都可產(chǎn)生本發(fā)明的新酶原。
因此，本發(fā)明優(yōu)選的新酶原形式人蛋白C得自氨基酸殘基順序如下的初生人蛋白C分子的分泌和加工
其中R1選自ASN和GLN，R2選自ASN和GLN，R3選自ASN和GLN，R4選自ASN和GLN。
新酶原Q097包括在139位用谷氨酰胺殘基取代天冬酰氨殘基。酶原Q248在290位用谷氨酰胺殘基取代天冬酰胺殘基。酶原Q313在355位用谷氨酰胺殘基取代天冬酰胺殘基，而酶原Q329在371位用谷氨酰胺殘基取代天冬酰胺殘基。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，許多種DNA化合物都可編碼上面給出的多肽。所以，下面描述的構(gòu)建過(guò)程以及本發(fā)明所附的優(yōu)選DNA化合物、載體和轉(zhuǎn)化體的實(shí)施例都僅僅是說(shuō)明性的，不限制本發(fā)明的范圍。此外，用GLN取代ASN也是說(shuō)明性的，不限制本發(fā)明的范圍，因?yàn)橐部刹捎闷渌〈皇荂YS或PRO除外。而且，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的各種單個(gè)氨基酸取代可以結(jié)合，以產(chǎn)生其它新酶原。
本發(fā)明的所有DNA化合物都是通過(guò)人蛋白C基因的定點(diǎn)突變而制備的。然后將經(jīng)突變的酶原編碼分子插入真核表達(dá)載體，以便由腺病毒-2的較大晚期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該酶原基因表達(dá)。所述載體還包括BK病毒的P2增強(qiáng)子部分以增強(qiáng)由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。所述載體已轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12AG1細(xì)胞中并于1990年1月9日保藏在北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(Northern Regional Research Laboratories，Peoria，Illinois 61604)并成為該實(shí)驗(yàn)室永久性原種培養(yǎng)物的一部分。表Ⅱ給出了具體的培養(yǎng)物和保藏號(hào)。
表Ⅱ培養(yǎng)物 保藏號(hào)E.coli K12 AG1/pLPC-Q097 NRRL B-18608E.coli K12 AG1/pLPC-Q248 NRRL B-18609E.coli K12 AG1/pLPC-Q313 NRRL B-18610E.coli K12 AG1/pLPC-Q329 NRRL B-18611利用常規(guī)方法獲得培養(yǎng)物并分離質(zhì)粒，然后可直接轉(zhuǎn)染到真核寄主細(xì)胞中以產(chǎn)生酶原形式的人蛋白C。最好將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到可表達(dá)腺病毒E1A早期基因產(chǎn)物的寄主細(xì)胞中，在這種寄主細(xì)胞中載體上的BK增強(qiáng)子在E1A的存在下可最有效地增強(qiáng)表達(dá)。專(zhuān)業(yè)人員會(huì)意識(shí)到許多寄主細(xì)胞都表達(dá)或可被用于表達(dá)大DNA病毒的早期基因產(chǎn)物。優(yōu)選的細(xì)胞系為人腎293細(xì)胞系(得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)為ATCC CRL 1573)或金黃侖鼠細(xì)胞系A(chǔ)V12-664(ATCC 9595)。胚胎人腎細(xì)胞系293最為優(yōu)選。
為了獲得更高水平的表達(dá)，可將編碼各種酶原形式蛋白C的基因從保藏的載體上切下來(lái)并連到含有GBMT轉(zhuǎn)錄控制單位的載體上。具體說(shuō)，質(zhì)粒pGT-h含有潮霉素抗性授予基因它可(以E.coli K12 AG1的形式)從NRRL獲得，保藏號(hào)為NRRL B-18592。質(zhì)粒主鏈經(jīng)限制性酶Bcl I消化然后從大腸桿菌的dam甲基化酶菌株(如GM48 NRRL B-15725)中分離質(zhì)粒DNA而打開(kāi)。所述新酶原基因可通過(guò)用Bcl I消化而分別從其質(zhì)粒上除去。將載體主鏈純化并脫磷酸化，然后將本發(fā)明的任何一種新酶原基因連到Bcl I上。將含有位于GBMT轉(zhuǎn)錄單位之后的用于表達(dá)的新酶原基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到293細(xì)胞中，進(jìn)行培養(yǎng)，并利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從培養(yǎng)物中純化新酶原。從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化人蛋白C的一種方法已公開(kāi)于Yan所述的方法(歐洲專(zhuān)利公告0363126，1990年4月11日公開(kāi))，全部公開(kāi)內(nèi)容均作為本文參考。
本發(fā)明的化合物還包括本發(fā)明初生蛋白一經(jīng)分泌產(chǎn)生的酶原形式。因此，本發(fā)明的化合物包括DNA編碼順序、驅(qū)動(dòng)這些順序表達(dá)的表達(dá)載體、由這些編碼順序產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄本一經(jīng)轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的初生蛋白、那些初生蛋白一經(jīng)分泌產(chǎn)生的酶原和所述酶原的某些活化衍生物。
本發(fā)明的DNA化合物也可由化學(xué)方法合成，或通過(guò)將限制性片段的結(jié)合或通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)相結(jié)合。DNA合成儀也可買(mǎi)到，并可用于構(gòu)建本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的說(shuō)明性載體含有BK增強(qiáng)子，它通過(guò)本發(fā)明編碼順序的腺病毒較大晚期啟動(dòng)子定位刺激轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會(huì)意識(shí)到大量本領(lǐng)域已知的真核啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和表達(dá)載體都可用于本發(fā)明的方法。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員還會(huì)意識(shí)到真核表達(dá)載體可以在沒(méi)有增強(qiáng)子部分的存在下發(fā)揮其功能。本發(fā)明的關(guān)鍵不在于特定的增強(qiáng)子(如果有的話(huà))或用于驅(qū)動(dòng)蛋白C酶原表達(dá)的啟動(dòng)子，而在于新的編碼順序和由該順序產(chǎn)生的相應(yīng)的蛋白質(zhì)。
