技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明公開了一種用于茶酶解提香的復(fù)合酶及其應(yīng)用，屬于茶葉加工領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用木瓜蛋白酶與β-葡聚糖酶或風味糖苷酶的不同組合比例構(gòu)成復(fù)合酶制劑。復(fù)合酶制劑的應(yīng)用以茶為原料，制備茶濃縮液，在茶濃縮液中加入復(fù)合酶制劑，進行酶解提香。通過本發(fā)明的方法加入復(fù)合酶制劑的酶解提香茶粉與空白對照茶粉相比較，酶解提香茶粉香氣總量大幅提高，花香明顯。

背景技術(shù)：

茶濃縮液一般是以成品茶為原料，經(jīng)高溫浸提、過濾或離心、濃縮等工序制得，可以再經(jīng)殺菌和灌裝等工序制成原茶濃縮液，作為原漿或主劑直接用于茶飲料生產(chǎn)；也再可以經(jīng)噴霧干燥等工序制成速溶茶粉。茶濃縮液作為一種新型工業(yè)用茶原料，有著使用方便快捷的特點。但是上述加工方式，由于存在高溫處理，且缺少有效的保護措施，導致生產(chǎn)出來的茶濃縮液香氣物質(zhì)損失較多，而使用其制作的茶飲料和速溶茶粉普遍存在香氣不足的特點。

大量研究證實，茶葉中許多茶香氣物質(zhì)主要與糖結(jié)合以非揮發(fā)性的香氣前提——糖苷形式存在，目前已有多種糖苷類香氣前體物質(zhì)被分離鑒定，它們主要以吡喃葡萄糖苷、櫻草糖苷、野黑櫻苷、芹菜糖基葡萄糖苷、巢菜糖苷的形式存在，因此糖苷酶在茶葉香氣形成和增香方面的應(yīng)用研究越來越多。

目前文獻中已有報道可利用β-葡萄糖苷酶等復(fù)合酶，在經(jīng)過提取過程中的綠茶酶解之后，再通過反滲透濃縮來制備綠茶濃縮液的工藝方案。此方案雖然通過酶解提取的步驟，在一定程度上解決了濃縮液中香氣淡的問題，但是由于后續(xù)的反滲透濃縮工藝復(fù)雜昂貴，參數(shù)條件要求嚴格，很難實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。同時，由于復(fù)合酶制劑是在提取的過程中添加，所作用的酶解底物濃度小，水分含量較大，使得反應(yīng)往往達不到有效和充分的程度。而且提取時的溫度變化也對其效果影響很大，隨著溫度的不斷升高，復(fù)合酶活性逐步減弱至失活，造成一定程度的浪費。其所選擇添加的復(fù)合酶制劑造價也偏高，經(jīng)濟性較差，對于反應(yīng)中的ph值有特殊要求。

針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明嘗試摸索出了一種可以直接應(yīng)用于茶濃縮液中的更為高效和簡單的新型復(fù)合酶制劑。并且解決了通常情況下直接在濃縮液中加入糖苷酶，可能會與茶濃縮液中的多酚、單寧相結(jié)合，形成不溶性的膠體或沉淀，增加混濁度的問題。實現(xiàn)了可以將復(fù)合酶直接添加到茶濃縮液中進行酶解提香，針對茶葉香氣前體物進行酶解，進而使反應(yīng)過程更加快速和充分的目的。本發(fā)明取消了提取工藝對于酶解過程和條件的限制，不受應(yīng)用于酶解提香的底物是茶葉原料還是茶葉有效成分的提取物或濃縮物的局限，采用自然ph值，也可以有效的解決在速溶茶制備過程中，高溫提取及減壓濃縮等常規(guī)工藝所造成的茶濃縮液香氣淡問題，工藝更簡單，可實施性更強。經(jīng)過優(yōu)化后的復(fù)合酶制劑造價還更加便宜，很適合于工業(yè)上的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種用于茶酶解提香的復(fù)合酶，其由木瓜蛋白酶和其他酶組合而成的復(fù)合酶，其中所述其他酶選自：β-葡聚糖酶、風味糖苷酶；所述木瓜蛋白酶和其他酶的重量比例為：木瓜蛋白酶：其他酶＝0.4-2.4:0.1-6.0。本發(fā)明所述的復(fù)合酶，優(yōu)選的所述復(fù)合酶由木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶、風味糖苷酶組合而成，它們之間的重量比例為木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.4-2.4:0.1-6.0:0.1-1.0。

本發(fā)明所述的復(fù)合酶，更優(yōu)選的所述的復(fù)合酶，所述酶中各種酶的重量比例為：木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.4-1.0:1.0-2.5:0.1-0.3。

本發(fā)明所述的復(fù)合酶，最優(yōu)選的所述的復(fù)合酶，所述酶中各種酶的重量比例為：木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.5-0.8:1.5-2.0:0.15-0.2。

本發(fā)明所述的復(fù)合酶，制備方法包括將木瓜蛋白酶和其他酶混合的步驟。本發(fā)明還包括所述的復(fù)合酶的使用方法，所述方法包括將復(fù)合酶加入到茶濃縮液中的步驟；所述茶選自：曬青毛茶、普洱生茶、滇紅茶或以任意比例的混合，或在普洱熟茶中混合了一定比例的曬青毛茶、普洱生茶或滇紅茶的復(fù)配茶。

