本發(fā)明屬于植物多酚提取
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法。
背景技術(shù)：
：：藍(lán)莓，英文名稱：Blueberry，意為藍(lán)色漿果，屬杜鵑花科，越橘屬植物，果實(shí)呈深藍(lán)色，披白霜，近圓形，果肉細(xì)膩，果昧酸甜。藍(lán)莓果實(shí)中含有豐富的營養(yǎng)成分，具有防止腦神經(jīng)老化、保護(hù)視力、強(qiáng)心、抗癌、軟化血管、增強(qiáng)人機(jī)體免疫等功能，營養(yǎng)成分高，被譽(yù)為“黃金漿果”，是世界糧農(nóng)組織推薦的五大健康水果之一。藍(lán)莓果實(shí)中除了常規(guī)的糖、酸和維生素C外，富含維生素E、維生素A、維生素B、超氧化物歧化酶(SOD)、熊果苷、蛋白質(zhì)、花青苷、食用纖維以及豐富的鉀、鐵、鋅、鈣等礦物質(zhì)元素，維生素都高于其他水果，花青素、微量元素也很高，屬高氨基酸，高銅，高鋅，高鐵的果品。藍(lán)莓果實(shí)有極強(qiáng)的藥用價(jià)值及營養(yǎng)保健功能，藍(lán)莓能有效降低膽固醇，防止動(dòng)脈粥樣硬化，促進(jìn)心血管健康；有增強(qiáng)心臟功能、預(yù)防癌癥和心臟病的功效，能防止腦神經(jīng)衰老、增強(qiáng)腦力；可以強(qiáng)化視力，減輕眼球疲勞。此外，藍(lán)莓還可以治療一般的傷風(fēng)感冒、咽喉疼痛以及腹瀉等癥。此外，研究證明:藍(lán)莓具有抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用，這些作用主要是由高含量的多酚所介導(dǎo)的。1981年，Haslam首次提出植物多酚這一術(shù)語，它將多酚分為單寧及其相關(guān)化合物(如單寧的前體化合物和聚合化合物)和聚黃烷醇類(含縮合單寧和相關(guān)化合物)兩大基本類型。多酚是植物體內(nèi)復(fù)雜的酚類次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚結(jié)構(gòu)，主要存在于植物的皮、根、葉、殼及果肉中，具有抗氧化、清除自由基等功能。有關(guān)多酚的分類方法有很多種，類黃酮、花青素、酚酸等都屬于多酚。近幾年，國外學(xué)者根據(jù)多酚結(jié)合方式和萃取方法的不同，將其分為可萃取多酚(extractablepolyphenols，EPP)和不可萃取多酚(non-extractablepolyphenols，NEPP)，所謂可萃取多酚主要是指通過簡單的有機(jī)溶劑萃取或水就可以獲得的處于游離狀態(tài)的多酚，不可萃取多酚主要是指結(jié)合于細(xì)胞壁上的一些水合單寧酸和原花青素，需通過化學(xué)或者酶處理等方法，打破多酚物質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)合的化學(xué)鍵，才將其分離出來的部分。目前對植物多酚的研究主要集中在EPP，而很少關(guān)注NEPP。如果考慮NEPP，水果中有益多酚如原花青素、鞣花酸、兒茶酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們的估計(jì)。目前這些NEPP一直不被列為食物的營養(yǎng)組成，實(shí)際上這些NEPP是食物中具有生物活性的成分，可被結(jié)腸中細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對人體十分有益。藍(lán)莓中含有較高的NEPP，由于萃取過程的限制，不可提取多酚被研究人員忽視；并且藍(lán)莓中的NEPP和膳食纖維蛋白綴合，使其提取難度增大。目前關(guān)于提取藍(lán)莓中NEPP大多采用物理輔助方法進(jìn)行提取，提取方法處理步驟較多，提取效率較低，提取出的NEPP活性較低。