專利名稱：改進(jìn)的腦膜炎雙球菌多糖結(jié)合菌苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)改性的腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)B血清群多糖。本發(fā)明也提供多種菌苗，在該苗中相應(yīng)改性的多糖與蛋白質(zhì)載體結(jié)合。
由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌(E.coli)K1引起的腦膜炎仍是世界上主要的健康問(wèn)題。B型腦膜炎發(fā)生于地方性和流行性，并約占全部記錄的腦膜炎雙球菌腦膜炎病例的一半，而K1-陽(yáng)性大腸桿菌是新生兒腦膜炎的主要起因。現(xiàn)在尚無(wú)商業(yè)性的抗由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌K1引起的疾病菌苗。在很大程度上這是由于這樣一個(gè)事實(shí)，即腦膜炎雙球菌B血清群多糖(GBMP)在人體中僅產(chǎn)生很微弱的免疫。近來(lái)有某些報(bào)導(dǎo)基于GBMP與外膜蛋白質(zhì)形成復(fù)合體的選擇菌苗，然而迄今還沒(méi)有這些菌苗對(duì)人體有效的明顯證據(jù)。
近來(lái)，發(fā)展了基于含成化學(xué)改性的(N-丙?；?B血清群多糖-蛋白質(zhì)(N-Pr-GBMP-蛋白質(zhì))結(jié)合物菌苗的新概念。該菌苗在鼠中誘導(dǎo)IgG抗體的高滴度。該抗體不僅是預(yù)防性的，而且同未改性的GBMP(即-N-乙?；?GBMP)交叉反應(yīng)。這一概念已公開(kāi)在美國(guó)專利NO.4727136中并要求保護(hù)(1988年2月23日授權(quán)與Harold J.Jennings等人)。
已經(jīng)指出，例如在美國(guó)專利NO.4727136中公開(kāi)的增加交叉反應(yīng)抗體的菌苗只是在犧牲極限免疫耐受性時(shí)才是有成效的。這種假設(shè)被一般抗原決定簇證實(shí)是含理的，該抗原決定簇由天然N-Ac-GBMP和人及動(dòng)物組織中的α-(2-8)-連接的唾液酸殘基(最少需要10個(gè)殘基)鏈組成(Jennings，Contrib.Microbiol.Immunol.Basel，Karger，1989，Vol.10，151-165)。這些聚唾液基(polysialosyl)鏈的功能作為制備抗原并且大部分在胚胎中性細(xì)胞粘連方面與胚胎階段有關(guān)(Finne et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1983，112，482)。在出生后的成長(zhǎng)過(guò)程中，這種抗原是向下降調(diào)節(jié)(Friedlander et al，J.Cell Biol.1985，101，412)，但它在成年人在患病肌肉再生期間(Cashman at el，Ann.Neuron.，1987，21，481)在腫瘤細(xì)胞(Roth et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，1988，85，299)以及在天然K細(xì)胞(NK)和CD3+T細(xì)胞(Husmann et al，Eur.J.Immunol.，1989，19，1761)中表現(xiàn)出來(lái)。盡管至今對(duì)這些胎兒抗原的極限碉受性尚未形成結(jié)論，但通常認(rèn)為，由于這種交叉反應(yīng)，一些許可機(jī)構(gòu)對(duì)N-Pr-GBMP-蛋白質(zhì)結(jié)合物要進(jìn)行仔細(xì)研究，因?yàn)樵谒慌鷾?zhǔn)商品出售之前需做證明該菌苗安全性的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果導(dǎo)致相當(dāng)大的花費(fèi)并延誤時(shí)間。
本發(fā)明的一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)一種具有免疫特性的菌苗，其免疫特性強(qiáng)于N-Pr-GBMP蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一目的是提供一種顯示與GBMP交叉反應(yīng)實(shí)質(zhì)降低的菌苗。
本發(fā)明的一個(gè)方面，是提供具有唾液酸殘基N-乙?；?C2)被C4-C8酰基取代的改性腦膜炎雙球菌B血清群多糖。
本發(fā)明的另一方面，是提供一種抗原結(jié)合物，該結(jié)合物含有結(jié)合到合適的免疫蛋白質(zhì)上的N-C4-C8?；嗵牵⒕哂性鰪?qiáng)的致免疫性及誘導(dǎo)實(shí)質(zhì)上降低的交叉反應(yīng)抗體。
本發(fā)明的又一方面，是提供一種菌苗，該菌苗含有與合適載體或稀釋劑結(jié)合的N-C4-C8?；嗵?蛋白質(zhì)結(jié)合物。本發(fā)明的菌苗也可含有對(duì)人體適用的治療有效量的輔助劑，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。
