專利名稱：細(xì)胞分裂素混合粉劑及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)胞分裂素混合粉劑的方法，該粉劑屬于一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
1950-1953年，中國(guó)農(nóng)科院尹莘耘教授在調(diào)查棉麥病害時(shí)，發(fā)現(xiàn)凡是種過(guò)三年紫花苜蓿的地塊上，換種棉花或小麥時(shí)，不僅植株高壯，而且棉花的黃枯萎病和小麥銹病的發(fā)生均較連種棉麥的地塊輕微。尹莘耘教授從苜蓿根部分離并測(cè)定各種放線菌對(duì)棉花黃萎和立枯病菌的拮抗性能。分析結(jié)果表明，自苜蓿根部分離的高效抗生菌的比率，較從其它作物根部或土壤中分離的高達(dá)5-10倍。其中，從陜西省涇陽(yáng)縣苜蓿根上分離的“5406”號(hào)放線菌，在生長(zhǎng)過(guò)程中能分泌數(shù)種植物生長(zhǎng)刺激素及抗生素。具有刺激細(xì)胞分裂，促進(jìn)作物葉綠素增加，促進(jìn)早熟，?；ū９啦】共?，提高作物產(chǎn)量。資料證明，似“5406”號(hào)這樣多功能菌株，在國(guó)外屬罕見(jiàn)。
菌株5406號(hào)經(jīng)過(guò)鑒定，屬于粉紅孢類群鏈霉菌的一個(gè)新種，定名為涇陽(yáng)鏈霉菌(Streptomycesjingyangensisn.spTaoetal，1978)，并指定5406為這個(gè)新種的典型菌株，保存在中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，編號(hào)為4.891。其分泌物經(jīng)鑒定屬細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。
國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)都曾報(bào)道過(guò)多種細(xì)菌和與植物共生的菌根真菌培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)天然細(xì)胞分裂素及細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，但都未曾對(duì)如何提高這些菌株產(chǎn)生細(xì)胞分裂素活性以及如何工廠化生產(chǎn)細(xì)胞分裂素有過(guò)報(bào)導(dǎo)。
從50年代末到70年代末，5406的應(yīng)用技術(shù)以抗生素肥料用于農(nóng)業(yè)，簡(jiǎn)稱5406菌肥，在全國(guó)各地應(yīng)用中，對(duì)多種作物獲得良好的增產(chǎn)效果，但是5406菌肥是采用中國(guó)傳統(tǒng)固體發(fā)酵法生產(chǎn)，該方法雖然簡(jiǎn)單，成本低廉，但仍有很多缺陷(1)由于未對(duì)5406菌種加以篩選，故菌種退化嚴(yán)重，菌肥的肥效減小;(2)由于生產(chǎn)品僅為菌肥，故受到施用方法及自然條件限制;(3)菌肥的有效成分少，效果慢。
本發(fā)明針對(duì)以上缺陷提出一種篩選高產(chǎn)“5406”菌株的方法，以及用5406菌株生產(chǎn)細(xì)胞分裂素混合粉劑的工藝。
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明1、5406菌種分離與篩選鏈霉菌菌株5406是從我國(guó)陜西省涇陽(yáng)縣苜蓿地的苜蓿根部分離到的，通過(guò)鑒定屬于粉紅孢類群鏈霉菌的一個(gè)新種，定名為涇陽(yáng)鏈霉菌(Streptomycesjingyangensisn.spTaoetal，1978)。
2、形態(tài)和培養(yǎng)特征基內(nèi)菌絲體呈分枝狀，未觀察到菌絲斷裂現(xiàn)象。孢子絲單槎分枝，年幼時(shí)直或波曲，成熟時(shí)呈2-4圈松敞螺旋，有時(shí)可多至6-7圈。孢子長(zhǎng)橢圓形到柱形，1.4-1.6×0.8-1.0微米。孢子表面光滑，形似稻種。無(wú)輪生枝，無(wú)游動(dòng)孢子，無(wú)孢束和菌核。菌株在瓊脂培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)淺黃，反面木瓜黃到虎皮黃。氣生菌絲淺玫瑰粉到落英淡粉，可溶性色素微黃到淺粉。在孢子層表面產(chǎn)生茶色小露珠，并放出清涼的冰片香味。
