本發(fā)明涉及β-葡萄糖苷酶在豆奶中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豆奶和豆粉是傳統(tǒng)的大豆制品，有著悠久的發(fā)展歷史。上世紀(jì)70年代開始盛行于中國、日本、韓國等亞洲國家。豆奶和豆粉之所以被廣泛認(rèn)可，因其富含大豆蛋白和不飽和脂肪酸，且不含乳糖和膽固醇。大豆是我國的主要農(nóng)作物，大豆的加工業(yè)正處于不斷發(fā)展過程中。目前國內(nèi)生產(chǎn)豆奶和豆粉的大中型加工企業(yè)約為90家，年產(chǎn)量為85萬噸，年加工大豆65萬噸，年產(chǎn)沖調(diào)豆粉及豆乳粉35萬噸，飲用豆奶50萬噸，占大豆蛋白制品的18％左右。2013年我國城鎮(zhèn)居民對奶產(chǎn)品的消費(fèi)達(dá)到人均25kg左右，增長率達(dá)到18.3％。由于我國的動物奶源有限，進(jìn)口奶制品價格居高不下，對于植物蛋白源的開發(fā)利用將會起到積極作用，尤其是豆奶和豆粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展將是動物源奶制品的重要的補(bǔ)充。國外，如美國、日本和德國更加重視豆奶和豆粉的研究開發(fā)。對豆奶和豆粉的進(jìn)一步加工，賦予其對人體健康更有益的功能性將是應(yīng)用創(chuàng)新的重要方向。

近年來研究發(fā)現(xiàn)大豆中含有豐富的大豆異黃酮。大豆異黃酮具有一定的雌激素活性，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，對衰老、動脈粥樣硬化、癌癥、骨質(zhì)疏松等具有顯著的預(yù)防作用。作為主要大豆制品的豆奶和豆粉因含有特殊生理活性的大豆異黃酮而受到越來越多的關(guān)注。大豆中的異黃酮主要以異黃酮糖苷化合物和異黃酮糖苷配基化合物兩種形式存在。研究表明，異黃酮糖苷配基化合物的生物活性明顯高于異黃酮糖苷化合物，是人體利用的有效形式。而大豆中的異黃酮糖苷化合物的含量遠(yuǎn)高于異黃酮糖苷配基化合物，所以，天然大豆及其制品中異黃酮生物有效性較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種β-葡萄糖苷酶在豆奶中的應(yīng)用方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)解決方案是：

一種β-葡萄糖苷酶在豆奶中的應(yīng)用方法，具體是在豆奶中接入培養(yǎng)的植物乳桿菌，利用植物乳桿菌在豆奶發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶直接轉(zhuǎn)化豆奶的異黃酮糖苷化合物為異黃酮糖苷配基化合物，提高豆奶的生物有效性。

優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的植物乳桿菌的接種量為4％，以體積比計，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24h。

上述的一種β-葡萄糖苷酶在豆奶中的應(yīng)用方法，包括以下步驟：

(1)制備豆奶：將大豆置于蒸餾水中浸泡過夜；去除大豆皮，并用蒸餾水洗凈；取去皮大豆200g加入500ml蒸餾水，使用豆?jié){機(jī)磨碎；所得漿料于80℃煮15min后，用雙層紗布過濾，除去不溶的殘渣；將過濾出的豆?jié){加入錐形瓶中，121℃滅菌15min；冷卻至室溫，加入蔗糖溶液，得到豆奶培養(yǎng)基；取樣測定初始豆奶培養(yǎng)基中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)菌種培養(yǎng)：取保存于甘油管中的植物乳桿菌菌液300μl，接種于mrs培養(yǎng)基中，蓋上厭氧瓶瓶蓋，于37℃下靜置培養(yǎng)20h；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：取植物乳桿菌種子液接種于備用的豆奶培養(yǎng)基中，接種量為4％，以體積分?jǐn)?shù)計，于37℃下培養(yǎng)24h，取樣品用于測定β-葡萄糖苷酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的含量。

