本發(fā)明涉及保健品及藥品領(lǐng)域，具體是一種延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物。

背景技術(shù)：

多肽從二十世紀(jì)初才開始受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)它區(qū)別于蛋白質(zhì)區(qū)別于氨基酸，具有藥物的作用。到了上個(gè)世紀(jì)九十年代才有了長(zhǎng)足發(fā)展，在不斷更新的技術(shù)指導(dǎo)下，多肽的應(yīng)用范圍越來越廣，作用也越來越大，這才邁進(jìn)了我們的生活，在我們生活中占據(jù)的份額越來越大，多肽類藥物高效低毒特異性強(qiáng)具有區(qū)別于其他藥物的特有優(yōu)勢(shì)，正不斷影響著我們的生活。而且多肽潛力巨大，是生物科學(xué)發(fā)展的又一大突破和發(fā)展方向。

天然存在的海洋活性多肽由于在生物體中含量低，而且提取困難，難以實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)供給所需，化學(xué)人工合成多肽成本昂貴。所以，人們更多地把目光投向開發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物獲得活性多肽這條途徑上來。由于海洋生物生存的環(huán)境與陸地生物完全不同，如高壓、低溫、高溫和高鹽等極端環(huán)境，為了適應(yīng)這些極端的海洋生物環(huán)境，海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，同時(shí)，海洋生物蛋白資源無論在種類和數(shù)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陸地蛋白資源，并且未得到很好的開發(fā)。種類繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解，就釋放出有活性的肽段。海洋生物蛋白資源是21世紀(jì)人類重要的蛋白類食物及生物活性物質(zhì)的重要來源。我國(guó)目前的海洋生物蛋白資源總量在世界各國(guó)名列前茅，但我國(guó)目前的蛋白類水產(chǎn)品中，除一部分直接食用外，大部分通過簡(jiǎn)單的加工技術(shù)制成食品進(jìn)入市場(chǎng)，加工技術(shù)落后，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，產(chǎn)品的附加值低，使得產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力較差。因此，我國(guó)急需對(duì)海洋生物蛋白資源進(jìn)行優(yōu)化利用和高值化加工。

腦細(xì)胞是構(gòu)成腦的多種細(xì)胞的通稱。腦細(xì)胞主要包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)元細(xì)胞高度分化，不可再生，科學(xué)研究顯示，人到40歲以后腦細(xì)胞數(shù)目會(huì)逐漸減少，一般人到死亡時(shí)腦細(xì)胞會(huì)消耗掉10%左右。大腦掌管語(yǔ)言、思維記憶及計(jì)算等活動(dòng)，小腦掌握著人體的動(dòng)作與協(xié)調(diào)能力，腦細(xì)胞的減少會(huì)導(dǎo)致人出現(xiàn)記憶力下降，智力減退等癥狀。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn101503728b的中國(guó)發(fā)明專利，公開了一種從青占魚魚骨中提取復(fù)合多肽液的方法。包括以下步驟：將青占魚魚骨洗凈、絞碎，用去離子水浸泡；過濾除去去離子水，將魚骨按1∶5-1∶10的質(zhì)量比例的加入水，按魚骨質(zhì)量的1％-5％量按動(dòng)物蛋白水解酶和中性蛋白酶的質(zhì)量比為3∶1-1∶3的比例加入酶，調(diào)節(jié)ph在5.5-8.5，然后在45-70℃溫度下酶解；將上述酶解液90-100℃加熱，以使酶失活；用亞麻布過濾，濾液在2000-4000rpm離心10-15min，得到的上清液通過gpc凝膠凈化，再過濾除菌得到復(fù)合多肽液。上述制備方法制備的到的復(fù)合多肽純度不高，且在制備過程中損失量大，提取率不高。蛋白酶均采用陸地蛋白酶，不能對(duì)海洋蛋白進(jìn)行很好的開發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種純度高，可有效延長(zhǎng)人體腦細(xì)胞的壽命的深海魚提取物。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物，以深海魚魚糜為原料，通過分步酶解、微濾、二次超濾并納濾、大孔樹脂吸附洗脫和冷凍干燥得到。得到的深海魚提取物可抑制內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的產(chǎn)生，延緩細(xì)胞染色體的dna降解，從而延緩神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡程序的表達(dá)，有效延長(zhǎng)其壽命。分步酶解步驟為在深海魚魚糜中加入條斑紫菜蛋白酶和活性短肽酶解，調(diào)節(jié)ph后加入風(fēng)味蛋白酶酶解，得到酶解液。深海魚蛋白上有大量條斑紫菜蛋白酶的酶切位點(diǎn)，酶解后可得到長(zhǎng)短不一的肽鏈，再用風(fēng)味蛋白酶酶解可得到能有效延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的復(fù)合多肽。采用其他蛋白酶分步酶解不能得到上述復(fù)合多肽。