然而，載體的選擇如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、和可選擇的標(biāo)志物會(huì)極大地影響真核寄主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最終水平。歐洲專(zhuān)利公告0245949號(hào)(1987年11月19日公開(kāi)，系本文參考文獻(xiàn))公開(kāi)了許多天然酶原蛋白C的表達(dá)載體，這些表達(dá)載體利用BK增強(qiáng)子刺激能定位驅(qū)動(dòng)初生人蛋白C表達(dá)的真核啟動(dòng)子。這些載體一旦轉(zhuǎn)化到也可表達(dá)大DNA病毒最早期基因產(chǎn)物(如腺病毒的E1A基因產(chǎn)物)的真核細(xì)胞，可驅(qū)動(dòng)特別高水平的表達(dá)。這一點(diǎn)可由本發(fā)明公開(kāi)的載體pGT-Q097-h、pGT-Q248-h、pGT-Q313-h和pGT-329h證明，GBMT-E1A基因產(chǎn)物的表達(dá)方法對(duì)用本發(fā)明的載體而言特別優(yōu)選。
本發(fā)明不限于使用特定的真核寄主細(xì)胞。許多真核寄主細(xì)胞都可從保藏機(jī)構(gòu)如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD20852)得到，并適用于本發(fā)明的載體。具體寄主細(xì)胞的選擇在某種程度上取決于用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明蛋白C編碼DNA化合物的具體表達(dá)的載體。因?yàn)楸景l(fā)明的初生人蛋白C和初生人蛋白C衍生物需經(jīng)歷隨后的轉(zhuǎn)譯后修飾作用，所以某些寄主細(xì)胞更優(yōu)選地用于本發(fā)明的載體。根據(jù)歐洲專(zhuān)利公告0245949和Grinnel等人的論文(1987，Bio/Technolony 51189)，腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞對(duì)重組產(chǎn)生γ-羧基化蛋白如人蛋白C來(lái)說(shuō)特別優(yōu)選。一種這樣的腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系是293細(xì)胞系，它可從ATCC得到293保藏號(hào)為ATCC CRL 1573。293細(xì)胞系也優(yōu)選地適用于本發(fā)明的載體。
但是，有利于產(chǎn)生γ-羧基化蛋白(如人蛋白C酶原)的腺病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系不限于腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞。事實(shí)上，腺病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞一般說(shuō)來(lái)是產(chǎn)生γ-羧基化人蛋白C的特殊寄主。這一類(lèi)型的特別優(yōu)選的細(xì)胞系是可從ATCC得到的AV12-664(下文簡(jiǎn)稱(chēng)“AV12”)細(xì)胞系，保藏號(hào)為ATCC CRL 9595。AV12細(xì)胞系的構(gòu)建是將人腺病毒12注入金黃侖鼠的頸背，然后從生成的腫瘤中分離細(xì)胞。后面的實(shí)例3描述了用例證性載體pGT-Q097-h轉(zhuǎn)化293和AV12細(xì)胞系。
本發(fā)明載體可轉(zhuǎn)化到各種真核寄主細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并在其中表達(dá)。不具有可用于分離和鑒定穩(wěn)定的真核轉(zhuǎn)化株的可選擇標(biāo)記的本發(fā)明載體不僅可用于瞬間分析的目的，也可用于共轉(zhuǎn)化之目的，共轉(zhuǎn)化方法公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利4，399，216(1983年8月26日公開(kāi))，在此并入本文作為參考。本發(fā)明的載體還包括可使其在大腸桿菌中復(fù)制的順序，因?yàn)樵诖竽c桿菌中制備質(zhì)粒DNA通常比在其它寄主中更為有效。
本發(fā)明載體上所含有的人蛋白C的編碼順序在那些其中與結(jié)構(gòu)基因相連的特定啟動(dòng)子起作用的寄主細(xì)胞中表達(dá)。適用于本發(fā)明的寄主細(xì)胞實(shí)例列于表Ⅲ，附帶適當(dāng)?shù)淖⒔狻?br> 表Ⅲ寄主細(xì)胞 來(lái)源 購(gòu)自 備注HepG-2 人肝胚細(xì)胞瘤 ＊ATCC＃HB8065 美國(guó)專(zhuān)利4，393，133描述了該細(xì)胞系的使用。
CV-1 非洲綠猴腎細(xì)胞 ATCC＃CCL70LLC-MK2 獼猴腎細(xì)胞 ATCC＃CCL7LLC-MK2 獼猴腎細(xì)胞 ATCC＃CCL7.1 比ATCC＃CCL7生長(zhǎng)更衍生物 快。
3T3 小鼠胚成纖維細(xì)胞 ATCC＃CCL92CHO-K1 中國(guó)金黃侖鼠卵細(xì)胞 ATCC＃CCL61 需脯氨酸。CHO-K1衍生物如dhfr-衍生物DXB11可由該寄主產(chǎn)生。
HeLa 人子宮頸上皮樣細(xì)胞 ATCC＃CCL2RPMI8226 人骨髓瘤 ATCC＃CCL155 IgGλ-型輕鏈分泌H4IIEC3 小鼠肝細(xì)胞瘤 ATCC＃CRL1600 衍生物如8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤抗性FAZA寄主細(xì)胞可由該寄主產(chǎn)生。
C127I 小鼠成纖維細(xì)胞 ATCC＃CRL1616HS-Sultan 人漿細(xì)胞細(xì)胞瘤 ATCC＃CRL1484BHK- 幼年金黃侖鼠腎細(xì)胞 ATCC＃CCL10
如表Ⅲ所示，許多哺乳類(lèi)細(xì)胞都有必要的細(xì)胞識(shí)別機(jī)制和對(duì)本發(fā)明初生蛋白上信號(hào)肽的適當(dāng)處理程序，并提供轉(zhuǎn)譯后修飾如糖基化、γ-羧基化和β-羥基化，如觀察到的血漿中的蛋白C。然而，如上所述，HPC的最佳轉(zhuǎn)譯后處理過(guò)程發(fā)生于腺病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中。對(duì)這類(lèi)真核寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而言，存在許多載體(如下所討論)，但是，下面例舉的特定載體決非要限制本發(fā)明的范圍。