生理特性黑素反應(yīng)，在葡萄糖酪氨酸瓊脂，酵母膏酪氨酸瓊脂和試驗(yàn)所用其它有機(jī)培養(yǎng)基上，黑素均為負(fù)反應(yīng)。水解淀粉強(qiáng)烈。液化明膠明顯。凝固并胨化牛奶。產(chǎn)生H2S明顯，使懸掛于培養(yǎng)液上的醋酸鉛紙條變黑。纖維素，生長(zhǎng)。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。利用葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇;不利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、棉籽糖和蔗糖。利用肌醇可疑。
3、菌種選育把退化的5406菌株接入苜蓿根系進(jìn)行復(fù)壯處理，30-60天取苜蓿根，用0.05-0.15%升汞水消毒3-7分鐘，用滅菌蒸餾水洗苜蓿根2-4次，用無(wú)菌研缽磨成漿狀稀釋分離，分離培養(yǎng)基為高氏一號(hào)加1%苜蓿根煮汁。選擇標(biāo)準(zhǔn)菌落長(zhǎng)的豐滿，中央突起的;菌落形狀較大的;菌落色澤較紅的;菌落生長(zhǎng)快;菌落表面分泌露珠多的。根據(jù)這5個(gè)條件選擇菌落做刺激性試驗(yàn)及拮抗性試驗(yàn)。
(1)用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測(cè)定經(jīng)選擇的菌株產(chǎn)生細(xì)胞分裂素活性。挑選大小均一的黃瓜種子(津研1號(hào)或2號(hào))，用0.05-0.15%升汞水表面滅菌5-7分鐘，無(wú)菌蒸餾水沖洗數(shù)次，置于墊有濕潤(rùn)濾紙的無(wú)菌平皿內(nèi)，27-30℃下暗處發(fā)芽5-6天，在暗室綠光燈下，從每一個(gè)幼苗上切下子葉，切除全部下胚軸，選取大小均一的子葉，葉面朝上，放在事先已加好2.5ml無(wú)菌水及無(wú)菌濾紙的平皿中，每皿25片子葉，每片子葉上面貼一塊培養(yǎng)好的單菌落塊，27-30℃下暗處培養(yǎng)20-24小時(shí)，然后移至600-1000lux螢光燈下，距離10-30cm，光照2-4天。根據(jù)子葉的變綠及擴(kuò)大程度，判斷單菌落產(chǎn)生細(xì)胞分裂素活性大小。另設(shè)KT0.1、1、10ppm溶液做標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水做對(duì)照。
(2)將初篩選出的細(xì)胞分裂素活性較高菌株轉(zhuǎn)接“苜高”斜面，同時(shí)涂菌塊進(jìn)行復(fù)篩把事先制成的“苜高”平皿(每皿10-20ml苜高培養(yǎng)基)，用金屬切刀分割成相互隔開(kāi)的培養(yǎng)基塊4塊，每塊上涂接一個(gè)初篩選出的菌株，27-30℃下倒置培養(yǎng)4-6天。用圓形金屬打孔器，將長(zhǎng)好的菌塊打成數(shù)個(gè)園柱形菌塊(直徑4-6mm，高2.0-2.5mm)。用上述黃瓜黃化子葉法復(fù)篩細(xì)胞分裂素活性，每個(gè)菌株設(shè)3片子葉重復(fù)，暗培養(yǎng)20-24小時(shí)，見(jiàn)光培養(yǎng)2-4天。凡是處理后3片子葉均比出發(fā)菌株、菌塊及KT純品1ppm的處理明顯綠且大的菌株，才屬于挑選對(duì)象。
(3)將復(fù)篩反映較好的菌株，測(cè)定對(duì)深紅酵母的拮抗性，取兩環(huán)深紅酵母的菌苔，放入8-10ml無(wú)菌水中，充分打散搖勻，制成均勻懸液。加到已溶化好、并涼至50-60℃的100ml測(cè)定培養(yǎng)基中，搖勻后倒入無(wú)菌平板內(nèi))，培養(yǎng)基鋪平、冷凝。用(2)的方法制成的園形菌塊，順序貼放在測(cè)定平板上，每行7塊，12行。每個(gè)菌株設(shè)3塊重復(fù)，27-30℃下保溫培養(yǎng)20-26小時(shí)，挑取復(fù)篩時(shí)刺激作用明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，而且拮抗作用較出發(fā)菌株也大的菌株。
(4)將上述過(guò)程得到的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用發(fā)酵濾液測(cè)定對(duì)黃化黃瓜子葉的作用，驗(yàn)證上述篩選結(jié)果。培養(yǎng)基裝量為每250ml三角瓶裝40-60ml，接種一滿環(huán)菌苔，在200-240轉(zhuǎn)/分搖床上，28℃±1℃培養(yǎng)72小時(shí)。用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測(cè)定其發(fā)酵液的細(xì)胞分裂素活性。按此法篩選出高產(chǎn)5406菌株。把選育優(yōu)良菌株用砂土管保藏備用。
