本發(fā)明屬于制備納米脂質(zhì)體的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羧甲基殼聚糖包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體及其制備方法。

背景技術(shù)：

ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3pufa)是對身體健康至關(guān)重要的一類脂肪酸，具有抗炎癥作用、降低膽固醇水平、預(yù)防動脈粥樣硬化等功能，但其在人體內(nèi)不能正常合成，因而被認(rèn)為是體內(nèi)的必需脂肪酸，只能從食物中攝取。ω-3pufa主要分布在魚類及海洋生物中。魚油作為保健食品在90年代風(fēng)靡起來，在如今全球漁業(yè)資源衰退的背景下，魚類的捕撈有所限制，因此，為了滿足不久的將來人們對ω-3pufa的需求，新的ω-3pufa來源亟需開發(fā)。2012年11月北歐海洋油脂會議指出南極磷蝦是新型的ω-3pufa來源。南極磷蝦廣泛分布于南極海域，是地球最大的單種生物資源之一。研究表明南極磷蝦油中富含ω-3pufa，且epa和dha含量在總脂肪酸中的比例高達(dá)29.67％。值得注意的是，南極磷蝦油的pufa是以磷脂型態(tài)結(jié)合ω-3(epa、dha)，且磷脂型pufa的生物利用率(南極磷蝦磷脂)比甘油三酯型pufa(魚油)高，因此，南極磷蝦油因其富含磷脂備受關(guān)注。

脂質(zhì)體最早作為藥物的載體，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥界。近幾年來，脂質(zhì)體因其良好的生物相容性，緩釋性及靶向性，日益成為食品營養(yǎng)成分的新型理想載體。在制備食品級脂質(zhì)體時，通常會在磷脂中添加其他的輔助劑如表面活性劑、吐溫80和膽固醇進(jìn)行復(fù)配，這樣的體系其實(shí)是個復(fù)雜的混合體系。

此外，考慮到脂質(zhì)體中的磷脂易氧化，且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等原因，容易在貯藏過程中發(fā)生一系列的物理化學(xué)變化、導(dǎo)致粒徑增大、脂質(zhì)體聚集等現(xiàn)象發(fā)生。因此，本領(lǐng)域有必要開發(fā)一種簡單且貯藏性能好的新型納米脂質(zhì)體體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種以南極磷蝦油和pbs或醋酸緩沖液制備出納米脂質(zhì)體，再采用滴定法制得羧甲基殼聚糖(cmcs)包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體，形態(tài)規(guī)則、粒徑較小且均一且包封率高，顯著提高其氧化穩(wěn)定性和貯藏性能。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種羧甲基殼聚糖包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體，它是在以南極磷蝦油為原料制成的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體表面包覆羧甲基殼聚糖。

本發(fā)明所述的羧甲基殼聚糖包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體是通過以下方法制得的：以南極磷蝦油為原料，將其加入pbs或醋酸緩沖液中，采用高壓均質(zhì)法制得南極磷蝦油納米脂質(zhì)體，再采用滴定法將南極磷蝦油納米脂質(zhì)體滴入羧甲基殼聚糖溶液中制得羧甲基殼聚糖包覆南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

所述的南極磷蝦油和pbs或醋酸緩沖液的質(zhì)量體積比為0.5-2g:100ml，優(yōu)選為1g:100ml，發(fā)明人在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)南極磷蝦油用量較少時制備效果比較好，用量多了不能形成均一粒度的脂質(zhì)體，南極磷蝦油會析出來，呈膏狀。

所述的pbs緩沖液由以下方法制得：稱取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4、0.24gkh2po4，加去離子水800ml充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)ph至7.4，最后定容到1l，即得到pbs緩沖液。

所述的醋酸緩沖液為濃度為10mm的醋酸緩沖液，由以下方法制得：吸取570μl醋酸，加入900ml去離子水，用氨水調(diào)整ph值到7.4，然后定容至1l，即得到10mm醋酸緩沖液。其中，所述的氨水濃度為13.3mol/l。

使用pbs和醋酸緩沖液均能達(dá)到本發(fā)明要求的技術(shù)效果，調(diào)整兩種緩沖液的ph值為7.4，能夠提高制備和貯藏過程中脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，確保脂質(zhì)體的膜不被破壞，不會析出南極磷蝦油。