pSV2型載體包括構(gòu)成一個(gè)限定的真核轉(zhuǎn)錄單位-啟動(dòng)子(ep)、間插順序(IVS)和聚腺苷酸化(pA)位點(diǎn)的SV40基因組片段。在沒(méi)有SV40 T-抗原時(shí)，質(zhì)粒pSV2型載體通過(guò)整合到寄主細(xì)胞染色體DNA中而轉(zhuǎn)化哺乳類(lèi)和其它真核寄主細(xì)胞。已構(gòu)建了各種質(zhì)粒pSV2型載體(見(jiàn)Eukaryotic Viral Vectors，Gluzman編，Cold Spring Harbor Laboratories出版，Cold Spring Harbor，New York，1982)，如質(zhì)粒pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、pSV2-hyg和pSV2-β-球蛋白，其中SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)插入基因的轉(zhuǎn)錄。這些載體都適用于本發(fā)明的編碼順序，并可從ATCC(在Rockville，Maryland)或NRRL(在Peoria，Illinois)得到。
質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)含有受SV40早期啟動(dòng)子控制的鼠二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。在適當(dāng)?shù)臈l件下，獲知所述dhfr基因在寄主染色體中被放大或拷貝。該放大作用可以包括與dhfr基因緊密相連的DNA順序如本發(fā)明的初生人蛋白C編碼順序，見(jiàn)Schimke的綜述文章(1984，Cell 37705-713)，因此可用于增加本發(fā)明蛋白C酶原的產(chǎn)生。
被構(gòu)建用來(lái)在哺乳類(lèi)和其它真核寄主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明初生蛋白C和蛋白C酶原的質(zhì)?？刹捎酶鞣N啟動(dòng)子。本發(fā)明決不限于使用本文所列舉的特定的真核啟動(dòng)子。Bucher等人公開(kāi)的啟動(dòng)子如SV40晚期啟動(dòng)子或真核啟動(dòng)子(Bucher et al.，1986，Nuc.Acids Res.14(24)1009)或得自真核基因(如誘導(dǎo)雌激素的雞卵清蛋白基因、干擾素基因、誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素的酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因、胸苷激酶基因及較大早期和晚期腺病毒基因)的啟動(dòng)子都可容易地分離和修飾以用于設(shè)計(jì)在真核寄主細(xì)胞中產(chǎn)生人蛋白C酶原的重組DNA表達(dá)載體。真核啟動(dòng)子也可以串聯(lián)形式用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明編碼順序的表達(dá)。而且，已知道許多還原病毒可感染很大范圍的真核寄主細(xì)胞。所述還原病毒DNA的長(zhǎng)端重復(fù)常常編碼啟動(dòng)子的活性，因此可用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明編碼順序的表達(dá)。
質(zhì)粒pRSVcat(ATCC 37152)含有勞斯氏肉瘤病毒(RSV)的部分長(zhǎng)端重復(fù)，RSV已知可感染雞和其它寄主細(xì)胞。RSV的長(zhǎng)端重復(fù)順序可以從質(zhì)粒pRSVcat的～0.76kb Nde Ⅰ-HindⅢ片段分離。RSV的長(zhǎng)端重復(fù)(Gorman et al.，1982，P.N.A.S.796777)適用于本發(fā)明的載體。質(zhì)粒pMSVi(NRRL B-15929)含有鼠肉瘤病毒(MSV)的長(zhǎng)端重復(fù)，該病毒已知可感染鼠類(lèi)和其它寄主細(xì)胞。這些重復(fù)順序適合用作本發(fā)明載體的啟動(dòng)子。小鼠金屬硫因(MMT)啟動(dòng)子也已鑒定出有用于真核宿主細(xì)胞的特性，并且適用于本發(fā)明的載體。所述MMT啟動(dòng)子存在于15kb的質(zhì)粒pdBPV-MMTneo(ATCC 37224)中，該質(zhì)粒可用作構(gòu)建本發(fā)明其它質(zhì)粒的起始原料。
本發(fā)明說(shuō)明性DNA順序和質(zhì)粒的許多修飾和變化都是可能的。例如，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使得多肽編碼區(qū)域及轉(zhuǎn)譯終止信號(hào)的核苷酸可以被取代，而編碼出的多肽順序不變。這種可取代的順序可以從已知的人蛋白C氨基酸順序和DNA順序推導(dǎo)，并可通過(guò)以下常規(guī)合成或位點(diǎn)特異性變變方法而構(gòu)建。合成方法可基本上按照Itakura等人的方法(1977，Science 1981056)和Crea等人的方法(1978，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 755765)進(jìn)行。因此，本發(fā)明決不限于具體例舉的那些DNA順序和質(zhì)粒。
在本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化到真核寄主細(xì)胞中后，可以根據(jù)可選擇表型來(lái)選擇轉(zhuǎn)化體。所述可選擇表型可以由存在于所述表達(dá)載體上或存在于與所述表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)化到寄主細(xì)胞中的另一個(gè)載體上的可選擇標(biāo)記授與。一旦選擇出轉(zhuǎn)化株，便需要鑒定哪種轉(zhuǎn)化株表達(dá)最高水平的所述表達(dá)載體編碼的所需蛋白。這種鑒定在進(jìn)行共轉(zhuǎn)化方法后特別重要，共轉(zhuǎn)化產(chǎn)生許多只含有可選擇標(biāo)記物的質(zhì)粒而不含表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化株。在后面的實(shí)例4中描述了一種方法，它不但可以鑒定表達(dá)和分泌所需蛋白的細(xì)胞，還相對(duì)所考察的其它細(xì)胞定量所分必的蛋白。該方法還可用于分離可分泌最高水平所需蛋白的活細(xì)胞。
將酶原形式人蛋白C活化成活性蛋白C(APC)的方法是老的并為專(zhuān)業(yè)人員所熟知。蛋白C可僅由凝血酶活化、由凝血酶/凝血調(diào)變蛋白復(fù)合物活化、由Russell氏蝰蛇毒液活化或由各種其它方法活化。人蛋白C酶原的活性通過(guò)全酰胺解分析或抗凝固作用分析由凝血酶活性而測(cè)定凝血酶的活化作用和蛋白C的分析(酰胺解和抗凝性)按照文獻(xiàn)(Grinnell et al.，1987，Biotechnology 51189-1192，在此并入本文作為參考)所述方法進(jìn)行。人蛋白C糖類(lèi)突變體的酰胺解比活公開(kāi)于表Ⅳ。
