專利名稱:一種微生物復(fù)合酶綠色飼料促長劑及其生產(chǎn)方法
本發(fā)明涉及一種采用微生物工程技術(shù)，選用多株菌經(jīng)復(fù)活、分離、純化、誘變高活性菌種，制作果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、a淀粉酶、植酸酶、光合細(xì)菌等生物菌群與礦物質(zhì)、微量元素等，采用現(xiàn)代化工藝生產(chǎn)高效綠色動物促長劑。該技術(shù)由于含有大量的活性酶和促長因子，提高了動物新陳代謝功能，使之產(chǎn)生對動物機(jī)體互相協(xié)同及綜合平衡作用，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在動物腸道中快速降解，促進(jìn)動物對飼料營養(yǎng)成份的吸收和轉(zhuǎn)化，以達(dá)到促進(jìn)動物增長和節(jié)約飼料的目的。該技術(shù)的原料以農(nóng)作物秸稈、殼皮、餅等副產(chǎn)物，使廢物得到了有效的利用，變廢為寶，原料來源取之不盡，用之不竭，提高了飼料投入產(chǎn)出比，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。該技術(shù)主要應(yīng)用于豬、雞等動物飼料添加劑。本發(fā)明生產(chǎn)方法及工藝易掌握，投資小，成本低，適宜個體、中小企業(yè)和鄉(xiāng)鎮(zhèn)投資建廠。
現(xiàn)有技術(shù)中有多篇專利文件公開了種種微生物復(fù)合酶飼料添加劑及其生產(chǎn)方法，其中最接近的對比文獻(xiàn)為公開號1296765A公開了利用綠色乳桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等制作微生物飼料添加劑，其缺點(diǎn)是一是菌種名稱沒有全部公開；二是工藝設(shè)計過于簡單。
公開號1223081A公開了利用EM原液制作微生物飼料添加劑，其缺點(diǎn)是一是EM原液制作及菌種沒有公開；二是生產(chǎn)工藝沒有完全公開，生產(chǎn)和制作很難實(shí)現(xiàn)。
公開號1284286A公開了利用多種生物菌制作微生物飼料添加劑，其缺點(diǎn)是一是生物菌種的名稱和編號沒有完全公開，很難制作生物菌劑；二是工藝沒有完全公開。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)工藝設(shè)計和配方不足，提供一種采用制作微生物復(fù)合酶與微量元素、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等以及載體復(fù)配生產(chǎn)畜禽飼料添加劑的方法，采用制作多菌生物復(fù)合酶與合理的微量元素、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等復(fù)配，使之產(chǎn)生對動物機(jī)體互相協(xié)同及綜合平衡作用，通過生物多菌復(fù)合酶與其它物質(zhì)的作用，充分利用飼料的利用率，提高動物對飼料的吸收及其轉(zhuǎn)化，以達(dá)到促進(jìn)動物增長和節(jié)約飼料的目的。其中，果膠酶對飼料中不易消化的膠質(zhì)類物質(zhì)，具有改善消化和提高飼料的利用率；纖維素酶對飼料中不易消化的纖維素物質(zhì)，在酶的催化下可轉(zhuǎn)化為糖類成分，利于動物的消化和吸收；蛋白酶可提高飼料中蛋白的利用率，并利用自身菌體蛋白，達(dá)到促長效果；a淀粉酶對飼料中不易消化的大量淀粉類物質(zhì)，在酶的催化下可轉(zhuǎn)化為糖類成分，利于動物的消化和吸收；植酸酶是特異性水解植酸的酶，釋放出可以利用的磷，它不僅可以促進(jìn)植酸磷的消化吸收，還可改善蛋白質(zhì)和氨基酸以及能量的利用效果，同時，可以減少磷酸氫鈣的加入和因磷酸氫鈣倒置的氟中毒來源，改善動物因飼用磷酸氫鈣的排放對環(huán)境的污染；光合細(xì)菌含有豐富的葉酸、維生素B群、類胡蘿卜素、輔酶Q10、氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，特別是用作養(yǎng)魚餌料添加劑，可實(shí)現(xiàn)高密度魚蝦養(yǎng)殖，大幅度提高產(chǎn)量，并有凈化水質(zhì)和防治魚病的作用。
本技術(shù)發(fā)明中應(yīng)用了以下幾個生物菌種和有機(jī)物、微量元素，其中，生物菌種是從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心購進(jìn)并經(jīng)復(fù)活、分離、純化、誘變后，選取高活性菌株作為生產(chǎn)菌種；無機(jī)原料以及微量元素，需從市場購買；有機(jī)物農(nóng)作物副產(chǎn)物需從有關(guān)部門收取或收購，經(jīng)發(fā)酵和烘干處理。
本技術(shù)發(fā)明的，包括以下幾個步驟1菌種的誘變(1)菌懸液的制備取以上任一種純化好的斜面菌種一支，在無菌在無菌操作下用10ml無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入剩有玻璃珠的錐形瓶中，混合振蕩10分鐘，以打碎菌塊，離心(3000/分鐘)5-10分鐘，棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次，加入10ml無菌生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度為108；(2)平板制作將以上預(yù)誘變菌種的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿及其它所用器具全部滅菌，培養(yǎng)基取出后降溫到60℃左右倒平板，凝固后待用；(3)誘變處理①誘變處理采用紫外線燈照射(15w燈管)②預(yù)熱正式誘變照射前先開啟紫外線燈10-20分鐘；③取制備好的菌懸液用移液器或移液管移入6厘米無菌培養(yǎng)皿中，加入微量的抗菌素鏈霉素使之和勻，放入無菌磁力棒并置磁力攪拌器上，開動磁力攪拌器，打開培養(yǎng)皿蓋，打開紅燈(關(guān)閉其它照明燈)，紫外線燈管30厘米照射(視菌鐘不同)1-3分鐘；④稀釋涂平板在紅燈下分別取未照射的菌懸液(作為對照)和照射過的菌懸液各0.5毫升，進(jìn)行稀釋，一般取106-109稀釋度的菌液0.2毫升涂于平皿培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂3個培養(yǎng)皿，用無菌玻璃棒涂勻平板，注意，在每個培養(yǎng)皿背后要標(biāo)明處理時間、稀釋度、組號。