深海魚魚糜中加入20~30倍體積水，條斑紫菜蛋白酶的加入量為5~8wt‰，酶解溫度25~35℃，ph為7.0~9.0，酶解時(shí)間為30~40min，酶解結(jié)束后滅酶。上述酶解條件下，條斑紫菜蛋白酶的酶解效率高又不會(huì)造成資源浪費(fèi)。

風(fēng)味蛋白酶加入量為1~3wt﹪，酶解ph為6.0~7.0，酶解溫度為52~60℃，酶解時(shí)間為15~25min，酶解結(jié)束后滅酶，過濾取濾液。酶解結(jié)束后滅酶。上述酶解條件下，風(fēng)味蛋白酶的酶解效率高又不會(huì)造成資源浪費(fèi)。

活性短肽的加入量為條斑紫菜蛋白酶質(zhì)量的10~20﹪，氨基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。上述活性短肽可通過范德華力和靜電作用來改變條斑紫菜蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使條斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明顯提高。

微濾步驟為將濾液于20~30℃，0.14~0.27mpa條件下經(jīng)0.2~0.4μm微濾膜微濾。為了防止大分子蛋白及其他大分子雜質(zhì)污染超濾膜，需將濾液進(jìn)行微濾處理。

二次超濾并納濾步驟為先采用截留相對(duì)分子質(zhì)量20~30kd的膜超濾，再采用截留相對(duì)分子質(zhì)量1~3kd的膜超濾，最后將濾過液進(jìn)行納濾除鹽。為了防止膜孔堵塞或膜損害，先采用大孔超濾膜進(jìn)行超濾，再采用小孔超濾膜超濾，有效去除分子量大于1~3kd的雜質(zhì)。納濾可較徹底的去除溶液中的無機(jī)鹽及分子量小于200da的雜質(zhì)，對(duì)復(fù)合多肽進(jìn)一步進(jìn)行純化。

二次超濾的條件分別為，超濾溫度為20~30℃，操作壓力為0.14~0.25mpa，超濾時(shí)間為40~70min；超濾溫度為20~30℃，操作壓力為0.6~1mpa，超濾時(shí)間為1~2h。上述條件下，超濾過程中不會(huì)出現(xiàn)過厚的凝膠層，超濾速度也較為理想。

大孔樹脂吸附洗脫步驟為將納濾后的液體濃縮，上樣濃度為0.1~0.3g/ml，上樣流速為0.4~0.6ml/min，洗脫劑體積為7.7~7.9bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為0.8~1.4ml/min。收集最后2/3的洗脫液并低溫濃縮。大孔樹脂對(duì)復(fù)合多肽進(jìn)行吸附和解吸附，平衡吸附量可達(dá)14.23mg/g左右，靜態(tài)吸附率達(dá)到90.15%左右和靜態(tài)解吸率達(dá)到86.54%左右，可有效將復(fù)合多肽與其他雜質(zhì)分開。

冷凍干燥步驟為：預(yù)凍：-35~-45℃預(yù)凍3~5h；冷凍干燥：-45~-35℃，3~5pa冷凍干燥5~7h，-10~-5℃，10~20pa冷凍干燥2~3h；升華干燥：10~15℃，50~60pa升華干燥3~4h；解析干燥:7~14℃，3~5pa解析干燥2~4h，得到延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物。凍干整個(gè)過程都在程序的控制下，操作簡(jiǎn)單，工序簡(jiǎn)潔，自動(dòng)化程度高，減少了人力、物力。低溫下干燥能更好地保留復(fù)合多肽的活性；低壓下干燥，復(fù)合多肽不易氧化，療效更好；凍結(jié)時(shí)復(fù)合多肽形成“骨架”，干燥后保存原形，為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，產(chǎn)品外觀更加優(yōu)良；復(fù)水性好，凍干復(fù)合多肽能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài)，使用方便；脫水徹底，復(fù)合多肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于長(zhǎng)途運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。

作為優(yōu)選，深海魚為秋刀魚或馬面魚或海鱸或金槍魚或鯪魚或鱈魚。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1）本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，每一步均有詳細(xì)數(shù)據(jù)，重現(xiàn)性強(qiáng)，適合大規(guī)模生產(chǎn)；2）深海魚蛋白上有大量條斑紫菜蛋白酶的酶切位點(diǎn)，酶解后可得到長(zhǎng)短不一的肽鏈，再用風(fēng)味蛋白酶酶解可得到能有效延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物。得到的深海魚提取物可抑制內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的產(chǎn)生，延緩細(xì)胞染色體的dna降解，從而延緩神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡程序的表達(dá)，有效延長(zhǎng)其壽命；3）斑紫菜蛋白酶酶解時(shí)添加了氨基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc的活性短肽。上述活性短肽可通過范德華力和靜電作用來改變條斑紫菜蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使條斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明顯提高。