本發(fā)明的再一方面，是提供一種哺乳動(dòng)物抗腦膜炎雙球菌和大腸桿菌K1感染的免疫方法，該方法包括將免疫有效量的本發(fā)明菌苗通過(guò)腸胃外給藥于受到這種感染的哺乳動(dòng)物，包括人。該菌苗的典型給藥量為每千克體重約1-50微克，例如每千克體重5-25微克。
另一方面，本發(fā)明提供了能夠預(yù)防由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌K1引起的腦膜炎的γ-球蛋白餾分。該γ-球蛋白餾分通過(guò)用本發(fā)明的菌苗免疫哺乳動(dòng)物而產(chǎn)生。然后將該γ-球蛋白餾分給藥于一個(gè)個(gè)體，以提供預(yù)防或治療由上述微生物正在引起的感染。由此可認(rèn)為，本發(fā)明的免疫菌苗結(jié)合物由于它的良好致免疫性及最低誘導(dǎo)GBMP交叉反應(yīng)抗體，它可作為治療抗血清的來(lái)源。本發(fā)明的結(jié)合物也可用于增加單克隆抗體，并有可能用于抗遺傳型抗體。
在我們的最近實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)，由上述的Jennings等人的美國(guó)專利4727136中公開(kāi)的N-Pr-GBMP-蛋白質(zhì)結(jié)合物誘導(dǎo)的大多數(shù)殺菌和預(yù)防抗體與GBMP交叉反應(yīng)抗體無(wú)關(guān)。實(shí)際上，大多數(shù)預(yù)防活性包含在與GBMP不交叉反應(yīng)的N-Pr-GBMP特殊抗體種群中。根據(jù)這一點(diǎn)，可認(rèn)為N-Pr-GBMP在腦膜炎雙球菌B血清群表面復(fù)制一種獨(dú)有的殺菌抗原決定簇。
本發(fā)明是以能夠含成化學(xué)改性的GBMP′s這一發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，該GBMP復(fù)制殺菌抗原決定簇，并且在其結(jié)合形式上，它不僅顯示增強(qiáng)的致免疫性，而且也基本上免避同GBMP交叉反應(yīng)的抗體誘導(dǎo)。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，一系列不同的化學(xué)改性的GBMP′s已分別被含成并與蛋白質(zhì)結(jié)合，隨后將結(jié)合物注射入鼠中，并與由N-Pr-GBMP-蛋白質(zhì)結(jié)合物產(chǎn)生的效果相比較。意想不到的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)N-C4-C8?；鵊BMP蛋白質(zhì)結(jié)合物基本上復(fù)制殺菌抗原決定簇，并可以基本上降低交叉反應(yīng)抗體的誘導(dǎo)，這種結(jié)合物的例子如正丁?；?、異丁?；?、正戊?；愇祯；?、新戊?；?、己酰基、庚?；托刘；约疤貏e是N-丁?；?N-Bu)GBMP-蛋白質(zhì)結(jié)合物。
利用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法從腦膜炎雙球菌中分離出腦膜炎雙球菌B血清群多糖。結(jié)合上述方法，腦膜炎雙球菌B血清群(株9818B)于37℃在發(fā)酵桶中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)時(shí)用每升蒸餾水中含30克脫水Todd Hewitt Broth(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。在發(fā)酵桶中生長(zhǎng)之前，該凍干株在37℃的蠟罐中于5%(V/V)Sheeps′Blood Agar(Difco Laboratories，Dotroit，Michigan)平皿上初始生長(zhǎng)。然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至盛在Erlenmyer曲頸瓶中的1.0升Todd Hewitt Broth(如上述)中，以190轉(zhuǎn)/分的速度在37℃下?lián)u動(dòng)該曲頸瓶7小時(shí)。然后將該接種物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵桶中。在發(fā)酵桶中生長(zhǎng)(16小時(shí))后，通過(guò)添加福爾馬林使最終濃度達(dá)到0.75%而殺死細(xì)菌。細(xì)菌通過(guò)連續(xù)離心分離出，并且除了蛋白質(zhì)通過(guò)攪拌含90%冷的(4℃)而不是熱的(50-60℃)的苯酚的原多糖溶液進(jìn)引提取的以外，基本上按照Bundle等人在J.Biol.Chem.，249，4797-4801(1974)中所述進(jìn)行純化。該后一種處理過(guò)程保證產(chǎn)生高分子量形式的GBNP。
