本發(fā)明屬于水產養(yǎng)殖領域，涉及一種中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑及其制備方法和應用。

背景技術：

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹，屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，甲殼綱(Cmstacea)，十足目(Decapoda)，弓蟹科(Varunidae)，絨螯蟹屬(Eriocheir)，是一種肉質鮮美的特種水產品，具有重要的經濟價值，在江蘇水產養(yǎng)殖業(yè)中更是占了舉足輕重的地位——2015年江蘇河蟹養(yǎng)殖面積達到263.99千公頃，產量達到了364534噸，占了全國產量的45％。然而，隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，河蟹在集約化養(yǎng)殖過程中，一是養(yǎng)殖水環(huán)境日益惡化；二是病害問題日益凸顯，尤其是近年來河蟹“水癟子”(患病河蟹肝胰腺發(fā)白、發(fā)灰，糜爛、萎縮、壞死，導致河蟹干癟、殼內積水無肉)呈現(xiàn)發(fā)病面積、發(fā)病率增多的趨勢，據(jù)不完全統(tǒng)計，江蘇興化地區(qū)2015年約有80％以上蟹塘發(fā)病，患病河蟹達到30％～40％，嚴重影響了漁民的經濟效益，制約了河蟹產業(yè)的健康發(fā)展；三是河蟹極易受到飼養(yǎng)密度、水質變化和投喂管理等方面因素影響而產生應激，其中運輸應激就是養(yǎng)殖到銷售環(huán)節(jié)之間(尤其是高溫期間)一種較為常見的氧化應激反應；當應激強度過強或時間過長時，機體會產生大量的自由基，抗氧化水平下降，破壞氧化-抗氧化平衡，從而免疫力下降、機體受損。由上述可見，保護肝胰腺健康，提高河蟹自身免疫力，增強抗應激性能，對于河蟹產業(yè)的健康發(fā)展至關重要。

鑒于傳統(tǒng)的抗菌藥物、抗生素等具有引起病原菌耐藥性、高殘留、用量大等缺點，促使越來越多的科研人員將目光投向抗菌藥物替代品的研究。

目前已有一些關于果寡糖、乳酸菌、芽孢桿菌以及酵母菌等作為添加劑在水產飼料中的使用，但是有關這幾者之間的配伍使用，還未見報道。同時，由于甲殼動物缺乏特異性免疫，所以對其免疫動能的研究主要集中在非特異性免疫、抗氧化能力方面。此外，眾多研究表明，谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶常被用作評價肝臟健康指標；溶菌酶是重要的非特異性免疫因子；皮質醇、血糖可以反應魚類應激反應的強弱，是應激反應的敏感指標；此外，超氧化物氣化酶、過氧化氫酶等是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成成分。因此，通過對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴相關生化指標、肝胰腺抗氧化指標及運輸應激后成活率情況的研究，研制一種針對中華絨螯蟹幼蟹的安全、高效抗應激免疫增強劑，為新形勢下進一步完善其飼料配方提供科學依據(jù)，對中華絨螯蟹綠色健康養(yǎng)殖和產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑。

本發(fā)明的另一目的是提供該中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑的制備方法。

本發(fā)明的又一目的是提供該中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑的應用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：

一種中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強組合物，由以下組分組成：果寡糖55～75重量份，乳酸菌10～25重量份，芽孢桿菌8～20重量份，酵母菌5～15重量份。

所述的組合物優(yōu)選由以下組分組成：果寡糖65～75重量份，乳酸菌12～20重量份，芽孢桿菌8～15重量份，酵母菌5～10重量份。

本發(fā)明所述的抗應激免疫增強組合物在制備中華絨螯蟹幼蟹抗應激和/或提高免疫力的制劑中的應用。

一種中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑，含有本發(fā)明所述的抗應激免疫增強劑。

所述的抗應激免疫增強劑優(yōu)選通過以下方法制備得到：將本發(fā)明所述的組合物各組分分別經超微粉碎機粉碎，然后過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，即制成所述的抗應激免疫增強劑。

本發(fā)明所述的中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑的制備方法，將本發(fā)明所述的組合物各組分分別經超微粉碎機粉碎，然后過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，即制成所述的抗應激免疫增強劑。

本發(fā)明所述的中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑在制備中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強飼料中的應用。

所述的中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強飼料是將所述的抗應激免疫增強組合物按照0.5wt％～1wt％的量添加到常規(guī)中華絨螯蟹飼料中所得。

有益效果：

本發(fā)明針對中華絨螯蟹幼蟹的特性，從甲殼動物的免疫機理和應激反應機制出發(fā)，結合前期在其它甲殼動物試驗研究，篩選出果寡糖、乳酸菌、芽孢桿菌以及酵母菌，并將其按照特定配比復配，一是利用果寡糖、乳酸菌、芽孢桿菌保護機體、提高機體抗應激能力的功能；二是利用果寡糖、酵母菌的抗氧化功能，提高機體的抗氧化能力，保護肝胰腺，降低“水癟子”病發(fā)概率；三是利用果寡糖具有與乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌這三種益生菌一樣的抑制有害菌繁殖、改善腸道菌群平衡、促生長、增強機體免疫力的功能，各組分相輔相成，克服了單一組分可能存在的不足之處，高效安全。四種組分復配，得到抗應激免疫增強組合物，并在此基礎上制備得到中華絨螯蟹幼蟹抗應激免疫增強劑。此抗應激免疫增強劑有助于提高蟹肝胰腺抗氧化能力，清除體內自由基，同時提高機體的免疫力和抗應激能力，促使幼蟹健康生長。