4、5406細(xì)胞分裂素混合粉劑生產(chǎn)(1)工藝流程附

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖(2)培養(yǎng)條件A、斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為高氏一號(hào)，自然PH、27-32℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6天，孢子粉紅色，在3-5℃冰箱中保存20-40天。
B、一級(jí)種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)基為淀粉(或玉米粉)1-3%、葡萄糖0.5-1.5%、黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)1-3%、KH2PO40.04-0.05%、Nacl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.4-0.6%，CaCO30.3-0.5%、泡敵0.01-0.05%(或消沫油 0.2-0.4%)。
接種量1-2支茄形瓶斜面用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，在無(wú)菌條件下接種在一級(jí)種罐內(nèi)。
通風(fēng)量0-12小時(shí)1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v
罐壓0.6-0.7公斤/cm2培養(yǎng)溫度27-32℃攪拌速度270-290轉(zhuǎn)/分移種標(biāo)準(zhǔn)鏡檢無(wú)雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀。
C、二級(jí)種子罐培養(yǎng)基成分同一級(jí)種子罐培養(yǎng)基成分。
接種量8-10%，從一級(jí)種子罐移種到二級(jí)種子罐。
通風(fēng)量0-12小時(shí)，通風(fēng)量1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v。
罐壓0.6-0.7kg/cm攪拌速度240-260轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)溫度27-32℃移種標(biāo)準(zhǔn)鏡檢無(wú)雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀，密度均勻，分枝多而大，染色深。
D、發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為淀粉(或玉米粉)1-3%、葡萄糖(或飴糖或蔗糖)0.5-1.5%、黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)2-3%、(NH4)2SO40.3-0.5%、NaCl 0.2-0.4%、KH2PO40.03-0.05%、CaCO30.3 0.5%、泡敵0.01-0.05%(或植物油 0.2-0.4%)、酵母粉 0.2-1% 玉米漿 0.2-1%接種量10%，種令24-30小時(shí)。
通風(fēng)量0-12小時(shí)1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v，攪拌速度150-180轉(zhuǎn)/分，罐壓0.5-0.7kg/cm2。
培養(yǎng)溫度27-32℃鏡檢0-12小時(shí)菌絲呈團(tuán)網(wǎng)狀12小時(shí)以后菌絲發(fā)育成密封網(wǎng)狀菌絲。40-60小時(shí)放罐。
(3)后處理發(fā)酵液加5-20%CaCO3經(jīng)滾筒干燥機(jī)烘干，再加4-6%KCl，加5%微量元素(Zn2+、Cu2+)磨細(xì)分裝。
