本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種海參復(fù)方軟膠囊的制備方法。

背景技術(shù)：

海參屬于棘皮動(dòng)物門海參綱，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴海洋珍品，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，且含有多種有益于人類身體健康的生物活性物質(zhì)，是一種高蛋白的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，素有“海中人參”之稱，并被列為“八珍”之一，具有延緩衰老、防治腫瘤等多種功效，還具有很好的食用與醫(yī)療方面的作用。明代的《食物本草》指出，海參有很多種養(yǎng)生功效；主要滋補(bǔ)元?dú)狻⒆桃嫖迮K六腑和祛虛損等。清代的《本草綱目拾遺》將海參列為補(bǔ)益藥物。近年來(lái)先后有中醫(yī)提出了以海參單用或者組方分別治療腫瘤、再生障礙貧血和糖尿病等，取得了良好的效果，同時(shí)在輔佐如高血壓、痔瘡、神經(jīng)衰弱，癲癇、慢性腎炎、脫肛、胃及十二指腸潰瘍、肺結(jié)核、便秘、靜脈血栓和慢性乙型肝炎等常見(jiàn)病治療中得到了廣泛的應(yīng)用。

但是常見(jiàn)的海參的加工方法破壞了海參的營(yíng)養(yǎng)成分以及生物活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供了一種海參復(fù)方軟膠囊的制備方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中加工海參，造成海參中生物活性降低以及營(yíng)養(yǎng)流失的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，

一種海參復(fù)方軟膠囊的制備方法，該方法包括：將新鮮海參去除內(nèi)臟后勻漿，利用復(fù)合蛋白酶，在微波輔助條件下進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物依次經(jīng)過(guò)滅活、濃縮、冷凍干燥、研磨、過(guò)篩制得微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉。

進(jìn)一步地，所選用的微波功率為100w-300w進(jìn)行輔助酶解，其中復(fù)合蛋白酶用量為3000u-4000u/g海參勻漿液，在底物濃度為15-20％，ph6.0-6.5,酶解溫度為55-65℃下酶解3-4h。

進(jìn)一步地，所述復(fù)合蛋白酶選擇枯草桿菌蛋白酶復(fù)合體。

進(jìn)一步地，酶解產(chǎn)物于95-100℃下滅活5-10min，40-50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，制成固體微波輔助酶解海參產(chǎn)物。

進(jìn)一步地，研磨、過(guò)篩過(guò)程包括：經(jīng)滅活之后的海參產(chǎn)物研磨成粉，采用150-200目分樣篩進(jìn)行篩分，制得微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉。

進(jìn)一步地，微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉與殼寡糖和?；撬岚凑召|(zhì)量比為7-9：1-3：1-2進(jìn)行混合。

進(jìn)一步地，混合后的混合物按照質(zhì)量比1:20-30的比例加入到蒸餾水中，攪拌混合均勻進(jìn)行噴霧干燥，制得均一化微波輔助酶解海參復(fù)方物。

進(jìn)一步地，獲得的微波輔助酶解海參復(fù)方物加入混合油中，并在真空狀態(tài)下加熱至55-65℃，攪拌20-30min,冷卻至25-30℃后精制灌裝而成。

進(jìn)一步地，所述混合油為蜂蠟和橄欖油，質(zhì)量比例為1：1-2。

進(jìn)一步地，所述的微波輔助酶解海參復(fù)方物與混合油質(zhì)量比為1：6-9。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：

微波輔助降解是利用微波輔助反應(yīng)進(jìn)行的一項(xiàng)新技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)污染、可控性好、高效節(jié)能等特點(diǎn)。微波是頻率大約在300mhz至300ghz，波長(zhǎng)在100m至1mm范圍以內(nèi)的電磁波。傳統(tǒng)的加熱方式是通過(guò)熱源的熱傳導(dǎo)、熱輻射、熱對(duì)流的方式由外至內(nèi)加熱，通常造成加熱慢、受熱不均勻等。而微波加熱方式則是通過(guò)分子吸收微波而振動(dòng)引起內(nèi)外同步加熱，且微波可以穿透容器以及物料，它不需要傳導(dǎo)過(guò)程，加熱效果更好；此外，微波加熱比較均勻，由于微波加熱是對(duì)物料的整體同時(shí)進(jìn)行加熱，所以它加熱均勻、無(wú)滯后；另外，微波加熱時(shí)可選擇性加熱，因?yàn)椴煌锪蠈?duì)微波吸收程度不一樣，物料分子極性越強(qiáng)，加熱速度越快；并且，微波加熱節(jié)能高效，在微波場(chǎng)中只有那些能吸收微波的物質(zhì)才會(huì)被加熱，而空氣與相應(yīng)的容器不會(huì)發(fā)熱，所以熱效率極高。