具體實(shí)施例

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物，以深海魚魚糜為原料，通過分步酶解、微濾、二次超濾并納濾、大孔樹脂吸附洗脫和冷凍干燥得到。得到的深海魚提取物可抑制內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的產(chǎn)生，延緩細(xì)胞染色體的dna降解，從而延緩神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡程序的表達(dá)，有效延長(zhǎng)其壽命。分步酶解步驟為在秋刀魚魚糜中加入條斑紫菜蛋白酶和活性短肽酶解，調(diào)節(jié)ph后加入風(fēng)味蛋白酶酶解，得到酶解液。秋刀魚蛋白上有大量條斑紫菜蛋白酶的酶切位點(diǎn)，酶解后可得到長(zhǎng)短不一的肽鏈，再用風(fēng)味蛋白酶酶解可得到能有效延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的復(fù)合多肽。采用其他蛋白酶分步酶解不能得到上述復(fù)合多肽。

秋刀魚魚糜中加入26倍體積水，條斑紫菜蛋白酶的加入量為7wt‰，酶解溫度30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為32min，酶解結(jié)束后滅酶。上述酶解條件下，條斑紫菜蛋白酶的酶解效率高又不會(huì)造成資源浪費(fèi)。

風(fēng)味蛋白酶加入量為2wt﹪，酶解ph為6.5，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為18min，酶解結(jié)束后滅酶，過濾取濾液。酶解結(jié)束后滅酶。上述酶解條件下，風(fēng)味蛋白酶的酶解效率高又不會(huì)造成資源浪費(fèi)。

活性短肽的加入量為條斑紫菜蛋白酶質(zhì)量的13﹪，氨基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。上述活性短肽可通過范德華力和靜電作用來改變條斑紫菜蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使條斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明顯提高。

微濾步驟為將濾液于25℃，0.2mpa條件下經(jīng)0.3μm微濾膜微濾。為了防止大分子蛋白及其他大分子雜質(zhì)污染超濾膜，需將濾液進(jìn)行微濾處理。

二次超濾并納濾步驟為先采用截留相對(duì)分子質(zhì)量20kd的膜超濾，再采用截留相對(duì)分子質(zhì)量2kd的膜超濾，最后將濾過液進(jìn)行納濾除鹽。為了防止膜孔堵塞或膜損害，先采用大孔超濾膜進(jìn)行超濾，再采用小孔超濾膜超濾，有效去除分子量大于2kd的雜質(zhì)。納濾可較徹底的去除溶液中的無機(jī)鹽及分子量小于200da的雜質(zhì)，對(duì)復(fù)合多肽進(jìn)一步進(jìn)行純化。

二次超濾的條件分別為，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.21mpa，超濾時(shí)間為60min；超濾溫度為25℃，操作壓力為0.8mpa，超濾時(shí)間為1h。上述條件下，超濾過程中不會(huì)出現(xiàn)過厚的凝膠層，超濾速度也較為理想。

大孔樹脂吸附洗脫步驟為將納濾后的液體濃縮，上樣濃度為0.2g/ml，上樣流速為0.5ml/min，洗脫劑體積為7.8bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為1ml/min。收集最后2/3的洗脫液并低溫濃縮。大孔樹脂對(duì)復(fù)合多肽進(jìn)行吸附和解吸附，平衡吸附量可達(dá)14.54mg/g，靜態(tài)吸附率達(dá)到90.21%和靜態(tài)解吸率達(dá)到86.55%，可有效將復(fù)合多肽與其他雜質(zhì)分開。

冷凍干燥步驟為：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍5h；冷凍干燥：-40℃，4pa冷凍干燥6h，-7℃，16pa冷凍干燥2.6h；升華干燥：13℃，57pa升華干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的秋刀魚提取物。凍干整個(gè)過程都在程序的控制下，操作簡(jiǎn)單，工序簡(jiǎn)潔，自動(dòng)化程度高，減少了人力、物力。低溫下干燥能更好地保留復(fù)合多肽的活性；低壓下干燥，復(fù)合多肽不易氧化，療效更好；凍結(jié)時(shí)復(fù)合多肽形成“骨架”，干燥后保存原形，為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，產(chǎn)品外觀更加優(yōu)良；復(fù)水性好，凍干復(fù)合多肽能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài)，使用方便；脫水徹底，復(fù)合多肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于長(zhǎng)途運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。