28-30℃恒溫下培養(yǎng)24-72小時(培養(yǎng)皿用黑布包上)。挑選生長旺盛、活性高的菌株接入試管斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)誘變、分離、篩選，直至從試管或培養(yǎng)皿中篩選出無雜菌、活力強(qiáng)的有效菌種，然后接入斜面試管中作為生產(chǎn)菌種或做成真空冷凍干燥安瓶管常期保存。其余菌種按以上要求進(jìn)行誘變，誘變時，要按照每個菌種的生長條件綜合因素進(jìn)行2.生物菌酶和發(fā)酵菌種及菌劑的發(fā)酵制作1)黑曲酶AS3.316果膠酶的制作與培養(yǎng)(1)斜面菌種制作①斜面菌種培養(yǎng)基制作首先量5°Be度麥芽汁，測PH值為5～6左右，加入瓊脂2，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種；②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下
第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上，塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。
③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，待培養(yǎng)基表面長出黑褐色孢子為正常，其它顏色為感染雜菌則應(yīng)淘汰。
(2)二級菌劑培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉60，麥麩35，玉米面4，糖0.5，K2HPO40.1，碳酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，氯化鉀，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜(料水比為1∶0.8左右)，調(diào)PH值為6-6.5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水到入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右；③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在25℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，直到培養(yǎng)基表面長出黑色孢子時并結(jié)餅為成品，如長有其它顏色為感染雜菌。
(3)三級菌酶培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作豆餅粉60，麥麩34，玉米面5，糖0.5，K2HPO40.1，碳酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，氯化鉀，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜(料水比為1∶0.8左右)，調(diào)PH值為6-6.5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，涼至40℃左右時開始接種，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；
③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在25℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，案培養(yǎng)時間為48小時左右，直到培養(yǎng)料表面長出白色菌并有少量綠色孢子結(jié)餅為成品，如有其它顏色為雜菌。
2)康寧木酶AS3.2774纖維素酶的制作與培養(yǎng)(1)斜面菌種培養(yǎng)制作①斜面培養(yǎng)基制作馬鈴薯去皮去芽，稱20克切細(xì)放入100ml水中，用微火煮開后15分鐘即可用雙層紗布過濾。取汁為100ml，如水分不足再加些開水補(bǔ)足。另外稱葡萄糖1，瓊脂2，纖維素0.5(纖維素為將草粉過100目)放置電爐上溶解。
②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。
③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48小時左右，待培養(yǎng)基表面長出綠色孢子為正常，如長有其它顏色為感染雜菌。
(2)二級菌劑培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作草粉50，麥麩39，玉米面10，尿素0.3，硫酸銨0.3，氯化鈉0.4，PH值用磷酸調(diào)為5左右，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水倒入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右；③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在25℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為72小時左右，培養(yǎng)料表面長出綠色孢子并結(jié)餅為成品，如長有其它顏色為感染雜菌。
3)三級菌酶培養(yǎng)與制作①培養(yǎng)基制作草粉50，麥麩39，玉米面10，尿素0.3，硫酸銨0.3，氯化鈉0.4，PH值用磷酸調(diào)為5左右，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，然后裝入塑料袋或布袋內(nèi)放置高壓鍋中1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種。接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為30-48小時左右，直到培養(yǎng)料表面長出白色或有少量綠色孢子并結(jié)餅為成品，如長有其它顏色為感染雜菌。
3)黑曲酶AS3.350蛋白酶的制作與培養(yǎng)(1)斜面菌種制作①斜面菌種培養(yǎng)基制作首先量5°Be度麥芽汁，測PH值為5～6左右，加入瓊脂2，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立，打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種。
