本發(fā)明涉及一種北冬蟲夏草菌凍干粉的制備方法,有利于北冬蟲夏草菌種的有效保藏。

背景技術(shù)：

北冬蟲夏草菌cordycepsmilitaris,(l.exfr.)link.也稱蛹草、蛹蟲草、北蟲草。北冬蟲夏草，是一種具有較高滋補(bǔ)和藥用價(jià)值的珍貴中藥材。蛹蟲草在我國的人工栽培已有十多年歷史，其藥用價(jià)值與馳名中外的冬蟲夏草(cordycepssinensis)相似。

蛹蟲草人工栽培技術(shù)的成熟和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展一方面說明市場的大量需求，另一方面也反映出冬蟲夏草野生資源稀缺的現(xiàn)狀。野生冬蟲夏草價(jià)格的連年暴漲，使越來越多的人關(guān)注蛹蟲草的人工栽培。人工栽培的蛹蟲草原始菌株均來自與野外采集的冬蟲夏蟲菌，通常是每年野外采集，再經(jīng)過復(fù)雜的分離純化獲得性狀穩(wěn)定的菌種用于生產(chǎn)。但蛹蟲草菌較之其他真菌更易變異、退化，實(shí)際證明蟲草菌中通過有性繁殖后，轉(zhuǎn)管傳代超過三次以上，菌種的出草性能會(huì)有明顯的下降。無性傳代在5次以上，蟲草菌種會(huì)喪失出草性能。一般而言從制備原始母種到栽培種植,一般需要6-9個(gè)月保藏期，生產(chǎn)單位不得不每1-2個(gè)月即進(jìn)行傳代保藏，從而造成菌種性能嚴(yán)重退化。為保證菌種質(zhì)量，往往需要每年都要重新采集，重復(fù)分離純化工作，不但增加了工作量，而且每年的生產(chǎn)菌種的差異也會(huì)引起產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定。菌種退化會(huì)引起大面積減產(chǎn)失收，給批量生產(chǎn)帶來極大的風(fēng)險(xiǎn)。如何能夠有效地保藏優(yōu)良的蛹蟲草菌，解決蛹蟲草的菌種退化問題已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。目前廣泛應(yīng)用的保藏蛹蟲草菌的方法是低溫試管保藏法，但方華舟等人的研究結(jié)果表明用這種方法保藏，時(shí)間在30d內(nèi)蟲草菌種的后代性狀較為穩(wěn)定，不表現(xiàn)為退化，保藏60d后的菌種遺傳性狀表現(xiàn)出明顯的差異，隨著保藏時(shí)間的延遲其菌絲生長速度變慢和菌落形態(tài)發(fā)生改變，菌落的角變率明顯提高?，F(xiàn)有的保藏方法顯然不能解決實(shí)際生產(chǎn)問題，仍需探索更有效的保藏方法。

優(yōu)良的蛹蟲草菌種能夠保證蟲草產(chǎn)品的質(zhì)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)對(duì)蛹蟲草菌種的利用需要對(duì)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，操作繁瑣，周期長，菌種易污染、退化、變異等諸多弊端。為解決這一生產(chǎn)實(shí)際問題，本研究在分析菌種退化原因的基礎(chǔ)上，將已分離獲得的北冬蟲夏草菌種經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)、離心、加入保護(hù)劑、再經(jīng)真空冷凍干燥工藝，將其制成凍干粉，于-20℃下保存，以期達(dá)到長期保藏菌種的目的。本制作方法通過真空、冷凍、干燥等工藝在保存其活力的情況下給蛹蟲草菌創(chuàng)造了缺氧、低溫、干燥條件，有效控制了蟲草菌的繁殖代數(shù)，而且能夠直接用于生產(chǎn)，從根本上解決了菌種的繼代培養(yǎng)退化問題。不但有效地解決了菌種長期保存的問題，而且省去了每年繁重的菌種選育工作，降低了成本，保證了產(chǎn)品質(zhì)量，為蛹蟲草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展更進(jìn)一步提供技術(shù)支持，具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足,本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效保持菌種活力，方便生產(chǎn)應(yīng)用的北冬蟲夏草菌凍干粉的制備方法,制備得到的北冬蟲夏草菌凍干粉保存在-20℃下，無需傳代，存放數(shù)月后菌種仍保持較高出草率、且出草茁壯，轉(zhuǎn)色正常，無畸形。

本發(fā)明上述目的通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)將野外采集生產(chǎn)性狀優(yōu)良的冬蟲夏草菌經(jīng)過分離純化得到試管斜面純菌種，接種于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩增殖培養(yǎng)，獲得液體菌種。將增殖培養(yǎng)液在適當(dāng)條件下離心收集下層菌絲體，加入復(fù)合凍干保護(hù)劑，混勻，裝瓶，凍干，即得北冬蟲夏草菌凍干粉。

步驟1：增殖培養(yǎng)基的制備

增殖培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰鉀3.0g，硫酸鎂1.5g，vb10mg，蛋白胨（提供n源）5g，定容至1000ml，ph自然備用。

步驟2：冬蟲夏草菌增殖培養(yǎng)

