本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種高品質發(fā)酵蓮藕的制備方法。

技術背景

藕是一種組織脆嫩、含水量高的水生蔬菜。藕肉味甜，營養(yǎng)豐富，有健脾干胃，養(yǎng)血生肌，祛冷護肝之功效。蓮藕集營養(yǎng)與藥用價值為一體，是一種藥食同源的食品，具有獨特的保健功能，備受國內外消費者歡迎。

在蓮藕旺季，即便價格低廉，仍有大量的蓮藕得不到充分利用。新鮮蓮藕采后易失水、軟化、褐變甚至腐爛變質，阻礙了蓮藕產(chǎn)品的生產(chǎn)和流通。另外蓮藕的時令性強，上市季節(jié)短，不利于產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)推廣。

目前我國蓮藕產(chǎn)業(yè)仍以初級加工制品為主并且加工的比例較低。主要是藕汁飲料、藕粉、糖漬藕、鹽漬藕及一些經(jīng)初加工處理的鮮蓮藕制品，國內主要是以鮮食蓮藕、藕粉為主，國外則對蓮藕的食用較少，主要以鹽漬藕和蓮藕凈菜為主。將蓮藕進行發(fā)酵制成蓮藕泡菜可以在保證原有營養(yǎng)的基礎上，通過微生物發(fā)酵來提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和其他附加價值，減少采后損失，延長貯存時間，這對于蓮藕產(chǎn)品的多樣化發(fā)展和產(chǎn)業(yè)進一步提升有重要的意義。

未來蓮藕產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展趨勢是加強蓮藕泡菜、藕茶、休閑藕片、藕脯、即食罐頭以及蓮藕保健品的開發(fā)，對蓮藕進行深度加工，形成多樣化、特色化、系列化產(chǎn)品，以綠色、健康、功能性的產(chǎn)品形象拓寬國內外市場。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種新型發(fā)酵蓮藕泡菜的制備方法，通過該方法制備的蓮藕泡菜酸爽可口，開胃生津，且食鹽、亞硝酸鹽、生物胺含量較低，食用安全性高。

本發(fā)明是通過以下技術方案進行的：一種新型發(fā)酵蓮藕制備方法將蓮藕清洗干凈后，切片或整段，添加天然添加物，利用混合乳酸菌發(fā)酵劑，按常規(guī)發(fā)酵方法制備制得產(chǎn)品。

具體制備方法是：鹽濃度2％-4％(w/w)，乳清粉添加量2％-4％(w/w)，香料添加量為2‰-4‰(w/w)，辣椒添加量為1％-2％(w/w)，并接種5％-15％的混合乳酸菌發(fā)酵劑，20℃條件下發(fā)酵7d制備而成。

本發(fā)明所述混合乳酸菌發(fā)酵劑中的菌株包括：植物乳桿菌grx15(Lactobacillus plantarum grx15)，保藏號是CGMCC NO.7.199；發(fā)酵乳桿菌grx07(Lactobacillus fermentum grx07)，保藏號是CGMCC NO.8874；鼠李糖乳桿菌grx19(Lactobacillus rhamnosus grx19)，保藏號是CGMCC NO.5519。

進一步地，所述混合乳酸菌發(fā)酵劑的菌株由植物乳桿菌grx15、發(fā)酵乳桿菌grx07和鼠李糖乳桿菌grx19組成，其混合比例為1:1:1(v/v)。

本發(fā)明在蓮藕泡菜發(fā)酵過程中添加乳清粉，乳清是生產(chǎn)干酪的副產(chǎn)品，含有乳清蛋白、乳糖、維生素和礦物質等多種營養(yǎng)成分，價格低廉，能夠促進泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌的增殖。