大腸桿菌(018K1H7)(NRCC 4283)于37℃的發(fā)酵桶中在含有脫水Brain Heart Infusion(BHI;37克/升)(Difco Laboratiories，Detroit，Michigan)的蒸餾水中生長(zhǎng)。在發(fā)酵桶中生長(zhǎng)之前，該凍干株在Erlenmeyer曲頸瓶中的50mlBHI溶液(與上述相同)中生長(zhǎng)，在37℃下以200轉(zhuǎn)/分的速度搖動(dòng)曲頸瓶7小時(shí)。然后這種生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到1.5升BHI(如上述)中并在如上述相同條件下生長(zhǎng)7小時(shí)。然后將接種物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵桶中。
分離和純化大腸桿菌K1囊多糖所用的工藝過(guò)程與上述分離腦膜炎雙球菌B血清群多糖工藝過(guò)程完全一樣。
應(yīng)指出的是，有關(guān)上述的分離和純化工藝過(guò)程并不是唯一可使用的，而其他公開(kāi)的工藝過(guò)程也是適用的，例如Watson等人在J.Immunol.，81，331(1958)中描述的和在上述美國(guó)專利4727136中公開(kāi)的那些工藝過(guò)程。
天然多糖進(jìn)行N-脫去乙?；?，以在分子的唾液酸殘基部分形成一個(gè)反應(yīng)胺基。用任何已知的方法可發(fā)生N-脫乙酰作用，例如在增高溫度(如約90-110℃)和pH值約為13-14的堿性水培養(yǎng)基中。合適的堿性水培養(yǎng)基是堿金屬氫氧化物水滌液，例如約2M濃度的氫氧化鈉。另外，肼的水溶液也可使用。N-脫乙酰作用程度可以從約30%至100%變化，這取于具體條件。優(yōu)選的是達(dá)到約90-100%N-脫乙酰作用。N-脫去乙?；a(chǎn)物可通過(guò)例如冷卻、中和來(lái)回收，如需要可純化，并凍干。
在進(jìn)行N-脫乙酰作用之前，天然多糖具有約500000-800000道爾頓范圍的平均分子量。由于N-脫乙酰作用的結(jié)果，產(chǎn)生具有平均分子量在約10000-50000道爾頓范圍的多糖片段。
N-脫去乙?；亩嗵瞧稳缓笤貼-?；?，以產(chǎn)生相應(yīng)的N-?；a(chǎn)物。N-?；饔每赏ㄟ^(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn)，即將N-脫去乙?；亩嗵侨芙庠趐H為7.5-9.0的水培養(yǎng)基中，繼之加入合適的?；；蛇x擇地與乙醇一起加入，以增加溶解度，并冷卻到10℃以下，一直到反應(yīng)完成為止。如果需要，反應(yīng)培養(yǎng)基可以純化，如通過(guò)滲析，然后回收N-?；a(chǎn)物，典型的是通過(guò)凍干。反應(yīng)在約10-20小時(shí)內(nèi)基本完成。用分析技術(shù)，典型的是用1Hnmr(核磁共振)測(cè)定N-酰化作用程度，該作用程度至少為90%，并可能接近100%。N-酰化作用并不導(dǎo)致片段分子量任何明顯降低。
根據(jù)本發(fā)明，為了結(jié)合作用的效果，優(yōu)選具有平均分子量相當(dāng)于約30-200個(gè)唾液酸殘基的N-?；镔|(zhì)。這一般通過(guò)使用Ultragel(商標(biāo))AcA44(顆粒直徑60-140μm)柱，用PBS作洗脫液對(duì)N-?；腉BMP進(jìn)行凝膠過(guò)濾而得到。另外，也可使用合適尺寸的膜。
本發(fā)明使用平均分子量為10000-40000道爾頓，例如10000-15000道爾頓的N-?；镔|(zhì)。這可通過(guò)收集含有上述平均分子量范圍的N-?；腉BMP物質(zhì)的柱洗脫液餾分而得到。根據(jù)本發(fā)明，高平均分子量的，例如在30000-40000道爾頓范圍的N-酰化物質(zhì)也是適用的。
本發(fā)明的菌苗通過(guò)將N-?；亩嗵峭环N合適的免疫載體蛋白質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生。最好，載體蛋白質(zhì)本身是免疫原。合適的載體蛋白質(zhì)例子是破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRMs)，最好是CRM197(從Sclavo Ltd.，Siena，Italy獲得)，以及細(xì)菌蛋白質(zhì)載體，如腦膜炎雙球菌外膜蛋白質(zhì)類。
可以作用任何一種結(jié)合作用方式使改性的多糖片段與載體蛋白質(zhì)結(jié)合。優(yōu)選的方法是在美國(guó)專利4356170中公開(kāi)的方法，即將末端醛基團(tuán)(借助順式-連位羥基基團(tuán)的氧化作用)引入N-酰化的多糖，并通過(guò)還原性胺化作用使醛基團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基團(tuán)偶合。因此，多糖和蛋白質(zhì)通過(guò)-CH2-NH-蛋白質(zhì)鍵而連接。
