本發(fā)明屬于食品抗菌保鮮領(lǐng)域，具體涉及一種乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜及制備方法和用途。

背景技術(shù)：

乳酸鏈球菌素(nisin)是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)。乳酸鏈球菌素能有效地抑制引起食品腐敗的許多革蘭氏陽性細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌及單增核李斯特氏菌等的生長(zhǎng)和繁殖，且是gras認(rèn)證安全的食品防腐劑。食用后很快會(huì)水解成氨基酸，不會(huì)改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群以及產(chǎn)生如其它抗菌素所出現(xiàn)的抗性問題，是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑?，F(xiàn)己廣泛應(yīng)用于乳制品、罐頭制品、魚類制品和酒精飲料中。

但是在食品中直接使用乳酸鏈球菌素，其生物活性容易減少，因?yàn)槿樗徭溓蚓貢?huì)與食品中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合?，F(xiàn)在的研究熱點(diǎn)是利用食品生物聚合物進(jìn)行封裝來克服乳酸鏈球菌素直接使用的缺陷，因生物聚合物具有生物可降解性、生物相容性及便宜易得等特點(diǎn)。γ-聚谷氨酸和殼聚糖是生物聚合物的兩個(gè)代表。

γ-聚谷氨酸(γ-pga)在國際化妝品藥典上的命名為納豆膠。聚谷氨酸是芽孢桿菌屬產(chǎn)生的帶負(fù)電的多聚氨基酸，其結(jié)構(gòu)是由d型和l型谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基以肽鍵形式形成的聚合物。γ-聚谷氨酸具有良好的水溶性、對(duì)金屬離子的超強(qiáng)吸附性和生物可降解性，在體內(nèi)會(huì)降解為無毒的短肽和氨基酸單體，是一種環(huán)保型高分子材料?？勺鳛楸Ｋ畡⒅亟饘匐x子吸附劑以及藥物載體等，在化妝品、食品及醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)均有很大的使用價(jià)值。

而殼聚糖是由幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的帶正電荷的天然堿性多糖，因其具有廣譜殺菌活性而在食品工業(yè)中備受關(guān)注。殼聚糖可溶于稀酸、甲酸及乙酸中，但不溶于水和絕大多數(shù)有機(jī)溶劑。殼聚糖無毒、無害，因其安全性、微生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)而被各行各業(yè)廣泛使用。殼聚糖被用作增稠劑、被膜劑列入國家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)gb-2760。殼聚糖帶有正電，利用此特點(diǎn)在液態(tài)介質(zhì)中與帶有負(fù)電荷的γ-聚谷氨酸交聯(lián)制備殼聚糖納米粒子?？梢詫⒁恍╆栯x子分子，例如乳酸鏈球菌素包封在納米粒子之中。

然而，納米粒子直接在食品表面噴灑時(shí)很容易出現(xiàn)聚集和下降現(xiàn)象，降低了封裝物質(zhì)的生物活性。因此可以將殼聚糖納米顆粒載入到納米纖維中，從而納米顆粒被固定在纖維膜上。靜電紡絲是目前可以連續(xù)制備納米纖維且操作方式較溫和的方式，其制備的納米纖維膜具有比表面積大、納米級(jí)孔隙及活性化合物的高封裝性等優(yōu)點(diǎn)。許多聚合物如聚環(huán)氧乙烷、聚乳酸和聚乙烯醇因其優(yōu)良的性能已被廣泛用于制備納米纖維膜。

國內(nèi)有很多關(guān)于殼聚糖和靜電紡絲的專利申請(qǐng)：中國專利cn103706335a公開了一種鐵/殼聚糖/聚氧化乙烯復(fù)合納米纖維膜除砷材料及其靜電紡絲制備方法；中國專利cn103467772a公開了一種殼聚糖/γ-聚谷氨酸聚電解質(zhì)海綿及制備方法及用途；中國專利cn105713244a公開了一種去除水中金屬離子的聚谷氨酸-殼聚糖凝膠的制備方法；中國專利cn103041714a公開了一種改性殼聚糖復(fù)合靜電紡絲納米纖維的復(fù)合超濾及其制備方法；中國專利cn102776709a公開了一種靜電紡絲制備聚乙烯吡咯烷酮/殼聚糖復(fù)合納米纖維膜。

將負(fù)載乳酸鏈球菌素的殼聚糖納米粒子與靜電紡絲相結(jié)合，研究實(shí)驗(yàn)原料配方及其工藝參數(shù)，對(duì)于開發(fā)新型的食品活性包裝具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜的制備方法和用途，通過將乳酸鏈球菌素與γ-聚谷氨酸交聯(lián)，隨后加入殼聚糖，使其與γ-聚谷氨酸交聯(lián)制備得到負(fù)載乳酸鏈球菌素的γ-聚谷氨酸/殼聚糖納米粒子，以減少乳酸鏈球菌素使用過程中生物活性的減少。然后將負(fù)載乳酸鏈球菌素的γ-聚谷氨酸/殼聚糖納米粒子添加到靜電紡絲溶液中制備成納米纖維膜，提高殼聚糖納米粒子的穩(wěn)定性，達(dá)到長(zhǎng)效抗菌與高效利用的目的。

