本發(fā)明涉及一種低非淀粉多糖的花生蛋白及其制備方法，屬于動物飼料領域。

背景技術：

花生粕是花生仁經高溫壓榨提油后的副產品，含有豐富的植物蛋白?；ㄉ傻臓I養(yǎng)價值較高，2015年，中國花生粕產量300多萬噸，蛋白含量高達48％左右，是潛在的重要飼料蛋白。然而，花生粕存在約占總量的30％的非淀粉多糖(Non-starch Polysaccharides，NSP)，主要包括纖維素、半纖維素和果膠等，半纖維素又包括阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖等。非淀粉多糖在動物小腸內會增加食糜粘性，阻礙營養(yǎng)物質和消化酶的結合；由于食糜通過速度與消化率的降低，為細菌特別是致病菌的繁殖提供了有利條件，可導致動物腹瀉率增加、刺激腸道粘膜層增厚，損害微絨毛，減少養(yǎng)分吸收；此外，大量的非淀粉多糖會充當營養(yǎng)稀釋劑作用，降低了飼料的能量，導致飼料表觀代謝能降低。

目前已有申請?zhí)枮?01510583133.0和200810202911.7等專利中所述。對于降解非淀粉多糖的思路都是在飼料原料中直接添加復合酶制劑，和飼料復配后一同進食到動物的腸胃中，然后在腸胃的大環(huán)境中發(fā)生酶解反應，降解非淀粉多糖，消除其部分抗營養(yǎng)作用。這些專利存在以下不足：(1)由于在動物的腸胃中尤其是在胃中，酸性極強，不是復合酶制劑中各單一酶的最適反應條件，這種體外添加、體內起作用的方法對于降解非淀粉多糖的效果極其有限；(2)部分未降解的非淀粉多糖與營養(yǎng)素充分結合，從而影響營養(yǎng)素的消化、吸收，影響飼料利用率；(3)飼料原料的非淀粉多糖組成存在差異，未針對花生粕進行非淀粉多糖降解酶進行特異開發(fā)。針對這些不足，有必要進行花生粕非淀粉多糖降解酶的特異性復配，通過發(fā)酵技術進行動物體外降解，非淀粉多糖降解率高，同時降解產物可以被有益微生物轉化成有益代謝產物，起到調節(jié)動物生長性能和免疫性能的作用。

花生蛋白分為兩大類：水溶性蛋白和鹽溶性蛋白，其中約有10％的蛋白質是水溶性蛋白，其余的90％為鹽溶性蛋白?；ㄉ芍袃?yōu)質蛋白不足，不利于動物消化吸收的大分子蛋白偏多；花生粕肽的含量偏少，跟魚粉、發(fā)酵豆粕等市場上主要的飼料蛋白原料相比，蛋白質的可消化吸收率較低。另外，花生粕中缺乏賴氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸，賴氨酸是花生粕的第一限制性氨基酸；當花生粕中的可利用賴氨酸不足時，用它來替代豆粕飼喂雞、豬等單胃動物就會降低動物的生長性能?；ㄉ傻鞍椎倪@些缺陷，嚴重影響了花生粕在飼料行業(yè)的高效利用。

目前在對花生粕的利用上，專利201410283363.0的利用花生粕二步固態(tài)發(fā)酵生產益生肽的方法，雖然能夠得到多肽和乳酸含量較高的飼料，但是其非淀粉多糖含量約占總量的20％以上。此外，本研究組在中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?01510662262.9的專利申請中，將綠色木霉、枯草芽孢桿菌和干酪乳酸菌接種于花生粕上，能夠獲得黃曲霉毒素B₁無檢出、多肽豐富的花生粕，但未對非淀粉多糖進行處理。

綜上，有效提高非淀粉多糖含量以提高動物對飼料蛋白的利用率以及提高花生粕中必需氨基酸是目前亟待解決的問題。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種低非淀粉多糖的花生蛋白及其制備方法。

本發(fā)明的低非淀粉多糖的花生蛋白的制備方法，依次包括如下步驟：將花生粕原料加水滅菌后，接種解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵一段時間，然后再加一定量的水和復合酶制劑進行酶解，酶解后升溫滅酶，冷卻，加入活化后的乳酸菌或者同時加入酵母菌，半固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結束后固液分離、烘干、粉碎，即得到花生蛋白。

在一種實施方式中，所述花生粕加水滅菌，是按照1:(0.6～1)的料水比添加水。

在一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌的接種量為2～5wt％(比如100g花生粕原料添加2～5g解淀粉芽孢桿菌種子液)。

在一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵的時間為60～84h。

在一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵是在32～40℃下進行。

在一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵后加入的水，是加水至料水比1:(2.5～3.5)。

在一種實施方式中，所述復合酶制劑中含有纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、β-葡聚糖酶。

在一種實施方式中，所述纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的添加量為50～150U/g；果膠酶的添加量為100-300U/g。

