本發(fā)明涉及一種蘋果酵素及其制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

根據(jù)中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會的定義，酵素是指以果蔬或其他動、植物等為原料，采用自然或人工接種微生物發(fā)酵工藝，后經(jīng)提取所制得的具有某些特定功能的發(fā)酵制品。酵素不僅保存了發(fā)酵原料中原有的營養(yǎng)物質(zhì)，如多酚類、黃酮類、花青素等，而且通過有益菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)生了一些新的生物活性成分，如有機(jī)酸，氨基酸等。與發(fā)酵前相比，微生物的轉(zhuǎn)化使得這些小分子物質(zhì)更易于人體吸收。

近十年，微生物酵素功能性制品產(chǎn)業(yè)在全球開始大規(guī)模興起，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大。日本、臺灣等地區(qū)開始采用純種發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。純種發(fā)酵是在成分單一的發(fā)酵基質(zhì)中，僅接入一種或幾種微生物，通過對該微生物的培養(yǎng)，得到純度較高的單一性產(chǎn)物。不同于自然發(fā)酵，其發(fā)酵時間短，易控制，十分適合酵素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但是為使發(fā)酵順利進(jìn)行，要求人工擴(kuò)大的菌種不得被污染。因而對發(fā)酵設(shè)備和環(huán)境要求較高，要有嚴(yán)格的滅菌措施和空氣凈化系統(tǒng)。發(fā)酵用菌種也必須是經(jīng)嚴(yán)格研究后篩選出的最適合生產(chǎn)的菌種。

蘋果酵素不僅保持了蘋果原初營養(yǎng)和風(fēng)味，還將賦予其益生菌所產(chǎn)生的抗氧化活性，為消費者提供新的功能性產(chǎn)品。但目前的水果酵素制作主要存在：發(fā)酵時間長，影響水果原料穩(wěn)定性；發(fā)酵菌種性能和穩(wěn)定性差，影響酵素中天然的活性物質(zhì)等問題；發(fā)酵菌種酒精產(chǎn)量較高，不適合應(yīng)用于飲料和化妝品領(lǐng)域。

相關(guān)文獻(xiàn)

[1] 勾明玥，劉梁，張春枝.采用DPPH法測定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010（03）：148-150.

[2] 孫海彥，劉恩世，趙平娟，黎娟華等.氣相色譜法和蒸餾-酒精計法測定木薯發(fā)酵液中酒精含量的比較[J].釀酒科技，2012（11）：105-107.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是為了解決現(xiàn)有水果酵素生產(chǎn)過程中發(fā)酵時間過長影響酵素活性，酒精產(chǎn)量高，菌種性能不穩(wěn)定等問題而提供一種蘋果酵素的制備方法，該蘋果酵素的制備方法具有發(fā)酵時間短，最終所得的蘋果酵素抗氧化活性高，酒精含量低，適合應(yīng)用于飲料和化妝品領(lǐng)域。

本發(fā)明的目的之二是提供上述制備方法所得的蘋果酵素。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，用畢赤酵母Pichia kudriavzeviiPKD3001進(jìn)行發(fā)酵制備而成，其制備過程具體包括如下步驟：

（1）、菌種的選取

所用的菌種，是2016年9月29日于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的，其保藏編號為CCTCC NO: M 2016537的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001冷凍干燥管，保藏機(jī)構(gòu)地址：武漢市武昌珞珈山中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，郵編：430072；

（2）、發(fā)酵原料液的制備

將新鮮、成熟度好、天然酵素含量高的陜西紅富士蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到純蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中純蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計算，純蘋果汁：純凈水為10%:90%；

在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量3%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為6.0-7.0，然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；

（3）、菌種活化

用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，得到平板活化菌種；

（4）、種子培養(yǎng)

用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化菌種一環(huán)接入裝有50mL 麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250mL規(guī)格的三角瓶中，準(zhǔn)備若干份，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，得到培養(yǎng)液；

將上述所得的培養(yǎng)液控制轉(zhuǎn)速為5000r/min進(jìn)行離心20min, 離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入50mL 0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到種子液，所得的種子液中，每毫升種子液中含畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001為1×10⁸-1×10¹⁰ cfu；

（5）、發(fā)酵培養(yǎng)

在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，按1×10⁵ cfu/mL接種量將步驟（4）得到的種子液接入步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，然后控制轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25-35℃進(jìn)行發(fā)酵24-72h，得到發(fā)酵液；

（6）、綜合調(diào)配

在步驟（5）所得的發(fā)酵液中，按每升發(fā)酵液計算，在發(fā)酵液中依次添加蔗糖40-80g，檸檬酸5-10g，穩(wěn)定劑羧甲基纖維鈉2-4g，混勻后于121℃殺菌20min，然后罐裝，即得蘋果酵素成品。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的一種蘋果酵素，由于采用的原料蘋果是純天然的，利用低溫殺菌、嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度，有效的降低了酵素營養(yǎng)成分的損失，最大限度保留了酵素活性。