表ⅣAPC形式型 酰胺解活性 %3抗凝活性 相對(duì)水平的功能活性(μ/mg)天然APC 32±10 119±24 1Q097 80±10 118±11 2.5Q248 NDbND NDQ313 52±8 98±8 1.4Q329 116±16 128±21 3.9a.以酰胺解分析法測(cè)得的量除APTT分析法測(cè)得的活化蛋白C的量測(cè)定。
b.末做c.與天然APC相比的相對(duì)酰胺解活性乘相對(duì)抗凝活性用于表Ⅳ分析的酶原分子利用單克隆抗體由ELISA分析而定量，所述單克隆抗體不(不在同樣程度上象)與產(chǎn)生該抗體的相同量的野生型分子的(反應(yīng)那樣與)突變體或衍生物反應(yīng)。因此，根據(jù)蛋白含量進(jìn)一步純化和定量得到表Ⅴ所示的數(shù)據(jù)。
表Ⅴ功能活性(單位/mg)HPC 酰胺解(相對(duì)于wt HPC) 抗凝固(相對(duì)于血漿wt HPC)得自血漿 nd 250(1)wt aPC 35±5(1)(n＝7) 325±65(1.3)(n＝5)Q097 32±4(0.9)(n＝10) 303±33(1.2)(n＝3)Q248 63±12(1.8)(n＝8) 669±172(2.7)(n＝3)Q313 52±7(1.5)(n＝9) 627±99(2.5)(n＝3)Q329 47±6(1.4)(n＝9) 516±29(2.1)(n＝3)第一個(gè)圓括號(hào)中的數(shù)字是對(duì)得自血漿的HPC的活性增加倍數(shù)。還給出了兩次重復(fù)或三次重復(fù)測(cè)定的獨(dú)立樣品(n)的數(shù)字。
除了表Ⅴ中所示的增加的衍生物抗凝活性，突變體Q313還表現(xiàn)出對(duì)凝血酶的親和性增加，對(duì)僅由凝血酶或與輔助因子凝血調(diào)變蛋白復(fù)合時(shí)活化速率增加約3倍。該速率增加使得酶原型人蛋白C在臨床應(yīng)用上更為敏感，而且還改進(jìn)了酶原型蛋白C裂解形成活性蛋白C的生產(chǎn)方法。酶原Q313活化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)示于表Ⅵ。
表Ⅵ底物 Km(μM) k(cat)(min) k(cat)/Km(min-1mM-1)wt HPC 6.1±0.45，n＝3 480±14 79Q313 1.9±0.50，n＝4 380±14 200這些結(jié)果是三次獨(dú)立測(cè)定的平均值，這些值由非線(xiàn)性回歸分析而確定。
活化蛋白C在防止靜脈血栓擴(kuò)大、動(dòng)脈血栓形成和防止死亡和器官不能抵抗革蘭氏陰性膿毒癥、內(nèi)毒素血癥和彌散性血管內(nèi)血凝固等方面具有基本的抗凝血特性。特別重要的是，本發(fā)明活化蛋白C衍生物的功能性活性的增加，將降低上述臨床應(yīng)用的劑量，從而增加安全限度。
本發(fā)明的活化重組蛋白C酶原可用于防治各種涉及血管內(nèi)凝固的獲得性疾病，包括深度靜脈血栓、肺栓塞、外周動(dòng)脈血栓、起源于心臟或外周動(dòng)脈的栓子、急性心肌梗塞、血栓突發(fā)及彌散性血管內(nèi)凝固。這些蛋白C衍生物也可有效地用于治療患有繼發(fā)性深度靜脈血栓引起的雜合蛋白C不足的病人和患有紫癜暴發(fā)病的純合蛋白C缺乏的病人?；罨鞍證有吸引力的治療用途在于防止目前由低劑量肝素治療的深度靜脈血栓和肺栓塞。
本發(fā)明的蛋白C衍生物同樣可用于治療起源于外周動(dòng)脈(最顯著的是頸動(dòng)脈)血栓的栓子，這些疾病在目前的治療體制下還沒(méi)有令人滿(mǎn)意的防治方法，目前的治療體制包括使用能夠抑制血小板功能的藥物、口服抗凝劑或其結(jié)合物。
本發(fā)明的活化衍生物還可用于治療急性心肌梗塞，因?yàn)楸景l(fā)明的衍生物一旦被活化便具有纖維蛋白溶原的性質(zhì)。在心肌梗塞急性期，這些活化衍生物可以和組織血纖維蛋白溶酶原激活劑一起使用。在冠狀動(dòng)脈血栓閉塞解決后，本發(fā)明的酶原可再使用幾天以防止急性心肌再梗塞。
活化的蛋白C用于治療播散性血管內(nèi)凝固。對(duì)患有播散性血管內(nèi)凝固(DIC)的病人在廣泛的臨床試驗(yàn)中已使用了肝素和口服抗凝劑，但結(jié)果令人失望。而本發(fā)明的活化蛋白C及活化衍生物在治療DIC時(shí)比常規(guī)抗凝劑有明顯的優(yōu)點(diǎn)。
常規(guī)抗凝劑(特別是華法令)可用于治療侵害性惡性腫瘤。許多腫瘤細(xì)胞都產(chǎn)生引起凝固系統(tǒng)活化從而導(dǎo)致局部纖維蛋白沉積的物質(zhì)。這些纖維蛋白的沉積形成“巢”，癌細(xì)胞在其中可進(jìn)行分裂形成骨髓硬化性損傷。然而，不可能將華法令或其它常規(guī)抗凝劑與更強(qiáng)烈并更有效形式的化療結(jié)合使用，因?yàn)檫@種治療會(huì)使血小板急劇下降，而用華法令治療的血小板減少癥會(huì)將病人置于不可接受的高風(fēng)險(xiǎn)的嚴(yán)重出血并發(fā)癥中。本發(fā)明的蛋白C衍生物和活化蛋白C一樣比常規(guī)抗凝劑有更高的選擇性，并且比肝素或口服抗凝劑有更高的治療指數(shù)，可以相對(duì)安全地用于血小板減小癥的病人，因此使得用有效的強(qiáng)烈的化療與本發(fā)明活化的蛋白C結(jié)合治療侵害性癌癥的病人成為可能。
本發(fā)明的酶原及其活化形式可按照已知方法配制制備藥用組合物，其中本發(fā)明的人蛋白C酶原或活化的蛋白C與可藥用載體混合。合適的載體及其配制劑(包括其它人蛋白如人血清清蛋白)在例如文獻(xiàn)(Remington′s Pharmceutical Sciences第16版，1980，Mack出版公司，由Osol等人編輯)中已知描述，該文獻(xiàn)在此并入本文作為參考。這類(lèi)組合物含有有效量的蛋白C酶原或其活化對(duì)應(yīng)物以及合適量的可藥用載體，制備適于有效施用于寄主的藥用組合物。所述蛋白C組合物可以經(jīng)非腸道途徑給藥或通過(guò)其它能保證其以有效形式傳遞到血管中的其他方法給藥。
以下實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的方法，描述本發(fā)明具有代表性的化合物、載體和轉(zhuǎn)化株，但不限制本發(fā)明。
實(shí)例1質(zhì)粒pLPC-Q097從NRRL得到大腸桿菌K12 AG1/pLPC-Q097的凍干物，登記號(hào)為NRRLB-18608。將這些凍干物倒入裝有10ml LB培養(yǎng)基(10g細(xì)菌用胰化胨、5g細(xì)菌用酵母抽提物、每升10g NaCl;調(diào)pH至7.5)的管中，于32℃培養(yǎng)2小時(shí)，此時(shí)在培養(yǎng)物中加50μg/ml氨芐青霉素，然后于37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
取一小部分過(guò)夜培養(yǎng)物，以某種方式置于含50μg/ml氨芐青霉素的LB-瓊脂(加有15g/l細(xì)菌用瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上，從而獲得大腸桿菌K12 AG1/pLPC-Q097的單菌落分離菌。將得到的單菌落接種到10ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃下劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取10ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種到500ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃下劇烈振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)物達(dá)到靜止期。