本發(fā)明制備的發(fā)酵蓮藕泡菜，硬度、色度較好，總酸含量較高，感官得分較高，綠色健康，食用安全。

本發(fā)明對制備的新型純種發(fā)酵蓮藕泡菜與自然發(fā)酵泡菜進行分析比較，可以發(fā)現(xiàn)純種發(fā)酵蓮藕的總酸、VC含量、揮發(fā)性氨基氮顯著高于自然發(fā)酵組(P<0.05)，灰分不差異顯著(P>0.05)，而水分、淀粉、蛋白質、總糖、PPO和POD酶活、食鹽濃度均小于自然發(fā)酵(P<0.05)。兩種發(fā)酵方式的泡菜品質接近，純種發(fā)酵蓮藕營養(yǎng)成分略優(yōu)于自然發(fā)酵，而亞硝酸鹽和生物胺等對人體有害的物質含量較低，說明本發(fā)明的新型純種發(fā)酵泡菜制備方法，可在一定程度上提高產(chǎn)品質量，食用安全性高。

本發(fā)明在蓮藕泡菜殺菌條件的研究中，發(fā)現(xiàn)殺菌溫度85℃，殺菌時間15min最為適合，即達到了殺菌的目的，又保持了蓮藕泡菜原有的風昧。該產(chǎn)品在常溫保藏30d內品質基本穩(wěn)定，pH和總酸略微有波動，但是基本穩(wěn)定在2.9％-3.0％之間和0.9％-1.0％之間；鹽度維持在1.872％左右；亞硝酸鹽含量先上升后下降，30d時含量為0.43mg/kg，遠遠小于國標要求。大腸桿菌<30MPN·(100g)^-1，其他致病菌未檢出，符合商業(yè)化生產(chǎn)的需求。

本發(fā)明涉及的植物乳桿菌grx15，于2016年10月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，分類命名為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，保藏號：CGMCC NO.7.199。

附圖說明

圖1純種發(fā)酵蓮藕泡菜工藝流程圖；

圖2～圖4為蓮藕泡菜pH、總酸、色度和硬度隨溫度和時間的變化；

圖5～圖7為蓮藕泡菜pH、總酸、色度和硬度隨鹽濃度和時間的變化；

圖8～圖10為蓮藕泡菜pH、總酸、色度和硬度隨接種量和時間的影響；

圖11為硬化劑添加對蓮藕泡菜硬度的影響；

圖12～圖16為不同乳清粉添加量對泡菜pH、總酸、色度、硬度和感官的影響；

圖17～圖21為不同輔料添加量對泡菜pH、總酸、色度、硬度和感官的影響；

圖22～圖26為不同香料添加量對泡菜pH、總酸、色度、硬度和感官的影響；

圖27為香料添加量和乳清粉添加量及其交互作用對溶解度影響的響應面曲線和等高線；

圖28為辣椒添加量和乳清粉添加量及其交互作用對溶解度影響的響應面曲線和等高線；

圖29為辣椒添加量和香料添加量及其交互作用對溶解度影響的響應面曲線和等高線；

圖30～圖33為蓮藕泡菜在保藏期內pH、酸度、鹽度、亞硝酸鹽和感官的變化。

具體實施方式

本研究通過單菌和混菌接種試驗，以質構、pH、總酸、色度和感官為指標，確定最佳菌種配比。通過單因素試驗研究了發(fā)酵條件和輔料添加對蓮藕質構和風味的影響。以溫度、鹽濃度和接種量為因子，總酸、硬度和感官評分作為評價指標，進行三因素三水平正交試驗，確定最佳發(fā)酵條件。通過響曲面法，以感官評價為響應值，確定輔料添加的最佳配方，制備風味醇香、綠色健康安全的高品質的蓮藕泡菜。

1 蓮藕發(fā)酵工藝

1.1 原材料的處理

選用市售肉質白、根頭粗壯、完整無損傷、品種一致的新鮮蓮藕，洗去泥土，置于5℃冷庫中過夜，次日用不銹鋼刀去皮，切除藕節(jié)，切分為厚0.5cm左右的薄片。

1.2 發(fā)酵料液的制備

分別按2％和2％(w/w)的量在水中加入乳清粉和食鹽溶解，121℃滅菌15min，備用。

1.3 加工工藝流程

如圖1所示。

1.4 生產(chǎn)操作要點

(1)藕的選擇和處理

①選料選取成熟度高，無腐爛變質無機械損傷和蟲害斑點的蓮藕，按藕徑適當分級。

②清洗用流動水洗凈附著在上面的雜質。

③用不銹鋼刀去皮、切片(0.5cm)、再用清水沖洗干凈，

(2)泡制

菜水比為1:1。在發(fā)酵液內加人大蒜、生姜、辣椒、以及香料(荷葉、八角、花椒)，投入預處理過后的蓮藕，接種10％發(fā)酵劑，最后水封、定期檢查壇內pH變化。