②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。
③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48小時左右，培養(yǎng)基表面長出黑色孢子為正常，如長有其它顏色為感染雜菌。
(2)二級菌劑培養(yǎng)①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉60，麥麩35，玉米面5，糖0.5，K2PO40.1，碳酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，氯化鉀，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜(料水比為1∶0.8左右)，調(diào)PH值為6-6.5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種。
②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水到入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右。
③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，直到培養(yǎng)料表面長出黑色孢子時并結(jié)餅為成品，如長有其它顏色為雜菌。
(3)三級菌酶培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作豆餅粉60，麥麩34，玉米面5，糖0.5，K2HPO40.1，碳酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，氯化鉀，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜(料水比為1∶0.8左右)，調(diào)PH值為6-6.5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種。
接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％。
②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％。
③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，培養(yǎng)料表面長出白色菌或有少量黑色孢子并結(jié)餅為成品，如長有其它顏色為感染雜菌。
4)黑曲霉淀粉酶AS3.40斜面菌種和菌劑及菌酶的制作(1)斜面菌種制作①斜面培養(yǎng)基制作馬鈴薯去皮去芽，稱20克切細(xì)放入100ml水中，用微火煮開后15分鐘即可用雙層紗布過濾。取汁為100ml，如水分不足再加些開水補(bǔ)足。另外稱葡萄糖2，瓊脂2，蒸餾水100ml，PH7.0，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種。
②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。
③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，待培養(yǎng)基表面長出并布滿黑色孢子時為正常，如有其它顏色為感染雜菌。
(2)二級菌劑培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作培養(yǎng)基為豆餅粉30，麩皮50，玉米粉15.淀粉4，Nacl 0.2，磷酸氫二鈉0.8，PH值7.1-7.2；(3)三級菌酶培養(yǎng)與制作培養(yǎng)基為豆餅粉30，麩皮50，玉米粉15.淀粉4，Nacl 0.2，磷酸氫二鈉0.8，PH值為7左右，常壓滅菌1小時或1kg/cm2壓力滅菌30分鐘，降溫至40℃按種子液0.5-1％，深層通風(fēng)發(fā)酵或淺層發(fā)酵，室內(nèi)溫度為25℃左右，品溫35-40℃左右，培養(yǎng)發(fā)酵24-40小時，在35-40℃下烘干，即為成品。
5)黑曲酶植酸酶AS3.4322斜面菌種和菌劑及菌酶的制作(1)斜面菌種制作①斜面菌種培養(yǎng)基制作5°Be度麥芽汁30毫升，糖1克，碳酸鈉0.1克，硫酸鎂0.02克，氯化鉀0.03，硫酸鐵0.001克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水加至100毫升，測PH值為5～6左右，加入瓊脂2，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立，打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種。
②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。
③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，培養(yǎng)基表面長出并布滿黑色孢子為正常，如長有其它顏色為感染雜菌。
(2)二級菌劑培養(yǎng)①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，蛋白粉或玉米粉29，糖0.5，K2HPO40.1，碳酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，氯化鉀，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜(料水比為1∶0.8左右)，調(diào)PH值為6-6.5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種。
②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水到入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右。
③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，直到培養(yǎng)料表面長出并布滿黑色孢子為成品，如長有其它顏色為雜菌。