有鑒于此，有必要提出一種藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種方法溫和、操作步驟簡單、提取率高、提取出的不可萃取多酚活性高、對環(huán)境污染小的提取藍(lán)莓中不可萃取多酚的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，所采用的技術(shù)方案是：藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)制備藍(lán)莓渣：收集藍(lán)莓榨汁后的殘?jiān)⒃诔叵赂稍铮盟{(lán)莓渣；(2)制備藍(lán)莓渣粉末：粉碎藍(lán)莓渣，得藍(lán)莓渣粉末；(3)酸溶液浸泡：將藍(lán)莓渣粉末浸泡在酸溶液中，其料液比是1g:100-120ml，浸泡11.5-12.5小時(shí)，浸泡溫度為3-5℃，得酸性浸泡液；(4)堿溶液浸泡：向酸性浸泡液中加入堿溶液，至浸泡液中氫氧根離子濃度為0.45-0.55mol/L，浸泡2.5-3.5小時(shí)，浸泡溫度為3-5℃，得堿性浸泡液；(5)酶解：向堿性浸泡液中滴加酸溶液，至pH值為3.7-3.8；再加入纖維素酶、果膠酶，至維素酶濃度為2-3U/ml，果膠酶濃度為50-55U/ml，進(jìn)行酶解處理，酶解11.5-12.5小時(shí)，酶解溫度為38-42℃，得酶解溶液；(6)離心：將酶解溶液離心10-20min，轉(zhuǎn)速為7000-9000rpm，保留上清液；(7)萃?。河幂腿┹腿∩锨逡海o置分層后，上層為油相，下層為水相，收集水相；(8)收集提取物：蒸干水相，收集粉末，得所述不可萃取多酚。進(jìn)一步的，所述步驟(2)中藍(lán)莓渣粉末過80-120目的篩子；所述步驟(3)中酸溶液是氫離子濃度為0.5-0.6mol/L的酸溶液；所述步驟(5)中滴加的酸溶液是氫離子濃度為3-5mol/L的酸溶液。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(3)中酸溶液為鹽酸溶液；所述步驟(4)中加入的堿溶液為氫氧化鈉溶液；所述步驟(5)中滴加的酸溶液為鹽酸溶液。再進(jìn)一步優(yōu)選的，所述氫氧化鈉溶液為飽和氫氧化鈉溶液。進(jìn)一步的，所述步驟(7)中上清液與萃取劑的體積比為1:4-5。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述萃取劑是乙酸乙酯和乙醇混合液。再進(jìn)一步優(yōu)選的，所述乙酸乙酯和乙醇混合液是體積比為1:3-4的乙酸乙酯和乙醇混合液。進(jìn)一步的，所述步驟(8)中蒸干水相采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法。進(jìn)一步的，所述真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為70-75℃，真空度為0.01-0.09MPa。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：1、本發(fā)明所提供的提取方法，操作步驟簡單，可以在同一容器中進(jìn)行，無需反復(fù)收集提取物。2、本發(fā)明采用弱濃度酸堿對物料進(jìn)行處理，并利用乙酸乙酯和乙醇混合液萃取，方法溫和，可以最大限度的保留不可萃取多酚的生物活性，使不可萃取多酚清除自由基的能力較強(qiáng)，并且提高了提取率。3、本發(fā)明采用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液來浸提藍(lán)莓渣，鹽酸和氫氧化鈉反應(yīng)生成的是水和氯化鈉，不影響整體的操作過程，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的絕大多數(shù)物質(zhì)是多酚。采用其他的酸堿，需要用大孔吸附樹脂柱子，才可以減少無機(jī)鹽類及強(qiáng)離子、低分子化合物存在的影響，以達(dá)到分離、純化、除雜的目的。4、本發(fā)明的提取過程中用弱酸弱堿溶液，對環(huán)境污染十分小，有利于工業(yè)化生產(chǎn)與推廣。