然而應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明的結(jié)合菌苗并不限于通過(guò)還原性胺化作用而產(chǎn)生的那些。因此，也可按照Schneerson，R.等人在b型流感嗜血桿菌多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備、特性和致免疫性(J.Exp.Med.，1952，361-476(1980))中的描述和美國(guó)專利4644059(授與Lance K.Gordon)的描述，用己二酰肼間隔基將N-酰化的多糖與載體蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)生產(chǎn)菌苗。另外，也可用Merck發(fā)展的二元間隔基技術(shù)(按照Marburg，s.，等人在“Biomolecular Chemistry of Macrom oleculesSynthesis of Bacteial Polysaccharide Conjugates With Neisseria Meningitidis Membrane Protein”，J.Am.Chem.Soc.，108，5282-5287(1986)中的描述)，或者可能用還原末端方法(參閱授與Anderson的美國(guó)專利4673574)。
所得到的N-?；亩嗵?蛋白質(zhì)結(jié)合物不具有有效交聯(lián)，并且在水溶液中是可溶的。對(duì)菌苗的使用來(lái)說(shuō)，這使及本發(fā)明的結(jié)合物成為良好的選擇對(duì)象。
所得到的本發(fā)明的N-?；亩嗵?蛋白質(zhì)結(jié)合物已在鼠中做過(guò)體外試驗(yàn)，結(jié)果普遍表明，與N-丙?；亩嗵窍啾?，它具有改進(jìn)的免疫性能。另外，觀察到基本上降低形成交叉反應(yīng)抗體。根據(jù)這一點(diǎn)，可以相信本發(fā)明的菌苗可用于抵抗由腦膜炎雙球菌B血清群或大腸桿菌K1引起的腦膜炎。特別感興趣的是，該菌苗可預(yù)防人的嬰幼兒最易感染的細(xì)菌腦膜炎。
本發(fā)明的菌苗典型地是通過(guò)將結(jié)合物分散于任何適宜的可藥用的載體中而形成，所述的載體例如生理鹽水或其他可注射的液體。該菌苗腸胃外給藥，如皮下的、腹膜內(nèi)的或肌肉的。在菌苗中也可存在常用的添加劑，例如穩(wěn)定劑如乳糖或山梨醇，及輔助劑如磷酸鋁、氫氧化鋁或硫酸鋁。該菌苗也可能結(jié)合成為復(fù)合菌苗的一部分。
用于人的嬰幼兒的菌苗的合適劑量通常在每千克體重約5-25微克或約1-10微克范圍內(nèi)。
實(shí)施例用下面非限制性實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。為評(píng)定之目的已制備N-乙?；?、N-丙酰基、N-丁?；?、N-異丁?；?、N-戊?；蚇-己?；?GBMP-蛋白質(zhì)結(jié)合物，而結(jié)果在實(shí)施例中論述。
用于制備結(jié)合物的材料和方法(a)材料從Sigma Chemicals Co.，St.Louis，Mo.購(gòu)得丙酸酐、丁酸酐、異丁酸酐、戊酸酐和己酸酐及多聚乙酰神經(jīng)氨酸。由于多聚乙酰神經(jīng)氨酸在結(jié)構(gòu)上與腦膜炎雙球菌B血清群多糖(GBMP)相同，所以以后把它當(dāng)作GBMP。從Institut Armand Frappier，Laval，Quebec購(gòu)得破傷風(fēng)類毒素(TT)，而其單體形式(用于所有結(jié)合作用)是按照上述制備措施經(jīng)過(guò)一個(gè)Bio-Gel(商標(biāo))AO.5(200-400目)柱(1.6×90cm)(Bio-Rad，Richmond，CA.)平衡并用0.01M磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)(pH7.4)進(jìn)行洗脫而獲得的。
(b)GBMP的N-脫乙酰作用將GBMP(Na+鹽)(1.0g)溶解在5ml2M的NaOH溶液中，隨后加入NaBH4(150mg)，在一個(gè)螺旋蓋Teflon(商標(biāo))容器(60ml)中將該溶液在110℃加熱6小時(shí)。這種工藝規(guī)程基本上與J.Immunol.，134，2651(1985)和美國(guó)專利4727136(兩者的作者都是Harold J.Jennings等人)中公開(kāi)的工藝規(guī)程相同。然后冷卻的稀釋溶液在4℃對(duì)著蒸餾水進(jìn)行完全滲析，并凍干。達(dá)到N-脫去乙?；腉BMP的事實(shí)由在N-脫去己?；腉BMP的1H-nmr光譜中甲基乙酰氨基信號(hào)(單獨(dú)在σ2.07)消失而得到證實(shí)。
(c)GBMP的N-?；饔脤-脫去乙酰基的GBMP(1.0g)溶解在50ml5%NaHCO3水溶液中。向5份獨(dú)立的等分溶液(100ml上述溶液)中分別加入丙酸酐、丁酸酐、異丁酸酐、戊酸酐和己酸酐。這些試劑是在室溫下于3小時(shí)時(shí)間內(nèi)以3×0.5ml的等分量加入的，而用0.5NNaOH使溶液的pH保持在8.0。在每次加入酐的同時(shí)加入甲醇(0.5ml)，以增加其溶解度。最后在4℃下將溶液攪拌16小時(shí)，在4℃下對(duì)著蒸餾水進(jìn)行完全滲析，并凍干。獲得單獨(dú)的N-丙?；摹-丁?；摹-異丁?；?、N-戊酰基化的和N-己?；腉BMP，其產(chǎn)率都超出90%。在每種情況下，通過(guò)在N-脫去乙?；腉BMP的相應(yīng)的1H-nmr光譜中的消失證實(shí)N-?；饔没就瓿?。