優(yōu)選的，所述復(fù)配茶中加入曬青毛茶、普洱生茶或滇紅茶的比例為30％以上。本發(fā)明所述的復(fù)合酶的使用方法，所述方法包括：在茶濃縮液中加入復(fù)合酶后進行酶解，再經(jīng)高溫滅酶活，得到經(jīng)過酶解的茶濃縮液。

本發(fā)明還提供一種經(jīng)過酶解的茶濃縮液，制備方法如下，茶濃縮液中加入復(fù)合酶進行酶解，再經(jīng)高溫滅酶，得到經(jīng)過酶解的茶濃縮液。

本發(fā)明所述的經(jīng)過酶解的茶濃縮液，所述茶濃縮液經(jīng)過浸提、過濾或離心、濃縮等步驟加工制成。

本發(fā)明所述的經(jīng)過酶解的茶濃縮液，所述茶濃縮液中可溶性固形物的含量為10-45％(w/w)，更優(yōu)選為20-35％(w/w)，最優(yōu)選為25-30％(w/w)。

本發(fā)明所述的經(jīng)過酶解的茶濃縮液，優(yōu)選的所述制備方法步驟如下：在20-65℃的自然ph下，向茶濃縮液中添加復(fù)合酶，在30-100r/min下均速攪拌并酶解0.5-2.5h；所述高溫滅酶活是將茶濃縮液升溫至70-100℃，滅活5-40min，其中，向茶濃縮液中添加復(fù)合酶的量為其重量的0.2-5％。

本發(fā)明所述的經(jīng)過酶解的茶濃縮液，更優(yōu)選的所述制備方法步驟如下：在40-60℃的自然ph下，向茶濃縮液中添加復(fù)合酶，在40-80r/min下均速攪拌并酶解1.0-2.0h；所述高溫滅酶活是將茶濃縮液升溫至80-90℃，滅活15-35min，其中，向茶濃縮液中添加復(fù)合酶的量為其重量的1.5-3.5％。本發(fā)明所述的經(jīng)過酶解的茶濃縮液，最優(yōu)選的所述制備方法步驟如下：在50-60℃的自然ph下，向茶濃縮液中添加復(fù)合酶，在50-60r/min下均速攪拌并酶解1.5-2.0h；所述高溫滅酶活是將茶濃縮液升溫至80-85℃，滅活20-30min，其中，向茶濃縮液中添加復(fù)合酶的量為其重量的2.0-3.0％。本發(fā)明所述的復(fù)合酶，其中，β-葡聚糖酶和風味糖苷酶作用機理都是水解糖苷鍵，釋放呈香物質(zhì)。β-葡聚糖酶底物專一較差，對β-葡聚糖形成的香氣前體物，都能起效，在實際應(yīng)用中β-葡聚糖酶效果更好。β-葡聚糖酶和風味糖苷酶可以選擇添加，也可以都添加。木瓜蛋白酶作用是防止混濁產(chǎn)生，當上述兩種酶濃度較高時，易與茶濃縮液中的多酚、單寧結(jié)合，形成不溶性膠體或沉淀，增加混濁度。木瓜蛋白酶用于防止混濁產(chǎn)生，都需要添加。

本發(fā)明所述的復(fù)合酶中各種酶添加量分別占茶濃縮液的重量百分比為：木瓜蛋白酶0.20-1.20％、β-葡聚糖酶0.50-3.00％、風味糖苷酶0.05-0.50％。更優(yōu)選的，本發(fā)明所述的復(fù)合酶中各種酶添加量分別占茶濃縮液的重量百分比為：木瓜蛋白酶0.40-1.00％、β-葡聚糖酶1.00-2.50％、風味糖苷酶0.10-0.30％。

最優(yōu)選的，本發(fā)明所述的復(fù)合酶中各種酶添加量分別占茶濃縮液的重量百分比為：木瓜蛋白酶0.50-0.80％、β-葡聚糖酶1.50-2.00％、風味糖苷酶0.15-0.20％。

本發(fā)明所述茶為曬青毛茶、普洱生茶、滇紅茶或以任意比例的混合，或在普洱熟茶中混合了一定比例的曬青毛茶、普洱生茶或滇紅茶的復(fù)配茶。

優(yōu)選的，所述復(fù)配茶中，曬青毛茶、普洱生茶或滇紅茶的比例為30％以上。所述茶濃縮液，是以上述茶為原料經(jīng)浸提、過濾或離心、濃縮加工而成的茶濃縮液。

所述茶濃縮液中可溶性固形物的含量為10-45％(w/w)，更優(yōu)選為20-35％(w/w)，最優(yōu)選為25-30％(w/w)。

所述茶濃縮液的制備包括以下步驟；將茶浸提，過濾或離心，濃縮。

具體的，應(yīng)用本發(fā)明所述的復(fù)合酶來制備經(jīng)過酶解的茶濃縮產(chǎn)品，可以但是并不限于，包括以下的工藝步驟：

1)以茶為原料，制備茶濃縮液；

2)在茶濃縮液加入復(fù)合酶制劑，進行酶解提香；

3)酶解后茶濃縮液進行高溫滅酶活；

4)滅活后的茶濃縮液殺菌灌裝即為提香茶濃縮液(也稱為：經(jīng)過酶解的茶濃縮液)，或噴霧干燥制成提香速溶茶粉。

優(yōu)選地，將茶用6-10倍量的水低溫或高溫浸提1-3次，提取時間1-3小時，用碟式離心機轉(zhuǎn)速為5000-8000r/min，按照1500-3000l/h的流量離心，離心液60-80℃減壓濃縮至比重1.0-1.2。