上述β-葡萄糖苷酶活性測定方法如下：植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)體系為1.2ml0.1mph為5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反應(yīng)30min后加入2ml0.5m碳酸鈉終止反應(yīng)，在400nm測定對硝基苯酚的吸光值；以不同濃度的對硝基苯酚標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算對硝基苯酚含量；酶活單位定義為45℃下，在1min內(nèi)催化水解p-npg產(chǎn)生1μm對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活單位。

上述有機(jī)酸含量測定方法如下：取樣品1ml加入1.5ml離心管中，10000rpm離心1min，取上清液用0.22μm濾膜過濾用于hplc測定；色譜條件：高效液相色譜儀，aminexhpx-87h有機(jī)酸和醇分析柱，流動相為0.005mh2so4水溶液，流速為0.6ml/min，檢測波長為210nm，柱溫為35℃。

上述異黃酮含量測定方法如下：取5ml樣品加入5ml質(zhì)量百分比濃度70％乙醇溶液混勻后，60℃下超聲提取40min，10000rpm離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾用于hplc測定；色譜條件為：高效液相色譜儀，c18色譜柱，流動相為乙腈和0.2％甲酸，梯度洗脫，流速為0.8ml/min，檢測波長為260nm，柱溫為35℃。

本發(fā)明接種的植物乳桿菌具有胞外分泌β-葡萄糖苷酶的特性，從而將豆奶中的異黃酮糖苷化合物轉(zhuǎn)化為異黃酮糖苷配基化合物。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：

采用本發(fā)明應(yīng)用方法，β-葡萄糖苷酶活性最高為9.24u/ml，ph為4.12，乳酸含量為92.45mm，乙酸含量為10.01mm，大豆苷元的含量為9.06mg/l，提高了1.9倍，染料木素含量為34.14mg/l，提高了4.0倍。本方法有效的提高了豆奶的生物有效性，更利于人體的消化吸收，乳酸和乙酸調(diào)節(jié)了豆奶的風(fēng)味，同時益生菌植物乳桿菌的添加，促進(jìn)了人體腸道健康。

具體實(shí)施方式

β-葡萄糖苷酶能夠催化大豆中的異黃酮糖苷化合物轉(zhuǎn)化為異黃酮糖苷配基化合物，更利于人體吸收利用，可提高大豆制品中異黃酮的生物有效性。目前市場上未見利用β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)的豆奶和豆粉產(chǎn)品出現(xiàn)。所以，將β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于豆奶和豆粉中具有較大的市場潛力。

益生菌在人體吸收利用大豆異黃酮的過程中起著重要作用，相當(dāng)數(shù)量的益生菌能夠分泌β-葡萄糖苷酶直接轉(zhuǎn)化異黃酮糖苷化合物為異黃酮糖苷配基化合物，且一些益生菌還能將大豆異黃酮糖苷配基化合物中的大豆苷元進(jìn)一步代謝成雌馬酚，生物活性更高。但人體腸道中的益生菌的種類因年齡、疾病等原因的影響而各不相同，導(dǎo)致每個人每天攝入的大豆異黃酮的量有很大差異。將益生菌直接添加到大豆發(fā)酵制品中，在發(fā)酵過程中益生菌分泌β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷化合物為苷元形式，利于腸道的吸收利用，同時可促進(jìn)腸道中益生菌群的生長。

為了便于理解本發(fā)明，下面將結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明，然而這些實(shí)施例只是起到說明的作用，本發(fā)明并不局限于下述實(shí)施例。

實(shí)施例1

自制豆奶：將大豆置于蒸餾水中浸泡過夜；去除大豆皮，并用蒸餾水洗凈；取去皮大豆200g加入500ml蒸餾水，使用豆?jié){機(jī)磨碎；所有漿料于80℃煮15min后，用雙層紗布過濾，除去不溶的殘渣；將過濾出的豆?jié){加入錐形瓶中，121℃滅菌15min；冷卻至室溫，加入過濾除菌的蔗糖溶液，取樣測定初始豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種培養(yǎng)：取保存于甘油管中的植物乳桿菌菌液300μl，接種于mrs培養(yǎng)基中，蓋上厭氧瓶瓶蓋，于37℃下靜置培養(yǎng)20h。發(fā)酵培養(yǎng)：取植物乳桿菌種子液接種于準(zhǔn)備好的豆奶培養(yǎng)基中，接種量為4％(v/v)，于37℃下培養(yǎng)12h，取樣品用于測定β-葡萄糖苷酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的含量。