微波輔助酶解加速反應(yīng)進(jìn)程的原理主要有以下幾方面。(1)致熱效應(yīng)，它是指微波能增加分子的振動(dòng)頻率，從而使反應(yīng)體系中迅速產(chǎn)生大量熱量，活化反應(yīng)底物，加快反應(yīng)速度；(2)非熱效應(yīng)，是微波通過(guò)使極性分子極性增加，非極性分子產(chǎn)生極性，從而使分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；(3)微波電磁場(chǎng)還能通過(guò)改變反應(yīng)體系的電導(dǎo)率，使電子向特定方向移動(dòng)；(4)微波還可引起分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，造成化學(xué)鍵的斷裂，從而提高了反應(yīng)體系的反應(yīng)速率。所以，微波輔助酶解海參具有反應(yīng)速率快、效率高、無(wú)污染、可控性好、高效節(jié)能、酶解產(chǎn)物活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

軟膠囊是一種能將油或油狀物質(zhì)與粉狀功能性物質(zhì)混懸液定量壓注并包封與膠膜內(nèi)的密封膠囊，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)軟膠囊具有良好的隔離功能，可將光、氧敏感的功能性物質(zhì)與空氣和光線隔離，從而有效避免物質(zhì)的氧化，是其更加穩(wěn)定，保障生物活性物質(zhì)功效的發(fā)揮；(2)軟膠定量準(zhǔn)確，吸收快。軟膠囊在體內(nèi)崩解后，內(nèi)容物以液態(tài)形式很快被身體吸收；(3)軟膠囊表面光滑，口感好，易吞服，攜帶和食用方便等特點(diǎn)。

因此，本發(fā)明通過(guò)創(chuàng)新的酶解提取工藝制備海參酶解產(chǎn)物，獲得更多更高效的生物活性物質(zhì)，然后通過(guò)科學(xué)復(fù)配，進(jìn)一步強(qiáng)化其功能活性；再通過(guò)先進(jìn)的軟膠囊包裝方式，更有效的保存和釋放活性成分，實(shí)現(xiàn)了海參資源的高值化利用，促進(jìn)人類健康事業(yè)的發(fā)展。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3提供的微波輔助酶解海參的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖示；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3提供微波輔助酶解海參產(chǎn)物的清除超氧陰離子活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖示；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供微波輔助酶解海參產(chǎn)物的總還原力活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖示；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3提供的微波輔助酶解海參復(fù)方物的小鼠抗疲勞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖示。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

將新鮮海參去除內(nèi)臟后勻漿，取100g勻漿液，加入ph6.0，50mm乙酸緩沖液使其底物濃度達(dá)到15％，然后加入300000u復(fù)合蛋白酶，本實(shí)施例中，復(fù)合蛋白酶選擇枯草桿菌蛋白酶復(fù)合體，產(chǎn)品規(guī)格：br，200u/mg，活力：≥120units/mg。在微波輔助條件為100w，反應(yīng)溫度為55℃下酶解3h。海參酶解液經(jīng)95℃滅活5min，然后40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥后研磨成粉末，用150目分樣篩進(jìn)行篩分，制得微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉。然后，按照質(zhì)量比為微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉：殼寡糖：?；撬幔?：1：1進(jìn)行混合，然后將其加入到蒸餾水使其比例為1:20，然后攪拌混勻進(jìn)行噴霧干燥，制備均一化的微波輔助酶解海參復(fù)方物；最后將微波輔助酶解復(fù)方物按1:6的質(zhì)量比加入蜂膠和橄欖油混合物(1:1)中，并在真空狀態(tài)下加熱至55℃，攪拌20min,冷卻至25℃后灌裝軟膠囊。