進一步優(yōu)選，將茶用8-10倍量的水低溫或高溫浸提2-3次，提取時間1-2小時，用碟式離心機轉(zhuǎn)速為6000-7000r/min，按照2000-2500l/h的流量離心，離心液65-75℃減壓濃縮至比重1.03-1.10。

所述低溫浸提為50-79℃，高溫浸提為80-100℃。

所述酶解提香是將得到的茶濃縮液冷卻至20-65℃，自然ph下，在濃縮液中加入復(fù)合酶制劑，30-100r/min均速攪拌，酶解0.5-2.5h。

術(shù)語“自然ph”是指，在反應(yīng)體系中不需要額外添加酸或堿進行調(diào)節(jié)ph。所述酶解提香優(yōu)選為,是將得到的茶濃縮液冷卻至40-60℃，自然ph下，在濃縮液中加入復(fù)合酶制劑，40-80r/min均速攪拌,酶解1.0-2.0h。

所述酶解提香最優(yōu)選為,是將得到的茶濃縮液冷卻至50-60℃，自然ph下，在濃縮液中加入復(fù)合酶制劑，50-60r/min均速攪拌,酶解1.5-2.0h。

所述高溫滅酶活是將茶濃縮液升溫至70-100℃，滅活時間為5-40min。優(yōu)選為，升溫至80-90℃,滅活時間為15-35min；最優(yōu)選為,升溫至80-85℃,滅活時間為20-30min。

所述殺菌灌裝是將得到的茶濃縮液在130-135℃的溫度下殺菌10-15s后，用無菌灌裝袋進行灌裝。

所述噴霧干燥是將茶濃縮液在進料口溫度為175-210℃，出料口溫度為60-90℃下進行噴霧干燥制成速溶茶粉。

所述的提香茶濃縮液可用于速溶茶粉、茶飲料和茶食品的制作。

所述的提香速溶茶粉可用于茶飲料和茶食品的制作。

以下通過實驗數(shù)據(jù)進一步說明本發(fā)明的有益效果。

一、本發(fā)明對不同酶制劑進行考察篩選，并通過分析和實驗解決茶濃縮液酶解混濁問題，具體方法和結(jié)果如下：

1)酶制劑篩選

參考相關(guān)文獻及專利，分別考察了β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、風味糖苷酶、單寧酶以及不同組合，對茶濃縮液(普洱生茶與普洱熟茶比例1:1提取、離心及濃縮獲得，比重1.10/65℃，可溶性固形物含量為26.5％)酶解后感官品質(zhì)的影響。實驗方法為，取茶濃縮液，分別按重量比加入不同酶制劑，50℃酶解反應(yīng)2h后，85℃滅活20min；然后取2ml處理樣品，倒入200ml沸水沖溶，觀察狀態(tài)并做感官審評。酶添加量為茶濃縮液重量的0.5％，酶組合添加時比例分別為1:1和1:1:1，實驗結(jié)果如下表：

表1不同酶及其組合酶解后審評結(jié)果

注：感官審評方法為，取2ml處理后的濃縮液，倒入200ml沸水，沖溶后審評。

從上表酶解結(jié)果可知，湯色方面，所有實驗組產(chǎn)品審評后差別不大；滋味方面除了“風味糖苷酶+酸性蛋白酶”和“風味糖苷酶+中性蛋白酶”酶組合酶解后，口感不順滑以外，其他實驗組差別不大。有部分文獻及專利中報道，蛋白酶能分解提取液中大分子蛋白，從而提高茶湯鮮爽度；單寧酶能水解酯型兒茶素，從而降低茶湯苦澀度。而本實驗結(jié)果與之并不吻合，

蛋白酶及單寧酶酶解對茶湯的滋味改善效果并不明顯。

從香氣方面可以看出，β-葡聚糖酶和風味糖苷酶對產(chǎn)品的香氣改善效果十分明顯，產(chǎn)品花香突出。茶葉中許多香氣物質(zhì)主要與糖結(jié)合以非揮發(fā)性的香氣前體——糖苷形式存在，添加β-葡聚糖酶(水解β-葡聚糖和非淀粉的阿拉伯木聚糖)或風味糖苷酶(水解不同結(jié)構(gòu)糖苷鍵)，其能水解糖苷鍵，釋放呈香物質(zhì)，豐富香氣組成，因此添加β-葡聚糖酶或風味糖苷酶的實驗組，香氣更好。

2)茶濃縮液酶解混濁現(xiàn)象分析及處理

從上述結(jié)果可以看出，茶濃縮液經(jīng)過β-葡聚糖酶或風味糖苷酶，酶解后香氣品質(zhì)顯著改善。以β-葡聚糖酶為實驗對象，進行不同添加量酶解實驗考察，實驗結(jié)果見下表2。從結(jié)果可知，茶濃縮液酶解后的香氣濃度隨添加量的增大而增強，但是當酶添加量增加到茶濃縮液重量的1.5％以上時，沖溶后的茶湯有明顯混濁現(xiàn)象如圖1-3。