溫度24℃，震蕩頻率130-150rpm，培養(yǎng)時(shí)間72h，至能見到均勻的菌絲球。

步驟3：培養(yǎng)液離心收集菌絲體

離心時(shí)間10min，離心速度，6000rpm。

步驟4：凍干保護(hù)劑制備

凍干保護(hù)劑,按質(zhì)量百分比,包括如下組分：

脫脂乳粉10%，海藻糖5%，甘油10%，葡萄糖5%，β-cd5%，甘露醇15%。

所述凍干保護(hù)劑的制備方法,包括如下步驟：

將上述組分按照配比溶解并平衡30min后備用。

步驟5：按一定的體積比加入凍干保護(hù)劑，與菌絲體濃縮液混勻。

步驟6：預(yù)凍至凍干所需溫度。預(yù)凍溫度為-80℃，時(shí)間為60min。

步驟7：真空冷凍干燥的條件為：絕度真空度為20pa,溫度為-40℃,凍干時(shí)間為24h。

步驟8：蠟封，密閉。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下有益效果

目前采用的低溫試管保藏法，需對(duì)蛹蟲草菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，操作繁瑣，周期長，菌種易污染、退化、變異等諸多弊端。本制作方法通過真空、冷凍、干燥等工藝在保存其活力的情況下給蛹蟲草菌創(chuàng)造了缺氧、低溫、干燥條件，有效地解決了菌種長期保存的問題，從根本上解決了菌種的繼代培養(yǎng)退化問題。

實(shí)施例1

(1)增殖培養(yǎng)基的制備及其培養(yǎng)

a:其組分包括：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰鉀3.0g，硫酸鎂1.5g，vb10mg，蛋白胨（提供n源）5g。

b將上述組分按照配比溶解并平衡30min,在溫度121.3℃條件，30min高壓滅菌。即得培養(yǎng)基。

c:將菌塊接種于增殖培養(yǎng)基中，于20℃，震蕩頻率130rpm培養(yǎng)72h，至能見到均勻的菌絲球。

(2)將上述培養(yǎng)液倒入離心管，于6000rpm，15min的離心機(jī)中，進(jìn)行離心，取濃縮液備用。

(3)按質(zhì)量百分比,凍干保護(hù)劑包括如下組分：脫脂乳粉5%，海藻糖7%，甘油10%，葡萄糖5%，β-cd7%，甘露醇10%。將上述組分按照配比溶解并平衡30min后，按濃縮液和保護(hù)劑比為1：5與菌絲體濃縮液混勻。

(4)將(3)混合液進(jìn)行預(yù)凍至凍干所需溫度，其預(yù)凍溫度為-80℃，時(shí)間為60min。最后，進(jìn)行真空冷凍干燥，其條件為絕度真空度為20pa,溫度為-40℃,凍干時(shí)間為24h。

實(shí)施例2

(1)增殖培養(yǎng)基的制備及其培養(yǎng)

a:其組分包括：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰鉀3.0g，硫酸鎂1.5g，vb10mg，蛋白胨（提供n源）5g。

b將上述組分按照配比溶解并平衡30min,在溫度121.3℃條件，30min高壓滅菌。即得培養(yǎng)基。

c:將菌塊接種于增殖培養(yǎng)基中，于24℃，震蕩頻率140rpm培養(yǎng)72h，至能見到均勻的菌絲球。

(2)將上述培養(yǎng)液倒入離心管，于7000rpm，10min的離心機(jī)中，進(jìn)行離心，倒出上清液備用。

(3)按質(zhì)量百分比,凍干保護(hù)劑包括如下組分：脫脂乳粉10%，海藻糖3%，甘油10%，葡萄糖10%，β-cd3%，甘露醇12%。將上述組分按照配比溶解并平衡30min后，按濃縮液和保護(hù)劑比為1：8與菌絲體濃縮液混勻。

(4)將(3)混合液進(jìn)行預(yù)凍至凍干所需溫度其預(yù)凍溫度為-80℃，時(shí)間為60min。最后，進(jìn)行真空冷凍干燥，其條件為絕度真空度為20pa,溫度為-40℃,凍干時(shí)間為24h。

實(shí)施例3

(1)增殖培養(yǎng)基的制備及其培養(yǎng)

a:其組分包括：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰鉀3.0g，硫酸鎂1.5g，vb10mg，蛋白胨（提供n源）5g。

b將上述組分按照配比溶解并平衡30min,在溫度121.3℃條件，30min高壓滅菌。即得培養(yǎng)基。

c:將菌塊接種于增殖培養(yǎng)基中，于22℃，震蕩頻率150rpm培養(yǎng)72h，至能見到均勻的菌絲球。

(2)將上述培養(yǎng)液倒入離心管，于8000rpm，5min的離心機(jī)中，進(jìn)行離心，倒出上清液備用。

(3)按質(zhì)量百分比,凍干保護(hù)劑包括如下組分：脫脂乳粉15%，海藻糖5%，甘油10%，葡萄糖8%，β-cd5%，甘露醇15%。將上述組分按照配比溶解并平衡30min后，按濃縮液和保護(hù)劑比為1：10與菌絲體濃縮液混勻。

將(3)混合液進(jìn)行預(yù)凍至凍干所需溫度其預(yù)凍溫度為-80℃，時(shí)間為60min。最后，進(jìn)行真空冷凍干燥，其條件為絕度真空度為20pa,溫度為-40℃,凍干時(shí)間為24h。