實(shí)施例2：

將新鮮海參去除內(nèi)臟后勻漿，取100g勻漿液，加入ph6.550mm乙酸緩沖液使其底物濃度達(dá)到18％，然后加入350000u復(fù)合蛋白酶，在微波輔助條件為200w，反應(yīng)溫度為60℃下酶解3.5h。海參酶解液經(jīng)98℃滅活8min，然后45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥后研磨成粉末，用180目分樣篩進(jìn)行篩分，制得微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉。按照質(zhì)量比為微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉：殼寡糖：?；撬幔?：2：1進(jìn)行混合，然后將其加入到蒸餾水中使其比例為1:25，然后攪拌混勻進(jìn)行噴霧干燥，制得均一化的微波輔助酶解海參復(fù)方物；最后將微波輔助酶解海參復(fù)方物按1:7的比例加入蜂膠和橄欖油混合物(1:1.5)中，并在真空狀態(tài)下加熱至60℃，攪拌25min,冷卻至28℃后灌裝軟膠囊。

實(shí)施例3：

將新鮮海參去除內(nèi)臟后勻漿，取100g勻漿液，加入ph6.550mm乙酸緩沖液使其底物濃度達(dá)到20％，然后加入400000u復(fù)合蛋白酶，在微波輔助條件為300w，反應(yīng)溫度為65℃下酶解4h。海參酶解液經(jīng)100℃滅活10min，然后50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥后研磨成粉末，用200目分樣篩進(jìn)行篩分，制得微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉。按照質(zhì)量比為微波輔助酶解海參產(chǎn)物干粉：殼寡糖：?；撬幔?：3：2進(jìn)行混合，然后將其加入蒸餾水使其比例為1:30，然后攪拌混勻進(jìn)行噴霧干燥，制得均一化的微波輔助酶解海參復(fù)方物；最后將微波輔助酶解海參復(fù)方物按1:9的比例加入蜂膠和橄欖油混合物(1:2)中，并在真空狀態(tài)下加熱至65℃，攪拌30min,冷卻至30℃后灌裝軟膠囊。

1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化法，即響應(yīng)曲面法(responsesurfacemethodology,rsm)，是一種實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)的方法，通過(guò)在各因素水平的響應(yīng)值基礎(chǔ)上，可以找出預(yù)測(cè)的響應(yīng)最優(yōu)值以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。rsm與正交實(shí)驗(yàn)相比，其優(yōu)勢(shì)是：在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中，可以連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，而正交實(shí)驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)可以直觀顯現(xiàn)出酶解反應(yīng)的效率以及尋找出最佳實(shí)驗(yàn)條件。

以可溶性蛋白含量為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取微波功率、酶用量和酶解時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體條件如下：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(參加圖1)，在微波功率為輔助復(fù)合蛋白酶酶解海參效果顯著。其中，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化最佳酶解條件為微波輔助功率300w，60℃、ph6.5，底物濃度：15％、酶用量：4000u/g、酶解時(shí)間：4h。

對(duì)實(shí)施例的產(chǎn)品進(jìn)行體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，

3微波輔助酶解海參產(chǎn)物的清除超氧陰離子自由基活性，

清除超氧陰離子活性實(shí)驗(yàn)：超氧陰離子自由基(o^2-·)是生物體內(nèi)重要的自由基之一，也是所有活性氧自由基的前體，可以轉(zhuǎn)化為其它的活性氧自由基；人體新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，自由基在體內(nèi)長(zhǎng)期積累會(huì)造成眾多炎癥和衰老等現(xiàn)象。清除超氧陰離子活性實(shí)驗(yàn)是一種有效檢測(cè)體外抗氧化能力的方法，其清除能力的強(qiáng)弱代表生物活性物質(zhì)的體外抗氧化能力強(qiáng)弱。