以下操作沿用Maniatis等人的方法(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。
于4℃下以4000g離心10分鐘收集細(xì)胞，棄去上清液。用100毫升冰冷的STE緩沖液(0.1M NaCl;10mM Tris-HCl，pH7.8;1mM EDTA)洗滌細(xì)胞沉淀。洗滌后，將細(xì)胞沉淀再懸浮于10ml含5mg/ml溶菌酶的溶液1(50mM葡萄糖;25mM Tris-HCl，pH8.0;10mM EDTA)中，室溫下放置10分鐘。然后向經(jīng)溶菌酶處理的細(xì)胞中加入20ml溶液2(0.2N NaOH和1%SDS)，用倒轉(zhuǎn)法小心混合該溶液。將該混合物在冰上保溫10分鐘。
向溶解的細(xì)胞混合物中加入15ml冰冷的5M乙酸鉀，pH4.8，倒轉(zhuǎn)混合該溶液。將該溶液在冰上保溫10分鐘。5M乙酸鉀溶液的制備方法是在28.5ml水和60ml 5M乙酸鉀中加入11.5ml冰乙酸;所得的鉀濃度為3M，乙酸濃度為5M。
于4℃下，將溶解的細(xì)胞混合物以20，000rpm在Beckman SW27(或同等規(guī)格的轉(zhuǎn)子)中離心20分鐘。細(xì)胞的DNA和碎片在管底形成沉淀。回收到約36ml上清液，加入0.6倍體積的異丙醇并混合，所得溶液在室溫下放置15分鐘。室溫下以12，000g離心30分鐘收集質(zhì)粒DNA。棄去上清液，用70%乙醇于室溫下洗滌DNA沉淀。倒出乙醇洗滌液，將沉淀置于真空干燥器中干燥。然后將沉淀再懸浮于8ml TE緩沖液中(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)。
向DNA溶液中加入8克CsCl。在每10ml CsCl-DNA溶液中加入約0.8ml 10mg/ml溴乙錠溶液。該溶液的最終密度約為1.55g/ml，溴乙錠濃度約為600μg/ml。將溶液移至Beckman 50型離心管中，管頂用石蠟油裝滿(mǎn)，密封后于20℃下以45，000rpm離心24小時(shí)。離心后，在可見(jiàn)光下可看見(jiàn)兩條DNA帶。取下離心管蓋后，用帶有21號(hào)皮下注射針頭的注射器沿離心管壁插入而吸出較低的DNA帶。
用水飽和的1-丁醇萃取若干次，除去溴化乙錠。用TE緩沖液透析除去CsCl。先后用緩沖的苯酚和氯仿萃取，沉淀出DNA，用70%乙醇洗滌，干燥。得到約1mg質(zhì)粒pLPC-Q097，于4℃下在TE緩沖液中以約1μg/μl的濃度貯存。質(zhì)粒pLPC-Q097的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1。質(zhì)粒pLPC-Q248、pLPC-Q313和pLPC-Q329以同樣的方式從其相應(yīng)的宿主細(xì)胞(也得自NRRL)中分離。它們各自的限制性位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖。
實(shí)例2構(gòu)建質(zhì)粒pGT-Q097-h質(zhì)粒pLPC-Q097、pLPC-Q248、pLPC-Q313和pLPC-Q329可直接轉(zhuǎn)化到真核宿主細(xì)胞(優(yōu)選293細(xì)胞)中產(chǎn)生高水平的人蛋白C酶原。如果編碼突變型酶原的基因被連到某一載體上，這樣該基因的表達(dá)由GBMT轉(zhuǎn)錄單位驅(qū)動(dòng)，則可以得到高水平的表達(dá)和分泌產(chǎn)物。
質(zhì)粒pGTC是這類(lèi)載體中的一種，在該質(zhì)粒中野生型人蛋白C酶原基因由GBMT轉(zhuǎn)錄單位驅(qū)動(dòng)。野生型蛋白C基因可從載體的Bcl Ⅰ限制性片段上容易地除去，本發(fā)明的任何基因可插入載體的Bcl Ⅰ限制性片段。Bcl Ⅰ對(duì)質(zhì)粒DNA的消化受到順序5′-GATC-3′中的腺嘌呤的甲基化的抑制。因此，要從沒(méi)有腺嘌呤甲基化酶的大腸桿菌寄主細(xì)胞中制備質(zhì)粒pGTC，腺嘌呤甲基化酶由dam基因編碼，該基因的產(chǎn)物使順序5′-GATC-3′中的腺嘌呤殘基甲基化。大腸桿菌K12 GM48(NRRL B-15725)缺乏功能性的dam甲基化酶，因此是制備質(zhì)粒pGTC DNA的合適寄主，該質(zhì)粒DNA是構(gòu)建質(zhì)粒衍生物的起始材料。
將大腸桿菌K12 GM48細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并使其適于轉(zhuǎn)化，基本按照實(shí)例1的方法用質(zhì)粒pGTC轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12 GM48細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于含有氨芐青霉素的L-瓊脂上，一旦具有氨芐青霉素抗性的大腸桿菌K12 GM48/pGTC轉(zhuǎn)化株形成菌落，便可基本按照實(shí)例1的方法用一個(gè)這種菌落制備質(zhì)粒pGTC DNA。得到1mg質(zhì)粒pTGC DNA，并將其懸浮于1ml TE緩沖液中。該方法可用于從質(zhì)粒pGT-h和pGT-d制備質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒pGT-d含有GBMT轉(zhuǎn)錄單位，但在Bcl Ⅰ位點(diǎn)無(wú)基因，所以任何基因可以容易地插入。質(zhì)粒pGT-d還含有鼠類(lèi)dhfr基因，因此可利用氨甲蝶呤抗性表型選擇任何轉(zhuǎn)化株或進(jìn)行放大。質(zhì)粒pGT-h含有GBMT轉(zhuǎn)錄單位、易于插入目的基因的Bcl Ⅰ位點(diǎn)和授予潮霉素抗性的基因。含有這些質(zhì)粒的大腸桿菌K12 AG1菌株于1990年1月18日保藏于NRRL。這些菌株的保藏號(hào)為NRRL B-18591(大腸桿菌K12 AG1/pGT-d)、NRRL B-18592(大腸桿菌K12 AG1/pGT-h)和NRRL B-18593(大腸桿菌K12 AG1/pGTC)。以上菌株均可從NRRL得到。這些質(zhì)粒的限制性位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖。
將約10μl由GM48細(xì)胞制備的質(zhì)粒pLPC-Q097 DNA與20μl 10X Bcl Ⅰ限制性緩沖液(100mM Tris-HCl(pH7.4)、1.5M KCl、100mM MgCl和10mM DTT)、20μl 1mg/ml BSA、5μl限制性酶Bcl Ⅰ(～50單位，如Bethesda Research Laboratories(BRL)所限定，本文所用的所有限制性酶都得自BRL)及145μl水混合，所得反應(yīng)混合物在37℃下保溫2小時(shí)。本文所描述的限制性酶反應(yīng)都常規(guī)地由苯酚結(jié)束，并用氯仿提取，然后沉淀DNA，用乙醇洗滌，在TE緩沖液中再懸浮DNA。然后將消化的DNA通過(guò)1%的瓊脂糖制備凝膠電泳，并利用BioRad Prep-A-Gene藥盒，按照廠商的指示純化含有突變基因的約1400堿基對(duì)的限制性片段。