具體實(shí)施方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，達(dá)到預(yù)期發(fā)明目的，以下結(jié)合較佳實(shí)施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，其具體實(shí)施方式、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。在下述說明中，不同的“一實(shí)施例”或“實(shí)施例”指的不一定是同一實(shí)施例。此外，一或多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。在詳細(xì)闡述本發(fā)明藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法之前，有必要對本發(fā)明中提及的相關(guān)材料和實(shí)驗(yàn)儀器，以及名詞做進(jìn)一步說明，以達(dá)到更好的效果。本發(fā)明中采用的材料為：纖維素酶：纖維素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，是一種復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶。作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產(chǎn)物。本發(fā)明采用的是活力為10u/mg的纖維素酶。果膠酶：果膠酶由黑曲霉經(jīng)發(fā)酵精制而得。外觀呈淺黃色粉末狀。果膠酶主要用于果蔬汁飲料及果酒的榨汁及澄清，對分解果膠具有良好的作用。果膠酶是一種生物酶，作用是促進(jìn)果膠水解，常用于高中生物中植物體細(xì)胞雜交的去除細(xì)胞壁的過程。本發(fā)明采用的是活力為500u/mg的果膠酶。膠頭滴管又稱膠帽滴管，它是用于吸取或滴加少量液體試劑的一種儀器。移液管，用來準(zhǔn)確移取一定體積的溶液的量器。移液管是一種量出式儀器，只用來測量它所放出溶液的體積。它是一根中間有一膨大部分的細(xì)長玻璃管。其下端為尖嘴狀，上端管頸處刻有一條標(biāo)線，是所移取的準(zhǔn)確體積的標(biāo)志。燒杯是一種常見的實(shí)驗(yàn)室玻璃器皿，通常由玻璃、塑料、或者耐熱玻璃制成。燒杯呈圓柱形，頂部的一側(cè)開有一個(gè)槽口，便于傾倒液體。本發(fā)明采用的是帶有刻度的玻璃燒杯。量筒(graduatedcylinder,measuringcylinderorgraduatedglass)是用來量取液體的一種玻璃儀器。量筒是量度液體體積的儀器。規(guī)格以所能量度的最大容量(ml)表示，常用的有10ml、25ml、50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml等。外壁刻度都是以ml為單位。電子秤，屬于衡器的一種，利用胡克定律或力的杠桿平衡原理測定物體質(zhì)量的工具。電子秤主要由承重系統(tǒng)(如秤盤、秤體)、傳力轉(zhuǎn)換系統(tǒng)(如杠桿傳力系統(tǒng)、傳感器)和示值系統(tǒng)(如刻度盤、電子顯示儀表)3部分組成。本發(fā)明采用的是精確到0.0001g的電子秤。離心機(jī)：利用離心機(jī)中轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開。即利用離心力，分離液體與固體顆粒或液體與液體的混合物中各組分的機(jī)械。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀又叫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，通過電子控制，使燒瓶在最適合速度下，恒速旋轉(zhuǎn)以增大蒸發(fā)面積。通過真空泵使蒸發(fā)燒瓶處于負(fù)壓狀態(tài)。蒸發(fā)燒瓶在旋轉(zhuǎn)同時(shí)置于水浴鍋中恒溫加熱，瓶內(nèi)溶液在負(fù)壓下在旋轉(zhuǎn)燒瓶內(nèi)進(jìn)行加熱擴(kuò)散蒸發(fā)。本發(fā)明采用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀主要由真空泵、選裝蒸發(fā)儀、冷卻泵三部分組成。