(3)調味包裝

泡菜水pH達3.5左右，鹽水、菜鹽濃度一致時泡菜成熟。出壇調味。調味后包裝成約500g的小袋。然后真空密封。

(4)殺菌、冷卻、檢驗

不同溫度下巴氏殺菌，后冷卻迅速冷卻。并按GB/T 5009.54-2003醬腌菜衛(wèi)生標準的分析方法進行理化和細菌指標的檢驗。

(5)感官評定

產(chǎn)品應有愉快的色澤，無變色發(fā)暗現(xiàn)象，香氣柔和，質地脆嫩，酸咸適度。

(6)保溫檢驗

將成品于28℃作保溫檢驗，驗其保質期。

2.菌株組合對蓮藕發(fā)酵質構和風味的影響

將菌株按不同比例混合(見表1)接種于蓮藕進行發(fā)酵，接種量10％，溫度20℃，鹽濃度2％，乳清粉添加量為2％，發(fā)酵7d，測定蓮藕質構、色度、感官以及總酸含量和pH值，結果如表1所示。

表1 不同菌株配比設計

表2 不同菌株組合發(fā)酵泡菜的品質評定

根據(jù)表2可得，在pH和總酸方面，各組pH均達到4.0以下，1號pH最高為3.85，15號最低達到3.37，其他各組在3.4-3.6之間，差異性不顯著。5號、7號、9號、12號、14號和15號總酸含量較高，達到1％以上，其中14號總酸含量最高，達到1.28％，顯著高于其他組別(P<0.05)。

在色度方面，各組均高于空白對照1號組。其中6號、13號、14號色度均高于75，蓮藕顏色較白，其中14號色度顯著高于其他組(P<0.05)。

在質構方面，5號、6號、14號、16號和17號較好。其中，5號、6號、7號、9號、13號、14號和17號硬度較大，顯著高于其他菌株組合(P<0.05)，4號、5號、6號和14號粘附性顯著低于其他組別(P<0.05)；6號、9號、10號、11號、14號、15號和16號彈性較大，其中6號顯著高于其他組合(P<0.05)；另外6號、14號、16號和17號的咀嚼性顯著高于其他組合(P<0.05)。

在感官評分方面，5號、7號和14號感官分值較高，總分14號最高，顯著高于其他組合(P<0.05)。

綜合以上因素，確定14號為最佳菌種配比，即grx15：grx07：grx19＝1：1：1。

3 最佳發(fā)酵條件的研究

3.1 溫度對蓮藕泡菜質構和風味的影響

按篩選出的優(yōu)良發(fā)酵劑組合接入到蓮藕中，分別置于15℃、20℃、25℃、30℃條件下發(fā)酵，乳清粉添加量為2％、鹽水濃度為2％，發(fā)酵劑接種量為10％，每隔1d測定蓮藕pH、總酸含量、質構和色度，結果如圖2～圖4所示。

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的增加，蓮藕的酸度逐漸上升，環(huán)境溫度越高，最終酸度越高，30℃發(fā)酵終點酸度為1.24％。并且，30℃時的產(chǎn)酸速度也較快。發(fā)酵初始，溫度對pH有較大影響，20℃、25℃和30℃條件下pH下降較快，第3d開始25℃和30℃條件下pH相近，30℃時發(fā)酵最終僅為3.14，過酸。15℃和20℃發(fā)酵過程中pH下降速度相對較慢，平衡后穩(wěn)定在3.4左右。

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，蓮藕的色度降低，略微變黃，但是總體上顏色較白L*維持在70以上。20℃條件下，色度維持最好，發(fā)酵7d后仍保持在78左右。