β-葡萄糖苷酶活性測定：植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)體系為1.2ml0.1mph為5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反應(yīng)30min后加入2ml0.5m碳酸鈉終止反應(yīng)，在400nm測定對硝基苯酚的吸光值。以不同濃度的對硝基苯酚標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算對硝基苯酚含量。酶活單位(u)定義為45℃下，在1min內(nèi)催化水解p-npg產(chǎn)生1μm對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活單位。

有機(jī)酸含量測定：取樣品(植物乳桿菌在豆奶中發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶直接轉(zhuǎn)化異黃酮糖苷化合物液)1ml加入1.5ml離心管中，10000rpm離心1min，取上清液通過0.22μm濾膜過濾用于hplc測定。色譜條件：島津lc-20a高效液相色譜儀，aminexhpx-87h有機(jī)酸和醇分析柱，流動相為0.005mh2so4水溶液，流速為0.6ml/min，檢測波長為210nm，柱溫為35℃。

異黃酮含量測定：取5ml樣品加入5ml70％乙醇混勻后，60℃下超聲提取40min，10000rpm離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾用于hplc測定。色譜條件為：島津lc-20a高效液相色譜儀，c18色譜柱(150mm×4.6mm,5.0μm)，流動相為乙腈和0.2％甲酸(a：乙腈，b：0.2％甲酸)，梯度洗脫，流速為0.8ml/min，檢測波長為260nm，柱溫為35℃。

經(jīng)測定，豆奶中初始大豆苷為5.91mg/ml，染料木苷為28.30mg/ml，大豆苷元為3.09mg/ml，經(jīng)過植物乳桿菌發(fā)酵12h后，豆奶中的大豆苷為3.71mg/ml，染料木苷為11.62mg/ml，大豆苷元為5.36mg/ml，染料木素為23.53mg/ml，β-葡萄糖苷酶為8.64u/ml，乳酸為44.58mm，乙酸為8.79mm，ph為5.11。

實(shí)施例2

自制豆奶：將大豆置于蒸餾水中浸泡過夜；去除大豆皮，并用蒸餾水洗凈；取去皮大豆200g加入500ml蒸餾水，使用豆?jié){機(jī)磨碎；所有漿料于80℃煮15min后，用雙層紗布過濾，除去不溶的殘渣；將過濾出的豆?jié){加入錐形瓶中，121℃高壓滅菌15min；冷卻至室溫，加入的過濾除菌的蔗糖溶液使?jié)舛葹?％(w/v)，取樣測定初始豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種培養(yǎng)：取保存于甘油管中的植物乳桿菌lyt-3菌液300μl，接種于mrs培養(yǎng)基中，蓋上厭氧瓶瓶蓋，于37℃下靜置培養(yǎng)20h。

發(fā)酵培養(yǎng)：取植物乳桿菌lyt-3種子液接種于準(zhǔn)備好的豆奶培養(yǎng)基中，接種量為4％(v/v)，于37℃下培養(yǎng)12h，取樣品用于酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的測定。

β-葡萄糖苷酶活性測定：植物乳桿菌lyt-3發(fā)酵產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)體系為1.2ml0.1mph為5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反應(yīng)30min后加入2ml0.5m碳酸鈉終止反應(yīng)，在400nm測定對硝基苯酚的吸光值。以不同濃度的對硝基苯酚標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算對硝基苯酚含量。酶活單位(u)定義為45℃下，在1min內(nèi)催化水解p-npg產(chǎn)生1μm對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活單位。

有機(jī)酸含量測定：取樣品(植物乳桿菌lyt-3在豆奶中發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶直接轉(zhuǎn)化異黃酮糖苷化合物液)1ml加入1.5ml離心管中，10000rpm離心1min，取上清液于0.22μm濾膜過濾用于hplc測定。色譜條件：島津lc-20a高效液相色譜儀，aminexhpx-87h有機(jī)酸和醇分析柱，流動相為0.005mh2so4水溶液，流速為0.6ml/min，檢測波長為210nm，柱溫為35℃。