在一種實施方式中，所述酶解的條件為：45～55℃下酶解反應3～5h。

在一種實施方式中，所述乳酸菌的接種量為4-8wt％。

在一種實施方式中，所述酵母菌的接種量為2-5wt％。

在一種實施方式中，所述酵母菌為釀酒酵母。

在一種實施方式中，所述半固態(tài)發(fā)酵是在料水比1:(2.5～3.5)下發(fā)酵。

在一種實施方式中，所述半固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵時間為42～54h。

在一種實施方式中，所述半固態(tài)發(fā)酵的溫度為25～40℃，可以是30℃。

在一種實施方式中，所述方法，具體是：以花生粕為原料，按1:(0.6～1)的料水比與水混合并攪拌均勻，滅菌；滅菌后接入2～5wt％的解淀粉芽孢桿菌，攪拌均勻后，在32～40℃下發(fā)酵60～84h，發(fā)酵完畢后加水至料水比1:(2.5～3.5)，并添加復合酶制劑，置于35～55℃下酶解反應3～5h；其中纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的添加量為50～150U/g；果膠酶的添加量為100～300U/g；酶解反應后于80～110℃處理10～30min，冷卻后添加經活化好乳酸菌4～8wt％或者酵母與乳酸菌的復合物，半固態(tài)發(fā)酵42～54h后固液分離，烘干、粉碎。

在一種實施方式中，所述酵母與乳酸菌的復合物，是指同時添加酵母與乳酸菌；其中酵母添加量為2-5wt％、乳酸菌添加量為4-8wt％。

在一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌為CGMCC NO.9021；所述乳酸菌為戊糖片球菌CGMCC NO.9182；所述釀酒酵母為CGMCC 2.146。其中，CGMCC NO.9021已經在申請?zhí)?01410235025X、申請公布號CN103966147A的專利中公開了；CGMCC NO.9182已經在申請?zhí)?014102833630、申請公布號CN104161172A的專利中公開了；CGMCC 2.146為購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

在一種實施方式中，所述纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶均購自白銀賽諾生物科技有限公司；所述β-葡聚糖酶購自康地恩生物科技有限公司。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明通過添加復合酶制劑與混合發(fā)酵相結合的方法，非淀粉多糖含量可降低至7％-10％，蛋白質含量高達62％，必需氨基酸整體提升19.6％，其他各項指標明顯變好，本方法對花生粕的品質提升具有重要作用。

(2)本發(fā)明通過特定的復合酶制劑的組成和添加量，有效降低了非淀粉多糖含量；降解的非淀粉多糖，經再次發(fā)酵，被微生物利用形成一系列有利于消化吸收的代謝產物，提高了消化吸收利用率、提高了免疫力。

(3)本發(fā)明還通過添加酵母菌的方式，一方面進一步分解非淀粉多糖的降解物，另一方面提高了花生蛋白的風味；得到的花生蛋白，適口性更好。

(4)本發(fā)明的花生蛋白中黃曲霉毒素B₁含量極低(≤10μg/kg)；多肽含量為23％-30％，乳酸含量1.5％-3.0％，有益微生物含量達10⁸CFU/g以上，可以替代魚粉等優(yōu)質蛋白。

附圖說明

圖1：處理前后花生粕NSP和蛋白質含量變化；

圖2：處理前后花生粕的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為Marker、1為原料、2為本實施例處理后得到的產品。

具體實施方式

非淀粉多糖測定：按總糖含量減去還原糖的含量計算，總糖和還原糖采用3，5-二硝基水楊酸比色法進行測定。

蛋白質含量測定：按照GB 5009.5-2010食品中蛋白質的測定方法測定。

必需氨基酸的測定：按照GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的測定方法測定。

一般來說菌種為解淀粉芽孢桿菌、戊糖片球菌和釀酒酵母，所添加的飼料用酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶。不同的解淀粉芽孢桿菌、戊糖片球菌和釀酒酵母進行發(fā)酵，結果差異不大。本發(fā)明使用的解淀粉芽孢桿菌為CGMCC NO.9021；所述戊糖片球菌為CGMCC NO.9182；所述釀酒酵母為CGMCC 2.146。

實施例1

以花生粕為原料和水按1:0.8比例混合，121℃滅菌20min，冷卻后接種5wt％的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵72h；取出后加水至料水比1：3，添加復合酶制劑(纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶各以150U/g添加)并置于45℃下酶解反應4h；酶解反應后將樣品進行沸水浴20min，冷卻后添加5wt％的釀酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固態(tài)發(fā)酵48h后固液分離，烘干、粉碎。

對本實施例的花生粕原料(空白組)和按本實施例方法得到的產品進行NSP和蛋白質含量的分析，結果如圖1所示。結果顯示，花生粕的NSP從30％左右降至7.3％，蛋白質含量從48％左右提升至62％，NSP含量的減少可降低花生粕的抗營養(yǎng)作用，提高其飼用品質。此外，由圖2的蛋白質品質的改善情況可知，SDS-PAGE電泳圖顯示本實施例得到的花生粕蛋白中的大分子蛋白明顯降解為小分子蛋白；發(fā)酵后多肽占比29.2％，多肽相比于大分子蛋白更利于動物吸收，促進腸道發(fā)育。