本發(fā)明由殼聚糖，γ-聚谷氨酸，乳酸鏈球菌素，聚環(huán)氧乙烯制成負(fù)載乳酸鏈球菌素的納米纖維抗菌膜。

納米纖維抗菌膜的制備方法，包括以下步驟：

(1)自組裝的負(fù)載乳酸鏈球菌素的γ-聚谷氨酸/殼聚糖納米粒子溶液的制備：將殼聚糖溶解乙酸溶液中，常溫下攪拌均勻后用去離子水將其稀釋制得殼聚糖溶液；分別制備乳酸鏈球菌素溶液和γ-聚谷氨酸溶液，將乳酸鏈球菌素溶液緩慢加入到等體積的γ-聚谷氨酸溶液中，第一次磁力攪拌后得到乳酸鏈球菌素/γ-聚谷氨酸納米顆粒溶液；隨后將乳酸鏈球菌素/γ-聚谷氨酸納米顆粒溶液逐滴加到等體積的殼聚糖溶液中，第二次磁力攪拌后用naoh溶液調(diào)節(jié)ph至6，隨后通過離心機(jī)離心后獲得自組裝的負(fù)載乳酸鏈球菌素的γ-聚谷氨酸/殼聚糖納米粒子，并溶解于與離心前使用的去離子水等體積的去離子水中，制得自組裝的負(fù)載乳酸鏈球菌素的γ-聚谷氨酸/殼聚糖納米粒子溶液，4℃保藏。

所述乙酸溶液中乙酸的體積百分濃度為1％。

所述稀釋后的殼聚糖溶液濃度為2mg/ml。

所述殼聚糖的脫乙酰度為80.0～95.0。

所述乳酸鏈球菌素溶液的濃度為20mg/ml，γ-聚谷氨酸溶液的濃度為2mg/ml。

所述naoh溶液的濃度為2mol/l。

所述常溫下攪拌的時(shí)間為10min；第一次磁力攪拌的時(shí)間為30min；第二次磁力攪拌的時(shí)間為12h；離心機(jī)離心的時(shí)間為40min。

(2)納米纖維抗菌膜的制備方法：在步驟(1)中制得的自組裝的負(fù)載乳酸鏈球菌素的γ-聚谷氨酸/殼聚糖納米粒子溶液中加入聚環(huán)氧乙烯制備得到6wt％(g/g)的聚環(huán)氧乙烯靜電紡絲溶液，常溫?cái)嚢柽^夜后超聲脫氣得到紡絲前驅(qū)體溶液，注射器吸取紡絲前驅(qū)體溶液進(jìn)行靜電紡絲，采用平板收集法，經(jīng)3h后得到納米纖維抗菌膜。

所述超聲脫氣的時(shí)間為30min。

所述靜電紡絲電壓為5kv-30kv，推進(jìn)速率為0.1-3ml/h，接收距離為10-20cm，空氣濕度控制在35％以下。

(4)所制納米纖維抗菌膜的應(yīng)用，其用于奶酪制品的保鮮，將經(jīng)冷等離子體處理后的納米纖維抗菌膜包封奶酪制品，有效延長(zhǎng)其保質(zhì)期。

(5)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，所用的材料殼聚糖、γ-聚谷氨酸及乳酸鏈球菌素生物相容性好，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。納米纖維抗菌膜可避免殼聚糖納米顆粒直接噴灑食品表面時(shí)出現(xiàn)的聚集和下降現(xiàn)象。將抗菌膜應(yīng)用于奶酪制品的保鮮可有效抑制致病微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)制品的保質(zhì)期。

附圖說明

表1乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子的表征。

圖1聚環(huán)氧乙烯纖維膜和乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜。

圖2乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜的抑菌圈圖。

圖3乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜的抗菌效果圖。

圖4乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜在奶酪中的實(shí)際應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

通過下面實(shí)例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容，不僅局限于此。

實(shí)施例1乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子的表征

1實(shí)驗(yàn)材料

2實(shí)驗(yàn)方法

1)乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子的制備與表征

①吸取500μl乙酸加入去離子水配成50ml的1％(v/v)的乙酸溶液，磁力攪拌20min。

②稱取200mg殼聚糖加入到上述乙酸溶液中配制成4mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌30min，然后吸取25ml殼聚糖溶液加25ml去離子水稀釋。