異黃酮含量測定：取5ml樣品加入5ml70％乙醇混勻后，60℃下超聲提取40min，10000rpm離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾用于hplc測定。色譜條件為：島津lc-20a高效液相色譜儀，c18色譜柱(150mm×4.6mm,5.0μm)，流動相為乙腈和0.2％甲酸(a：乙腈，b：0.2％甲酸)，梯度洗脫程序?yàn)?-10min，b5％-80％；10-16min，b80％；16-22min，b80％-5％，流速為0.8ml/min，檢測波長為260nm，柱溫為35℃。

經(jīng)測定，豆奶中初始大豆苷為5.91mg/ml，染料木苷為28.30mg/ml，大豆苷元為3.09mg/ml，經(jīng)過植物乳桿菌lyt-3發(fā)酵18h后，豆奶中的大豆苷為1.23mg/ml，染料木苷為2.97mg/ml，大豆苷元為7.63mg/ml，染料木素為32.45mg/ml，β-葡萄糖苷酶為8.49u/ml，乳酸為74.24mm，乙酸為9.05mm，ph為4.71。

實(shí)施例3

自制豆奶：將大豆置于蒸餾水中浸泡過夜；去除大豆皮，并用蒸餾水洗凈；取去皮大豆200g加入500ml蒸餾水，使用豆?jié){機(jī)磨碎；所有漿料于80℃煮15min后，用雙層紗布過濾，除去不溶的殘渣；將過濾出的豆?jié){加入錐形瓶中，121℃高壓滅菌15min；冷卻至室溫，加入的過濾除菌的蔗糖溶液使?jié)舛葹?％(w/v)，取樣測定初始豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種培養(yǎng)：取保存于甘油管中的植物乳桿菌lyt-3菌液300μl，接種于mrs培養(yǎng)基中，蓋上厭氧瓶瓶蓋，于37℃下靜置培養(yǎng)20h。

發(fā)酵培養(yǎng)：取植物乳桿菌lyt-3種子液接種于準(zhǔn)備好的豆奶培養(yǎng)基中，接種量為4％(v/v)，于37℃下培養(yǎng)24h，取樣品用于酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的測定。

β-葡萄糖苷酶活性測定：植物乳桿菌lyt-3發(fā)酵產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)體系為1.2ml0.1mph為5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反應(yīng)30min后加入2ml0.5m碳酸鈉終止反應(yīng)，在400nm測定對硝基苯酚的吸光值。以不同濃度的對硝基苯酚標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算對硝基苯酚含量。酶活單位(u)定義為45℃下，在1min內(nèi)催化水解p-npg產(chǎn)生1μm對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活單位。

有機(jī)酸含量測定：取植物乳桿菌lyt-3在豆奶中發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶直接轉(zhuǎn)化異黃酮糖苷化合物液1ml加入1.5ml離心管中，10000rpm離心1min，取上清液于0.22μm濾膜過濾用于hplc測定。色譜條件：島津lc-20a高效液相色譜儀，aminexhpx-87h有機(jī)酸和醇分析柱，流動相為0.005mh2so4水溶液，流速為0.6ml/min，檢測波長為210nm，柱溫為35℃。

異黃酮含量測定：取5ml樣品加入5ml70％乙醇混勻后，60℃下超聲提取40min，10000rpm離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾用于hplc測定。色譜條件為：島津lc-20a高效液相色譜儀，c18色譜柱(150mm×4.6mm,5.0μm)，流動相為乙腈和0.2％甲酸(a：乙腈，b：0.2％甲酸)，梯度洗脫程序?yàn)?-10min，b5％-80％；10-16min，b80％；16-22min，b80％-5％，流速為0.8ml/min，檢測波長為260nm，柱溫為35℃。

經(jīng)測定，豆奶中初始大豆苷為5.91mg/ml，染料木苷為28.30mg/ml，大豆苷元為3.09mg/ml，經(jīng)過植物乳桿菌lyt-3發(fā)酵24h后，豆奶中的大豆苷為0mg/ml，染料木苷為0mg/ml，大豆苷元為9.05mg/ml，染料木素為34.14mg/ml，β-葡萄糖苷酶為7.52u/ml，乳酸為92.45mm，乙酸為10.01mm，ph為4.12。