由圖4可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蓮藕的硬度一開始下降較快，第3d后，15℃和30℃溫度條件下的硬度相近；第5d后，所有溫度條件下蓮藕的硬度幾乎維持在同一水平。發(fā)酵后期15℃條件下蓮藕的硬度下降更快，而其他三個溫度條件下硬度維持在較好水平，發(fā)酵7d，硬度在42N以上。

綜上所述，溫度過低時，泡菜產(chǎn)酸速度較慢，發(fā)酵周期長；而溫度過高時，菌株生長活力增強，可能會使泡菜過酸，另外溫度較高可能會破壞蓮藕的質構，加速蓮藕的褐變。綜合以上分析，發(fā)酵溫度為20℃，蓮藕泡菜的狀態(tài)較好，選其作為最適因素進行下一步研究。

3.2 鹽濃度對蓮藕泡菜質構和風味的影響

調鹽水濃度分別為1％、2％、3％、4％、5％，乳清粉添加量為2％，發(fā)酵劑接種量為10％，每隔1d測定蓮藕pH、總酸含量、質構和色度，結果如圖5～圖7所示。

圖5顯示出，鹽濃度越大，pH值降低的越慢。鹽濃度為1％時，發(fā)酵液pH值在第1d迅速降低，5d后達到平衡，且平衡后pH值低于其它各組，pH降到最低為3.41，一般泡菜成熟指標為3.5左右。鹽濃度為4％、5％時，菌株產(chǎn)酸受到了較大的影響，pH下降相對較緩慢。

另外從圖中也可以看出，1％和2％鹽濃度時產(chǎn)酸速度較快，總酸增加較多，最終維持在0.92％左右；5％鹽濃度時，總酸含量增加較慢，發(fā)酵第7d僅為0.74％。

由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，蓮藕的色度降低，但是總體上L*維持在70以上，鹽添加量為2％時，亮度最大，發(fā)酵7d后仍保持在80左右。

采用不同食鹽添加量腌制泡菜，發(fā)酵過程中微生物生長情況以及酸性環(huán)境有差異，蓮藕細胞的滲透壓、色素物質和參與美拉德反應的糖類等物質的不同，所以對色澤的影響不盡相同。也有研究表明，低鹽濃度能抑制褐變，鹽濃度過高會抑制乳酸菌的生長，影響其抗氧化能力，使蓮藕褐變速度加快?；趯οM者感官的考慮，選擇2％的食鹽濃度較為適宜。

由圖7可以看出，發(fā)酵7d后，3％食鹽濃度泡制蓮藕硬度損失較少，2％食鹽濃度的泡菜次之。這可能是此食鹽濃度下的相關微生物數(shù)量少，其產(chǎn)生分解細胞結構的酶量降低，且這些酶在較高濃度的NaCl中其活性也會受到影響，使得組織結構遭到破壞的程度降低，減少硬度損失。而鹽濃度過高，Na⁺可以通過置換蓮藕細胞多糖分子中的Ca²⁺，破壞細胞結構中多糖分子間的氫鍵導致分子的分散性增加，也可能導致其硬度降低。

食鹽濃度是影響泡菜發(fā)酵速度和品質的一個重要因素。食鹽濃度過低，腐敗微生物容易生長，泡菜質量難以保證，且產(chǎn)品風味欠佳；食鹽濃度過高，抑制乳酸菌生長，發(fā)酵速度較慢，發(fā)酵周期長，且風味難以被廣大人群接受。綜上所述，食鹽添加量為2％時，發(fā)酵蓮藕的風味、狀態(tài)較好，選其作為最適因素進行下一步研究。

3.3 接種量對蓮藕泡菜質構和風味的影響

乳清粉添加量為2％，鹽水濃度為2％，發(fā)酵劑接種量分別為5％、10％、15％、20％，20℃下發(fā)酵蓮藕，每隔1d測定蓮藕pH、總酸含量、質構和色度，結果如圖8～圖10所示。

由圖8可以看出，接種量對發(fā)酵產(chǎn)酸有較大影響，接種量越大，pH值降低速度越快。在發(fā)酵初始階段pH值下降較快，第3d開始，10％、15％和20％的接種量pH變化基本一致，到第7d時pH分別為3.28、3.27和3.14。隨著發(fā)酵的進行，總酸含量不斷增加，而且接種量越多產(chǎn)酸速度越快，當乳酸菌接種量為20％時，在發(fā)酵第7d總酸含量最高，達到0.97％，接種量為5％時，發(fā)酵7d總酸僅為0.78％。