表2不同添加量茶濃縮液酶解實驗

圖1茶濃縮液酶解混濁現(xiàn)象

為了解決該問題，首先通過高速離心，收集了形成混濁的沉淀物，并對其進行紅外光譜分析，結(jié)果如下圖2。

圖2沉淀紅外光譜分析結(jié)果

紅外檢測分析結(jié)果顯示，其主要成分應(yīng)該是一種蛋白質(zhì)，可能是膠原質(zhì)或者類似明膠的蛋白物質(zhì)。據(jù)以上結(jié)果分析，可以考慮應(yīng)用蛋白酶來解決混濁的問題。

我們分別考察了不同種類蛋白酶對混濁現(xiàn)象的處理情況，通過多輪實驗，

最后確定了使用木瓜蛋白酶解決該問題，實驗結(jié)果如下圖3。實驗方法為，分別取純化水或茶濃縮液，按重量比加入不同量的不同酶制劑，50℃反應(yīng)2h后，85℃滅活20min；然后取2ml處理樣品，倒入200ml沸水沖溶，觀察狀態(tài)。

圖3混濁現(xiàn)象酶解實驗結(jié)果

從圖3-a1、a2可以看出，隨著β-葡聚糖酶添加量的增大，達到2.0％時，純化水產(chǎn)生混濁，說明酶自身變性后會生成沉淀，因此推測圖1-3中的混濁可能是由酶自身引起。但是，圖3-b1和圖3-b2對比可以看出，純化水中添加木瓜蛋白酶可以分解酶自身造成的混濁；相反，從圖3-c2和圖3-d2對比可知，在茶濃縮液中添加酶制劑產(chǎn)生混濁后，再添加木瓜蛋白酶，混濁無法分解。說明該混濁物并不是簡單由酶自身引起，而可能是與茶濃縮液中的多酚、單寧結(jié)合，形成了不溶性的膠體或沉淀，增加了混濁度。圖3-d1是在茶濃縮液中同時加入了2.0％的β-葡聚糖酶和0.5％的木瓜蛋白酶，復(fù)合酶解后，沖溶狀態(tài)與圖3-c1近似，無混濁現(xiàn)象。因此，我們推測造成混濁的物質(zhì)可能是在反應(yīng)過程中緩慢形成的，當體系中同時存在木瓜蛋白酶時，其能夠防止該物質(zhì)的產(chǎn)生，因此復(fù)合酶需要同時添加，混濁現(xiàn)象才可以解決。另從審評結(jié)果可知，復(fù)合酶同時添加獲得的茶濃縮液，其具有與單獨添加β-葡聚糖酶或風味糖苷酶酶解后相同的獨特香氣。

綜上可知，確定了以木瓜蛋白酶分別與β-葡聚糖酶、風味糖苷酶中的一種或兩種復(fù)配，復(fù)合添加酶解，用以改善茶濃縮液的香氣品質(zhì)。

二、本發(fā)明將加入復(fù)合酶制劑與未加入復(fù)合酶制劑的茶濃縮液，制成茶粉進行了對照，具體方法和結(jié)果如下：

(一)以普洱熟茶和曬青毛茶的復(fù)配茶為原料的對比實驗

1.茶粉制備方法

(1)取普洱熟茶和曬青毛茶的復(fù)配茶30.0kg為原料(曬青毛茶占比例為50％)，94℃高溫提取三次，第一次加茶葉10倍量的水，第二、三次各加茶葉8倍量的水，每次的提取時間為1h；提取液用100目濾布過濾；過濾液減壓濃縮至比重為1.028/65℃，可溶性固形物含量為12.5％；再經(jīng)碟式離心，轉(zhuǎn)速6000rpm；離心液再濃縮至比重1.120/70℃，獲得可溶性固形物含量為25.0％的茶濃縮液23.5kg。

(2)將茶濃縮液冷卻至55℃，取20.0kg茶濃縮液，并平均分成兩份，一份茶濃縮液a(10.0kg)做空白處理，另一份茶濃縮液b(10.0kg)酶解提香。

(3)在茶濃縮液b中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑中各酶重量比為，木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶＝0.4：1.0，添加量為濃縮液重量的1.50％，即分別添加30g木瓜蛋白酶(濃縮液重量的0.30％)、120g的β-葡聚糖酶(濃縮液重量的1.20％)，50rpm均速攪拌，酶解2.0h。

(4)將酶解提香后的茶濃縮液升溫至85℃，維持30min，進行酶滅活。

(5)將茶濃縮液a和茶濃縮液b在進口溫度為200℃，出口溫度為90℃的工藝參數(shù)下進行噴霧干燥，制得空白對照茶粉和酶解提香茶粉，常溫避光保存。

2.空白對照茶粉和酶解提香茶粉結(jié)果對照

(1)取空白對照茶粉和酶解提香茶粉各0.5g，用200ml沸水沖溶后進行感官審評；并根據(jù)國標《gbt8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》和《gbt8312-2013茶咖啡堿測定》規(guī)定檢測茶多酚和咖啡堿的含量，具體結(jié)果如下表1所示：