(d)不同N-酰化的GBMP片段尺寸使用Ultragel(商標(biāo))AcA44(顆粒直徑60-140um)柱(IBF)以得到所需平均分子量的N-?；腉BMP物質(zhì)，收集用FLPC(見(jiàn)下面)在K00.5-K00.7測(cè)量的來(lái)自柱的洗脫餾分，滲析并凍干。這種K0的范圍與約30-50個(gè)唾液酸殘基的N-?；腉BMP(平均分子量為10000-15000道爾頓，典型的是12000道爾頓)相一致。也可收集并結(jié)合與具有平均分子量為30000-40000道爾頓片段相對(duì)應(yīng)的K00.2-K00.4范圍內(nèi)的餾分。因此，對(duì)在K00.2-0.7范圍內(nèi)洗脫的N-?；奈镔|(zhì)是特別感興趣的。
(e)多糖結(jié)合物通過(guò)高碘酸鹽氧化(見(jiàn)美國(guó)專利4356170)將末端酐基引入N-?；腉BMP。室溫下在暗處在0.1MNaIO4(偏高碘酸鈉)(10ml)水溶液中將上面的N-?；腉BMP片段氧化2小時(shí)。然后通過(guò)加入1ml1，2-亞乙基二醇將過(guò)量高碘酸鹽消耗掉，隨后在4℃下將該溶液完全滲析，并凍干。在N-脫乙酰作用過(guò)程中(除GBMP外)使用NaBH4使每個(gè)N-?；腉BMP的末端還原性唾液酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)鏈多羥基化合物殘基。這種類型的殘基對(duì)高碘酸鹽是敏感的(見(jiàn)J.Immunol.，127，1011(1981)和美國(guó)專利4356170，Harold J.Jennings et al)，因此，在兩端都導(dǎo)致酐基團(tuán)引入N-?；腉BMP片段。
將100mg氧化的片段溶解在2ml0.1M的NaHCO3(PH8.1)緩沖液中，并向這種溶液添加20mgTT。最后，接著添加40mg氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)，在室溫下慢慢攪拌溶液。在結(jié)合過(guò)程中使用含Superose(商標(biāo)名)12HR10/30(Pharmacia)的凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行FPLC，在PBS緩沖液(PH7.2)中以1ml/分的速度流動(dòng)，在214nm處測(cè)量蛋白質(zhì)和N-?；钠巍Ｆ蔚腒0＝0.6，TT的K0＝0.39及結(jié)合物的K0＝0.23。當(dāng)所有TT耗盡時(shí)，這種結(jié)合反應(yīng)就完成了，TT耗盡是按照對(duì)應(yīng)于K00.39組分的FPLC色譜峰值損失測(cè)定的。在大多數(shù)情況下，結(jié)合反應(yīng)在2天內(nèi)可完成，但允許總反應(yīng)時(shí)間為4天。在凝膠過(guò)濾之前，潛在的未反應(yīng)的醛基最后用20mg氫化硼鈉進(jìn)行還原。
通過(guò)使用生物凝膠(Bio Gel)柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾、用PBS作洗脫液使多糖-TT結(jié)合物與多糖片段分離。含有結(jié)合物的洗脫液逆著蒸餾水進(jìn)行滲析并冷凍干燥。N-?；腉BMP-TT結(jié)合物含有12-30%、通常是12-20%的唾液酸，這種唾液酸是用間苯二酚方法測(cè)定的(這種方法見(jiàn)Svennerholm，L.，Quantitative Resorcinol-Hydrochloric Acid Method，Biochim.Biophys.Acta.24，604(1957))。這表明該結(jié)合物具有的多糖與TT的克分子比為2-3∶1。
免疫作用和免疫測(cè)定(a)免疫作用的程序20只雌性白色CFI鼠(出生8-10周)每只單獨(dú)用存在于Freund完全輔藥(FCA)(Difco，Detroit，MI)中的N-酰化的GBMP-TT結(jié)合物進(jìn)行3次腹膜內(nèi)免疫(每隔3星期進(jìn)行一次)。每次免疫都含有足夠的結(jié)合物(10-12μg)以便含有2μg唾液酸。在第3次注射后第11天鼠出現(xiàn)貧血。下面實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清完成。
(b)放射性抗原結(jié)合測(cè)定這種測(cè)定按照改進(jìn)的放射性免疫法測(cè)定抗體量(Farr)技術(shù)在體外使用[3H]-標(biāo)記的GBMP(Jennings H.J.，et al，Determinant Specificities of the Groups B and C polysaccharides of Neisseria meningitidis，J.Immunol.，134，2651(1985)或者[3H]-標(biāo)記的N-Pr-GBMP(Jennings H.J.，et al，Unigue Intermolecular Bactericidel Epitope involving the HomeSialo Polysaccharide Capsule on the Cell Surface of Group B Neisseria meningitidis and Escherichie coli K1，J.Immunol.，142，3585-3591(1989)進(jìn)行。