進(jìn)一步，本發(fā)明的一種蘋果酵素，由于制備過程所用的發(fā)酵時間控制在80h以內(nèi)，避免了蘋果本身含有的風(fēng)味物質(zhì)和酵素物質(zhì)的損失。

進(jìn)一步，本發(fā)明的一種蘋果酵素，是采用畢赤酵母Pichia kudriavzevii PKD3001進(jìn)行發(fā)酵而成，所得蘋果酵素與自然發(fā)酵所得的蘋果酵素相比，其抗氧化活性指標(biāo)提高75%，酒精產(chǎn)量低于1%，因此可廣泛應(yīng)用于飲料和化妝品領(lǐng)域。

附圖說明

圖1、實施例1，2，3，4通過添加畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001進(jìn)行發(fā)酵所得的蘋果酵素樣品和對照實施例1按自然發(fā)酵的方法所得的蘋果酵素樣品中的酒精度柱狀圖；

圖2、實施例1，2，3，4通過添加畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD 3001進(jìn)行發(fā)酵所得的蘋果酵素樣品和對照實施例1按自然發(fā)酵的方法所得的蘋果酵素樣品的清除率柱狀圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。

以下各實施例中所用的原材料蘋果購自上海聯(lián)華超市。

以下各實施例中所用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

以下各實施例中所用的0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，具體配制方法為：稱取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后用蒸餾水定容至1L，121℃滅菌20min。

本發(fā)明各實施例中所用的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001冷凍干燥管，保藏編號CCTCC NO: M 2016537，是本發(fā)明人于2016年9月29日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏機(jī)構(gòu)地址：武漢市武昌珞珈山中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，郵編：430072。

實施例1

一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，應(yīng)用畢赤酵母Pichia kudriavzevii PKD3001進(jìn)行發(fā)酵制備而成，其制備過程具體包括如下步驟：

（1）、菌種的選取

所用的菌種，是畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001冷凍干燥管；

（2）、發(fā)酵原料液的制備

將新鮮、成熟度好、天然酵素含量高的陜西紅富士蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到純蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中純蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計算，純蘋果汁：純凈水為10%:90%；

在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量3%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為6.0，然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；

（3）、菌種活化

用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzeviiPKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，得到平板活化菌種；

（4）、種子培養(yǎng)

用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化菌種一環(huán)接入裝有50mL 麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250mL規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，得到培養(yǎng)液；

將上述所得的培養(yǎng)液控制轉(zhuǎn)速為5000r/min進(jìn)行離心20min, 離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入50mL 0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到種子液，所得的種子液中，每毫升種子液中含畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001為1×10⁸-1×10¹⁰ cfu；

（5）、發(fā)酵培養(yǎng)

在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，按1×10⁵ cfu/mL接種量將步驟（4）得到的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001種子液接入到步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，溫度為28℃進(jìn)行發(fā)酵36h，最后得到發(fā)酵液；

（6）、綜合調(diào)配

在步驟（5）所得的發(fā)酵液中，按每升發(fā)酵液計算，在發(fā)酵液中依次添加蔗糖40g，檸檬酸7g，穩(wěn)定劑羧甲基纖維鈉4g，混勻后于121℃殺菌20min，然后罐裝，即得蘋果酵素成品。

實施例2

一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，應(yīng)用畢赤酵母Pichia kudriavzevii PKD3001進(jìn)行發(fā)酵制備而成，其制備過程具體包括如下步驟：

（1）、菌種的選取

所用的菌種，是畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001冷凍干燥管；

（2）、發(fā)酵原料液的制備

將新鮮、成熟度好、天然酵素含量高的陜西紅富士蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到純蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中純蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計算，純蘋果汁：純凈水為10%:90%；

在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量3%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉調(diào)pH值為6.30，105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；

（3）、菌種活化

用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzeviiPKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，得到平板活化菌種；

（4）、種子培養(yǎng)

用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化菌種一環(huán)接入裝有50mL 麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250mL規(guī)格的三角瓶中，準(zhǔn)備若干份，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，得到培養(yǎng)液；

將上述所得的培養(yǎng)液控制轉(zhuǎn)速為5000r/min進(jìn)行離心20min, 離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入50mL 0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到種子液，所得的種子液中，每毫升種子液中含畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD 3001為1×10⁸-1×10¹⁰ cfu；

（5）、發(fā)酵培養(yǎng)

在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，按1×10⁵ cfu/mL接種量將步驟（4）得到的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001種子液接入到步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，然后控制轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25℃進(jìn)行發(fā)酵72h，最后得到發(fā)酵液；