(3)三級菌酶培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，蛋白粉或玉米粉29，糖0.5，K2HPO40.1，碳酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，氯化鉀，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜(料水比為1∶0.8左右)，調(diào)PH值為6-6.5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種。
接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％。
②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％。
③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為20-36小時左右，培養(yǎng)料表面長出并布滿白色菌絲為成品，如長有其它顏色為感染雜菌。
6)光合細(xì)菌的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基配方為①氯化胺NH4C1 0.3-1.5克②碳酸氫鈉 0.3-1.5克③磷酸氫二鉀 0.1-0.5克④醋酸鈉(乙酸鈉)CH3COONa 0.5-2.8克⑤硫酸鎂 0.1-0.4克⑥氯化鈉 0.5-2.5克⑦生長因子 0.5-1.8克⑧微量元素水溶液 5-15毫升(2)制作工藝將以上原料用40毫升蒸餾水溶解，加蒸餾水至1000毫升，加入生長因子1克，微量元素水溶液10毫升，用磷酸調(diào)ph值7左右，在加入10％的菌液搖晃均勻，放入透明度比較好的瓶內(nèi)，用40瓦電燈進(jìn)行對稱照射，距離為10-20厘米，溫度控制在28-30℃左右，經(jīng)三天培養(yǎng)即可成功(3)生長因子配方①維生素B10.0005-0.002mg，②尼克丁酸0.05-0.25mg，③對氨基苯鉀酸0.05-0.25mg，④生物素0.0005-0.002mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至10ml，過濾除菌備用；(4)微量元素溶液配方①氯化鐵0.1-15mg，②硫酸銅0.01-0.15mg，③硼酸0.01-10mg，④硫酸錳0.01-0.1mg，⑤硫酸鋅0.1-10mg，⑥硝酸鈷0.1-1.5mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至1000ml，過濾除菌備用；(5)培養(yǎng)好的光合細(xì)菌用麥芽根或麩皮或麥糠吸附后在40-50℃烘干、粉碎，作為飼料添加劑3.生物復(fù)合酶混合比例為蛋白酶∶植酸酶∶α淀粉酶∶果膠酶∶纖維素酶∶光合細(xì)菌比例為3∶3∶1∶1∶1∶14.飼料添加劑配方(1000質(zhì)量份)
1)復(fù)合多維素(克) 5----222)硫酸亞鐵(克) 0.5--103)硫酸錳(克) 0.5--84)硫酸銅(克) 4----125)硫酸鋅(克) 2----66)碘化鉀(毫克) 6----407)氯化鈷(毫克) 6----608)亞硒酸鈉(毫克) 4----259)磷酸氫鈣(克) 50---20010)腐植酸鈉(克) 5----3011)硼酸(克) 0.2---412)生物復(fù)合酶(克) 400--60013)氫質(zhì)碳酸鈣(克) 50---20014)鉬(克) 0.2--215)蛋氨酸(克) 20----8016)賴氨酸(克) 40----12017)氯化膽堿(克) 40---18018)貝殼粉(克) 40---2005.實(shí)施例實(shí)例1.中豬飼料添加劑配方(1000質(zhì)量份)飼料中按1％加入(1)復(fù)合多維素(克) 10(2)硫酸亞鐵(克) 8(3)硫酸錳(克) 1(4)硫酸銅(克) 6(5)硫酸鋅(克) 8(6)碘化鉀(毫克) 20(7)氯化鈷(毫克) 80(8)亞硒酸鈉(毫克) 25(9)磷酸氫鈣(克) 300(10)硼酸(克) 1(11)生物復(fù)合酶(克) 500(12)輕質(zhì)碳酸鈣(克) 45(13)鉬(克) 2(14)賴氨酸(克) 80(15)貝殼粉(克) 38.875
實(shí)例2.肉中雞飼料添加劑配方(1000質(zhì)量份)飼料中按1％加入(1)復(fù)合多維素(克) 10(2)硫酸亞鐵(克) 12(3)硫酸錳(克) 12(4)硫酸銅(克) 2(5)硫酸鋅(克) 10(6)碘化鉀(毫克) 70(7)亞硒酸鈉(毫克) 30(8)碳酸氫鈣(克) 120(9)腐植酸鈉(克) 1(10)生物復(fù)合酶(克) 500(11)鉬(克) 2(12)蛋氨酸(克) 120(13)氯化膽堿(克) 120(14)貝殼粉(克) 87.900(15)氯化鈉(克) 3實(shí)例3.育肥牛飼料添加劑配方(1000質(zhì)量份)飼料中按1％加入(1)復(fù)合多維素(克) 2(2)硫酸亞鐵(克) 10(3)硫酸錳(克) 3(4)硫酸銅(克) 2.5(5)硫酸鋅(克) 6.5(6)碘化鉀(毫克) 50(7)氯化鈷(毫克) 100(8)亞硒酸鈉(毫克) 50(9)磷酸氫鈣(克) 300(10)生物復(fù)合酶(克) 500(11)氫質(zhì)碳酸鈣(克) 175.800光合細(xì)菌固體粉料可作為生物復(fù)合酶的原料與以上生物酶混合，添加到飼料中；用于水產(chǎn)養(yǎng)殖可直接用液體潑灑水面(3公斤/畝)，每10天潑灑一次6.操作工藝與步驟1)原料的預(yù)處理(1)硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅因含水分在加工中會有很大的困難，因此須先進(jìn)行處理，主要以干燥處理為主，可采用強(qiáng)制干燥，在條件及設(shè)備較差的情況下，可用日光晾曬，粉碎過100目；
(2)碘化鉀、氯化鈷的預(yù)處理采用吸收劑平衡法，將碘化鉀和氯化鈷原料分別準(zhǔn)確的稱量，然后各以1∶15-1∶20的比例溶解于水中，再分別按照1∶100的比例噴在石粉等吸收劑上進(jìn)行混合，而后進(jìn)行干燥、粉碎過200目；(3)亞硒酸鈉的預(yù)處理一般采用將含50％以上的亞硒酸鈉加入81℃的熱水中，經(jīng)過5min溶解后制成10kg水溶液(即1kg原料溶解于10kg水中然后再噴灑在攪拌機(jī)內(nèi)的糠粉上，糠粉過200目以1∶100的比例噴在糠粉上，混合烘干后過200目)，混合均勻制成稀釋劑，再與其它原料混合成為硒的預(yù)混合料；2)載體和稀釋劑的選擇載體一般選擇石粉、氫質(zhì)碳酸鈣、沸石粉、淀粉、麥麩、玉米粉等，以3-8％的比例逐級擴(kuò)大；3)原料的粒度微量元素一般要求通過80-400目，即粒度在0.17-0.05mm以下，鐵、鋅、錳、銅、鎂等微量元素的粉碎粒度應(yīng)全部通過80目(0.3mm)鈷、碘、硒等級微量成分粉碎至200目(0.076mm)以下，為了達(dá)到很