③稱取50mg的γ-聚谷氨酸加到25ml去離子水中，攪拌10min。

④稱取500mg的乳酸鏈球菌素加到到25ml去離子水中，攪拌15min。

⑤將乳酸鏈球菌素溶液(20mg/ml)滴加到γ-聚谷氨酸溶液(2mg/ml)中，攪拌30min。

⑥將50ml的上述溶液逐滴加到50ml的殼聚糖溶液(2mg/ml)中，攪拌12h。

⑦攪拌完成后用2mol/l的naoh調(diào)節(jié)ph至6。

⑧通過離心機(jī)(9659×g)離心40min后獲得自組裝的乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子，并重懸于99.75ml去離子水中，并保藏與4℃冰箱。

2)包封率的測(cè)定

將制備得到的殼聚糖納米粒子的溶液通過離心機(jī)(9659×g)離心40min獲得上清溶液，按法國微量蛋白檢測(cè)試劑盒的要求配制工作液，在空白孔中加10μl雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)孔中加10μl標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定孔中加10μl上清液，隨后三孔中分別加250μl工作液混合，37℃孵育30min后用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算出未包封的乳酸鏈球菌素的含量，由此可以計(jì)算出乳酸鏈球菌素的包封率。則：

3)粒徑、多分散系數(shù)(pdi)值及zeta電位的測(cè)定

用美國布魯克海文儀器公司產(chǎn)的，型號(hào)為bi-9000的高濃度激光粒度儀測(cè)定殼聚糖納米粒子的粒徑、多分散系數(shù)(pdi)值和zeta電位，所測(cè)樣品放入樣品池直接測(cè)量即可。

4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子的表征

由表1可看出，乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子包封率為49.3％，包封效果較好。多分散系數(shù)(pdi)直接反映納米粒子的穩(wěn)定性，因此是主要參考指標(biāo)，pdi＜0.3較好，當(dāng)pdi>0.8時(shí)，不予考慮。空白殼聚糖納米粒子的粒徑為228.3nm、pdi為0.134，乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子的粒徑為412.1nm、pdi為0.196，粒徑明顯變大。zeta電位也可以直接反映乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子的穩(wěn)定性，因此也是主要參考指標(biāo)，zeta電位的絕對(duì)值越大說明脂質(zhì)體越穩(wěn)定性，zeta電位的絕對(duì)值在0～30范圍內(nèi)屬于不穩(wěn)定，在大于30時(shí)脂質(zhì)體較穩(wěn)定性。如表1所示，空白殼聚糖納米粒子的zeta電位為35.8mv，負(fù)載乳酸鏈球菌素的殼聚糖納米粒子的zeta電位為46.1mv，兩種殼聚糖納米粒子都較穩(wěn)定。

實(shí)施例2乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜的表征

1實(shí)驗(yàn)材料

聚環(huán)氧乙烯sigma-aldrich

實(shí)施例1殼聚糖納米粒子

2實(shí)驗(yàn)方法

1)乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜的制備

①將離心得到的殼聚糖納米粒子溶解于99.75ml去離子水中。

②稱取600mg的聚環(huán)氧乙烯慢慢加入到9.4g的殼聚糖納米粒子溶液中攪拌過夜，制備得到6wt％(g/g)的聚環(huán)氧乙烯紡絲前驅(qū)體溶液。

③注射器吸取5ml紡絲前驅(qū)體溶液，靜電紡絲電壓為20kv，推進(jìn)速率為0.6ml/h，接收距離為15.5cm，空氣濕度控制在35％以下，采用平板收集法，經(jīng)3h后得到納米纖維膜。

④按紡絲步驟，不加殼聚糖納米粒子溶液，稱取600mg的聚環(huán)氧乙烯慢慢加入到9.4g的去離子水中攪拌過夜，然后紡絲可得到空白聚環(huán)氧乙烯纖維膜；稱取500mg的乳酸鏈球菌素溶于99.75ml去離子水中，攪拌均勻，隨后稱取600mg的聚環(huán)氧乙烯慢慢加入到9.4g的上述溶液中攪拌過夜，紡絲可得到乳酸鏈球菌素抗菌膜。

2)sem觀察靜電紡絲纖維膜

使用jsm-7001f掃描電子顯微鏡檢查納米纖維膜的形態(tài)。在真空下用au/pd混合物濺射不同的樣品，且所有的sem實(shí)驗(yàn)在30kv下進(jìn)行。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

掃描電鏡圖如圖1所示，聚環(huán)氧乙烯纖維膜表面光滑，而乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子纖維膜有明顯的突起，表明殼聚糖納米粒子被包裹其中。

實(shí)施例3乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜的抑菌圈實(shí)驗(yàn)