（6）、綜合調(diào)配

按每升發(fā)酵液計算，在步驟（5）所得的發(fā)酵液中依次添加蔗糖50g，檸檬酸5g，穩(wěn)定劑羧甲基纖維鈉3g，混勻后于121℃殺菌20min，然后罐裝，即得蘋果酵素成品。

實施例3

一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，應(yīng)用畢赤酵母Pichia kudriavzevii PKD3001進(jìn)行發(fā)酵制備而成，其制備過程具體包括如下步驟：

（1）、菌種的選取

所用的菌種，是畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001冷凍干燥管；

（2）、發(fā)酵原料液的制備

將新鮮、成熟度好、天然酵素含量高的陜西紅富士蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到純蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中純蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計算，純蘋果汁：純凈水為10%:90%；

在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量3%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉調(diào)pH值為7.0，105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；

（3）、菌種活化

用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，得到平板活化菌種；

（4）、種子培養(yǎng)

用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化菌種一環(huán)接入裝有50mL 麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250mL規(guī)格的三角瓶中，準(zhǔn)備若干份，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，得到培養(yǎng)液；

將上述所得的培養(yǎng)液控制轉(zhuǎn)速為5000r/min進(jìn)行離心20min, 離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入50mL無菌的磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到種子液，所得的種子液中，每毫升種子液中含畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001為1×10⁸-1×10¹⁰ cfu；

（5）、發(fā)酵培養(yǎng)

在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，按1×10⁵ cfu/mL接種量將步驟（4）得到的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001種子液接入到步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，然后控制轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為33℃進(jìn)行發(fā)酵24h，最后得到發(fā)酵液；

（6）、綜合調(diào)配

按每升發(fā)酵液計算，在步驟（5）所得的發(fā)酵液中依次添加蔗糖80g，檸檬酸8g，穩(wěn)定劑羧甲基纖維鈉2g，混勻后于121℃殺菌20min，然后罐裝，即得蘋果酵素成品。

實施例4

一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，應(yīng)用畢赤酵母發(fā)酵制備蘋果酵素，其制備過程具體包括如下步驟：

（1）、菌種的選取

所用的菌種，是畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001；

（2）、發(fā)酵原料液的制備

將新鮮、成熟度好、天然酵素含量高的陜西紅富士蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到純蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中純蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計算，純蘋果汁：純凈水為10%:90%；

在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量3%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉調(diào)pH值為6.7，105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；

（3）、菌種活化

用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzeviiPKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，得到平板活化菌種；

（4）、種子培養(yǎng)

用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化菌種一環(huán)接入裝有50mL 麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250mL規(guī)格的三角瓶中，準(zhǔn)備若干份，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，得到培養(yǎng)液；

將上述所得的培養(yǎng)液控制轉(zhuǎn)速為5000r/min進(jìn)行離心20min,離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入50mL無菌的磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到種子液，所得的種子液中，每毫升種子液中含畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001為1×10⁸-1×10¹⁰ cfu；

（5）、發(fā)酵培養(yǎng)

在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，按1×10⁵ cfu/mL接種量將步驟（4）得到的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD3001種子液接入到步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中，然后控制轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為35℃進(jìn)行發(fā)酵60h，最后得到發(fā)酵液；

（6）、綜合調(diào)配

按每升發(fā)酵液計算，在步驟（5）所得的發(fā)酵液中依次添加蔗糖70g，檸檬酸10g，穩(wěn)定劑羧甲基纖維鈉2.5g，混勻后于121℃殺菌20min，然后罐裝，即得蘋果酵素成品。

對照實施例1

采用自然發(fā)酵法制備蘋果酵素，以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，通過自然發(fā)酵法而成，其制備過程具體包括如下步驟：

（1）、發(fā)酵原料液的制備

將新鮮、成熟度好、天然酵素含量高的陜西紅富士蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到純蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中純蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計算，純蘋果汁：純凈水為10%:90%，即為發(fā)酵原料液；

（2）、發(fā)酵培養(yǎng)

將上述得到的發(fā)酵原料液分裝到玻璃瓶中，加上專用蓋子，室溫放置20天進(jìn)行自然發(fā)酵，得到發(fā)酵液；

（3）、綜合調(diào)配

按每升發(fā)酵液計算，在步驟（2）所得的發(fā)酵液中依次添加蔗糖40g，檸檬酸7g，穩(wěn)定劑羧甲基纖維鈉4g，混勻后于121℃殺菌20min，然后罐裝，即得蘋果酵素成品。

效果例1

采用酒精計法^[1]分別對實施例1，2，3，4通過添加畢赤酵母亞種Pichia kudriavzeviiPKD3001進(jìn)行發(fā)酵所得的蘋果酵素樣品和對照實施例1按自然發(fā)酵的方法所得的蘋果酵素樣品中的酒精度進(jìn)行檢測，其步驟如下：