發(fā)明人還比較了處理前后花生粕中必需氨基酸組成的變化，如表1所示。

表1處理前后花生粕中必需氨基酸組成的變化(％)

注：-表示低出檢出線

由表1可知，必需氨基酸含量提升了20.88％；花生粕氨基酸得到了一定的平衡。

此外，本實施例方法得到的發(fā)酵花生粕中黃曲霉毒素B₁含量為9.14μg/kg，乳酸含量達到2.4％，有益菌活菌數量達到10⁸CFU/g以上。

實施例2

以花生粕為原料和水按1:0.8比例混合，100-105℃滅菌20min，冷卻后接種5wt％的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵72h。添加復合酶制劑(纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶各以150U/g添加)并置于45℃下酶解反應3h；酶解結束后100℃處理20min，冷卻后添加5wt％的釀酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固態(tài)發(fā)酵48h后固液分離，烘干、粉碎。發(fā)酵花生粕中NSP降至8.7％，總蛋白含量60.3％，多肽占比23.6％，必需氨基酸含量提升了16.76％；黃曲霉毒素B1含量為10μg/kg，乳酸含量2.1％，有益菌活菌數量達到10⁸CFU/g以上。

實施例3

以花生粕為原料和水按1：3比例混合，接種5wt％的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵72h；添加復合酶制劑(纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶以100U/g添加，果膠酶以150U/g添加)并置于45℃下酶解反應4h；酶解反應后將樣品進行沸水浴20min，冷卻后添加5wt％的釀酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固態(tài)發(fā)酵48h后固液分離，烘干、粉碎。發(fā)酵花生粕NSP降至9.6％，總蛋白含量58.9％，多肽占比26.3％，必需氨基酸含量提升了17.48％；黃曲霉毒素B1含量為23.5μg/kg，乳酸含量2.4％，有益菌活菌數量達到10⁸CFU/g以上。

實施例4

以花生粕為原料和水按1:0.6比例混合，100℃滅菌20min，冷卻后接種2wt％的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵84h；取出后加水至料水比1:3.5，添加復合酶制劑(纖維素酶120U/g、木聚糖酶50U/g、β-葡聚糖酶120U/g、果膠酶200U/g添加)并置于48℃下酶解反應5h；酶解反應后將樣品進行沸水浴20min，冷卻后添加8wt％戊糖片球菌，半固態(tài)發(fā)酵48h后固液分離，烘干、粉碎。

發(fā)酵花生粕NSP降至9.6％，總蛋白含量60％，多肽占比24.2％，必需氨基酸含量提升了16.56％；乳酸含量2.8％，有益菌活菌數量達到10⁸CFU/g以上。

實施例5

以花生粕為原料和水按1:1比例混合，110℃滅菌20min，冷卻后接種4wt％的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵60h；取出后加水至料水比1:2.5，添加復合酶制劑(纖維素酶50U/g、木聚糖酶100U/g、β-葡聚糖酶50U/g、果膠酶300U/g添加)并置于49℃下酶解反應3.8h；酶解反應后將樣品進行沸水浴20min，冷卻后添加3wt％的釀酒酵母和4wt％戊糖片球菌，半固態(tài)發(fā)酵48h后固液分離，烘干、粉碎。

發(fā)酵花生粕NSP降至9.6％，總蛋白含量61.1％，多肽占比25.1％，必需氨基酸含量提升了16.72％；乳酸含量2.2％，有益菌活菌數量達到10⁸CFU/g以上。

對照組1

省略實施例1中的酶解步驟，其他步驟與實施例一致，即：

以花生粕為原料和水按1:0.8比例混合，121℃滅菌20min，冷卻后接種5wt％的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵72h；取出后加水至料水比1：3，添加復合酶制劑(纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶各以150U/g添加)后，將樣品進行沸水浴20min，冷卻后添加5wt％的釀酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固態(tài)發(fā)酵48h后固液分離，烘干、粉碎。

結果顯示，按照實施例方法得到的發(fā)酵花生粕的NSP含量29.5％，總蛋白含量52.3％，多肽占比20.3％；發(fā)酵花生粕中黃曲霉毒素B₁含量為18.9μg/kg，乳酸含量1.3％，有益菌活菌數量達到10⁸CFU/g以上。

對照組2

省略實施例1中添加的木聚糖酶，其他步驟與實施例一致，即：

以花生粕為原料和水按1:0.8比例混合，121℃滅菌20min，冷卻后接種5wt％的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵72h；取出后加水至料水比1：3，添加復合酶制劑(纖維素酶、β-葡聚糖酶、果膠酶各以150U/g添加)并置于45℃下酶解反應4h；酶解反應后將樣品進行沸水浴20min，冷卻后添加5wt％的釀酒酵母和5wt％戊糖片球菌，半固態(tài)發(fā)酵48h后固液分離，烘干、粉碎。

結果顯示，按照實施例方法得到的發(fā)酵花生粕的NSP含量23.5％，總蛋白含量55.9％，多肽占比22.3％；乳酸含量1.9％，有益菌活菌數量達到10⁸CFU/g以上。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。