表1空白對照茶粉和酶解提香茶粉感官審評及理化指標對照

(2)通過對空白對照茶粉和酶解提香茶粉進行香氣成分分析，方法如下。香氣萃取條件：稱取茶粉6g，放到100ml頂空瓶中，加入4g氯化鉀，18ml水和轉(zhuǎn)子，ptfa膜封口。將頂空瓶放到70℃水浴中，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為400rpm，插入萃取頭(75μmcar-pdms)萃取60min，萃取結(jié)束迅速拔出，插到gc進樣口，解吸附3.5min，同時啟動gc-ms采集系統(tǒng)。氣相色譜(gc)條件：色譜柱為hp-5石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣為高純氦氣(>99.999％)，流速1.0ml/min；進樣口溫度250℃；進樣方式為手動無分流進樣。色譜柱升溫程序：初始溫度60℃，以2℃/min升至180℃，以10℃/min升至250℃，運行時間為70min。

質(zhì)譜條件：電離方式ei源，電離能量70ev；離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；質(zhì)量掃描m/z35-500。

香氣分析結(jié)果見表2，結(jié)果顯示，酶解提香茶粉的主要貢獻性香氣成分含量顯著增加，其中芳樟醇氧化物(強烈的花香、木香)含量是空白對照茶粉的5.3倍，a-萜品醇(花香、甜香)含量是空白對照茶粉的5.7倍，香葉醇(玫瑰花香)含量是空白對照茶粉的3.9倍；此外茶香氣組分的種類明顯增多，如香葉基丙酮(木香、果香)、香葉基乙酸酯等。

表2不同工藝茶粉的主要貢獻性香氣成分含量

3.結(jié)論

空白對照茶粉和酶解提香茶粉的理化指標基本一致，相比空白對照茶粉，酶解提香茶粉的貢獻性香氣成分含量大幅提高，茶香組分增多，花香明顯。大量研究表明，茶葉中的主要香氣包括芳樟醇及其氧化物、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、(順)-3-己烯醇等，這些主要的香氣成分多以不揮發(fā)的單糖苷或雙糖苷形式存在，即香氣前體物。采用β-葡聚糖酶或風味糖苷酶對茶濃縮液進行處理，β-葡聚糖酶能夠水解β-葡聚糖和非淀粉的阿拉伯木聚糖，而風味糖苷酶可以水解不同結(jié)構(gòu)的糖苷鍵，因此，通過兩種酶制劑的添加，可將不揮發(fā)狀態(tài)的香氣前體物水解，變成可揮發(fā)性香氣成分，釋放呈香物質(zhì)，豐富香氣組成，從而達到改善濃縮液風味的目的。

(二)以曬青毛茶和普洱生茶為原料的對比實驗

1.茶粉制備方法

(1)取曬青毛茶10.0kg和普洱生茶10.0kg為原料，50-55℃低溫提取三次，第一次加茶葉10倍量的水，第二、三次各加茶葉8倍量的水，每次的提取時間為1h；提取液用100目濾布過濾；過濾液減壓濃縮至比重為1.035/68℃，可溶性固形物含量為10.5％；再經(jīng)碟式離心，轉(zhuǎn)速6000rpm；離心液再濃縮至比重1.120/65℃，獲得可溶性固形物含量為26.5％的茶濃縮液16.3kg。

(2)將茶濃縮液冷卻至55℃，并平均分成兩份，一份茶濃縮液a(8.0kg)做空白處理，另一份茶濃縮液b(8.0kg)酶解提香。

(3)在茶濃縮液b中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑中各酶重量比為，木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.5：2.0：0.1，添加量為濃縮液重量的1.30％，即分別添加20g木瓜蛋白酶(濃縮液重量的0.25％)、80g的β-葡聚糖酶(濃縮液重量的1.00％)、4.0g風味糖苷酶(濃縮液重量的0.05％)，50rpm/min均速攪拌，酶解1.5h。

(4)將酶解提香后的茶濃縮液升溫至85℃，維持20min，進行酶滅活。

(5)將茶濃縮液a和茶濃縮液b在進口溫度為200℃，出口溫度為90℃的工藝參數(shù)下進行噴霧干燥，制得空白對照茶粉和酶解提香茶粉，常溫避光保存。

2.空白對照茶粉和酶解提香茶粉結(jié)果對照

(1)取空白對照茶粉和酶解提香茶粉各0.5g，用200ml沸水沖溶后進行感官審評；并根據(jù)國標《gbt8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》和《gbt8312-2013茶咖啡堿測定》規(guī)定檢測茶多酚和咖啡堿的含量，具體結(jié)果如下表3所示：

表3空白對照茶粉和酶解提香茶粉感官審評及理化指標對照

(2)通過對空白對照茶粉和酶解提香茶粉進行香氣成分分析，方法如下。香氣萃取條件：稱取茶粉6g，放到100ml頂空瓶中，加入4g氯化鉀，18ml水和轉(zhuǎn)子，ptfa膜封口。將頂空瓶放到70℃水浴中，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為400rpm，插入萃取頭(75μmcar-pdms)萃取60min，萃取結(jié)束迅速拔出，插到gc進樣口，解吸附3.5min，同時啟動gc-ms采集系統(tǒng)。氣相色譜(gc)條件：色譜柱為hp-5石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣為高純氦氣(>99.999％)，流速1.0ml/min；進樣口溫度250℃；進樣方式為手動無分流進樣。色譜柱升溫程序：初始溫度60℃，以2℃/min升至180℃，以10℃/min升至250℃，運行時間為70min。