然后基本上按照實(shí)例1所述的方法從大腸桿菌K12 AG1/pGTC(NRRLB-18592)中分離質(zhì)粒pGT-h，在GM48細(xì)胞中系列并基本上如實(shí)例2所述的方法分離。然后如上所述用限制性酶Bcl Ⅰ消化質(zhì)粒pGT-h DNA，然后分離并純化較大的載體片段。將該載體片段用TE(pH8.0)調(diào)到90μl，然后加入10μl(0.05單位)小牛腸道堿性磷酸酶以使載體末端去磷酸化。將該混合物在37℃下保溫30分鐘，然后加入10μl 500mM EGTA，將反應(yīng)物在65℃下保溫45分鐘以使所述酶失活。反應(yīng)物然后用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，洗滌并再懸浮于20μl水中。
將約7μl(10ng)Bcl Ⅰ消化的載體主鏈與約1μl(100ng)約1400堿基對(duì)的質(zhì)粒pLPC-Q097的Bcl Ⅰ限制性片段、1μl 10X連接酶緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH7.6，100mM MgCl，100mM DTT和500μg/ml BSA)及1μl T4 DNA連接酶混合。將該連接反應(yīng)物在16℃下保溫12-16小時(shí)。該連接反應(yīng)可產(chǎn)生含有從GBMT轉(zhuǎn)錄單位中定向轉(zhuǎn)錄的突變酶原基因的質(zhì)粒，或所述基因被反向連接的質(zhì)粒。這些含有以適當(dāng)取向轉(zhuǎn)錄的所述基因的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pGT-Q097-h。
冰冷的感受態(tài)大腸桿菌K12 AG1細(xì)胞得自Strategene(3770 Tansey Road，San Diego，California 92121)。將約5μl所述連接反應(yīng)物與100μl感受態(tài)細(xì)胞混合，然后將該細(xì)胞-DNA混合物在冰上保溫1小時(shí)，在42℃下熱休克45秒，再在冰上冷卻約2分鐘。將該細(xì)胞-DNA混合物稀釋到Falcon 2059試管中的1ml SOC培養(yǎng)基中，并在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。將100μl試樣平鋪于含有氨芐青霉素的LB-瓊脂平皿上，在37℃下培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。
將上述菌落分開(kāi)單個(gè)培養(yǎng)，并通過(guò)限制性酶分析而考察單個(gè)菌落中的質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA的分離按照實(shí)例1的方法以較小規(guī)模進(jìn)行，但省去CsCl步驟直至鑒定出適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌K12 AG1/pGT-Q097-h轉(zhuǎn)化株。這時(shí)進(jìn)行大規(guī)模的高純度的質(zhì)粒制備。按照實(shí)例1和2的步驟，任何突變酶原基因都可容易地克隆到任何GBMT載體中去，以形成質(zhì)粒pGT-Q097-h、pGT-Q248-h、pGT-Q313-h和pGT-Q329-h。
實(shí)例3用質(zhì)粒pGT-Q097-h構(gòu)建腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系293和腺病毒轉(zhuǎn)化的金黃侖鼠細(xì)胞系A(chǔ)V12轉(zhuǎn)化株人胚胎腎細(xì)胞系293得自ATCC，登記號(hào)為ATCC CRL 1573。腺病毒轉(zhuǎn)化的金黃侖鼠細(xì)胞系A(chǔ)V12也得自ATCC，登記號(hào)為ATCC CRL 9595。下面描述以293細(xì)胞為寄主細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化方法，但是該方法對(duì)大多數(shù)真核細(xì)胞系(包括AV12細(xì)胞系)都普遍適用，并表達(dá)本發(fā)明的載體。
293細(xì)胞以登記號(hào)CRL 1573得自ATCC，在-25平方毫米的小瓶中在加有10%熱失活馬血清的Eagle氏最低限基本培養(yǎng)基(Gibco)中含有融合單層的約5.5×10個(gè)細(xì)胞。將該小瓶在37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)基一星期換兩次。培養(yǎng)基由DMEM(Gibco)加上10%小牛血清、50μg/ml慶大霉素和10μg/ml Aqua MEPHYTON植物甲萘醌維生素K1(Merck Sharp and Dohme，Merch and CO.，Inc.，West Point，PA19486)組成。將這些細(xì)胞傳代培養(yǎng)，方法是除去培養(yǎng)基，用Hank氏平衡鹽溶液(Gibco)沖洗，加入0.25%的胰蛋白酶(含有0.2g/L EDTA)1-2分鐘，用新鮮培養(yǎng)基沖洗，吸出，以1∶5或1∶10的傳代培養(yǎng)比例分配到新的培養(yǎng)瓶中。
在轉(zhuǎn)化的前一天，將這些細(xì)胞以每100mm盤(pán)0.7×10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種。滅菌，將溶于TE緩沖液中的乙醇沉淀的質(zhì)粒DNA用于制備含有25μg/ml轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒DNA和250mM CaCl的2X DNA-CaCl溶液。制備含有280mM NaCl、50mM Hepes和1.5mM磷酸鈉的2X HBSS，pH調(diào)至7.05-0.15。將2X DNA-CaCl溶液滴加到等體積的無(wú)菌2X HBSS中。在加入DNA時(shí)，將1枝帶有棉花塞的無(wú)菌1ml塑料吸管插入含有2X HBSS混合物管中并吹入氣泡。在室溫下不攪拌放置30-45分鐘，以形成磷酸鈣-DNA沉淀。