用于放射性抗原結(jié)合測(cè)定的反應(yīng)混合物通過(guò)將20μl混合抗血清用PBS稀釋至100ul，在Eppendorf聚丙烯微量試管中，與在50μlPBS中的[3H]標(biāo)記的GBMP和[3H]-標(biāo)記的N-Pr-GBMP混合而獲得，所述的混合抗血清取自每只單獨(dú)用N-?；腉BMP-TT結(jié)合物免疫的20只鼠群。在4℃培育16小時(shí)后，在4℃向試管中加入150μl飽合硫酸銨(PH7.0)并攪拌試管，在4℃保持30分鐘。將試管以15000轉(zhuǎn)/分離心處理10分鐘并從試管中取出130μl兩等分試樣。將兩等分試樣與2ml水及一種含甲苯閃爍體(ACS含水閃爍體)混合并在液體閃爍計(jì)數(shù)器中對(duì)混合物進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果示于表1中。
表1[3H]-標(biāo)記的N-AC-GBMP與各種鼠的抗-N-?；?GBMP-TT結(jié)合物血清的結(jié)合抗血清結(jié)合%a1 2 3 4N-Pr-GBMP-TT 40 40 39 12N-Bu-GBMP-TT 4 4 7 4N-Iso Bu-GBMP-TT 9 / / /N-Pen-GBMP-TT 36 / / /N-Hex-GBMP-TT 16 / / /a表示對(duì)取自20只免疫鼠的混合抗血清做的四次結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
在表1和其他表中使用的縮寫詞N-Ac、N-Pr、N-Bu、N-IsoBu、N-Pen和N-Hex分別代表N-乙酰基、N-丙?；-丁?；-異丁?；-戊?；蚇-己酰基。
數(shù)字1、2、3、4是4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表1清楚地表明N-Ac-GBMP(其中載有相同的抗原決定簇如胎兒的N-CAM)與N-Bu-GBMP、N-IsoBu-GBMP、N-Pen-GBMP和N-Hex-GBMP誘導(dǎo)的抗血清的結(jié)合少于與N-Pr-GBMP誘導(dǎo)的抗血清的結(jié)合。由此從表1可以推知N-Bu、N-IsoBu、N-Pen和N-Hex多糖結(jié)合物比N-Pr結(jié)合物增加交叉反應(yīng)抗體要少。
(c)定量沉淀素分析這些實(shí)驗(yàn)按照Kabat和Mayer方法(Experimental Immunochemistry charlesc.Thomas，springfield，p，22(1961))進(jìn)行。100μl抗N-?；鵊BMP-TT血清等分試樣(在PBS中稀釋至5倍)在試管中與總體積為200μl(用PBS調(diào)節(jié))的增高濃度的N-乙?；?多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸)，N-丙酰基，N-丁?；?，N-異丁?；?，N-戊酰基和N-己?；鵊BMP進(jìn)行反應(yīng)。在這些實(shí)驗(yàn)中使用這些衍生物的高分子量餾分，它們由Ultragel AcA 44柱(K00.4，通過(guò)FPLC測(cè)量)的洗脫而獲得，這種柱預(yù)先用于測(cè)定N-酰化的GBMP片段尺寸。這些試管伴隨每日混合在4℃培育4天，然后離心處理，抗體蛋白質(zhì)數(shù)量按照Lowry等人的方法-用福林(Folin)酚試劑測(cè)定蛋白質(zhì)(J.Biol.Chem.1933，265(1951))進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果示于表2表2使用不同的N-?；鵊BMP作為沉淀抗原時(shí)，鼠的抗N-?；?GBMP-TT血清的沉淀a抗血清 N-?；?GBMP抗原N-乙 N-丙 N-丁 N-戊 N-己?；? 酰基 ?；? 酰基 ?；鵑-Pr-GBMP-TT 0.16 0.40 0.20 0.15 0.15N-Bu-GBMP-TT 0.04 1.15 2.60 3.20 1.90N-Pen-GBMP-TT 0.13 0.38 0.44 6.35 3.55N-Hex-GBMP-TT 0.02 0.08 0.80 4.15 4.40
a表示以mg/ml抗血清表示的已沉淀的抗體最大數(shù)量。
關(guān)于交叉活性，表2第1欄表明，與N-Pr結(jié)合物相比，N-Bu和N-Hex結(jié)合物產(chǎn)生極少量交叉反應(yīng)抗體。也可以看出，N-Pen結(jié)合物較N-Pr結(jié)合物產(chǎn)生的交叉反應(yīng)抗體少。關(guān)于致免疫性(以相同應(yīng)答表示)，由表2可以看出，N-Bu-(2.60)，N-Pen-(6.35)和N-Hex-(4.40)GBMP-TT結(jié)合物比N-Pr-GBMP-TT結(jié)合物(0.40)是更致免疫的。