酸溶液：酸溶液是指里面的溶質(zhì)一定要是酸，比如硫酸、硝酸。本發(fā)明采用的是鹽酸溶液。若采用硫酸溶液或硝酸溶液等，需要將離心后的上清液過大孔吸附樹脂柱子。堿溶液：溶質(zhì)一定是堿類物質(zhì),如氫氧化鈉溶液.氫氧化鈣溶液。本發(fā)明采用的是氫氧化鈉溶液。在了解上述相關(guān)材料和實(shí)驗(yàn)儀器后，下面將結(jié)合具體的實(shí)施例，對本發(fā)明藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法做進(jìn)一步的詳細(xì)介紹：實(shí)施例1.具體操作步驟如下：1、制備藍(lán)莓渣：收集藍(lán)莓榨汁后的殘?jiān)⒃诔叵赂稍?，得藍(lán)莓渣；2、制備藍(lán)莓渣粉末：粉碎藍(lán)莓渣，過80目的篩，得藍(lán)莓渣粉末；3、酸浸泡：將10g藍(lán)莓渣粉末放入2L的玻璃燒杯中，加入1000ml的0.5mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為12.5小時(shí)，浸泡溫度為3℃，得酸性浸泡液。4、堿浸泡：用量筒量取50ml飽和氫氧化鈉溶液，將其加入到酸性浸泡液中，繼續(xù)浸泡3.5小時(shí)，浸泡溫度為3℃，得堿性浸泡液。飽和氫氧化鈉的濃度為20mol/L，有20×50÷1000＝1mol的氫氧化鈉，與0.5mol的鹽酸反應(yīng)后，剩0.5mol的氫氧化鈉，同時(shí)生成0.5mol的水，溶液又增加9ml的體積，此時(shí)氫氧化鈉的濃度為0.5÷(1000+50+9)×1000＝0.47mol/L。5、酶解：用膠頭滴管和移液管向堿性浸泡液中加入3mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，用pH計(jì)測pH值為3.7時(shí)，此時(shí)氫氧化鈉溶液加入量為158ml；再用電子秤稱取243.4mg的纖維素酶121.7mg的果膠酶，加入到溶液中進(jìn)行酶解處理，酶解時(shí)間為12.5小時(shí)，酶解溫度為38℃，得酶解溶液。纖維素酶的濃度為243.4×10÷(1000+50+9+158)＝2U/ml，纖維素酶的濃度為121.7×500÷(1000+50+9+158)＝50U/ml。滴加鹽酸溶液時(shí)，先用膠頭滴管滴加，待pH值接近4.2時(shí)再用量程為1ml的移液管滴加。6、離心：在常溫下，將酶解溶液用離心機(jī)離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為9000rpm，離心時(shí)間為10分鐘。離心完成后溶液會分層，上層為上清液，保留上清液。7、萃?。河皿w積比為1:3的乙酸乙酯和乙醇混合液萃取上清液，靜置分層后，上層為油相，下層為水相，收集水相。乙酸乙酯和乙醇混合液的用量為上清液體積的4倍。8、收集提取物：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)水相，溫度為70℃，真空度為0.01MPa，得不可萃取多酚粉末。不可萃取多酚溶于乙醇，乙醇更易溶于水，所以萃取完成后，水相里主要含有水、不可萃取多酚、乙醇，用減壓蒸餾的方法，除去水和乙醇，蒸干后得到不可萃取多酚粉末。本實(shí)施例的提取率取率為96.31％。通過清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)得知自由基清除率達(dá)到73.21％。本實(shí)施例所述的藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，本發(fā)明所提供的提取方法，操作步驟簡單，可以在同一容器中進(jìn)行，無需反復(fù)收集提取物；采用弱濃度酸堿對物料進(jìn)行處理，并利用乙酸乙酯和乙醇混合液萃取，方法溫和，可以最大限度的保留不可萃取多酚的生物活性，并且提高了提取率，對環(huán)境污染十分小。實(shí)施例2.具體操作步驟如下：1、制備藍(lán)莓渣：收集藍(lán)莓榨汁后的殘?jiān)?，并在常溫下干燥，得藍(lán)莓渣；2、制備藍(lán)莓渣粉末：粉碎藍(lán)莓渣，過120目的篩，得藍(lán)莓渣粉末；3、酸浸泡：將10g藍(lán)莓渣粉末放入2L的玻璃燒杯中，加入1200ml的0.6mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為11.5小時(shí)，浸泡溫度為5℃，得酸性浸泡液。4、堿浸泡：用量筒量取71ml飽和氫氧化鈉溶液，將其加入到酸性浸泡液中，繼續(xù)浸泡2.5小時(shí)，浸泡溫度為5℃，得堿性浸泡液。飽和氫氧化鈉的濃度為20mol/L，有20×71÷1000＝1.42mol的氫氧化鈉，與1.2×0.6＝0.72mol的鹽酸反應(yīng)后，剩0.7mol的氫氧化鈉，同時(shí)生成0.72mol的水，溶液又增加13ml的體積，此時(shí)氫氧化鈉的濃度為0.7÷(1200+71+13)×1000＝0.54mol/L。5、酶解：用膠頭滴管和移液管向堿性浸泡液加入3mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，用pH計(jì)測pH值為3.8時(shí)，此時(shí)氫氧化鈉溶液加入量為234ml；再用電子秤稱取455.4mg的纖維素酶166.9mg的果膠酶，加入到溶液中進(jìn)行酶解處理，酶解時(shí)間為11.5小時(shí)，酶解溫度為42℃，得酶解溶液。纖維素酶的濃度為455.4×10÷(1200+71+13+234)＝3U/ml，纖維素酶的濃度為166.9×500÷(1200+71+13+234)＝55U/ml。滴加鹽酸溶液時(shí)，先用膠頭滴管滴加，待pH值接近4.5時(shí)再用量程為1ml的移液管滴加。6、離心：在常溫下，將酶解溶液用離心機(jī)離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為7000rpm，離心時(shí)間為20分鐘。離心完成后溶液會分層，上層為上清液，保留上清液；7、萃?。河皿w積比為1:4的乙酸乙酯和乙醇混合液萃取上清液，靜置分層后，上層為油相，下層為水相，收集水相。乙酸乙酯和乙醇混合液的用量為上清液體積的5倍。8、收集提取物：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)水相，溫度為75℃，真空度為0.09MPa，得不可萃取多酚粉末。不可萃取多酚溶于乙醇，乙醇更易溶于水，所以萃取完成后，水相里主要含有水、不可萃取多酚、乙醇，用減壓蒸餾的方法，除去水和乙醇，蒸干后得到不可萃取多酚粉末。本實(shí)施例的提取率取率為96.34％。通過清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)得知自由基清除率達(dá)到73.25％。本實(shí)施例所述的藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，本發(fā)明所提供的提取方法，操作步驟簡單，可以在同一容器中進(jìn)行，無需反復(fù)收集提取物；采用弱濃度酸堿對物料進(jìn)行處理，并利用乙酸乙酯和乙醇混合液萃取，方法溫和，可以最大限度的保留不可萃取多酚的生物活性，并且提高了提取率，對環(huán)境污染十分小。實(shí)施例3.具體操作步驟如下：1、制備藍(lán)莓渣：收集藍(lán)莓榨汁后的殘?jiān)?，并在常溫下干燥，得藍(lán)莓渣；2、制備藍(lán)莓渣粉末：粉碎藍(lán)莓渣，過100目的篩，得藍(lán)莓渣粉末；3、酸浸泡：將10g藍(lán)莓渣粉末放入2L的玻璃燒杯中，加入1100ml的0.5mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為12小時(shí)，浸泡溫度為4℃，得酸性浸泡液。4、堿浸泡：用量筒量取54ml飽和氫氧化鈉溶液，將其加入到酸性浸泡液中，繼續(xù)浸泡3小時(shí)，浸泡溫度為4℃，得堿性浸泡液。飽和氫氧化鈉的濃度為20mol/L，有20×54÷1000＝1.08mol的氫氧化鈉，與0.55mol的鹽酸反應(yīng)后，剩0.53mol的氫氧化鈉，同時(shí)生成0.55mol的水，溶液又增加10ml的體積，此時(shí)氫氧化鈉的濃度為0.53÷(1000+54+10)×1000＝0.498mol/L。5、酶解：用膠頭滴管和移液管向堿性浸泡液中加入4mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，用pH計(jì)測pH值為3.8時(shí)，此時(shí)加入量為133ml；再用電子秤稱取259.4mg的纖維素酶129.7mg的果膠酶，加入到溶液中進(jìn)行酶解處理，酶解時(shí)間為12小時(shí)，酶解溫度為40℃，得酶解溶液。纖維素酶的濃度為259.4×10÷(1100+54+10+133)＝2U/ml，纖維素酶的濃度為129.7×500÷(1100+54+10+133)＝50U/ml。滴加鹽酸溶液時(shí)，先用膠頭滴管滴加，待pH值接近4.2時(shí)再用量程為1ml的移液管滴加。6、離心：在常溫下，將酶解溶液用離心機(jī)離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心時(shí)間為15分鐘。離心完成后溶液會分層，上層為上清液，保留上清液；7、萃?。河皿w積比為1:3的乙酸乙酯和乙醇混合液萃取上清液，靜置分層后，上層為油相，下層為水相，收集水相。乙酸乙酯和乙醇混合液的用量為上清液體積的4倍。8、收集提取物：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)水相，溫度為72℃，真空度為0.05MPa，得不可萃取多酚粉末。不可萃取多酚溶于乙醇，乙醇更易溶于水，所以萃取完成后，水相里主要含有水、不可萃取多酚、乙醇，用減壓蒸餾的方法，除去水和乙醇，蒸干后得到不可萃取多酚粉末。本實(shí)施例的提取率取率為96.41％。通過清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)得知自由基清除率達(dá)到73.31％。本實(shí)施例所述的藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，本發(fā)明所提供的提取方法，操作步驟簡單，可以在同一容器中進(jìn)行，無需反復(fù)收集提取物；采用弱濃度酸堿對物料進(jìn)行處理，并利用乙酸乙酯和乙醇混合液萃取，方法溫和，可以最大限度的保留不可萃取多酚的生物活性，并且提高了提取率，對環(huán)境污染十分小。實(shí)施例4.具體操作步驟如下：1、制備藍(lán)莓渣：收集藍(lán)莓榨汁后的殘?jiān)⒃诔叵赂稍?，得藍(lán)莓渣；2、制備藍(lán)莓渣粉末：粉碎藍(lán)莓渣，過90目的篩，得藍(lán)莓渣粉末；3、酸浸泡：將5g藍(lán)莓渣粉末放入1L的玻璃燒杯中，加入500ml的0.5mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為11.5小時(shí)，浸泡溫度為4℃，得酸性浸泡液。4、堿浸泡：用量筒量取25ml飽和氫氧化鈉溶液，將其加入到酸性浸泡液中，繼續(xù)浸泡3小時(shí)，浸泡溫度為5℃，得堿性浸泡液。飽和氫氧化鈉的濃度為20mol/L，有20×25÷1000＝0.5mol的氫氧化鈉，與0.25mol的鹽酸反應(yīng)后，剩0.25mol的氫氧化鈉，同時(shí)生成0.25mol的水，溶液又增加4.5ml的體積，此時(shí)氫氧化鈉的濃度為0.25÷(500+25+4.5)×1000＝0.47mol/L。5、酶解：用膠頭滴管和移液管用向堿性浸泡液中加入5mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，用pH計(jì)測pH值為3.8時(shí)，此時(shí)氫氧化鈉溶液加入量為50.1ml；再用電子秤稱取115.9mg的纖維素酶，58mg的果膠酶，加入到溶液中，進(jìn)行酶解處理，酶解時(shí)間為12小時(shí)，酶解溫度為39℃，得酶解溶液。纖維素酶的濃度為115.9×10÷(500+25+4.5+50.1)＝2U/ml，纖維素酶的濃度為58×500÷(500+25+4.5+50.1)＝50U/ml。滴加鹽酸溶液時(shí)，先用膠頭滴管滴加，待pH值接近4.2時(shí)再用量程為1ml的移液管滴加。6、離心：在常溫下，將酶解溶液用離心機(jī)離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心時(shí)間為14分鐘。離心完成后溶液會分層，上層為上清液，保留上清液；7、萃取：用體積比為1:4的乙酸乙酯和乙醇混合液萃取上清液，靜置分層后，上層為油相，下層為水相，收集水相。乙酸乙酯和乙醇混合液的用量為上清液體積的4倍。8、收集提取物：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)水相，溫度為73℃，真空度為0.06MPa，得不可萃取多酚粉末。不可萃取多酚溶于乙醇，乙醇更易溶于水，所以萃取完成后，水相里主要含有水、不可萃取多酚、乙醇，用減壓蒸餾的方法，除去水和乙醇，蒸干后得到不可萃取多酚粉末。本實(shí)施例的提取率取率為96.61％。通過清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)得知自由基清除率達(dá)到73.51％。本實(shí)施例所述的藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，本發(fā)明所提供的提取方法，操作步驟簡單，可以在同一容器中進(jìn)行，無需反復(fù)收集提取物；采用弱濃度酸堿對物料進(jìn)行處理，并利用乙酸乙酯和乙醇混合液萃取，方法溫和，可以最大限度的保留不可萃取多酚的生物活性，并且提高了提取率，對環(huán)境污染十分小。實(shí)施例5.具體操作步驟如下：1、制備藍(lán)莓渣：收集藍(lán)莓榨汁后的殘?jiān)?，并在常溫下干燥，得藍(lán)莓渣；2、制備藍(lán)莓渣粉末：粉碎藍(lán)莓渣，過110目的篩，得藍(lán)莓渣粉末；3、酸浸泡：將10g藍(lán)莓渣粉末放入2L的玻璃燒杯中，加入1000ml的0.5mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為12.5小時(shí)，浸泡溫度為5℃，得酸性浸泡液。4、堿浸泡：用量筒量取50ml飽和氫氧化鈉溶液，將其加入到酸性浸泡液中，繼續(xù)浸泡3小時(shí)，浸泡溫度為5℃，得堿性浸泡液。飽和氫氧化鈉的濃度為20mol/L，有20×50÷1000＝0.1mol的氫氧化鈉，與0.5mol的鹽酸反應(yīng)后，剩0.5mol的氫氧化鈉，同時(shí)生成0.5mol的水，溶液又增加9ml的體積，此時(shí)氫氧化鈉的濃度為0.5÷(1000+50+9)＝0.47mol/L。5、酶解：用膠頭滴管和移液管向堿性浸泡液中加入5mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，用pH計(jì)測pH值為3.7時(shí)，此時(shí)加入量為94.2ml；再用電子秤稱取230.7mg的纖維素酶，120mg的果膠酶，加入到溶液中進(jìn)行酶解處理，酶解時(shí)間為12小時(shí)，酶解溫度為41℃，得酶解溶液。纖維素酶的濃度為230.7×10÷(1000+50+9+94.2)＝2U/ml，纖維素酶的濃度為120×500÷(1000+50+9+94.2)＝52U/ml。滴加鹽酸溶液時(shí)，先用膠頭滴管滴加，待pH值接近4.2時(shí)再用量程為1ml的移液管滴加。6、離心：在常溫下，將酶解溶液用離心機(jī)離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為9000rpm，離心時(shí)間為14分鐘。離心完成后溶液會分層，上層為上清液，保留上清液；7、萃?。河皿w積比為1:3的乙酸乙酯和乙醇混合液萃取上清液，靜置分層后，上層為油相，下層為水相，收集水相。乙酸乙酯和乙醇混合液的用量為上清液體積的5倍。8、收集提取物：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)水相，溫度為72℃，真空度為0.06MPa，得不可萃取多酚粉末。不可萃取多酚溶于乙醇，乙醇更易溶于水，所以萃取完成后，水相里主要含有水、不可萃取多酚、乙醇，用減壓蒸餾的方法，除去水和乙醇，蒸干后得到不可萃取多酚粉末。本實(shí)施例的提取率取率為96.11％。通過清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)得知自由基清除率達(dá)到74.21％。本實(shí)施例所述的藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，本發(fā)明所提供的提取方法，操作步驟簡單，可以在同一容器中進(jìn)行，無需反復(fù)收集提取物；采用弱濃度酸堿對物料進(jìn)行處理，并利用乙酸乙酯和乙醇混合液萃取，方法溫和，可以最大限度的保留不可萃取多酚的生物活性，并且提高了提取率，對環(huán)境污染十分小。實(shí)施例6.具體操作步驟如下：1、制備藍(lán)莓渣：收集藍(lán)莓榨汁后的殘?jiān)⒃诔叵赂稍?，得藍(lán)莓渣；2、制備藍(lán)莓渣粉末：粉碎藍(lán)莓渣，過100目的篩，得藍(lán)莓渣粉末；3、酸浸泡：將10g藍(lán)莓渣粉末放入2L的玻璃燒杯中，加入1100ml的0.5mol/L的硝酸溶液進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為12小時(shí)，浸泡溫度為4℃，得酸性浸泡液。4、堿浸泡：用量筒量取115ml飽和氫氧化鉀溶液，將其加入到酸性浸泡液中，繼續(xù)浸泡3小時(shí)，浸泡溫度為4℃，得堿性浸泡液。飽和氫氧化鉀的濃度為9.37mol/L，有9.37×115÷1000＝1.08mol的氫氧化鉀，與0.55mol的硝酸反應(yīng)后，剩0.53mol的氫氧化鉀，同時(shí)生成0.55mol的水，溶液又增加10ml的體積，此時(shí)氫氧化鉀的濃度為0.53÷(1000+115+10)×1000＝0.47mol/L。5、酶解：用膠頭滴管和移液管向堿性浸泡液中加入4mol/L的硝酸溶液調(diào)節(jié)pH值，用pH計(jì)測pH值為3.8時(shí)，此時(shí)加入量為130ml；再用電子秤稱取271mg的纖維素酶135.5mg的果膠酶，加入到溶液中進(jìn)行酶解處理，酶解時(shí)間為12小時(shí)，酶解溫度為40℃，得酶解溶液。纖維素酶的濃度為271×10÷(1100+115+10+130)＝2U/ml，纖維素酶的濃度為135.5×500÷(1100+115+10+130)＝50U/ml。滴加硝酸溶液時(shí)，先用膠頭滴管滴加，待pH值接近4.2時(shí)再用量程為1ml的移液管滴加。6、離心：在常溫下，將酶解溶液用離心機(jī)離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心時(shí)間為15分鐘。離心完成后溶液會分層，上層為上清液，保留上清液；7、將上清液通過大孔吸附樹脂柱子上吸附1h后，收集吸附后的上清液；8、萃?。河皿w積比為1:3的乙酸乙酯和乙醇混合液萃取上清液，靜置分層后，上層為油相，下層為水相，收集水相。乙酸乙酯和乙醇混合液的用量為上清液體積的4倍。9、收集提取物：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)水相，溫度為72℃，真空度為0.05MPa，得不可萃取多酚粉末。不可萃取多酚溶于乙醇，乙醇更易溶于水，所以萃取完成后，水相里主要含有水、不可萃取多酚、乙醇，用減壓蒸餾的方法，除去水和乙醇，蒸干后得到不可萃取多酚粉末。本實(shí)施例的提取率取率為95.41％。通過清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)得知自由基清除率達(dá)到71.31％。本實(shí)施例所述的藍(lán)莓中不可萃取多酚的提取方法，本發(fā)明所提供的提取方法，操作步驟簡單，可以在同一容器中進(jìn)行，無需反復(fù)收集提取物；采用弱濃度酸堿對物料進(jìn)行處理，并利用乙酸乙酯和乙醇混合液萃取，方法溫和，可以最大限度的保留不可萃取多酚的生物活性，并且提高了提取率，對環(huán)境污染十分小。以上所述，僅是本發(fā)明實(shí)施例的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明實(shí)施例作任何形式上的限制，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3