質(zhì)譜條件：電離方式ei源，電離能量70ev；離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；質(zhì)量掃描m/z35-500。

香氣分析結(jié)果見表4，結(jié)果顯示，酶解提香茶粉的主要貢獻性香氣成分含量顯著增加，其中芳樟醇(強烈花香)含量是空白對照茶粉的1.2倍，a-萜品醇(花香、甜香)含量是空白對照茶粉的1.7倍，香葉醇(玫瑰花香)含量是空白對照茶粉的2.6倍；此外茶香氣組分的種類明顯增多，如脫氫芳樟醇等。

表4不同工藝茶粉的主要貢獻性香氣成分含量

3.結(jié)論

空白對照茶粉和酶解提香茶粉的理化指標基本一致，相比空白對照茶粉，酶解提香茶粉香氣突出,貢獻性香氣成分含量明顯提高，茶香組分增多，花香明顯。

(三)以滇紅茶為原料的對比實驗

1.茶粉制備方法

(1)取滇紅茶60.0kg為原料，加入茶葉16倍量的水，連續(xù)投料，70-80℃低溫管道逆流提取，提取總時間為3h；提取液用100目濾布過濾；過濾液減壓濃縮至比重為1.030/70℃，可溶性固形物含量為15.3％；再經(jīng)碟式離心，轉(zhuǎn)速6000rpm；離心液再濃縮至比重1.130/65℃，獲得可溶性固形物含量為29.4％的茶濃縮液46.0kg。

(2)將茶濃縮液冷卻至55℃，并平均分成兩份，一份茶濃縮液a(10.0kg)做空白處理，另一份茶濃縮液b(10.0kg)酶解提香。

(3)在茶濃縮液b中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑中各酶重量比為，木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶＝0.5：2.25，添加量為濃縮液重量的2.75％，即分別添加50g木瓜蛋白酶(濃縮液重量的0.5％)、225g的β-葡聚糖酶(濃縮液重量的2.25％)，50rpm均速攪拌，酶解2.0h。

(4)將酶解提香后的茶濃縮液升溫至85℃，維持20min，進行酶滅活。

(5)將茶濃縮液a和茶濃縮液b在進口溫度為200℃，出口溫度為90℃的工藝參數(shù)下進行噴霧干燥，制得空白對照茶粉和酶解提香茶粉，常溫避光保存。

2.空白對照茶粉和酶解提香茶粉結(jié)果對照

(1)取空白對照茶粉和酶解提香茶粉各0.5g，用200ml沸水沖溶后進行感官審評；并根據(jù)國標《gbt8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》和《gbt8312-2013茶咖啡堿測定》規(guī)定檢測茶多酚和咖啡堿的含量，具體結(jié)果如下表5所示：

表5空白對照茶粉和酶解提香茶粉感官審評及理化指標對照

(2)通過對空白對照茶粉和酶解提香茶粉進行香氣成分分析，方法如下。香氣萃取條件：稱取茶粉6g，放到100ml頂空瓶中，加入4g氯化鉀，18ml水和轉(zhuǎn)子，ptfa膜封口。將頂空瓶放到70℃水浴中，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為400rpm，插入萃取頭(75μmcar-pdms)萃取60min，萃取結(jié)束迅速拔出，插到gc進樣口，解吸附3.5min，同時啟動gc-ms采集系統(tǒng)。氣相色譜(gc)條件：色譜柱為hp-5石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣為高純氦氣(>99.999％)，流速1.0ml/min；進樣口溫度250℃；進樣方式為手動無分流進樣。色譜柱升溫程序：初始溫度60℃，以2℃/min升至180℃，以10℃/min升至250℃，運行時間為70min。

質(zhì)譜條件：電離方式ei源，電離能量70ev；離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；質(zhì)量掃描m/z35-500。

香氣分析結(jié)果見表6，結(jié)果顯示，酶解提香茶粉的主要貢獻性香氣成分含量顯著增加，其中芳樟醇(強烈花香)含量是空白對照茶粉的1.5倍，脫氫芳樟醇含量是空白對照茶粉的1.7倍，a-萜品醇(花香、甜香)含量是空白對照茶粉的1.8倍，香葉醇(玫瑰花香)含量是空白對照茶粉的2.4倍；此外茶香氣組分的種類明顯增多，如反式-紫羅蘭酮、橙花醇氧化物等。

表6不同工藝茶粉的主要貢獻性香氣成分含量

3.結(jié)論

空白對照茶粉和酶解提香茶粉的理化指標基本一致，相比空白對照茶粉，酶解提香茶粉香氣突出，貢獻性香氣成分含量明顯提高，茶香組分增多，花香明顯。

本發(fā)明的有益效果包括以下幾個方面：

1、為解決傳統(tǒng)茶濃縮液香氣不足的問題，本發(fā)明通過復(fù)合酶酶解茶濃縮液，有效釋放其中的呈香成分，豐富香氣物質(zhì)組成，具有明顯提高茶香、產(chǎn)生特異性花香的效果，提香后的茶濃縮液，可以廣泛用于速溶茶粉、茶飲料等其他茶食品的制作中。