(d)ELISA給EIA微量滴定板(Flowlabs，Mississauga，Ontario，Canada)的井涂上濃度為10μg/ml的溶于PBS中的或GBMP-、NPrGBMP-或NBu-GBMP10-BSA結(jié)合物溶液，每個(gè)井涂上100μl。該板在4℃放置18小時(shí)，在涂抹后，在室溫將這些板用1%的溶于PBS的牛血清白蛋白溶液沖洗10分鐘(阻塞步驟)。然后用在PBS中連續(xù)稀釋10倍的100μl抗-鼠-N-?；鵊BMP-TT結(jié)合物血清填入這些井中并在室溫下將這些板培育1小時(shí)。用SBT沖洗后，在室溫用50μl山羊抗鼠免疫球蛋白過(guò)氧化物酶標(biāo)記的結(jié)合物(Kirkegard and Perry Laboratories)的相應(yīng)稀釋液培育1小時(shí)，然后吸出井中的物質(zhì)并用SBT將板洗滌5次。最后向每個(gè)井中加入50μl四亞甲基藍(lán)色過(guò)氧化物酶培養(yǎng)基(TMB)(Kirkegard and Perry Laboratories)，10分鐘后使用Multiscan分光光度計(jì)(Flow Laboratories，Mississauga，Ont.)。結(jié)果示于表3。
表3
混合鼠抗-N-?；?GBMP-TT結(jié)合物血清對(duì)N-酰基-GBMP-BSA結(jié)合物的ELISA滴度涂敷抗原抗血清滴度aa，N-Pr-GBMPba，N-Bu-GBMPba，N-IsoBu-GBMPbN-AC-GBMP-BSA 7800 1000 7000N-Pr-GBMP-BSA 40000 39000 9800N-Bu-GBMP-BSA 26000 52000 9700N-IsoBu-GBMP-BSA / / 25000a滴度(GM)＝50%的稀釋溶液在450nm處最大吸光度的倒數(shù)。
b表示在鼠中由同系化合物N-?；?GBMP-TT結(jié)合物誘導(dǎo)的N-?；厥饪寡?。
關(guān)于交叉反應(yīng)性，由表3可以看出，N-Bu-GBMP-TT結(jié)合物對(duì)N-AC-GBMP的交叉反應(yīng)抗體的增加(1000)比N-Pr-GBMP-TT結(jié)合物(7800)少。其原因在于，GBMP與由N-Pr-GBMP-TT結(jié)合物誘導(dǎo)的抗體的結(jié)合少于與由N-Bu-GBMP-TT結(jié)合物誘導(dǎo)的抗體的結(jié)合。類似的解釋適用于N-IsoBu-GBMP-TT結(jié)合物。
關(guān)于致免疫性。如同系結(jié)合的滴度52000(N-Bu)和40000(N-Pr)所示，N-Bu結(jié)合物比N-Pr結(jié)合物是更致免疫的。
(e)放射性結(jié)合抑制測(cè)定為了提高大分子尺寸化的N-酰基GBMP的濃度，向20μl的鼠抗-N-Pr-GBMP-TT結(jié)合物抗血清中添加抑制劑(溶于80μlPBS)，其數(shù)量是在沒(méi)有抑制劑時(shí)足以結(jié)合50%的(3H)-標(biāo)記的N-Pr-GBMP。試管在37℃培育1小時(shí)并加入50μl溶于PBS中的(3H)-標(biāo)記的-N-Pr-GBMP。在平靜之后，按照上述放射性抗原結(jié)合測(cè)定法進(jìn)行精確測(cè)定。作用下式計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)抑制百分?jǐn)?shù)＝100×[(有抑制劑的每分鐘計(jì)數(shù)-無(wú)抑制劑的每分鐘計(jì)數(shù))/(無(wú)抗體的每分鐘計(jì)數(shù)-無(wú)抑制劑的每分鐘計(jì)數(shù))]結(jié)果列于表4。
表4(3H)-標(biāo)記的N-Pr-GBMP與IgG2a′ IgG2b(A)a和IgG(B)a抗體誘導(dǎo)的鼠抗N-Pr-GBMP-TT結(jié)合物的結(jié)合抑制抑制劑bA BN-AC-GBMP ＞50.0 ＞50.0N-Pr-GBMP 0.6 0.3N-Bu-GBMP 0.3 0.2N-IsoBu-GBMP ＞50.0 /N-Pen-GBMP 2.3 2.5N-Hex-GBMP 10.2 10.0a是鼠的多克隆抗N-Pr-GBMP-TT血清餾分(Jennings等人在J，Immuol.，142，3585-3591(1938)中已描述)b是產(chǎn)生50%抑制作用的抑制劑的微克數(shù)。
殺菌測(cè)定 這些測(cè)定按照J(rèn)ennigs等人在J.Exp.Med.，165，1207-1211(1987)中描述的方法進(jìn)行。
腦膜炎雙球菌株B(M986)用于這些測(cè)定。結(jié)果列于表5
表5(3H)-標(biāo)記的-N-Pr-GBMP與各種鼠抗N-?；?GBMP-TT結(jié)合物血清結(jié)合和相應(yīng)的抗血清的殺菌滴度抗血清抗血清a(μl) 殺菌滴度bN-Pr-GBMP-TT 13 128N-Bu-GBMP-TT 10 64N-IsoBu-GBMP-TT ND 64N-Pen-GBMP-TT 24 64N-Hex-GBMP-TT ＞100 8N-Ac-GBMP-TT ＞100 8a是要求50%結(jié)合的抗血清(用PBS稀釋至5倍)的μl數(shù)b是稀釋實(shí)驗(yàn)?zāi)撤N稀釋差別，例如128與64相比，在實(shí)驗(yàn)誤差之內(nèi)。