細(xì)的粒度，需要使用特別磨進(jìn)行細(xì)磨，如碘、鉀、硒用球磨機(jī)細(xì)磨才能達(dá)到所需求的粒度，氯化鈷、銅、鐵、錳、鋅要使用微米極磨細(xì)至幾個微米才能保證適宜的粒度，達(dá)到最佳的混合均勻度；4)操作(1)一次擴(kuò)大稀釋①先將碘化鉀、氯化鈷、亞硒酸鈉用磷酸氫鈣或碳酸氫鈣為載體以3倍的比例擴(kuò)大稀釋，先加入1％載體量的油脂，混合5分鐘然后加入以上微量元素，混合攪拌20分鐘后取出，再進(jìn)行二次稀釋；②將鐵、鋅、銅、錳等微量元素用磷酸氫鈣或碳酸鈣或玉米粉為載體以3倍的比例擴(kuò)大稀釋，先將載體加入混合機(jī)中，加入載體量1％的油脂，混合5分鐘然后加入以上微量元素，混合20分鐘后取出，再進(jìn)行二次稀釋；③將其它生長劑、多維素等用碳酸鈣或玉米粉為載體以3倍左右的比例混合稀釋，先將載體加入混合機(jī)中，加入載體量1％的油脂，混合5分鐘，然后加入生長劑等混合20分鐘取出，再進(jìn)行二次擴(kuò)大稀釋；(2)二次擴(kuò)大稀釋將以上一次預(yù)混劑用麥麩、玉米面為載體以3倍左右的比例進(jìn)行稀釋擴(kuò)大，復(fù)合酶也采取二次稀釋擴(kuò)大。
(3)三次擴(kuò)大稀釋與混合將全部二次混合的預(yù)混劑合并稱重，載體以磷酸氫鈣加入足量，然后加入1％的油脂，混合5分鐘，然后將全部二次稀釋劑加入混合劑攪拌混合20分鐘，即為動物促長劑。
權(quán)利要求
1.一種微生物復(fù)合酶綠色飼料促長劑及其生產(chǎn)方法，包括菌種和菌劑以及酶制劑培養(yǎng)基的制作及培養(yǎng)發(fā)酵；菌種的復(fù)活、分離、純化、誘變；有機(jī)肥的準(zhǔn)備與制作；微量元素的準(zhǔn)備與制作；復(fù)合肥的配方與工藝其中，微生物菌種為1)黑曲霉果膠酶AS3.3162)康寧木霉纖維素酶AS3.27743)黑曲霉蛋白酶AS3.3504)黑曲霉淀粉酶AS3.405)黑曲酶植酸酶AS3.43226)光合細(xì)菌
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種微生物復(fù)合酶綠色飼料促長劑及其生產(chǎn)方法，其特征在于動物復(fù)合促長劑的配方(1000質(zhì)量份)為1)復(fù)合多維素(克) 5----222)硫酸亞鐵(克) 0.5--103)硫酸錳(克) 0.5--84)硫酸銅(克) 4----125)硫酸鋅(克) 2----66)碘化鉀(毫克) 6----407)氯化鈷(毫克) 6----608)亞硒酸鈉(毫克) 4----259)磷酸氫鈣(克) 50---20010)腐植酸鈉(克) 5----3011)硼酸(克) 0.2--412)生物復(fù)合酶(克) 400--60013)氫質(zhì)碳酸鈣(克) 50---20014)鉬(克) 0.2---215)蛋氨酸(克) 20----8016)賴氨酸(克) 40----12017)氯化膽堿(克) 40---18018)貝殼粉(克) 40---200
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種微生物復(fù)合酶綠色飼料促長劑及其生產(chǎn)方法，其特征在于生物復(fù)合酶菌種的復(fù)活、分離、純化、誘變?yōu)?)按以上菌種的要求制作斜面和倒平板培養(yǎng)基；2)培養(yǎng)基在1.5公斤/平方厘米滅菌30分鐘；3)取一支預(yù)誘變的斜面或安瓶管，在無菌操作下把菌種接入斜面試管進(jìn)行多次培養(yǎng)復(fù)活、培養(yǎng)皿劃線分離、再多次斜面試管培養(yǎng)，最后選取活性高、生長旺盛的菌種作為誘變菌株；4)菌種的誘變(1)菌懸液的制備取以上任一種純化好的斜面菌種一支，在無菌在無菌操作下用10ml無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入剩有玻璃珠的錐形瓶中，混合振蕩10分鐘，以打碎菌塊，離心(3000/分鐘)5-10分鐘，棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次，加入10ml無菌生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度為108；(2)平板制作將以上預(yù)誘變菌種的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿及其它所用器具全部滅菌，培養(yǎng)基取出后降溫到60℃左右倒平板，凝固后待用；(3)誘變處理①誘變處理采用紫外線燈照射(15w燈管)②預(yù)熱正式誘變照射前先開啟紫外線燈10-20分鐘；③取制備好的菌懸液用移液器或移液管移入6厘米無菌培養(yǎng)皿中，加入微量的抗菌素鏈霉素使之和勻，放入無菌磁力棒并置磁力攪拌器上，開動磁力攪拌器，打開培養(yǎng)皿蓋，打開紅燈(關(guān)閉其它照明燈)，紫外線燈管30厘米照射(視菌鐘不同)1-3分鐘；④稀釋涂平板在紅燈下分別取未照射的菌懸液(作為對照)和照射過的菌懸液各0.5毫升，進(jìn)行稀釋，一般取106-109稀釋度的菌液0.2毫升涂于平皿培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂3個培養(yǎng)皿，用無菌玻璃棒涂勻平板，注意，在每個培養(yǎng)皿背后要標(biāo)明處理時間、稀釋度、組號。28-30℃恒溫下培養(yǎng)24-72小時(培養(yǎng)皿用黑布包上)。挑選生長旺盛、活性高的菌株接入試管斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)誘變、分離、篩選，直至從試管或培養(yǎng)皿中篩選出無雜菌、活力強(qiáng)的有效菌種，然后接入斜面試管中作為生產(chǎn)菌種或做成真空冷凍干燥安瓶管常期保存。其余菌種按以上要求進(jìn)行誘變，誘變時，要按照每個菌種的生長條件綜合因素進(jìn)行