所述的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體和羧甲基殼聚糖溶液的體積比為1:1。所述的羧甲基殼聚糖溶液的濃度為0.1～1％(w/v)，優(yōu)選為0.1％或0.4％。所述的羧甲基殼聚糖溶液通過將羧甲基殼聚糖溶于pbs或10mm醋酸緩沖液中制得。羧甲基殼聚糖(cmcs)是殼聚糖改性后的衍生物，它的水溶性比殼聚糖好。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種羧甲基殼聚糖包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體的制備方法，包括：以南極磷蝦油為原料，將南極磷蝦油加入pbs或醋酸緩沖液中，采用高壓均質(zhì)法制得南極磷蝦油納米脂質(zhì)體，再采用滴定法將南極磷蝦油納米脂質(zhì)體滴入羧甲基殼聚糖溶液中制得羧甲基殼聚糖包覆南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

具體步驟如下：

(1)、分別配制pbs或醋酸緩沖液、羧甲基殼聚糖溶液；

(2)、取南極磷蝦油和pbs或醋酸緩沖液，使用乳化分散機(jī)，在轉(zhuǎn)速15000-23000rpm下剪切2-5分鐘；然后使用高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2-5次，得到均勻的粉白色懸濁液，得到南極磷蝦油納米脂質(zhì)體；

(3)、取等體積步驟(2)制得的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體和羧甲基殼聚糖溶液，按照滴速1-3d/s(滴/秒)將南極磷蝦油納米脂質(zhì)體滴入羧甲基殼聚糖溶液中，邊滴加邊攪拌；滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌1-3h，制得羧甲基殼聚糖包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

步驟(2)中，南極磷蝦油和pbs或醋酸緩沖液的質(zhì)量體積比0.5-2g:100ml，優(yōu)選為1g:100ml。高壓均質(zhì)機(jī)的壓力為9000psi。作為優(yōu)選的技術(shù)方案為：取南極磷蝦油和pbs或醋酸緩沖液，使用乳化分散機(jī)，在轉(zhuǎn)速為21000rpm下剪切4分鐘；然后使用高壓均質(zhì)機(jī)，在壓力為9000psi下均質(zhì)3次，均質(zhì)到南極磷蝦油與緩沖液充分融合，呈牛奶狀，沒有多余的南極磷蝦油存在。

步驟(3)中，作為優(yōu)選的技術(shù)方案為：取等體積步驟(2)制得的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體和羧甲基殼聚糖溶液，在溫度20-25℃下，按照滴速為1d/s將南極磷蝦油納米脂質(zhì)體滴入羧甲基殼聚糖溶液中，邊滴加邊攪拌羧甲基殼聚糖溶液，確保攪拌均勻；滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌2h，制得羧甲基殼聚糖包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

攪拌的轉(zhuǎn)速為200-400r/min，優(yōu)選為300r/min。可以根據(jù)樣品量的大小，調(diào)整轉(zhuǎn)速，確保攪拌均勻，確保羧甲基殼聚糖與脂質(zhì)體充分接觸，完成包覆。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明以新型來源—南極磷蝦油作為研究材料，南極磷蝦油因自身含有豐富的磷脂、少量的甘油二酯、膽固醇和游離脂肪酸，這些表面活性脂質(zhì)的天然組合(如磷脂、膽固醇等)可以自乳化形成水包油型乳狀液，在不需要添加其他輔助物的情況下，只用到南極磷蝦油和pbs或醋酸緩沖液就能制備出納米脂質(zhì)體。cmcs具有水溶性好，形成溶液透明度高、安全無毒的特點(diǎn)，采用滴定法制備cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體，形態(tài)規(guī)則、粒徑較小且均一且包封率較高，包封率可高達(dá)88.23％。

2、考察脂質(zhì)體在冷藏溫度4℃下貯藏36天，pov值、tbars值、ph和濁度的變化，與傳統(tǒng)南極磷蝦油納米脂質(zhì)體比較，cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體能顯著降低pov值、tbars值，顯著抑制ph值降低和濁度升高，可以顯著提高其氧化穩(wěn)定性和貯藏性能，保護(hù)南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

附圖說明

圖1為對比例1脂質(zhì)體粒徑分布圖；

圖2為實(shí)施例1脂質(zhì)體粒徑分布圖；

圖3為實(shí)施例4脂質(zhì)體粒徑分布圖；

圖4為脂質(zhì)體的透射電鏡圖，(a)為對比例1，(b)為實(shí)施例1，(c)為實(shí)施例4；

圖5為不同濃度cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體在貯藏過程中的pov值的變化分析圖；

圖6為不同濃度cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體在貯藏過程中的tbars值的變化分析圖；