(4)測(cè)定方法發(fā)酵液中細(xì)胞分裂素(CTK)測(cè)定發(fā)酵液用0.1NHCl酸化至PH2-3上搖床搖2小時(shí)，過(guò)濾，濾液用1NNaOH調(diào)節(jié)PH8.0，取20ml用水飽和正丁醇萃取1∶1v/v三次，把三次正丁醇萃取液濃縮至干，用1ml35%乙醇溶解其干燥物(或用1ml95%乙醇溶解，上高壓液相色譜測(cè)定CTK含量)，樣品(用250-500ml)電薄板，再用水飽和正丁醇、異丙醇、氨水、水(2∶8∶1∶1)，25℃展開(kāi)，2-3小時(shí)結(jié)束吹干，將Rf值0.73-0.82的斑點(diǎn)刮下，用酪氨酸緩沖液(含有0.4%的酪氨酸的1/75克分子量的磷酸緩沖液)洗脫，用尾穗莧黃化子葉葉綠素合成法測(cè)定其洗脫液含量，具體方法如下精選已度過(guò)休眠期的尾穗莧種子，用0.1%升汞液消毒5分鐘，沖洗后，摘于培養(yǎng)皿中的濕潤(rùn)濾紙上，在28℃黑暗中發(fā)芽76小時(shí)。在暗室微弱綠光燈下，選取子葉大小均一的黃化幼苗，剪取子葉和下胚軸的上半部，置于已放有2.5ml或3ml待測(cè)溶液的培養(yǎng)皿中，每皿30枚。在28℃暗室放置18小時(shí)。分別把幼苗切段，在重蒸餾水中洗滌，在濾紙上吸去多余水分，移入盛有4ml重蒸餾水的有塞試管中，放置低溫冰箱(-15--20℃)冰凍過(guò)夜，移至25℃暗室中讓其融化，2小時(shí)后，再放入低溫冰箱冰凍。再融化，反復(fù)一次，莧紅素即被浸提而出。在542nm和620nm處分別光密度，二者相減即為莧紅濃度的光密度。同時(shí)查標(biāo)準(zhǔn)激動(dòng)素座標(biāo)，查出其含量，洗脫液細(xì)胞分裂素含量，再換算每立升發(fā)酵液含量。一般每立升發(fā)酵液中含CTK80-150l(測(cè)定過(guò)程中回收率40-50%)。
產(chǎn)品檢驗(yàn)?zāi)壳安捎酶邏阂合嗌V儀測(cè)定將50克樣品浸泡在200ml80%乙醇中，搖振蕩2小時(shí)，過(guò)濾，50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至20ml，用水飽和正丁醇1∶1v/v萃取三次，三次萃取液合并，真空濃縮至干，用1-2ml95%乙醇溶解，上高壓液相色譜，Waters 244 柱u-Bondapak pheny (0.4×30cm) 流動(dòng)相22%CH3CN PH＝4流速1.0ml/mm，檢測(cè)器UV254×0.1AUFS，標(biāo)準(zhǔn)品玉米素，異戊烯基腺嘌呤。 。
產(chǎn)品每500克中含CTK總量800-1000微克(回收率40-50%)苯乙酸測(cè)定方法發(fā)酵液2ml，加24N硫酸4滴，酸化之，加NaCl1.2克，加10%十五烷基溴代吡啶2滴，稍加振搖后，準(zhǔn)確加入苯2ml，加塞振搖2-3分鐘，離心后，取苯層上HPLC機(jī)，填＃3011膠的柱子(250×2.6mm)作固定相，以CH3OH∶H2O＝87∶13作為流動(dòng)相，流速0.4ml/min。220nm檢測(cè)。
產(chǎn)品檢測(cè)苯乙酸含量5克粉劑浸泡在20ml80%乙醇中，振蕩1小時(shí)，過(guò)濾，濾液真空濃縮2ml，加濃硫酸4滴，加NaCl1.2克，振蕩之，準(zhǔn)確加苯2ml，加塞振搖，取上層苯相上高壓液相色譜儀測(cè)定。
以下是本發(fā)明的實(shí)施例1、菌種選育把退化的5406菌株接入苜蓿根系進(jìn)行復(fù)壯處理，40天取苜蓿根，用0.1%升汞水消毒5分鐘，用滅蒸餾水洗苜蓿根3次，用無(wú)菌研缽磨成漿狀稀釋分離，分離培養(yǎng)基為高氏一號(hào)加1%苜蓿根煮汁。選擇標(biāo)準(zhǔn)菌落長(zhǎng)的豐富，中央突起的;菌落形狀較大的;菌落色澤較紅的;菌落生長(zhǎng)快;菌落表面分泌露珠多的。根據(jù)這5個(gè)條件選擇菌落做刺激性試驗(yàn)及拮抗性試驗(yàn)。
(1)用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測(cè)定經(jīng)選擇的菌株產(chǎn)生細(xì)胞分裂素活性。挑選大小均一的黃瓜種子津研1號(hào)，用0.1%升汞水表面滅菌5分鐘，無(wú)菌蒸餾水沖洗數(shù)次，置于墊有濕潤(rùn)濾紙的12cm無(wú)菌平皿內(nèi)，28℃下暗處發(fā)芽6天，在暗室綠光燈下，從每一個(gè)幼苗上切下子葉，切除全部下胚軸，選取大小均一的子葉，葉面朝上，放在事先已加好2.5ml無(wú)菌水及無(wú)菌濾紙的9cm平皿中，每皿25片子葉，每片子葉上面貼一塊培養(yǎng)好的單菌落塊，28℃下暗處培養(yǎng)20小時(shí)，然后移至800lux螢光燈下距離20cm，光照3天。根據(jù)子葉的變綠及擴(kuò)大程度，判斷單菌落產(chǎn)生細(xì)胞分裂素活性大小。另設(shè)KT0.1、1、10ppm溶液做標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水做對(duì)照。