采用pms-nadh-nbt體系來(lái)測(cè)定微波輔助酶解海參產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。向試管中依次加入0.5ml78μmnadh，0.5ml50μmnbt，0.5ml10μmpms及不同劑量的微波輔助酶解海參產(chǎn)物，最后用16mm，ph8.0tris-hcl緩沖液將體系總體積稀釋至為3.0ml，使其終濃度為：1、5、10、15、20、30、40、50mg/ml?；靹蚝?，采用分光光度法在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度?？瞻捉M用相同體積的16mm,ph8.0tris-hcl緩沖液替代供試樣品和nadh，對(duì)照組用相同體積16mm,ph8.0tris-hcl緩沖液替代供試樣品，每個(gè)濃度重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用清除率e來(lái)表示:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(參見(jiàn)圖2)，微波輔助酶解海參產(chǎn)物的清除超氧陰離子自由基的半清除率(ic50)僅為0.0675mg/ml，說(shuō)明該微波輔助酶解海參產(chǎn)物具有很強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基能力，展現(xiàn)出很強(qiáng)的體外抗氧化活性。

4微波輔助酶解海參產(chǎn)物的總還原能力

機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在這密切聯(lián)系，而總還原能力是評(píng)價(jià)生物活性物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，總還原能力的大小則直接反映出其抗氧化能力的強(qiáng)弱。

向試管中依次加入1.0ml不同濃度的微波輔助酶解海參產(chǎn)物使其終濃度分別為：1、5、10、15、20、30、40、50mg/ml，1ml1％的鐵氰化鉀，50℃水浴20min，然后加入2ml10％的三氯乙酸終止反應(yīng)，5min后，加入1.25ml0.1％的三氯化鐵，混合均勻，靜置30min，于700nm比色?？瞻捉M用0.2mol/lph6.6pbs來(lái)代替樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(參見(jiàn)圖3)，微波輔助酶解海參產(chǎn)物具有很好的還原能力，并且其總還原能力與底物濃度之間具有良好的線性關(guān)系，是一個(gè)非常好的抗氧化劑。

5微波輔助酶解海參復(fù)方物的小鼠體內(nèi)抗疲勞實(shí)驗(yàn)：

小鼠抗疲勞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：運(yùn)動(dòng)性疲勞是指運(yùn)動(dòng)本身引起的機(jī)體工作能力暫時(shí)降低，經(jīng)適當(dāng)時(shí)間休息和調(diào)整可以恢復(fù)的生理現(xiàn)象。疲勞既標(biāo)志著機(jī)體原有工作能力的暫時(shí)下降,又可能是機(jī)體發(fā)展到傷病狀態(tài)的一個(gè)先兆?？蛊诰褪茄泳徠诘漠a(chǎn)生，加速疲勞的消除；運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)如小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是衡量抗疲勞能力的最有利的宏觀表現(xiàn)，通過(guò)小鼠抗疲勞實(shí)驗(yàn)則可檢驗(yàn)生物活性物質(zhì)的體內(nèi)抗疲勞能力。

實(shí)驗(yàn)分為5組，每組10只雌雄各半昆明種spf小鼠：(1)空白對(duì)照組；(2)陽(yáng)性對(duì)照組(西洋參0.3mg/g.d)；(3)低劑量組(0.05mg/g.d)；(4)中劑量組(0.15mg/g.d)；(5)高劑量組(0.5mg/g.d)?？瞻讓?duì)照組灌胃蒸餾水，給藥頻率為1次/日，給藥時(shí)間為4周。通過(guò)觀察5組小鼠在末次灌胃30min后，小鼠尾根部負(fù)荷5％體重鉛皮，置于游泳箱中(水溫25±1℃，水深不少于30cm)游泳，至小鼠沉入水底后10s不再浮起作為力竭死亡標(biāo)準(zhǔn)，記錄自游泳開(kāi)始至死亡時(shí)間，作為小鼠力竭游泳時(shí)間。力竭游泳實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)新型活性物質(zhì)抗疲勞特性，小鼠力竭游泳時(shí)間越長(zhǎng)，說(shuō)明其緩解疲勞作用越明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(參見(jiàn)圖4)，微波輔助酶解海參復(fù)方物具有非常強(qiáng)的體內(nèi)抗疲勞能力，其抗疲勞能力比陽(yáng)性對(duì)照西洋參更強(qiáng)，是非常有效的抗疲勞活性物質(zhì)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。