用塑料吸管輕輕吹氣而將沉淀混合，并將1ml沉淀(每平皿)直接加到10ml含有受納細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)后，換用新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞在提供選擇壓力前再培養(yǎng)72小時(shí)。對(duì)那些不含有在真核細(xì)胞中起作用的可選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化過(guò)程利用一種質(zhì)?；旌衔铮?br> 即缺少可選擇標(biāo)記的本發(fā)明表達(dá)載體和一種含有可在真核細(xì)胞中起作用的可選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。許多載體都可用于這類(lèi)共轉(zhuǎn)體系，包括質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)、pSV2-neo(ATCC 37149)、pSV2-gpt(ATCC 37145)和pSV2-hyg(NRRL B-18039)。質(zhì)粒pSV2-hyg授予真核寄主細(xì)胞對(duì)潮霉素B的抗性。該共轉(zhuǎn)化技術(shù)可用選擇標(biāo)記選擇含質(zhì)粒的細(xì)胞。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的考察以鑒定出含有兩種轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞。當(dāng)然，本發(fā)明還包括含有對(duì)真核細(xì)胞可選擇標(biāo)記的表達(dá)載體，因此不需使用共轉(zhuǎn)化技術(shù)。
對(duì)用授予潮霉素抗性的基因的質(zhì)粒(如質(zhì)粒pGT-Q097-h)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將潮霉素B加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中至最終濃度為約200μg/ml。然后將所述細(xì)胞與培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)一周，3-4天換一次培養(yǎng)基。將所得潮霉素抗性菌落轉(zhuǎn)移到鑒定用的單個(gè)培養(yǎng)瓶中，質(zhì)粒pSV2-neo授予新霉素抗性(G418也用于代替新霉素)，G418抗性菌落的選擇基本上按照潮霉素抗性細(xì)胞的選擇方法進(jìn)行，只是G418的最終濃度加到300μg/ml。
用二氫葉酸還原酶(dhfr)基因或授予氨甲蝶呤抗性的dhfr基因衍生物作為選擇性標(biāo)記將基因或質(zhì)粒引入dhfr-缺陷型細(xì)胞系中，然后用氨甲蝶呤放大質(zhì)?？截悢?shù)量的方法在文獻(xiàn)中已有記載。293細(xì)胞為dhfr陽(yáng)性，因此含有包含dhfr基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株不是僅僅基于dhfr陽(yáng)性表型進(jìn)行選擇，它還能夠在缺少次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。缺少功能性dhfr基因并用含dhfr的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系可根據(jù)dhfr表型進(jìn)行選擇。盡管用dhfr在產(chǎn)dhfr的細(xì)胞中作為可選擇和可放大標(biāo)記的方法還未很好地研究，文獻(xiàn)中的記載證明dhfr可在產(chǎn)生dhfr的細(xì)胞中用作選擇性標(biāo)記和用于基因放大作用。本發(fā)明不被用于表達(dá)載體的可選擇標(biāo)記所限制。而且，還可使用可放大標(biāo)記，如金屬硫因基因、腺苷脫氨酶基因或多基因抗性類(lèi)成員如P-糖蛋白基因。
用質(zhì)粒pGT-Q097-h、pGT-Q248-h、pGT-Q313-h和pGT-Q329-h轉(zhuǎn)化293細(xì)胞系，產(chǎn)生許多轉(zhuǎn)化體。這些轉(zhuǎn)化株的分析見(jiàn)實(shí)例4。
實(shí)例4選擇分泌人蛋白C酶原突變型的細(xì)胞將實(shí)例3得到的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化株以每個(gè)組織培養(yǎng)皿幾百個(gè)細(xì)胞克隆的密度培養(yǎng)在100mm組織培養(yǎng)皿中。潷出培養(yǎng)基，細(xì)胞用5ml Hank氏平衡鹽溶液(Gibco)沖洗兩次。通過(guò)將1ml 1.8%瓊脂(47℃)與3ml Dulbecco;s Modified Eagle′s(DME)鹽(Gibco，37℃)混合而制備無(wú)菌的0.45%瓊脂溶液(Sigma Type 4 agarose，catalogue ＃A3643，Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)，并將2ml該0.45%瓊脂溶液鋪于所述細(xì)胞上。
將硝酸纖維濾膜(Schleicher和Schuell公司，Keene，NH 03431)煮沸，然后高壓滅菌2小時(shí)以除去對(duì)細(xì)胞有毒的濕潤(rùn)劑。將濾膜置于瓊脂糖層上，除去氣泡后在37℃下培養(yǎng)1-3小時(shí)。然后除去濾膜并放入PBS(50mM Tris-HCl，pH＝7.2，和150mM NaCl)，所述濾膜預(yù)先標(biāo)記以表明其在平皿中的原始取向以便于以后的菌落鑒定。
為保持濾膜分析期間細(xì)胞在平皿上存活，在細(xì)胞上蓋一個(gè)含有2ml 1.8%瓊脂(47℃)、2ml DME鹽(37℃)和4ml加有20%胎牛牛血清的DME鹽溶液(37℃)的8ml混合物。然后將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中。
在濾膜上的所有洗滌和反應(yīng)當(dāng)濾膜在搖動(dòng)的平面上時(shí)完成。將所述濾膜首先通過(guò)在含5%牛奶的PBS中于室溫下保溫而阻滯，然后在PBS中沖洗4次(每次5分鐘)。將10μg/ml生物素化的羊抗人蛋白C多克隆抗體的2.5%牛血清清蛋白溶液加到該濾膜上(以足夠的量蓋在濾膜上)，然后將該濾膜在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。
用于后面制備抗蛋白C抗體的蛋白C的純化，可按照Kisiel所述方法(1979.J.Clin.Invest.64761)而完成。多克隆抗體可利用E.A.Kabat公開(kāi)的方法而制備(Structural Concepts in Immunology andImmunochemistry，published in 1968 by Holt，Rhinehart，and Winston)。單克隆抗體也適用于所述檢測(cè)，單克隆抗體可如Kohler和Milstein公開(kāi)的方法(1975，Nature，256495)或如美國(guó)專(zhuān)利4，696，895、EPO Pub.205046號(hào)、Laurell等人(1985，F(xiàn)EBS 191(1)75)、Suzuki等人(1985，J.Biochem、97127-138)和EPO Pub.138222號(hào)公開(kāi)的方法制備。用于所述分析的抗生素D和生物素化的馬辣根過(guò)氧化物酶(HRP)以Vectastain藥合(Veotor Laboratories，Inc.，30 Ingold Road，Burlingame，CA 94010)得到。生物素也得自Vector Labora tories，Inc.