2、目前利用酶解技術(shù)改善速溶茶香氣方面的研究，主要集中在茶葉的酶解提取過程，酶解底物為茶葉。雖然這種方式可以在一定程度上的提高速溶茶香氣品質(zhì)，但是由于低溫酶解，成品得率很低；且酶解用量較大。而本發(fā)明針對茶葉香氣的前體物，將復(fù)合酶直接應(yīng)用于濃縮液中，酶與底物接觸充分，香氣成分含量成倍增加，效果突出，且本發(fā)明還克服了茶濃縮液直接酶解帶來的產(chǎn)品混濁問題。

3、相對于現(xiàn)有技術(shù)來說，以“醇香酶解綠茶濃縮液工藝研究”一文為例(周紹遷等，醇香酶解綠茶濃縮液工藝研究，飲料工藝，2012年，第15卷，第08期，6-12頁)(簡稱文獻1)，本發(fā)明的區(qū)別點如下：

1)文獻1中公開了復(fù)合酶用于綠茶提取過程的應(yīng)用研究；本發(fā)明所述復(fù)合酶直接應(yīng)用于茶濃縮液中，針對茶葉香氣前體物進行酶解，反應(yīng)更加快速、充分，在保證產(chǎn)品得率的情況下，極大地提高香氣品質(zhì)。

2)文獻1中公開的綠茶濃縮液是由提取茶汁反滲透濃縮制成，并未進行真空蒸發(fā)濃縮研究，因此無法評價該提取茶汁真空濃縮后，復(fù)合酶對產(chǎn)品的影響效果。雖然相比于真空蒸發(fā)濃縮，反滲透能更好的保留茶葉香氣成分，但是其生產(chǎn)成本高，設(shè)備投入大，難以用于工業(yè)化生產(chǎn)。而本發(fā)明的復(fù)合酶可應(yīng)用于各種濃縮工藝來源的茶濃縮液，有效解決真空濃縮過程給產(chǎn)品帶來的香氣損失問題。

3)文獻1中公開了復(fù)合酶為單寧酶、纖維素酶、風味蛋白酶和β-葡萄糖苷酶按照1：1：1：1的比例組成，單寧酶、纖維素酶、風味蛋白酶等主要對茶湯口感有所改善，可以提高其中的有效成分，而β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用主要針對綠茶提取中改善香氣；而本發(fā)明所述復(fù)合酶為木瓜蛋白酶與以下一種或兩種成分的組合：β-葡聚糖酶、風味糖苷酶，針對香氣問題，本發(fā)明應(yīng)用價格低廉的β-葡聚糖酶(200元/公斤)替代價格高昂的β-葡萄糖苷酶(2000元/公斤)，大大降低成本，并且效果突出，木瓜蛋白酶的應(yīng)用，解決了濃縮液直接酶解，酶解量增大時給產(chǎn)品帶來的混濁問題。

4)文獻1中公開的復(fù)合酶在應(yīng)用時需調(diào)整體系ph到5.0，這在工業(yè)化應(yīng)用中需要額外添加緩沖溶液，因此可能對產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生負面影響；而本發(fā)明是在自然ph進行酶解，操作更加簡便、快速。

5)本發(fā)明經(jīng)過上述篩選過程發(fā)現(xiàn)，實施例1的技術(shù)所得產(chǎn)品具有最佳技術(shù)效果。

附圖說明

圖1茶濃縮液酶解混濁現(xiàn)象

1、茶濃縮液；2、茶濃縮液+0.5％β-葡聚糖酶；3、茶濃縮液+2.0％β-葡聚糖酶.

圖2沉淀紅外光譜分析結(jié)果

其中，上圖為測試的茶沉淀；下圖為圖譜庫中的譜圖。

圖3混濁現(xiàn)象酶解實驗結(jié)果，圖3中的組別如下

圖4酶解提香工藝流程圖，

具體實施方式

以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。

實施例1

(1)取曬青毛茶10.0kg和普洱生茶10.0kg為原料，50-55℃低溫提取三次，第一次加茶葉10倍量的水，第二、三次各加茶葉8倍量的水，每次的提取時間為1h；提取液用100目濾布過濾；過濾液減壓濃縮至比重為1.035/68℃，可溶性固形物含量為10.5％；再經(jīng)碟式離心，轉(zhuǎn)速6000rpm；離心液再濃縮至比重1.120/65℃，獲得可溶性固形物含量為26.5％的茶濃縮液16.3kg。

(2)將茶濃縮液冷卻至55℃，取8.0kg上述茶濃縮液，在茶濃縮液添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑中各酶重量比為，木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.5：2.0：0.1，添加量為濃縮液重量的1.30％，即分別添加20g木瓜蛋白酶(濃縮液重量的0.25％)、80g的β-葡聚糖酶(濃縮液重量的1.00％)、4.0g風味糖苷酶(濃縮液重量的0.05％)，50rpm/min均速攪拌，酶解1.5h。