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種微生物復(fù)合酶綠色飼料促長劑及其生產(chǎn)方法，其特征在于生物復(fù)合酶的制作1)黑曲霉果膠酶AS3.316斜面和菌劑及菌酶的制作(1)斜面一級菌種的制作5°Be度麥芽汁20毫升，糖1克，碳酸鈉0.1克，硫酸鎂0.02克，氯化鉀0.03，硫酸鐵0.001克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水加至100毫升，調(diào)PH值為5-6左右，加入瓊脂2，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種；②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上，塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，待培養(yǎng)基表面長出并布滿黑褐色孢子為正常，其它顏色為感染雜菌則應(yīng)淘汰。(2)二級菌劑培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，果渣29，(NH4)SO40.7，K2HPO40.3，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，調(diào)PH值為5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水到入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右；③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在25℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，直到培養(yǎng)基表面長出并布滿黑色孢子為成品，如長有其它顏色為感染雜菌(3)三級菌酶培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，果渣29，(NH4)SO40.7，K2HPO40.3，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，調(diào)PH值為5左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，涼至40℃左右時開始接種，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在25℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為20-36小時左右，直到培養(yǎng)料長出并布滿白色菌絲為成品，如長出有其它顏色為雜菌2)康寧木霉纖維素酶AS3.2774斜面菌種和菌劑及菌酶的制作(1)斜面菌種培養(yǎng)制作①斜面培養(yǎng)基制作馬鈴薯去皮去芽，稱20克切細(xì)放入100ml水中，用微火煮開后15分鐘即可用雙層紗布過濾。取汁為100ml，如水分不足再加些開水補(bǔ)足。另外稱葡萄糖2，瓊脂2，纖維素0.5(纖維素為將草粉過100目)放置電爐上溶解。②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，待培養(yǎng)基表面長出并布滿綠色孢子為正常，如長有其它顏色為感染雜菌(2)二級菌劑培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作草粉50，麥麩39，玉米面10，尿素0.3，硫酸銨0.3，氯化鈉0.4，PH值用磷酸調(diào)為5左右，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水倒入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右；③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在25℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，培養(yǎng)料表面長出并布滿綠色孢子為成品，如長有其它顏色為感染雜菌(3)三級菌酶培養(yǎng)與制作①培養(yǎng)基制作草粉50，麥麩39，玉米面10，尿素0.3，硫酸銨0.3，氯化鈉0.4，PH值用磷酸調(diào)為5左右，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，然后裝入塑料袋或布袋內(nèi)放置高壓鍋中1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種。接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為20-36小時左右，直到培養(yǎng)料長出并布滿白色菌絲為成品，如長有其它顏色為感染雜菌3)黑曲霉蛋白酶AS3.350斜面菌種和菌劑及菌酶的制作(1)斜面菌種制作①斜面菌種培養(yǎng)基制作5°Be度麥芽汁30毫升，糖1克，碳酸鈉0.1克，硫酸鎂0.02克，氯化鉀0.03，硫酸鐵0.001克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水加至100毫升，測PH值為5～6左右，加入瓊脂2，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立，打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種；②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種；③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，培養(yǎng)基表面長出并布滿黑色孢子為正常，如長有其它顏色為感染雜菌(2)二級菌劑培養(yǎng)①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，蛋白粉29，(NH4)SO40.7，K2HPO40.3，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，測調(diào)PH值為5～6左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水到入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右；③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，直到培養(yǎng)料表面長出并布滿黑色孢子時為成品，如長有其它顏色為雜菌；(3)三級菌酶培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，蛋白粉或玉米粉29，(NH4)SO40.7，K2HPO40.3，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，測調(diào)PH值為5～6左右，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％；③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為20-36小時左右，培養(yǎng)料表面長出并布滿白色菌為合格，如長有其它顏色為感染雜菌；4)黑曲霉淀粉酶AS3.40斜面菌種和菌劑及菌酶的制作(1)斜面菌種制作①斜面培養(yǎng)基制作馬鈴薯去皮去芽，稱20克切細(xì)放入100ml水中，用微火煮開后15分鐘即可用雙層紗布過濾。