表4表明，N-Bu-GBMP象N-Pr-GBMP一樣是一種對(duì)N-Pr-GBMP與其自身的同系抗體結(jié)合的良好抑制劑。因此，用N-Bu-GBMP代替N-Pr-GBMP不會(huì)使N-Pr-GBMP所具有的性能顯著損失。表5表明，N-Bu-GBMP象N-Pr-GBMP一樣也結(jié)合由N-Pr-GBMP-TT結(jié)合物誘導(dǎo)的抗體。由N-Bu-GBMP-TT和N-Pr-GBMP-TT結(jié)合物兩者誘導(dǎo)的抗血清具有類似的殺菌滴度。這些數(shù)據(jù)表示，N-Bu-GBMP，N-IsoBu-GBMP和N-Pen-GBMP的摸擬在腦膜炎雙球菌B血清群表面殺菌抗原決定簇的能力與N-Pr-GBMP相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.一種改性的腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)B血清群多糖，它具有的唾液酸殘基N-乙酰基被C4-C8?；〈?br> 2.一種大腸桿菌(E.coli)K1夾膜多糖，它具有的唾液酸殘基N-乙?；籆4-C8?；〈?br> 3.一種權(quán)利要求1所述的改性多糖，其中C4-C8?；x自正丁基，異丁基，正戊基，正己基，正庚基和正辛基。
4.一種權(quán)利要求3所述的改性多糖，其中?；x自正丁基，異丁基，正戊基和正己基。
5.一種權(quán)利要求2所述的改性多糖，其中C4-C8酰基選自正丁基，異丁基，正戊基，正己基，正庚基和正辛基。
6.一種權(quán)利要求5所述的改性多糖，其中酰基選自正丁基，異丁基，正戊基和正己基。
7.一種權(quán)利要求1所述的改性多糖，它的平均分子量在10，000-50，000范圍內(nèi)。
8.一種權(quán)利要求2所述的改性多糖，它的平均分子量在10，000-50，000范圍內(nèi)。
9.一種權(quán)利要求1所述的改性多糖，它具有的N-?；饔贸潭燃s為90-100%。
10.一種權(quán)利要求2所述的改性多糖，它具有的N-?；饔贸潭燃s為90-100%。
11.一種含有結(jié)合到合適免疫蛋白質(zhì)上的腦膜炎雙球菌B血清群多糖的結(jié)合物，其中該腦膜炎雙球菌B血清群多糖具有的唾液酸殘基N-乙?；籒-C4-C8-?；〈?。
12.一種權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其中?；x自正丁基，異丁基，戊基，己基，庚基和辛基。
13.一種權(quán)利要求12所述的結(jié)合物，其中?；x自正丁基，異丁基，戊基和己基。
14.一種權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其中蛋白質(zhì)選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRM)和細(xì)菌蛋白質(zhì)載體。
15.一種權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其中蛋白質(zhì)和多糖是通過(guò)-CH2-NH-蛋白質(zhì)鍵共價(jià)健合的。
16.權(quán)利要求14所述的結(jié)合物，其中CRM是CRM197。
17.一種含有權(quán)利要求11的結(jié)合物和一種可藥用的可注射載體的菌苗。
18.一種權(quán)利要求17所述的菌苗，它還含有一種生理可接受的輔藥。
19.一種權(quán)利要求18所述的菌苗，其中所述輔藥選自氫氧化鋁，磷酸鋁和硫酸鋁。
20.一種哺乳動(dòng)物抗腦膜炎雙球菌和大腸桿苗K1感染的免疫方法，該方法包括以腸胃外方式給受到所述感染的哺乳動(dòng)物施以治療有效量的如權(quán)利要求17中所述的菌苗這一步驟。
21.一種權(quán)利要求20所述的方法，其中施用菌苗的劑量為以每千克體重約1-25微克。
22.一種對(duì)由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌K1引起的腦膜炎能被動(dòng)預(yù)防的γ-球蛋白餾分，該γ-球蛋白餾分是通過(guò)用一種如權(quán)利要求17中所述的菌苗免疫哺乳動(dòng)物，并從所述的哺乳動(dòng)物中將γ-球蛋白分離出而產(chǎn)生的。
全文摘要
所具有的唾液酸殘基N-乙?；籒-?；〈男缘哪X膜炎雙球菌B血清群多糖(GBMP)顯示出增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。此外，與未改性腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌(E.coli)K1囊多糖及其有共同抗原決定簇的其他組織細(xì)胞交叉反應(yīng)的抗體誘導(dǎo)減到最小程度。改性的多糖與一種生理上可接受的蛋白質(zhì)(例如破傷風(fēng)類毒素)的結(jié)合誘導(dǎo)特殊預(yù)防抗體的產(chǎn)生，該抗體具有不可忽視水平的GBMP交叉反應(yīng)抗體，因此能夠預(yù)防由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌K1引起的感染。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1055541SQ9011044
公開(kāi)日1991年10月23日 申請(qǐng)日期1990年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1989年12月14日
發(fā)明者哈羅德·J·詹寧斯, 弗朗西斯·米瓊 申請(qǐng)人:加拿大國(guó)家研究委員會(huì)