實(shí)施例2：

延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物，以深海魚魚糜為原料，通過分步酶解、微濾、二次超濾并納濾、大孔樹脂吸附洗脫和冷凍干燥得到。

延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物的制備方法，包括以下步驟：

1）分步酶解：在鱈魚魚糜中加入25倍體積水，攪拌均勻后加入6wt‰條斑紫菜蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶質(zhì)量10%的活性短肽酶解。活性短肽的氨基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。酶解溫度30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為32min，酶解結(jié)束后沸水浴3min滅酶。調(diào)節(jié)ph后加入3wt﹪風(fēng)味蛋白酶酶解。酶解ph為6.5，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為18min，酶解結(jié)束后沸水浴3min滅酶，得到酶解液；

2）微濾：將濾液于25℃，0.2mpa條件下經(jīng)0.3μm微濾膜微濾。待濾液微濾至加入量80%時(shí)，向截留液中加入適量水，攪拌，繼續(xù)微濾，待微濾液收集至體積等于濾液加入量時(shí)停止微濾；

3）二次超濾并納濾：先采用截留相對(duì)分子質(zhì)量20kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.21mpa，超濾時(shí)間為60min。再采用截留相對(duì)分子質(zhì)量2kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.8mpa，超濾時(shí)間為1h，最后將濾過液進(jìn)行納濾除鹽；

4）大孔樹脂吸附洗脫：將hpd100型非極性大孔樹脂置于燒杯中，用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨脹，抽濾后加入95%乙醇洗滌大孔樹脂至洗滌液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗凈乙醇，真空抽濾備用。將納濾后的液體濃縮，上樣濃度為0.2g/ml，上樣流速為0.5ml/min，洗脫劑體積為7.8bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為1ml/min。收集最后2/3的洗脫液并低溫濃縮；

5）冷凍干燥：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍5h；冷凍干燥：-40℃，4pa冷凍干燥6h，-7℃，16pa冷凍干燥2.6h；升華干燥：13℃，57pa升華干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的鱈魚提取物。得到的鱈魚提取物可抑制內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的產(chǎn)生，延緩細(xì)胞染色體的dna降解，從而延緩神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡程序的表達(dá)，有效延長(zhǎng)其壽命。

實(shí)施例3：

延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物，以深海魚魚糜為原料，通過分步酶解、微濾、二次超濾并納濾、大孔樹脂吸附洗脫和冷凍干燥得到。

延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物的制備方法，包括以下步驟：

1）分步酶解：在鱈魚魚糜中加入27倍體積水，攪拌均勻后加入7wt‰條斑紫菜蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶質(zhì)量15%的活性短肽酶解?；钚远屉牡陌被嵝蛄袨閟casvckarcracrrgcgsvfcrclrc。酶解溫度30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為32min，酶解結(jié)束后沸水浴3min滅酶。調(diào)節(jié)ph后加入3wt﹪風(fēng)味蛋白酶酶解。酶解ph為6.5，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為18min，酶解結(jié)束后沸水浴3min滅酶，得到酶解液；

2）微濾：將濾液于25℃，0.218mpa條件下經(jīng)0.3μm微濾膜微濾。待濾液微濾至加入量80%時(shí)，向截留液中加入適量水，攪拌，繼續(xù)微濾，待微濾液收集至體積等于濾液加入量時(shí)停止微濾；

3）二次超濾并納濾：先采用截留相對(duì)分子質(zhì)量20kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.18mpa，超濾時(shí)間為50min。再采用截留相對(duì)分子質(zhì)量1kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.8mpa，超濾時(shí)間為1.8h，最后將濾過液進(jìn)行納濾除鹽；

4）大孔樹脂吸附洗脫：將hpd100型非極性大孔樹脂置于燒杯中，用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨脹，抽濾后加入95%乙醇洗滌大孔樹脂至洗滌液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗凈乙醇，真空抽濾備用。將納濾后的液體濃縮，上樣濃度為0.2g/ml，上樣流速為0.5ml/min，洗脫劑體積為7.9bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為1ml/min。收集最后2/3的洗脫液并低溫濃縮；

5）冷凍干燥：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍5h；冷凍干燥：-40℃，4pa冷凍干燥6h，-7℃，16pa冷凍干燥2.6h；升華干燥：13℃，57pa升華干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的鱈魚提取物。得到的鱈魚提取物可抑制內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的產(chǎn)生，延緩細(xì)胞染色體的dna降解，從而延緩神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡程序的表達(dá)，有效延長(zhǎng)其壽命。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>浦江縣泰如食品科技有限公司

<120>延長(zhǎng)腦細(xì)胞壽命的深海魚提取物

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>27

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

sercysalaservalcyslysalaargcysargalacysargarggly

151015

cysglyservalphecysargcysleuargcys

2025