取汁為100ml，如水分不足再加些開水補(bǔ)足。另外稱葡萄糖2，瓊脂2，蒸餾水100ml，PH7.0，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種；②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上，劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種。③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，待培養(yǎng)基表面長出并布滿黑色孢子時為正常，如有其它顏色為感染雜菌；(2)二級菌劑培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作培養(yǎng)基為豆餅粉30，麩皮50，玉米粉15.淀粉4，NaCl 0.2，磷酸氫二鈉0.8，PH值7.1-7.2；(3)三級菌酶培養(yǎng)與制作培養(yǎng)基為豆餅粉30，麩皮50，玉米粉15.淀粉4，Nacl 0.2，磷酸氫二鈉0.8，PH值為7左右，常壓滅菌1小時或1kg/cm2壓力滅菌30分鐘，降溫至40℃按種子液0.5-1％，深層通風(fēng)發(fā)酵或淺層發(fā)酵，室內(nèi)溫度為25℃左右，品溫35-40℃左右，培養(yǎng)發(fā)酵24-40小時，在35-40℃下烘干，即為成品5)黑曲酶植酸酶AS3.40斜面菌種和菌劑及菌酶的制作(1)斜面菌種制作①斜面菌種培養(yǎng)基制作5°Be度麥芽汁30毫升，糖1克，碳酸鈉0.1克，硫酸鎂0.02克，氯化鉀0.03，硫酸鐵0.001克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水加至100毫升，測PH值為5～6左右，加入瓊脂2，放置電爐上溶解，待瓊脂溶解后，分別裝入試管，每管裝量一般為管的四分之一處。裝管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水紙包好，放入高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘。滅菌后，拔掉電源，待壓力回到0時將放氣閥和安全閥直立，打開滅菌鍋，將培養(yǎng)基拿出擺成斜面，斜面長度為管的1/3處，等斜面凝固后開始接種；②接種接種前，要將接種用具及接種室用紫外線燈滅菌20～30分鐘。關(guān)掉滅菌燈后過5～10分鐘左右在酒精燈下按無菌要求進(jìn)行操作，操作步驟如下第一，用右手小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，棉塞下部應(yīng)露在手外，勿放桌上，以免污染；第二，將試管口迅速在火焰上微燒一周，使試管口上可能沾染的少量雜菌或帶菌塵埃得以燒死；第三，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體。然后用環(huán)輕輕取菌少許，并將接種環(huán)慢慢從試管中抽出；第四，在火旁迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃線時由底部劃起，劃成較密的波浪線狀，注意勿將培養(yǎng)基劃破，也不要使菌體沾污管壁；第五，灼燒試管口，并在火旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要將試管去迎棉塞，以免試管在移動時污染雜菌；第六，接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須徹底燒死后才能進(jìn)行下一個試管接種③培養(yǎng)接種完畢將試管菌種包扎好放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度為28℃～32℃左右，培養(yǎng)時間為48-72小時左右，培養(yǎng)基表面長出并布滿黑色孢子為正常，如長有其它顏色為感染雜菌(2)二級菌劑培養(yǎng)①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，蛋白粉或玉米粉29，(NH4)SO40.7，K2HPO40.3，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，測調(diào)PH值為5～6左右，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種；②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，然后取出無菌鹽水到入試管內(nèi)半管，用大拇指堵住試管口搖晃幾下，使菌液充分混合，倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻。接種量為1支斜面菌種可接250克左右；③培養(yǎng)把接好的二級菌種放入恒溫箱培養(yǎng)28℃～32℃或室溫在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48小時左右，直到培養(yǎng)料表面長出并布滿黑色孢子為成品，如長有其它顏色為雜菌；(3)三級菌酶培養(yǎng)制作①培養(yǎng)基制作稱豆餅粉15，麥麩55，蛋白粉或玉米粉29，(NH4)SO40.7，K2HPO40.3，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，測調(diào)PH值為5～6左右，加水至用手緊握指縫有水而不滴下來為宜，然后裝入塑料袋或罐頭瓶中放置高壓鍋1.05kg/cm2滅菌30分鐘，在滅菌的同時，應(yīng)取0.5％的鹽水同時滅菌稱無菌鹽水，備用。滅菌完畢將物料取出，晾涼至40℃左右時開始接種；接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％②接種首先將接種室及接種工具用紫外線滅菌20～30分鐘，關(guān)掉滅菌燈5～10分鐘后再進(jìn)行操作。