由圖9可知，在5-15％范圍內菌株添加量越大，色度變化越小，發(fā)酵7d后能夠維持在75以上。添加量為20％時，色度下降較快，最終只有73左右。這可能是由于，在一定范圍內乳酸菌添加量越多，抗氧化能力越強，PPO酶和POD酶活被抑制。乳酸菌超過一定量，可能導致環(huán)境營養(yǎng)缺少，菌株生長繁殖被抑制，抗氧化活性下降，藕片在發(fā)酵過程中易褐變。

由圖10可以看出，5％接種量泡菜硬度損失較少，這可能是由于微生物數(shù)量較少，其產(chǎn)生分解細胞結構的酶量降低，組織結構遭到破壞的程度減少，從而硬度損失較低。

綜上所述，接種量過大會引起溶氧不足，從而影響產(chǎn)物合成，并且還會產(chǎn)生過多代謝廢物，對感官品質產(chǎn)生不良影響，而接種量過小會又影響發(fā)酵效率，延長發(fā)酵時間。當混合菌株添加量為10％時，蓮藕發(fā)酵產(chǎn)酸速率較快，發(fā)酵蓮藕的色度、硬度狀態(tài)較好，因此選其作為最適因素進行下一步研究。

3.4 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素試驗基礎上，選取對發(fā)酵蓮藕泡菜影響較大的三個因素，即接種量(A)、溫度(B)、鹽濃度(C)進行L9正交優(yōu)化實驗，以酸度、硬度和感官評價為指標，確定發(fā)酵豆乳的最佳工藝條件。發(fā)酵蓮藕泡菜工藝正交試驗結果見表3。

表3 發(fā)酵工藝正交試驗結果表

從極差分析結果可以看出，泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸的最佳組合為A2B2C3，溫度和接種量對總酸的影響較大，鹽濃度的影響較小，這三個因素對于總酸的影響都達到顯著水平。硬度方面，溫度和鹽濃度是亞硝酸鹽含量的重要影響因素，各因素影響大小為：C(鹽濃度)>B(溫度)>A(接種量)，最佳組合為A2B2C2。從感官評分上來看，溫度和鹽濃度對感官品質影響較大，各因素影響大小為：B＝C>A，最佳組合為A2B2C2。

因此，綜合考慮各因素指標，選擇最佳發(fā)酵條件為：A2B2C2，即接種量10％，溫度20℃，鹽濃度2％，此時蓮藕泡菜的總酸為1.017％，硬度為42.5N，感官得分為85。

4.輔料添加對蓮藕泡菜品質的影響

4.1 硬化劑添加對蓮藕泡菜的影響

選用硬化劑0.1％CaCl₂、0.1％MgCl₂、6％乳糖和1％葡萄糖浸泡洗凈切片的蓮藕，測定蓮藕浸泡前后質構變化，結果如圖10，用CaCl₂浸泡效果最佳，硬度顯著高于其他硬化劑效果(P<0.05)。這可能是因為氯化鈣具有凝固性，它可以使可溶性果膠凝固為凝膠狀不溶性果膠酸鈣，保持果蔬加工制品的脆度和硬度。并且鈣鹽能一定程度上抑制果膠甲酯酶等水解酶的活力，這些酶的水解作用使中膠層溶解，纖維分解，導致細胞壁發(fā)生明顯的變化，結構松散失去黏結性，此外果膠結構的變化使果蔬質地變軟、脆度降低。此外，鈣是人體內重要的無機成分，以鹽的形式存在于人體的各個組織內，具有多種生理功能，如調節(jié)神經(jīng)心肌，參與肌肉收縮，細胞分泌，凝血過程等，故氯化鈣也可以作為一種食品強化劑。，