分別取100mL實施例1，2，3，4所得的蘋果酵素樣品和對照實施例1所得的對照用的蘋果酵素樣品于200mL蒸餾瓶中，再加幾顆潔凈玻璃珠，連接冷凝器，以100mL容量瓶作接收器（外加冰?。?，開啟冷凝水，緩慢加熱蒸餾，收集餾出液接近刻度，于20℃水浴中保溫30min，補(bǔ)加水至刻度，混勻，倒入潔凈、干燥的100mL量筒中，靜止數(shù)分鐘，待其中氣泡消失后，放入洗凈、干燥的酒精計（uoe，武強(qiáng)縣精誠儀表廠），再輕輕按一下，不得接觸量筒壁，同時插入溫度計，平衡5min，水平觀測，讀取與彎月面相切處的刻度示值，同時記錄溫度，根據(jù)測得的酒精計示值和溫度，查酒精計溫度濃度換算表，換算成20℃時酒精度。每個樣品平行測定3次，所得結(jié)果表示至一位小數(shù)。

實驗結(jié)果見附圖1，從附圖1可以看出，本發(fā)明制備方法所得的蘋果酵素，其酒精產(chǎn)量低于1%。

效果例2

TTC(2,3,5一氯化苯基四氮唑)是一種顯色劑，它對酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母菌中呼吸酶活力的大小，即酵母菌產(chǎn)酒精能力的高低。固體培養(yǎng)基上的不同酵母菌落上覆蓋一層TTC顯色劑后會顯不同顏色，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌落呈深紅色，次之為粉紅色。以酵母菌代謝產(chǎn)物和TTC顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)來測試發(fā)酵用畢赤酵母菌產(chǎn)酒精能力強(qiáng)弱，分別測定發(fā)酵用畢赤酵母菌、其他酵母菌與TTC的顯色反應(yīng)。

用滅過菌的牙簽分別挑取發(fā)酵用畢赤酵母菌和其他酵母菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，發(fā)酵用畢赤酵母菌用黑色記號筆在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記，30℃培養(yǎng)36h后，在培養(yǎng)基上再覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，避光靜置半天。實驗結(jié)果可明顯看出發(fā)酵用畢赤酵母菌呈白色，其他酵母菌呈深紅色、粉色，由此表明所用畢赤酵母亞種Pichia kudriavzeviiPKD3001產(chǎn)酒精量低。

效果例3

采用DPPH法^[2]分別測定實施例1，2，3，4通過添加畢赤酵母亞種Pichia kudriavzeviiPKD 3001進(jìn)行發(fā)酵所得的蘋果酵素樣品和對照實施例1按自然發(fā)酵的方法所得的蘋果酵素樣品的抗氧化活性，即以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除活力為指標(biāo)進(jìn)行檢測，其步驟如下：

在5個10 mL的試管中，分別加入2mL實施例1，2，3，4所得的蘋果酵素樣品和對照實施例1所得的蘋果酵素樣品，然后每個試管中分別加入 2mL 0.1mmol/L DPPH 溶液，搖勻，分別室溫下暗處靜置 30min，以無水乙醇為空白，分別測定各試管中樣品在517nm下的吸光度，記作A_sample。同時測定 2mL DPPH溶液與 2mL乙醇混合后的吸光度，記作 A_control，以及2mL發(fā)明樣品溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度A_blank。然后計算實施例1，2，3，4所得的蘋果酵素樣品和對照實施例1所得的蘋果酵素樣品的自由基清除能力，即清除率，每個樣品平行測定3次，其計算方法按以下公式：

清除率越大表明自由基的清除能力越強(qiáng)，由此表明其抗氧化能力越強(qiáng)。

上述測得的實驗結(jié)果見附圖2，從圖2可以看出，通過本發(fā)明通過添加畢赤酵母菌亞種Pichia kudriavzevii PKD3001進(jìn)行發(fā)酵所得的蘋果酵素樣品對DPPH自由基清除率比對照實施例中采用自然發(fā)酵方法所得的蘋果酵素提高至少75%以上，表現(xiàn)出較好的抗氧化活力。

綜上所述，本發(fā)明提供的一種蘋果酵素，保留了蘋果中的原初營養(yǎng)成分，通過添加畢赤酵母菌亞種Pichia kudriavzevii PKD3001進(jìn)行發(fā)酵，不僅增加了新的風(fēng)味，還提高了蘋果酵素的抗氧化活性，且產(chǎn)酒精量低，適合應(yīng)用于飲料和化妝品領(lǐng)域。

以上所述僅是本發(fā)明的實施方式的舉例，并不用以限制本發(fā)明，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。