1實(shí)驗(yàn)材料

聚環(huán)氧乙烯纖維膜；乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜

李斯特菌

2實(shí)驗(yàn)方法

1)制備菌液

接種李斯特菌于pyg液體培養(yǎng)基中,置于空氣搖床中，在37℃、140rpm的條件下震蕩培養(yǎng)24h，獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液。振蕩器混勻后用0.03mol/l磷酸鹽緩沖液10倍梯度稀釋10000倍(約為10⁴cfu/ml)。

2)靜電紡絲纖維膜處理

按照實(shí)施例1和2制備乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜和聚環(huán)氧乙烯纖維膜，烘箱干燥4h。將膜切成1cm×1cm的規(guī)格并放置于紫外燈下滅菌處理1h以備用。

3)抑菌圈實(shí)驗(yàn)

將滅菌后的聚環(huán)氧乙烯膜和抗菌膜經(jīng)冷等離子體500w處理4min，用移液槍吸取100μl的李斯特菌液(約為10⁴cfu/ml)涂布于pyg固體培養(yǎng)基上。20min后將制備的空白纖維膜和抗菌膜無菌操作放置于固體培養(yǎng)基中心處，恒溫培養(yǎng)箱37℃正置培養(yǎng)48h后觀察抑菌圈。

4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抑菌圈實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖2所示，空白組沒有明顯的抑制區(qū)，乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜有較大的抑制區(qū)(直徑26-41mm)。結(jié)果表明，乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜表現(xiàn)出明顯的李斯特菌抗菌活性。

實(shí)施例4乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜抗李斯特菌活性測(cè)定

1實(shí)驗(yàn)材料

聚環(huán)氧乙烯纖維膜；乳酸鏈球菌素抗菌膜；乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜

李斯特菌

2實(shí)驗(yàn)方法

1)靜電紡絲纖維膜處理

按照實(shí)施例1和2制備聚環(huán)氧乙烯纖維膜、乳酸鏈球菌素抗菌膜和乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜，烘箱干燥4h。將膜切成2cm×2cm的規(guī)格并放置于紫外燈下滅菌處理1h以備用。

2)實(shí)驗(yàn)測(cè)定

將滅菌后的聚環(huán)氧乙烯纖維膜、乳酸鏈球菌素抗菌膜和乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜經(jīng)冷等離子體500w處理4min。50ml的離心管中加入15ml磷酸鹽緩沖液滅菌處理，將三種纖維膜分別置于含有李斯特菌(約為10⁵cfu/ml)的磷酸鹽緩沖液中，離心管置于37℃的空氣搖床中震蕩反應(yīng)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定，每隔24h后取適量培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋到合適的濃度，然后移取100μl稀釋液滴到固體培養(yǎng)基上，涂布均勻之后放入37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。24h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，從而對(duì)殼聚糖納米粒子抗菌膜的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)一式三份，結(jié)果取平均值。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3清晰可知，乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜對(duì)李斯特菌具有較好的抗菌活性。而且乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜具有明顯的緩釋作用，且比單紡乳酸鏈球菌素的效果要好。

實(shí)施例5乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜在奶酪中的實(shí)際應(yīng)用

1實(shí)驗(yàn)材料

聚環(huán)氧乙烯纖維膜；乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜

李斯特菌、奶酪(切成切成30×25×5mm大小)

2實(shí)驗(yàn)方法

1)靜電紡絲纖維膜處理

按照實(shí)施例1和2制備乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜和聚環(huán)氧乙烯纖維膜，烘箱干燥4h，放置于紫外燈下滅菌處理1h以備用。

2)實(shí)驗(yàn)測(cè)定

將滅菌后的聚環(huán)氧乙烯纖維膜膜和抗菌膜經(jīng)冷等離子體500w處理4min。用李斯特菌(約10³cfu/ml)接種奶酪樣品，在無菌條件下保持20min后，用聚環(huán)氧乙烯纖維膜膜和抗菌膜包裝接種的奶酪樣品，將樣品在4℃下儲(chǔ)存。采用李斯特菌顯色培養(yǎng)基通過平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定，每隔72h后取出奶酪試樣后于無菌環(huán)境下晾干，再轉(zhuǎn)移到無菌均質(zhì)袋中，并向裝有奶酪試樣的無菌均質(zhì)袋中加入9倍的磷酸緩沖液均質(zhì)。吸取上清液測(cè)定奶酪試樣中的李斯特菌數(shù)，從而對(duì)抗菌膜的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)一式三份，結(jié)果取平均值。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4清晰可知乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜對(duì)奶酪中的李斯特菌具有較好的抗菌活性。而且從時(shí)間上可以看出，乳酸鏈球菌素/殼聚糖納米粒子抗菌膜具有明顯的緩釋作用，從而保證乳酸鏈球菌素能夠發(fā)揮長(zhǎng)效的抗菌活性以及更好的殺菌效果。