4.2 乳清粉添加添加對蓮藕泡菜的影響

乳清粉添加量分別為1％、2％、3％、4％，鹽濃度為2％，發(fā)酵劑接種量為10％，20℃條件下接種發(fā)酵并且在相同條件下培養(yǎng)。發(fā)酵7d后測定蓮藕pH、總酸含量、質構和色度，并進行感官評價，結果見圖12～圖16。

由圖12和13可以看出，隨著乳清粉添加量的增加，pH先下降后上升，總酸含量先上升后下降。添加適量的乳清粉(2％、3％)情況下，其pH值更低，總酸更高，而且降速也更快。經(jīng)差異性分析得出，乳清粉添加量為3％，pH顯著低于其他濃度(P<0.05)。乳清粉添加量為2％和3％時，總酸含量顯著高于其他組(P<0.05)。

這可能是由于乳清粉的添加能夠為乳酸菌發(fā)酵提供營養(yǎng)因子，提高其產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量。當乳清粉濃度較高時，泡菜水呈黏稠狀，感官品質較差，而且過高的乳清粉濃度產(chǎn)生的高滲透壓還會抑制乳酸菌的發(fā)酵。

由圖14可以看出，2％加乳清粉量發(fā)酵蓮藕泡菜的色度明顯著高于其他組別(P<0.05)，一可能是由于過高的乳清粉添加量會使發(fā)酵液顏色變黃，引起非酶褐變使蓮藕泛黃，二是抑制了乳酸菌的生長使抗氧化活性下降，酶促褐變加強。

由圖15可以看出，添加1％-2％乳清粉時，硬度增加，超過2％，硬度隨著乳清粉濃度的提高而降低。

根據(jù)圖16可以得出，乳清粉添加量在2％和3％范圍內感官品質較好，感官評分維持在80分以上，顯著高于其他濃度水平(P<0.05)。

乳清粉添加量少，乳酸菌所需的營養(yǎng)物質少不利于生長繁殖；乳清粉添加量過多會影響泡菜的風味，并且從養(yǎng)生保健的角度上也不推薦。因此，綜合考慮不同乳清粉添加量對發(fā)酵蓮藕pH值、總酸、色度、硬度以及感官評定結果，選擇2％為乳清粉添加水平用于后續(xù)的響應面設計實驗。

4.3 辣椒、大蒜、生姜添加對蓮藕泡菜的影響

腌制泡菜時加入辣椒、大蒜和生姜，可以提升泡菜的風味。辣椒洗凈后直接添加，大蒜、生姜經(jīng)清洗、削皮、切條或切片后添加。在蓮藕泡菜發(fā)酵時，分別添加1％、2％、3％、4％、5％的大蒜、辣椒和生姜，乳清粉添加量添加量為2％，發(fā)酵劑接種量為10％，20℃條件下接種發(fā)酵并且在相同條件下培養(yǎng)。發(fā)酵7d后測定相關指標。結果見圖17～圖22。

圖17和圖18顯示，辣椒添加量為2％時產(chǎn)酸最多，pH最低。當添加量大于3％，pH升高、總酸降低。大蒜添加量為2％和3％時pH顯著低于其他組別(P<0.05)，酸度顯著高于其他組別(P<0.05)。生姜添加量為3％時pH最低，酸度顯著高于其他組別(P<0.05)。

由圖可以看出，辣椒添加量為1-3％時，色度隨著添加量的增加而增加，添加量為3％時，色度顯著高于其他組別(P<0.05)，超過3％則降低，可能是由于辣椒本身色素溶出。辣椒中的辣椒素具有抗炎及抗氧化作用，能抑制蓮藕的褐變。

大蒜的添加量為2％和3％時，色度顯著高于其他組別(P<0.05)。蒜氨酸及其分解產(chǎn)物是大蒜及其制品發(fā)揮抗氧化作用的重要成分。另外大蒜里的含硒化合物具有很強的抗氧化作用,可以減少自由基的破壞，具有一定的防癌、抗癌功效。

生姜添加量為2％時色度顯著高于其他組(P<0.05)。生姜中含有姜醇、姜酌、姜酮等活性物質，這些物質具有較好抗氧化功能，從而抑制蓮藕的褐變。

由圖20可以看出，辣椒添加量為2％時，硬度為51.4N，顯著高于其他組(P<0.05)。大蒜添加量為3％時，硬度為53.7N，顯著高于其他組(P<0.05)。生姜添加量為2％時，硬度為47.1N，顯著高于其他組(P<0.05)。