圖7為不同濃度cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體在貯藏過程中的ph的變化分析圖；

圖8為不同濃度cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體在貯藏過程中的濁度的變化分析圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方法作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

(1)吸取570μl醋酸，加入900ml去離子水，用氨水調(diào)整ph值到7.4，然后轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至1l，即得到10mm醋酸緩沖液；以10mm醋酸緩沖液作為溶劑，配制濃度為0.1％羧甲基殼聚糖(cmcs)溶液；

(2)取5g南極磷蝦油，加入500ml醋酸緩沖液，先用乳化分散機(jī)剪切4分鐘，轉(zhuǎn)速為21000rpm，然后用高壓均質(zhì)機(jī)(壓力：9000psi)均質(zhì)3次，得到均勻的粉白色懸濁液，即為南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

(3)取等體積步驟(2)制得的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體和cmcs溶液，cmcs溶液置于磁力攪拌器上，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為300r/min，將南極磷蝦油納米脂質(zhì)體倒入分液漏斗中，滴入cmcs溶液中，控制速度為1d/s，邊滴加邊攪拌，待全部滴加進(jìn)cmcs溶液后，繼續(xù)在磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌2h，即得cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

實(shí)施例2

調(diào)整cmcs溶液濃度為0.2％，其他操作均與實(shí)施例1相同，制得cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

實(shí)施例3

調(diào)整cmcs溶液濃度為0.3％，其他操作均與實(shí)施例1相同，制得cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

實(shí)施例4

調(diào)整cmcs溶液濃度為0.4％，其他操作均與實(shí)施例1相同，制得cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

實(shí)施例5

調(diào)整cmcs溶液濃度為0.5％，其他操作均與實(shí)施例1相同，制得cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

對比例1

(1)吸取570μl醋酸，加入900ml去離子水，用氨水調(diào)整ph值到7.4，然后轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至1l，即得到10mm醋酸緩沖液；

(2)取5g南極磷蝦油，加入500ml醋酸緩沖液，先用乳化分散機(jī)剪切4分鐘，轉(zhuǎn)速為21000rpm，然后用高壓均質(zhì)機(jī)(壓力：9000psi)均質(zhì)3次，得到均勻的粉白色懸濁液，即得到南極磷蝦油納米脂質(zhì)體。

考察不同濃度的cmcs對包覆脂質(zhì)體性質(zhì)的影響

粒徑、電位和多分散系數(shù)(pdi)的測定：將脂質(zhì)體用去離子水稀釋500倍，采用zeta電位儀測定脂質(zhì)體粒徑、電位大小和粒度分布。測定波長633nm，散射角90℃，溫度25℃和折光系數(shù)1.33。

脂質(zhì)體包封率的測定：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：先取100mg的南極磷蝦油溶于25ml的容量瓶中作為母液，然后依次從中吸取2ml、4ml、6ml、8ml于10ml的容量瓶中，加入三氯甲烷:無水乙醇(1:1，v/v)定容至10ml。

測定：取5ml脂質(zhì)體樣品加入10ml正己烷于3800rpm下離心10min，用吸管去除上層有機(jī)相，然后加入10ml無水乙醇作為破乳劑，超聲振蕩10分鐘。加入10ml三氯甲烷，在3800rpm下離心10min，取下層紅色有機(jī)層于新的離心管中，于240nm處測定吸光度。