膜濾用PBS在4℃下沖洗四次。然后，制備抗生素D和生物素化的辣根過(guò)氧化物酶，并按照Vectastain(Vector Laboratories)藥合廠商的指示加入。將所述濾膜與HRP-結(jié)合的抗生素D一起在4℃下保溫1小時(shí)(當(dāng)分泌蛋白量小時(shí)，也可用更長(zhǎng)時(shí)間，如過(guò)夜);然后，濾膜在4℃下用PBS沖洗四次。
為顯示濾膜上指示劑的顏色，將溶于冰冷的100%甲醇中的約30mg HRP(4-氯-1-萘酚，Sigma)加到50ml PBS和30μl 30%HO中。再將該混合物加到硝酸纖維濾膜上，室溫下保溫至顯色。分泌本發(fā)明人蛋白C酶原最多的菌落，在濾膜上的指征不僅顯色最早，而且顏色較深。
濾膜顯色后，用原來(lái)的平皿再次印跡濾膜以確定菌落與濾膜上印跡的關(guān)系。然后選出分泌本發(fā)明人蛋白C酶原最多的菌落并用于生產(chǎn)所述酶原。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會(huì)明白上述檢測(cè)僅僅是說(shuō)明鑒定高度分泌細(xì)胞系的方法。許多檢測(cè)法都可成功地用于該方法。例如，可以用雙抗體反應(yīng)，即用羊抗蛋白C抗體(IgG)和生物素化的抗羊IgG抗體代替生物素化的羊抗蛋白C抗體。
酶原突變體可從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化。從表達(dá)所述重組產(chǎn)物的細(xì)胞中除去上清液并在Pharmacia Fast flow-Q柱上純化。將約1ml樹(shù)脂用20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM EDTA和4mM芐脒平衡。將培養(yǎng)物上清液通過(guò)加入Tris-HCl(pH8.0)調(diào)到pH7.4，并調(diào)到5mM EDTA和4mM芐脒。將該上清液上樣到柱中的樹(shù)脂上，用3倍柱體積的Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM EDTA洗柱，然后用3倍柱體積的20mM Tris(HCl)、0.15M NaCl、4mM芐脒洗柱。利用含10mM CaCl的20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM芐脒的洗脫緩沖液從柱中洗下重組產(chǎn)物。
產(chǎn)物的比活按照Grinnell等人的方法(1987，Biotechnology 51189-1192)測(cè)定如下將從柱中洗脫下的濃縮的并透析過(guò)的產(chǎn)物先用固相凝血酶-凝血調(diào)變蛋白復(fù)合物活化。產(chǎn)物的酰胺解活性通過(guò)水解三肽底物S-2366(得自Helena Labs)而測(cè)定。產(chǎn)物的抗凝活性利用得自Helena的試劑通過(guò)延長(zhǎng)活化的部分凝血致活酶的時(shí)間而測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種制備重組DNA載體的方法，該方法包括將(Ⅰ)含有一種蛋白編碼順序的重組DNA化合物和(Ⅱ)含有一種啟動(dòng)子的DNA化合物連接起來(lái)，以便啟動(dòng)子在連接后定位驅(qū)動(dòng)所述編碼順序的表達(dá)，所述蛋白質(zhì)從氨基端到羧基端的氨基酸殘基順序如下MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILESER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARGALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLUGLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE GYSASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEUALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PROLEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILEASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLYARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU R1CYS SER LEU ASP ASNGLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYSSER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HISPRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYSLYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VALASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PROTRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALAVAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASPGLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARGTRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HISPRO R2TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HISLEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEUPRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLUTHR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALALYS ARG R3ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VALPRO HIS R4GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASNMET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP.ALA CYS GLU GLYASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEUVAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYRGLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HISILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中R1選自ASN和GLN，R2選自ASN和GLN，R3選自ASN和GLN，R4選自ASN和GLN。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法產(chǎn)生含有權(quán)利要求1的DNA化合物的重組DNA表達(dá)載體。
3.權(quán)利要求2的方法，該方法產(chǎn)生一種載體，其中R1為GLN、R2為ASN、43為ASN和R4為ASN。
4.權(quán)利要求3的方法，該方法產(chǎn)生選自質(zhì)粒pLPC-Q097和質(zhì)粒pGT-Q097-h的質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求2的方法，該方法產(chǎn)生一種載體，其中R1為ASN、A2為GLN、R3為ASN和R4為ASN。
6.權(quán)利要求5的方法，該方法產(chǎn)生選自質(zhì)粒pLPC-Q248和質(zhì)粒pGT-Q248-h的質(zhì)粒。
7.權(quán)利要求2的方法，該方法產(chǎn)生一種載體，其中R1為ASN、R2為ASN、R3為GLN和R4為ASN。
8.權(quán)利要求7的方法，該方法產(chǎn)生選自質(zhì)粒pLPC-Q313和質(zhì)粒pGT-Q313-h的質(zhì)粒。
9.權(quán)利要求2的方法，該方法產(chǎn)生一種載體，其中R1為ASN、R2為ASN、R3為ASN和R為GLN。
10.權(quán)利要求9的方法，該方法產(chǎn)生一種選自質(zhì)粒pLPC-Q329和質(zhì)粒pGT-Q329-h的質(zhì)粒。
11.一種經(jīng)從真核寄主細(xì)胞中分泌重組產(chǎn)生酶原型人蛋白C的方法，該方法包括以下步驟(A)用一種重組DNA載體轉(zhuǎn)化一種真核寄主細(xì)胞，所述載體包括(ⅰ)編碼一種氨基酸殘基順序的DNA順序，所述氨基酸殘基順序包括從氨基端到羧基端的以下氨基酸順序
其中R1選自ASN和GLN，R2選自ASN和GLN，R3選自ASN和GLN和R4選自ASN和GLN;(ⅱ)定位驅(qū)動(dòng)所述DNA順序表達(dá)的啟動(dòng)子;(B)將步驟(A)中轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞培養(yǎng)在允許所述DNA順序表達(dá)的條件下;(C)從所述培養(yǎng)物中回收所述蛋白C酶原。
12.權(quán)利要求11的方法，其中在步驟(B)中培養(yǎng)的所述寄主細(xì)胞選自293/pLPC-Q097、293/pLPC-Q248、293/pLPC-Q313、293/pLPC-Q329、293/pGT-Q097-h、293/pGT-Q248-h、293/pGT-Q313-h和293/pGT-Q329-h寄主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種重組產(chǎn)生高活性酶原型人蛋白C的方法。這些酶原形式不同于天然蛋白C，它們有更高的酰胺解和功能活性及新的糖類(lèi)結(jié)構(gòu)。還公開(kāi)了用于該方法的DNA化合物、載體和轉(zhuǎn)化株。
文檔編號(hào)C12R1/19GK1055560SQ9110120
公開(kāi)日1991年10月23日 申請(qǐng)日期1991年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月23日
發(fā)明者布魯斯·E·格里茨, 布賴(lài)恩·威廉·格林內(nèi)爾 申請(qǐng)人:伊萊利利公司