接種時先將手和接種工具用酒精消毒，把二級菌劑倒入培養(yǎng)料中攪拌均勻，接種量濕菌種為3％，干菌種為1.5％③培養(yǎng)把接好的三級菌劑放入恒溫箱或發(fā)酵機(jī)或淺層在20℃～30℃之間的無菌室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為20-36小時左右，培養(yǎng)料表面長出并布滿白色菌絲為成品，如長有其它顏色為感染雜菌6)光合細(xì)菌的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基配方為①氯化胺NH4Cl 0.8克②碳酸氫鈉 0.5克③磷酸氫二鉀 0.2克④醋酸鈉(乙酸鈉)CH3COONa 0.4克⑤硫酸鎂 0.1克⑥氯化鈉 0.5克⑦生長因子 0.6毫升⑧微量元素水溶液6毫升(2)制作工藝將以上原料用40毫升蒸餾水溶解，加蒸餾水至1000毫升，加入生長因子1克，微量元素水溶液10毫升，用磷酸調(diào)ph值7左右，在加入10％的菌液搖晃均勻，放入透明度比較好的瓶內(nèi)，用40瓦電燈進(jìn)行對稱照射，距離為10-20厘米，溫度控制在28-30℃左右，經(jīng)三天培養(yǎng)即可成功(3)生長因子配方①維生素B10.00mg，②尼克丁酸0.1mg，③對氨基苯鉀酸0.1mg，④生物素0.001mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至10ml，過濾除菌備用；(4)微量元素溶液配方①氯化鐵0.12mg，②硫酸銅0.1mg，③硼酸0.1mg，④硫酸錳0.05mg，⑤硫酸鋅0.4-mg，⑥硝酸鈷0.8mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至1000ml，過濾除菌備用；
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種微生物復(fù)合酶綠色飼料促長劑及其生產(chǎn)方法，其特征在于操作工藝與步驟1)原料的預(yù)處理(1)硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅因含水分在加工中會有很大的困難，因此須先進(jìn)行處理，主要以干燥處理為主，可采用強(qiáng)制干燥，在條件及設(shè)備較差的情況下，可用日光晾曬，粉碎過100目；(2)碘化鉀、氯化鈷的預(yù)處理采用吸收劑平衡法，將碘化鉀和氯化鈷原料分別準(zhǔn)確的稱量，然后各以1∶15-1∶20的比例溶解于水中，再分別按照1∶100的比例噴在石粉等吸收劑上進(jìn)行混合，而后進(jìn)行干燥、粉碎過200目；(3)亞硒酸鈉的預(yù)處理一般采用將含50％以上的亞硒酸鈉加入81℃的熱水中，經(jīng)過5min溶解后制成10kg水溶液(即1kg原料溶解于10kg水中然后再噴灑在攪拌機(jī)內(nèi)的糠粉上，糠粉過200目以1∶100的比例噴在糠粉上，混合烘干后過200目)，混合均勻制成稀釋劑，再與其它原料混合成為硒的預(yù)混合料2)載體和稀釋劑的選擇載體一般選擇石粉、氫質(zhì)碳酸鈣、沸石粉、淀粉、麥麩、玉米粉等，以3-8％的比例逐級擴(kuò)大；3)原料的粒度微量元素一般要求通過80-400目，即粒度在0.17-0.05mm以下，鐵、鋅、錳、銅、鎂等微量元素的粉碎粒度應(yīng)全部通過80目(0.3mm)鈷、碘、硒等級微量成分粉碎至200目(0.076mm)以下，為了達(dá)到很細(xì)的粒度，需要使用特別磨進(jìn)行細(xì)磨，如碘、鉀、硒用球磨機(jī)細(xì)磨才能達(dá)到所需求的粒度，氯化鈷、銅、鐵、錳、鋅要使用微米極磨細(xì)至幾個微米才能保證適宜的粒度，達(dá)到最佳的混合均勻度；4)操作(1)一次擴(kuò)大稀釋①先將碘化鉀、氯化鈷、亞硒酸鈉用磷酸氫鈣或碳酸氫鈣為載體以3倍的比例擴(kuò)大稀釋，先加入1％載體量的油脂，混合5分鐘然后加入以上微量元素，混合攪拌20分鐘后取出，再進(jìn)行二次稀釋；②將鐵、鋅、銅、錳等微量元素用磷酸氫鈣或碳酸鈣或玉米粉為載體以3倍的比例擴(kuò)大稀釋，先將載體加入混合機(jī)中，加入載體量1％的油脂，混合5分鐘然后加入以上微量元素，混合20分鐘后取出，再進(jìn)行二次稀釋；③將其它生長劑、多維素等用碳酸鈣或玉米粉為載體以3倍左右的比例混合稀釋，先將載體加入混合機(jī)中，加入載體量1％的油脂，混合5分鐘，然后加入生長劑等混合20分鐘取出，再進(jìn)行二次擴(kuò)大稀釋(2)二次擴(kuò)大稀釋將以上一次預(yù)混劑用麥麩、玉米面為載體以3倍左右的比例進(jìn)行稀釋擴(kuò)大，復(fù)合酶也采取二次稀釋擴(kuò)大(3)三次擴(kuò)大稀釋與混合將全部二次混合的預(yù)混劑合并稱重，載體以磷酸氫鈣加入足量，然后加入1％的油脂，混合5分鐘，然后將全部二次稀釋劑加入混合劑攪拌混合20分鐘，即為動物促長劑。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種采用微生物工程技術(shù)，選用多株菌經(jīng)復(fù)活、分離、純化、誘變高活性菌種，制作果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、a淀粉酶、植酸酶、光合細(xì)菌等生物菌群與礦物質(zhì)、微量元素等，采用現(xiàn)代化工藝生產(chǎn)高效綠色動物促長劑。該技術(shù)由于含有大量的活性酶和促長因子，提高了動物新陳代謝功能，使之產(chǎn)生對動物機(jī)體互相協(xié)同及綜合平衡作用，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在動物腸道中快速降解，促進(jìn)動物對飼料營養(yǎng)成分的吸收和轉(zhuǎn)化，以達(dá)到促進(jìn)動物增長和節(jié)約飼料的目的。該技術(shù)的原料以農(nóng)作物秸稈、殼皮、餅等副產(chǎn)物，使廢物得到了有效的利用，變廢為寶，原料來源取之不盡，用之不竭，提高了飼料投入產(chǎn)出比，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。該技術(shù)主要應(yīng)用于豬、雞等動物飼料添加劑。本發(fā)明生產(chǎn)方法及工藝易掌握，投資小，成本低，適宜個體、中小企業(yè)和鄉(xiāng)鎮(zhèn)投資建廠。
文檔編號C12N1/14GKCN1522591SQ03156870
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月11日
發(fā)明者張明, 羅旭東, 董春青, 杜永樂, 周賀年, 高銀相, 張 明 申請人:北京中科群星科技有限責(zé)任公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan