本發(fā)明涉及毛皮動(dòng)物微生態(tài)制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毛皮動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)在養(yǎng)殖毛皮動(dòng)物過(guò)程中長(zhǎng)期在飼料中添加抗生素，再加上不注重養(yǎng)殖環(huán)境的控制，造成污染嚴(yán)重，不能使毛皮動(dòng)物完全抵御病菌、病毒的侵染，使毛皮動(dòng)物長(zhǎng)期處于亞健康狀態(tài)。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，復(fù)合微生態(tài)制劑具有動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)的作用。具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、提高飼料轉(zhuǎn)化率、提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、提高抗病菌和抗病毒的能力。
目前現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)毛皮動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑的研究比較鮮見(jiàn)，如能研究一種復(fù)合微生態(tài)制劑，并將它用于養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖場(chǎng)長(zhǎng)期使用復(fù)合微生態(tài)制劑將進(jìn)一步提高毛皮動(dòng)物的免疫力，提高產(chǎn)品品質(zhì)，取代抗生素防病、治病，減少獸藥殘留，無(wú)疑將增強(qiáng)我國(guó)毛皮動(dòng)物的國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，增加農(nóng)民收入水平。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種毛皮動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，在原料的選取上，選用多種菌和纖維素酶復(fù)配而成，該復(fù)合微生態(tài)制劑在治療細(xì)菌性、病毒性疾病的同時(shí)還能提高毛皮動(dòng)物機(jī)體免疫力。
其技術(shù)解決方案包括：
一種毛皮動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，依次包括以下步驟：
a活化保存斜面菌種，用LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶，在pH為7-7.5、100-130℃高壓滅菌一段時(shí)間、在一定的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間；
b對(duì)步驟a培養(yǎng)得到的酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶分別進(jìn)行一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)；
c對(duì)步驟b一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)后的酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶接著分別進(jìn)行二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)；
d將二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的酵母菌液、乳酸菌液、白腐菌液、枯草芽孢桿菌液、雙歧桿菌液、霉菌液和纖維素酶液按照重量比2:2:2:1:1:1:2混合，即得復(fù)合微生態(tài)制劑。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，步驟a中，高壓滅菌時(shí)間為20-40分鐘，培養(yǎng)溫度為30-38℃，培養(yǎng)時(shí)間為12-20小時(shí)。
作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案，步驟b和步驟c中的接種量均為10％-20％。
本發(fā)明所帶來(lái)的有益技術(shù)效果：
在原料的選取上，本發(fā)明選取酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶為原料，并將這幾種原料二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的菌液按照一定配比2:2:2:1:1:1:2混合制備得到復(fù)合微生態(tài)制劑，所得復(fù)合微生態(tài)制劑可以起到治養(yǎng)同步的目的，在治療細(xì)菌性、病毒性疾病的同時(shí)提高毛皮動(dòng)物機(jī)體免疫力；可在一定范圍內(nèi)代替抗生素和化學(xué)抗病藥物，達(dá)到真正的綠色生態(tài)養(yǎng)殖。
下面結(jié)合試驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明復(fù)合微生態(tài)制劑的安全性與治病防病效果。
本發(fā)明復(fù)合微生態(tài)制劑在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)大鼠急性毒性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組為50只大鼠，按0.6ml/10g體重飼喂21天；空白對(duì)照組為50只大鼠，按照常規(guī)飼養(yǎng)。
結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組大鼠全部存活,活動(dòng)自如,毛發(fā)光滑,飲食正常,呼吸道、眼及口腔等處無(wú)分泌物外，未發(fā)現(xiàn)任何中毒癥狀，體重均有增加。與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的大鼠體重明顯增加(P＜0.001)。21天觀察期結(jié)束，將大鼠脫臼處死解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、小腸等臟器均未見(jiàn)明顯異常表現(xiàn)。另外，大鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠脾臟系數(shù)明顯增加(P＜0.01)，提示本發(fā)明的復(fù)合微生態(tài)制劑具有免疫增強(qiáng)作用，屬實(shí)際無(wú)毒類物質(zhì)，安全度大。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提出了一種毛皮動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，為了使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)、技術(shù)方案更加清楚、明確，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。
首先，本發(fā)明中LB培養(yǎng)基的配方如下:
胰蛋白胨(Tryptone)10g/L
酵母提取物(Yeast extract)5g/L
氯化鈉(NaCl)10g/L。
實(shí)施例1：
復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法包括如下步驟：
(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌20分鐘，在38℃培養(yǎng)12小時(shí)；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；
(4)將酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶發(fā)酵液按以下配比混合：酵母菌20份、乳酸菌20份、白腐菌20份、枯草芽孢桿菌10份、雙歧桿菌10份、霉菌10份和纖維素酶20份。無(wú)菌裝罐，包裝得到復(fù)合微生態(tài)制劑。
實(shí)施例2：
復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法包括如下步驟：
(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌40分鐘，在30℃培養(yǎng)15小時(shí)；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；
(4)將酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶發(fā)酵液按以下配比混合：酵母菌30份、乳酸菌30份、白腐菌30份、枯草芽孢桿菌15份、雙歧桿菌15份、霉菌15份和纖維素酶30份。無(wú)菌裝罐，包裝得到復(fù)合微生態(tài)制劑。
實(shí)施例3：
復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法包括以下步驟：
(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌30分鐘，在35℃培養(yǎng)16小時(shí)；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；
(4)將酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶發(fā)酵液按以下配比混合：酵母菌40份、乳酸菌40份、白腐菌40份、枯草芽孢桿菌20份、雙歧桿菌20份、霉菌20份和纖維素酶40份。無(wú)菌裝罐，包裝得到復(fù)合微生態(tài)制劑。
對(duì)比例1：
與實(shí)施例1不同之處在于：原料的選取上不同，以下分為五組，
A組：生理鹽水；
B組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液；
C組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液、白腐菌液；
D組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液、白腐菌液、霉菌液；
E組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液、白腐菌液、雙歧桿菌液、霉菌液
為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)施例1-3和對(duì)比例1制備得到的復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)毛皮動(dòng)物的作用效果，下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明。
毛皮動(dòng)物以水貂為例，復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)水貂體重、免疫力和腸道健康的影響，以下對(duì)水貂進(jìn)行分組對(duì)照。
試驗(yàn)水貂，為大連黑，由青島某農(nóng)業(yè)科技有限公司毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖基地提供。選取150日齡仔貂60只，按性別和體重隨機(jī)分成6組，每組5個(gè)重復(fù)，每重復(fù)2只，公母各半，試驗(yàn)從2016年4月20日起，5月24日結(jié)束，共計(jì)35天。每組小水貂分籠喂養(yǎng)，自由采食和飲水。由青島某大學(xué)動(dòng)物微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室分離保存的乳酸菌和芽孢桿菌的活菌株。
菌落計(jì)數(shù)(平板計(jì)數(shù)法)
在超凈臺(tái)內(nèi)用經(jīng)過(guò)高壓的量筒取25mL菌液置于盛有250mL生理鹽水的廣口瓶?jī)?nèi)，充分搖勻成比例為1:10的稀釋液。用容積為1.0mL的經(jīng)過(guò)高壓的吸管吸取1.0mL置于盛有9mL的生理鹽水內(nèi)，進(jìn)行十倍稀釋，重復(fù)上述操作直至菌液稀釋倍數(shù)為109。用吸管吸取1.0mL的菌液置于經(jīng)過(guò)高壓、烘烤后的平皿內(nèi)，同時(shí)將冷卻至46℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂倒入平皿內(nèi)，同時(shí)移動(dòng)平皿使溶液充分混合。將平板置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h計(jì)數(shù)，重復(fù)做三次。
免疫注射
將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成A、B、C、D、E、F六組，每組5個(gè)重復(fù)。對(duì)水貂進(jìn)行免疫，第一次每只水貂注射等體積混合的抗原與弗氏完全佐劑0.1mL。一個(gè)星期后每只水貂注射等體積混合的抗原與弗氏不完全佐劑佐劑0.1mL，間隔一周后每只水貂重復(fù)注射等體積混合的抗原與弗氏不完全佐劑佐劑0.1mL。
對(duì)水貂灌胃處理，見(jiàn)表1。
表1為對(duì)試驗(yàn)水貂的不同處理方式
不同試驗(yàn)組對(duì)水貂體重的影響，見(jiàn)表2。
表2試驗(yàn)期水貂的體重增長(zhǎng)情況(單位：g)
備注：同一行中出現(xiàn)小寫(xiě)字母相同上標(biāo)的表示差異不顯著(P＞0.05)，具有不同小寫(xiě)字母的表示差異性顯著(P＜0.05)。
結(jié)果分析：從表2中可以看出試驗(yàn)前水貂的體重大題一致。試驗(yàn)期間，對(duì)照組和試驗(yàn)組的水貂體重都有大幅增長(zhǎng)，試驗(yàn)組水貂的體重普遍比對(duì)照組增長(zhǎng)的快。對(duì)試驗(yàn)前后水貂的體重增長(zhǎng)情況進(jìn)行分析，得出試驗(yàn)組水貂在試驗(yàn)前后的平均日增重比對(duì)照組增長(zhǎng)的快，尤其是公貂，平均日增重達(dá)到了22.44g。
不同試驗(yàn)組對(duì)水貂內(nèi)臟指數(shù)的影響，見(jiàn)表3。
表3不同處理組小水貂的內(nèi)臟指數(shù)(n＝5)
數(shù)據(jù)分析：用spss軟件對(duì)水貂的內(nèi)臟器官進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用多重比較的方法。由表3得出，F(xiàn)組(實(shí)施例1)的水貂各內(nèi)臟指數(shù)與對(duì)照組相比極顯著(P＜0.01)且顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，芽孢桿菌、乳酸菌、中藥組單獨(dú)作用組各內(nèi)臟器官的重量也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，F(xiàn)組顯著高于對(duì)照組及益生菌和中藥組(P＜0.05)。
血清免疫瓊擴(kuò)結(jié)果，表4為血清法氏囊病毒抗體效價(jià)。
表4血清法氏囊病毒抗體效價(jià)
由表4計(jì)算得出：每個(gè)試驗(yàn)組血清效價(jià)較對(duì)照組分別升高了29％，24％，11％，17％，14％；30％，26％，15％，8％，12％?？梢缘贸鰪?fù)合微生態(tài)制劑組水貂血清法氏囊抗體含量與其它試驗(yàn)組相比有比較明顯的促進(jìn)作用。
ELISA試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表5。
表5為不同處理組小水貂的OD值
由表5可以得出第一次測(cè)得的OD值除了E組之外其它試驗(yàn)組均比較接近，即在第一次免疫后水貂體內(nèi)的抗體含量差異不明顯；第二次由試驗(yàn)測(cè)得的OD值仍然比較接近，即水貂體內(nèi)的抗體含量相差不大；第三次免疫后復(fù)合微生態(tài)制劑組OD數(shù)值明顯高于其它試驗(yàn)組，說(shuō)明其體內(nèi)抗體含量與其它試驗(yàn)組相比數(shù)值升高的更大。
不同試驗(yàn)組對(duì)水貂空腸的粘膜厚度、絨毛長(zhǎng)度的影響
在光鏡下觀察得出，芽孢桿菌組、中藥組、復(fù)合微生態(tài)制劑組和對(duì)照組水貂空腸粘膜結(jié)構(gòu)均比較完整，并且層次分明，腸絨毛完整整齊?？梢?jiàn)有明顯的支部，小腸粘膜上皮表面的紋狀緣結(jié)構(gòu)整齊均勻。與對(duì)照組相比，復(fù)合微生態(tài)制劑組小水貂空腸粘膜絨毛排列更加緊密，絨毛比較長(zhǎng)。
本次試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論給水貂灌胃芽孢桿菌組、乳酸菌組、中藥組，還是復(fù)合微生態(tài)制劑組均能促進(jìn)水貂的增長(zhǎng)，但是復(fù)合微生態(tài)制劑組的水貂體重在兩周后與其它試驗(yàn)組相比遠(yuǎn)大于其它試驗(yàn)組。
不同試驗(yàn)組對(duì)水貂內(nèi)臟指數(shù)的影響：
由試驗(yàn)可以得出復(fù)合微生態(tài)制劑組在促進(jìn)小水貂內(nèi)臟器官的生長(zhǎng)方面與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)。灌胃乳酸菌組、芽孢桿菌組和中藥組對(duì)臟器指數(shù)的影響與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)。表明復(fù)合微生態(tài)制劑組對(duì)水貂的內(nèi)臟指數(shù)方面效果更顯著。
不同試驗(yàn)組對(duì)法氏囊抗體效價(jià)的影響：
本試驗(yàn)結(jié)果顯示不同試驗(yàn)組的水貂抗體效價(jià)與對(duì)照組相比差異顯著，但是復(fù)合微生態(tài)制劑組水貂的血清效價(jià)較對(duì)照組在第一次和第二次分別升高了29％和30％，與其它試驗(yàn)組相比數(shù)值變化較大。表明復(fù)合微生態(tài)制劑組在增強(qiáng)抗體的效價(jià)方面效果更顯著。
綜上所述，本發(fā)明制備得到的復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)水貂的生長(zhǎng)增重，內(nèi)臟器官的生長(zhǎng)，雞法氏囊抗體效價(jià)的升高以及腸道微絨毛的長(zhǎng)度及腸壁厚度均有比較明顯的促進(jìn)作用，大幅度提高了水貂的性能。
需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)下本領(lǐng)域技術(shù)人員所做出的任何等同方式，或明顯變型方式均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。