表1不同濃度的cmcs對包覆脂質(zhì)體性質(zhì)的影響

分析不同濃度的cmcs對包覆脂質(zhì)體性質(zhì)的影響。脂質(zhì)體通常分為小單室脂質(zhì)體(粒徑小于200nm)、大單室脂質(zhì)體(粒徑200nm～1000nm)和多室脂質(zhì)體(1μm～5μm)。醫(yī)藥界制備的給藥脂質(zhì)體粒徑大小在200nm以下。發(fā)明人研究目標(biāo)是也是制備200nm以下的脂質(zhì)體，有利于今后功能性食品的開發(fā)和應(yīng)用，有利于人體吸收。如表1、圖1-3所示，當(dāng)cmcs濃度為0.1％、0.2％和0.4％時，脂質(zhì)體的平均粒徑小于200nm，且cmcs濃度為0.1％和0.4％時制得的脂質(zhì)體的平均粒徑與不包覆cmcs的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體沒有顯著差別，而當(dāng)cmcs濃度為0.3％和0.5％時，脂質(zhì)體的平均粒徑超過200nm。此外，pdi是膠體系統(tǒng)中粒度分布的評價指標(biāo)，pdi越小，說明粒子的粒度分布越窄且分布均勻。從表1中可知，所有樣品的pdi為0.14～0.19，表明本發(fā)明制備的脂質(zhì)體具有較窄的粒度分布。采用cmcs包覆南極磷蝦油納米脂質(zhì)體，隨著cmcs濃度的增加，脂質(zhì)體的包封率沒有顯著性差異，可能是因?yàn)閏mcs具有較強(qiáng)的雙親性，基本不會破壞脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)。綜上所述，采用cmcs包覆南極磷蝦油納米脂質(zhì)體后，脂質(zhì)體符合要求，尤其當(dāng)cmcs濃度為0.1％和0.4％時，包封率達(dá)到最大，分別為87.33％和88.23％，且平均粒徑較小。

脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)觀察：

運(yùn)用負(fù)染色法來觀察脂質(zhì)體的表面形態(tài)。用蒸餾水將樣品稀釋約10倍，然后與2％磷鎢酸以體積比1:1混合放置5min，將銅網(wǎng)浸入上述液體，并用濾紙吸干多余液體，待自然晾干后，放大60000倍，工作電壓為75kv的透射電鏡下觀察參照實(shí)施例1、2和對比例1制備的脂質(zhì)體的形態(tài)。由圖4可以看到，南極磷蝦油納米脂質(zhì)體(圖4a)呈球形，粒徑大小約為60nm；經(jīng)cmcs包覆后同樣為球形，粒徑增大到大約100nm左右。這與采用zeta電位儀測定的結(jié)果有一定差異(如表1)。原因可能是納米粒度儀所測的脂質(zhì)體呈液體狀態(tài)，測到的是水力學(xué)直徑，粒子包覆著一定的水，從而使得粒徑較大，而透射電鏡是在脫水的狀態(tài)下測定的，所以粒徑結(jié)果較小。

考察pov值、tbars值、ph值和濁度

以對比例1制備的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體(0.0％cmcs)作為對照樣品，考察cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體在冷藏溫度為4℃下貯藏36天過程中的pov值、tbars值、ph和濁度的變化趨勢。

采用比色法測定pov值：

(1)fe³⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取鐵粉0.5g溶解于50ml10mol/l鹽酸溶液中，加入2ml30％過氧化氫溶液，加熱煮沸5min，冷卻后用水定容至500ml，吸取溶液1ml于100ml容量瓶中，用氯仿-甲醇(2:1，v/v)定容至刻度。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取fe³⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分別用氯仿-甲醇(2:1，v/v)定容至10ml，取200μlfe³⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液，加2.5ml氯仿-甲醇(2:1，v/v)，然后再加50μl30％硫氰酸鉀溶液，搖勻后放置10min，于500nm處，用1cm比色皿測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)測定：吸取1ml乳狀液，加入2ml氯仿-甲醇(2:1，v/v)，渦旋3s后分層，取上清液200μl，加2.5ml氯仿-甲醇(2:1，v/v)，然后再加50μl的30％硫氰酸鉀溶液和50μl的氯化亞鐵溶液。搖勻后放置10min，以氯仿-甲醇(2:1，v/v)混合溶劑為參比，于500nm處，用1cm比色皿測定吸光度。

tbars值測定方法：

(1)丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取31.5mg1,1,3,3-四乙氧基丙烷，溶解后稀釋至100ml，此溶液每ml相當(dāng)于丙二醛10μg。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確吸取相當(dāng)于丙二醛10μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml置于錐形瓶中，加水至總體積為5ml，加入5ml0.02mol/ltba溶液(tba溶液的配制：準(zhǔn)確稱取tba0.288g溶于水中，并稀釋至100ml，可適當(dāng)加熱促進(jìn)溶解)，混勻，用保鮮膜封口。置于90℃水浴鍋內(nèi)30min，取出冷卻至室溫，移入離心管中，離心5min。取上清液，加入5ml三氯甲烷，搖勻。靜置，分層，取上清液在532nm波長下比色。