(2)將初篩選出的細(xì)胞分裂素活性較高菌株轉(zhuǎn)接“苜高”斜面，同時(shí)涂菌塊進(jìn)行復(fù)篩，把事先制成的“苜高”9cm平皿(每皿20ml苜高培養(yǎng)基)，用金屬切刀分割成相互隔開(kāi)的培養(yǎng)基塊4塊，每塊上涂接一個(gè)初篩選出的菌株，28℃下倒置培養(yǎng)5天。用圓形金屬打孔器，將長(zhǎng)好的菌塊打成數(shù)個(gè)園柱形菌塊(直徑5mm，高2.2mm)。用上述黃瓜黃化子葉法復(fù)篩細(xì)胞分裂素活性，每個(gè)菌株設(shè)3片子葉重復(fù)，暗培養(yǎng)24小時(shí)，見(jiàn)光培養(yǎng)3天。處理后3片子葉均比出發(fā)菌株菌塊及KT純品1ppm的處理明顯綠且大的菌株，才屬于挑選對(duì)象。
(3)將復(fù)篩反映較好的菌株，測(cè)定對(duì)深紅酵母的拮抗性，取兩環(huán)深紅酵母的菌苔，放入9ml無(wú)菌水中，充分打散搖勻，制成均勻懸液，加到已溶化好、并涼至58℃的100ml測(cè)定培養(yǎng)基中，搖勻后倒入無(wú)菌平板內(nèi)(20×30cm2)，培養(yǎng)基鋪平、冷凝。用(2)的方法制成的園形菌塊，順序貼放在測(cè)定平板上，每行7塊，12行。每個(gè)菌株設(shè)3塊重復(fù)，28℃下保溫培養(yǎng)24小時(shí)，取復(fù)篩時(shí)刺激作用明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，而且拮抗作用較出發(fā)菌株也大的菌株。
(4)將上述過(guò)程得到的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用發(fā)酵濾液測(cè)定對(duì)黃化黃瓜子葉的作用，驗(yàn)證上述篩選結(jié)果培養(yǎng)基裝量為每250ml三角瓶裝50ml，接種一滿環(huán)菌苔，220轉(zhuǎn)/分搖床上，28℃培養(yǎng)72小時(shí)。用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測(cè)定其發(fā)酵的細(xì)胞分裂素活性。接此法篩選出高產(chǎn)5406菌株。把選育優(yōu)良菌株用砂土管保藏備用。
2、5406細(xì)胞分裂素混合粉劑生產(chǎn)(1)工藝流程見(jiàn)附圖1
(2)培養(yǎng)條件A、斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為高氏一號(hào)，自然PH、28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天，孢子粉紅色，保存1個(gè)月4℃冰箱。
B、一級(jí)種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)基為淀粉2%、葡萄糖1%、黃豆餅粉2%、KH2PO40.045%、Nacl 0.3% (NH4)2SO40.5%，CaCO30.4%、泡敵 0.02%。
接種量2支茄形瓶斜面用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，在無(wú)菌條件下接種在一級(jí)種罐內(nèi)。
通風(fēng)量0-12小時(shí)1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v罐壓0.67公斤/cm2培養(yǎng)溫度28℃攪拌速度180轉(zhuǎn)/分移種標(biāo)準(zhǔn)鏡檢無(wú)雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀。
C、二級(jí)種子罐培養(yǎng)基成分同一級(jí)種子罐培養(yǎng)基成分。
接種量8%，從一級(jí)種子罐移種到二級(jí)種子罐。
通風(fēng)量0-12小時(shí)，通風(fēng)量1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v。
罐壓0.6kg/cm2攪拌速度250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)溫度28℃移種標(biāo)準(zhǔn)境檢無(wú)雜菌，菌絲呈網(wǎng)狀，程度均勻，分枝多而大，染色深。