本發(fā)明各組分來源穩(wěn)定，取材廣泛，制備簡單，性價比高。

具體實施方式

實施例1

取果寡糖70重量份、乳酸菌13重量份、芽孢桿菌10重量份、酵母菌7重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例2

生長試驗：中華絨螯蟹由江蘇省淡水水產研究所浦口基地提供。試驗選擇健康、規(guī)格和重量基本一致的幼蟹(初均體重：9.91±0.05g)。隨機分組，設有對照組A(投喂基礎日糧)、對照組B(在基礎日糧中添加1.0％果寡糖)、對照組C(在基礎日糧中添加0.2％酵母菌+0.2％芽孢桿菌+0.1％酵母菌)和試驗組(在基礎日糧中添加0.7％實施例1制備的抗應激免疫增強劑)，每組設3個平行試驗，每平行組75只試驗蟹。共12個水泥池(4m×4m×2m)。蟹馴化7天后投喂各組飼料70天，測定其生長、免疫相關指標。

基礎日糧：河蟹飼料(粗蛋白38％，粗脂肪5.2％，粗纖維6.9％，粗灰分17.8％，總磷1.2％，賴氨酸2.1％)。

其中，所使用的酵母菌、芽孢桿菌來源沒有特殊限制，乳酸菌為高溫乳酸菌。市售可飼料用的酵母菌、芽孢桿菌、高溫乳酸菌均適宜使用于本發(fā)明，如江蘇易實生物科技有限公司生產的酵母菌、芽孢桿菌，思科福(北京)生物科技有限公司生產的高溫乳酸菌等。

表1

*增重率％＝(平均終體重-平均初體重)/平均初體重*100

結果表明：與對照組A相比，抗應激免疫增強劑組顯著提高了：增重率25.92％、溶菌酶水平38.58％、超氧化物氣化酶水平12.67％、過氧化氫酶水平68.41％(P<0.05)；顯著降低了餌料系數(shù)26.80％、谷丙轉氨酶水平30.03％、谷草轉氨酶水平14.66％(P<0.05)。與對照組B相比，抗應激免疫增強劑組顯著提高了：增重率17.48％(P<0.05)；顯著降低了餌料系數(shù)18.25％、谷丙轉氨酶水平10.78％(P<0.05)。與對照組C相比，抗應激免疫增強劑組顯著提高了增重率13.57％、溶菌酶水平38.58、過氧化氫酶水平21.54％(P<0.05)；顯著降低了餌料系數(shù)13.85％、谷丙轉氨酶水平40.00％、谷草轉氨酶水平9.37％。因此，本發(fā)明抗應激免疫增強劑的添加較之各對照組能顯著促進中華絨螯蟹幼蟹的生長，提高蟹機體的免疫力和抗氧化能力；同時還起到保護肝臟的作用。

運輸應激試驗：生長試驗70天后，禁食24小時，再挑選規(guī)格一致的蟹，每組6個重復，每個重復15只裝在一個網兜里，試驗采用無水運輸，運輸時間為3h(鎮(zhèn)江——南京)；達到南京后，將蟹放置養(yǎng)殖箱(容積為160L，水深20cm)中觀察其生理活動，并統(tǒng)計各組蟹0d、1d、2d、3d的累積死亡率.

表2

結果表明：中華絨螯蟹幼蟹在運輸應激后，蟹的活力開始下降，對外界反應能力減弱。由表3可見，與對照組A相比，抗應激免疫增強劑組死亡率在1d、2d、3d分別顯著降低了60.07％、41.94％、45.65％(P<0.05)；與對照組B相比，抗應激免疫增強劑組死亡率在2d、3d分別顯著降低了18.18％、19.35％(P<0.05)；與對照組C相比，抗應激免疫增強劑組死亡率在2d、3d分別顯著降低了35.71％、30.55％(P<0.05)。因此，該抗應激免疫增強劑能提高中華絨螯蟹幼蟹抗應激的能力，減少由應激造成的死亡。

實施例3

取果寡糖65重量份、乳酸菌20重量份、芽孢桿菌10重量份、酵母菌5重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例4

取果寡糖65重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌15重量份、酵母菌8重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例5

取果寡糖66重量份、乳酸菌17重量份、芽孢桿菌11重量份、酵母菌6重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例6

取果寡糖68重量份、乳酸菌13重量份、芽孢桿菌12重量份、酵母菌7重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例7

取果寡糖70重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌8重量份、酵母菌10重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例8

取果寡糖73重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌7重量份、酵母菌8重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例9

取果寡糖75重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌8重量份、酵母菌5重量份；將上述各組分經超微粉碎機粉碎，過120目的篩網，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機內充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應激免疫增強劑。

實施例10

按照實施例2中的生長試驗和應激試驗方法，分別測定投喂含實施例3～9中制備的抗應激免疫增強劑的蟹的生長、免疫等指標以及應激后2d成活率。對照組投喂基礎日糧，各試驗組分別在基礎日糧中添加0.7％實施例3～9制備的抗應激免疫增強劑。結果見表4和表5。

表3

*平均增重率％＝(平均終體重-平均初體重)/平均初體重*100

表4

表3和4中的實驗組A～G分別對應實施例3～9制備的抗應激免疫增強劑。