(3)測定：取4ml樣品于有蓋的錐形瓶中，加入10ml三氯乙酸混合液，振搖30min。然后離心10min。取濾液5ml，加入5mltba溶液，混勻，用保鮮膜封口。置于90℃水浴鍋內(nèi)30min，取出冷卻至室溫，移入離心管中，離心5min。取上清液，加入5ml三氯甲烷，搖勻。靜置，分層，取上清液，以三氯甲烷為參比，于532nm波長下比色，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到丙二醛的含量(μg丙二醛/ml樣品)。同時用蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn)。

ph測定方法：在25℃下，用delta320ph計(jì)測定脂質(zhì)體ph值。

濁度測定方法：取1ml脂質(zhì)體，用醋酸緩沖液稀釋定容到10ml，室溫放置30min后，用1cm石英比色皿在288nm下用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定。

如圖5所示，不包覆cmcs的南極磷蝦油脂質(zhì)體(0.0％cmcs)的pov值明顯大于0.1％和0.4％cmcs包覆的南極磷蝦油脂質(zhì)體。pov值的升高表明氧化作用大于氧化產(chǎn)物的分解作用。隨著貯藏時間的延長，由于氧化產(chǎn)物過多，分解作用強(qiáng)，超過其氧化作用，所以三個樣品的過氧化值呈現(xiàn)下降的趨勢。值得注意的是，由于缺少cmcs的保護(hù)，不包覆cmcs的南極磷蝦油脂質(zhì)體，到29天后，氧化產(chǎn)物由于繼續(xù)氧化而升高，從而導(dǎo)致曲線上升。而0.1％和0.4％cmcs包覆南極磷蝦油脂質(zhì)體的pov值基本保持穩(wěn)定，這說明cmcs能提高南極磷蝦油脂質(zhì)體的氧化穩(wěn)定性，起到一定的保護(hù)作用。

tbars是指每ml脂質(zhì)體溶液中丙二醛的含量，丙二醛是磷脂氧化的一個中間產(chǎn)物，故測定丙二醛的含量可以間接反映脂質(zhì)體的氧化程度。從圖6中可知，三個樣品的變化趨勢總體上來說是呈上升的趨勢，但是在29天過后有一個明顯幅度的下降。此外，值得注意的是，三個樣品中的丙二醛含量從高到低依次是0.0％，0.1％和0.4％cmcs包覆的南極磷蝦油脂質(zhì)體。這說明cmcs的加入對于南極磷蝦油脂質(zhì)體的氧化穩(wěn)定性有明顯的保護(hù)作用，可以有效防止南極磷蝦油脂質(zhì)體的過度氧化作用。

脂肪在貯藏過程中易發(fā)生酸敗，ph值可反映南極磷蝦油脂質(zhì)體的酸敗程度。ph值越低，由圖7可知，不包覆cmcs的南極磷蝦油脂質(zhì)體的ph值明顯小于其他兩種樣品，且cmcs包覆的南極磷蝦油脂質(zhì)體樣品的ph變化不明顯，這也說明了cmcs能夠保護(hù)脂質(zhì)體。

濁度反映的是脂質(zhì)體貯藏一段時間過后的透明度變化，用吸光度表示，吸光度越高，表明濁度越大。脂質(zhì)體在貯藏過程中發(fā)生破裂聚集會使得溶液的均一性下降，從而導(dǎo)致吸光度變大。從圖8中可以看出，不包覆cmcs的南極磷蝦油脂質(zhì)體的濁度明顯高于其他兩種樣品，這說明未經(jīng)cmcs包覆的南極磷蝦油脂質(zhì)體在貯藏過程中不穩(wěn)定，而cmcs包覆作用能明顯提高南極磷蝦油脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性，防止脂質(zhì)體泄露，聚集引起的濁度升高。

此外，我們也考察了0.2％、0.3％和0.5％cmcs包覆的南極磷蝦油脂質(zhì)體的pov值、tbars值、ph值和濁度這四個指標(biāo)在貯藏過程中的變化。這3個樣品同樣呈現(xiàn)相同的變化趨勢。因此，cmcs包覆的南極磷蝦油納米脂質(zhì)體能顯著地降低pov值、tbars值，較好地抑制ph值降低和濁度升高，而且cmcs濃度越高，保護(hù)作用越明顯，越能提高貯藏穩(wěn)定性。

綜上所述僅為本發(fā)明的較佳施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所做的等效變化與修飾都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)。