(3)將酶解提香后的茶濃縮液升溫至85℃，維持20min，進行酶滅活。

(4)將酶解提香后的茶濃縮液在進口溫度為200℃，出口溫度為90℃的工藝參數(shù)下進行噴霧干燥，制得酶解提香茶粉，常溫避光保存。

實施例2

(1)取滇紅茶60.0kg為原料，加入茶葉16倍量的水，連續(xù)投料，70-80℃低溫管道逆流提取，提取總時間為3h；提取液用100目濾布過濾；過濾液減壓濃縮至比重為1.030/70℃，可溶性固形物含量為15.3％；再經(jīng)碟式離心，轉(zhuǎn)速6000rpm；離心液再濃縮至比重1.130/65℃，獲得可溶性固形物含量為29.4％的茶濃縮液46.0kg。

(2)取10.0kg上述茶濃縮液，將茶濃縮液冷卻至55℃，在茶濃縮液中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑中各酶重量比為，木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶＝0.5：2.25，添加量為濃縮液重量的2.75％，即分別添加50g木瓜蛋白酶(濃縮液重量的0.5％)、225g的β-葡聚糖酶(濃縮液重量的2.25％)，攪拌均勻后，酶解2.0h。

(3)將酶解提香后的茶濃縮液升溫至85℃，維持20min，進行酶滅活。

(4)將酶解提香后的茶濃縮液在進口溫度為200℃，出口溫度為90℃的工藝參數(shù)下進行噴霧干燥，制得酶解提香茶粉，常溫避光保存。

實施例3

(1)取普洱熟茶和曬青毛茶的復(fù)配茶30.0kg為原料(曬青毛茶占比例為50％)，94℃高溫提取三次，第一次加茶葉10倍量的水，第二、三次各加茶葉8倍量的水，每次的提取時間為1h；提取液用100目濾布過濾；過濾液減壓濃縮至比重為1.028/65℃，可溶性固形物含量為12.5％；再經(jīng)碟式離心，轉(zhuǎn)速6000rpm；離心液再濃縮至比重1.120/70℃，獲得可溶性固形物含量為25.0％的茶濃縮液23.5kg。

(2)將茶濃縮液冷卻至55℃，取10.0kg茶濃縮液，在茶濃縮液中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑中各酶重量比為，木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶＝0.4：1.0，添加量為濃縮液重量的1.50％，即分別添加30g木瓜蛋白酶(濃縮液重量的0.30％)、120g的β-葡聚糖酶(濃縮液重量的1.20％)，攪拌均勻后，酶解2.0h。

(3)將酶解提香后的茶濃縮液升溫至85℃，維持30min，進行酶滅活。

(4)將酶解提香后的茶濃縮液在進口溫度為200℃，出口溫度為90℃的工藝參數(shù)下進行噴霧干燥，制得酶解提香茶粉，常溫避光保存。

實施例4

(1)取普洱熟茶和曬青毛茶的復(fù)配茶20.0kg為原料(曬青毛茶占比例為30％)，94℃高溫提取三次，第一次加茶葉10倍量的水，第二、三次各加茶葉8倍量的水，每次的提取時間為1h；提取液用100目濾布過濾；過濾液減壓濃縮至比重為1.020/65℃，可溶性固形物含量為11.5％；再經(jīng)碟式離心，轉(zhuǎn)速6000rpm；離心液再濃縮至比重1.110/70℃，獲得可溶性固形物含量為25.0％的茶濃縮液18.0kg。

(2)將茶濃縮液冷卻至55℃，取10.0kg茶濃縮液，在茶濃縮液中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑中各酶重量比為，木瓜蛋白酶：風味糖苷酶＝0.4：0.1，添加量為濃縮液重量的0.5％，即分別添加50g木瓜蛋白酶(濃縮液重量的0.4％)、10g的風味糖苷酶(濃縮液重量的0.1％)，攪拌均勻后，酶解2.0h。

(3)將酶解提香后的茶濃縮液升溫至85℃，維持20min，進行酶滅活。

(4)將酶解提香后的茶濃縮液在進口溫度為200℃，出口溫度為90℃的工藝參數(shù)下進行噴霧干燥，制得酶解提香茶粉，常溫避光保存。

實施例5

方法和實施例4相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑重量比為，木瓜蛋白酶：風味糖苷酶＝2.4:1.0，添加量為濃縮液重量的3.4％。

實施例6

方法和實施例4相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑重量比為，木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶＝0.4:0.1，添加量為濃縮液重量的0.5％。

實施例7

方法和實施例1相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑為：木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶；木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶＝2.4:6.0。

實施例8

方法和實施例1相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑為：所述復(fù)合酶由木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶、風味糖苷酶組合而成，它們之間的重量比例為木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.4:0.1:0.1。

實施例9

方法和實施例1相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑為：所述復(fù)合酶由木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶、風味糖苷酶組合而成，它們之間的重量比例為木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝2.4:6.0:1.0。

實施例10

方法和實施例1相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑中各種酶的重量比例為：木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.4:1.0:0.1。

實施例11

方法和實施例1相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑中各種酶的重量比例為：木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝1.0:2.5:0.3。

實施例12

方法和實施例1相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑中各種酶的重量比例為：木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.5:1.5:0.15。

實施例13

方法和實施例1相同，不同之處在于使用的復(fù)合酶制劑中各種酶的重量比例為：木瓜蛋白酶：β-葡聚糖酶：風味糖苷酶＝0.8:2.0:0.2。