D、發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為淀粉 2%、葡萄糖 1%、黃豆餅粉 2.5%、(NH4)2SO40.4%、Nacl 0.3%、KH2PO40.035%、CaCO30.4%、泡敵0.015%。酵母粉 0.2%、玉米粉0.2%。
接種量10%，種令24小時(shí)。
通風(fēng)量0-12小時(shí)1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v，攪拌速度180轉(zhuǎn)/分，罐壓0.6kg/cm2。
培養(yǎng)溫度28℃鏡檢0-12小時(shí)菌絲呈團(tuán)網(wǎng)狀12小時(shí)以后菌絲發(fā)育成密網(wǎng)狀菌絲。55小時(shí)后放罐。
本發(fā)明較已有技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)用本工藝所生產(chǎn)的細(xì)胞分裂素混合粉劑每500克含細(xì)胞分裂素0.8-1.0毫克，苯乙酸1.0-1.5毫克，B族維生素2.5克，以及大量氨基酸。具有明顯增效作用。田間試驗(yàn)示范證明5406細(xì)胞分裂混合粉劑對(duì)多種作物都具有良好的增產(chǎn)效果。
1、糧食作用稻麥上通過(guò)浸種及穗期噴灑能增產(chǎn)10-20%，玉米通過(guò)浸種，每畝投資0.12元，可增產(chǎn)80-100斤。
2、蔬菜白菜、黃瓜、茄子、西紅柿等噴3次，一般增產(chǎn)15-20%，每畝增收100-200元。
3、瓜果用于西瓜浸種并噴灑3-4次，一般增產(chǎn)15-20%，含糖量提高0.5-2.0度，并提前3-7天成熟。
每畝增收100-200元。在柑桔上噴灑2-3次，一般增產(chǎn)10-20%，每畝增收100-200元。對(duì)葡萄、桃、蘋(píng)果、草莓也能提高座果率及含糖量。
4、經(jīng)濟(jì)作物在煙草上噴灑3次減輕花葉病50-83%，提高尼古丁含量，每畝增收70-100元，在人參上噴灑，一般增產(chǎn)10-20%，可減輕葉斑病提高人參皂甙12-33%，每畝增收2000-4000元，在茶葉上能增產(chǎn)10-15%，提高咖啡堿含量25.8%，茶多酚3.4%，品質(zhì)提高一級(jí)。
5、對(duì)煙草花葉病毒病防治效果比較突出對(duì)煙草花葉病毒病防效50-83%，西紅柿蕨葉病防效達(dá)51.2-61.5%，對(duì)青椒病毒病防效達(dá)50.7%以上，可使小麥黃矮病減輕。
5406細(xì)胞分裂素混合粉劑使用成本低，經(jīng)濟(jì)效益高。經(jīng)衛(wèi)生部門(mén)毒性試驗(yàn)LD50＞10g體重，屬相對(duì)元毒，無(wú)致突變，致畸作用，使用安全。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞分裂素混合粉劑的制造方法，包括選用涇陽(yáng)鏈霉菌(Streptom-ycesjingyangensis)菌株，其特征在于該方法包括下列步驟(1)菌種復(fù)壯與選育；(2)將選育好的菌種在27-32℃下分別經(jīng)試管斜面和茄形瓶斜面培養(yǎng)4-6天，移至一級(jí)種子罐，在27-32℃培養(yǎng)24-30小時(shí)；(3)將通過(guò)一級(jí)種子罐培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接于二級(jí)種子罐，在27-32℃下培養(yǎng)24-30小時(shí)；(4)將通過(guò)二級(jí)子罐培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接于發(fā)酵罐培養(yǎng)，在27-32℃下培養(yǎng)40-60小時(shí)；(5)發(fā)酵液加5-20%CaCO3烘干，再加4-6%KCl，磨細(xì)分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌種復(fù)壯與選育，其特征在于包括下列步驟(1)把退化的涇陽(yáng)鏈霉菌(Streptomycesjingyangensis)菌株接入苜蓿根系復(fù)壯處理，30-60天，取苜蓿根，用0.05-0.15%升汞水消毒3-7分鐘，用蒸餾水洗苜蓿根2-4次，用無(wú)菌研缽磨成漿狀稀釋分離，加1%苜蓿根煮汁于高氏一號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇菌落;(2)用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法初篩經(jīng)選擇的菌落;(3)將初篩出的菌株轉(zhuǎn)接在“苜高”斜面，同時(shí)涂菌塊進(jìn)行復(fù)篩，用黃化黃瓜子葉法測(cè)定菌株活性;(4)將復(fù)篩出的菌株，測(cè)定對(duì)深紅酵母的拮抗性，取拮抗作用明顯的菌株;(5)將上述過(guò)程得到的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用發(fā)酵液測(cè)定對(duì)黃化黃瓜子葉的作用，驗(yàn)證上述篩選結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于一級(jí)種子罐的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基為淀粉(或玉米粉)1-3%葡萄糖0.5-1.5%黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)1-3%KH2PO40.04-0.05% NaCl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.4-0.6% CaCO30.3-0.5%泡敵0.01-0.05%(或消沫油0.2-0.4%)接種量1-2支茄形瓶斜面用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，在無(wú)菌條件下接種在一級(jí)種罐內(nèi);通風(fēng)量0-12小時(shí)1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v罐壓0.6-0.7公斤/cm2攪拌速度270-290轉(zhuǎn)/分
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于二級(jí)種子罐的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基配方同一級(jí)種子罐，接種量8-10%，通風(fēng)量0-12小時(shí)1∶0.5v/v，12小時(shí)以后1∶1v/v。罐壓0.6-0.7kg/cm2攪拌速度240-260轉(zhuǎn)/分;
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基配方淀粉(或玉米粉)1-3%葡萄糖(或蔗糖或飴糖)0.5-1.5%黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)2-3%KH2PO40.03-0.05% Nacl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.3-0.5% CaCO30.3-0.5%泡敵0.01-0.05%(或植物油0.2-0.4%)酵母粉0.2-1%玉米漿0.2-1%接種量10%通風(fēng)量0-12小時(shí)1∶0.5v/v12小時(shí)后1∶1v/v攪拌速度150-180轉(zhuǎn)/分罐壓 0.5-0.7kg/cm2
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于采用尾穗莧莧紅素合成法和高壓液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液及產(chǎn)品的細(xì)胞分裂素含量和用高壓液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中苯乙酸的含量。
全文摘要
一種細(xì)胞分裂素混合粉劑的制造方法，該方法包括采用黃化黃瓜葉綠素合成法初篩及復(fù)篩涇陽(yáng)鏈霉菌(Streptomyces jingyangsis n.sp Tao et al，1978)菌株和用篩后菌株工廠化生產(chǎn)細(xì)胞分裂素混合粉劑，用本發(fā)明制造出的產(chǎn)品富含細(xì)胞分裂素、苯乙酸、B族維生素及大量氨基酸。該粉劑價(jià)格低廉，試驗(yàn)證明對(duì)多種農(nóng)作物具有明顯的增產(chǎn)作用。
文檔編號(hào)C12N1/00GK1046350SQ8910210
公開(kāi)日1990年10月24日 申請(qǐng)日期1989年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月11日
發(fā)明者尹莘耘, 梁光云, 張震林, 張辛庚, 尹蔚莊, 丁鳳葆, 林德炘, 蔣炳生 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所