從圖21中可以看出辣椒添加量在3％及以下為宜，大蒜添加量在2％和3％時感官評分較高，生姜添加量在2％和3％為宜，過量則會降低泡菜品質，影響感官。

在泡菜腌制過程中，辣椒起調和諸味、增加鮮味的作用。大蒜能夠為泡菜提香，刺激人們的食欲，適量的生姜也可抑菌、去除異味以及賦予泡菜良好風味。但是，辣椒添加量過多，會使泡菜過辣，影響食用愉悅性。大蒜添加量過多，會使泡菜刺激性蒜辣味過大，掩蓋了泡菜本身的發(fā)酵香味和蓮藕的清香。

綜合上述指標，選取辣椒添加量2％、大蒜添加量3％以及生姜添加量2％作為最適添加量進行下一步試驗。

4.4 香料添加對蓮藕泡菜的影響

花椒：荷葉：八角＝2：1：1，分別按2‰、4‰、6‰、8‰直接添加，乳清粉添加量為2％，鹽濃度為2％，發(fā)酵劑接種量為10％，20℃條件下接種發(fā)酵并且在相同條件下培養(yǎng)，發(fā)酵7d后測定相關指標，結果見圖22～圖26。

由圖22可知，香料添加量為4‰時，pH顯著低于其他組(P<0.05)。添加量為6‰時，酸度顯著高于其他組(P<0.05)。研究表明，添加花椒能顯著促進乳酸菌生長。

從圖24可以看出，添加2‰和4‰的香料蓮藕泡菜色度顯著高于其他組(P<0.05)。這可能是由于花椒中主要活性成分生物堿、揮發(fā)油、多糖、黃酮均有不同程度的抗氧化及酪氨酸酶抑制活性，其中生物堿的酪氨酸酶抑制活性最強。八角和荷葉提取物也都具有抗氧化功能，可以抑制褐變引發(fā)酶活性。所以適量的添加香料能抑制蓮藕的褐變。

從圖25可以看出，香料添加2‰，硬度顯著高于其他組(P<0.05)。添加過多香料可以使發(fā)酵液中的滲透壓升高，蔬菜中的營養(yǎng)物質溶出，加快了微生物繁殖，可能使溶解細胞壁的酶含量身高，破壞細胞結構，使蓮藕泡菜硬度降低。

從圖26可以看出，香料添加量為4‰時，感官得分顯著高于其他組(P<0.05)，超過4‰，感官評分下降。泡菜生產(chǎn)中加入不同比例的天然物質，可以增進泡菜的風味。香料在泡菜鹽水中起增香、除異、去腥的功效，甚至還可以可以保持泡菜色鮮。但是香料添加過多會使刺激性氣味掩蓋泡菜原本的風味，也會使發(fā)酵液發(fā)黃渾濁，對產(chǎn)品產(chǎn)生不良影響。

綜上所述，香料添加量為4‰時對泡菜總酸、色度、硬度影響較好，感官得分較高。

4.5 響應面優(yōu)化輔料添加比例

4.5.1 輔料添加PB試驗

在前期試驗基礎上，采用部分因子試驗設計方法對乳清粉、硬化劑、辣椒、生姜、大蒜和香料等六個因素進行篩選，從中篩選出對蓮藕發(fā)酵影響較大的因素，結果如表6和表7所示。

表6 Plackett-Burman設計表及實驗結果

表7 Plackett-Burman實驗各因素的效應表

6個因素中對響應值影響的顯著性如表7所示，因此，以感官得分為響應值則應選乳清粉添加量、辣椒添加量以及香料添加量作為后續(xù)試驗的主要研究因素。

4.5.2 Box-Behnken實驗設計

在上述已經(jīng)選取的3個單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設計原理，選擇乳清粉添加量(A)、辣椒添加量(B)和香料添加量(C)作為響應面優(yōu)化的考察因素，以產(chǎn)品感宮評價為響應值，設計三因素三水平試驗，試驗結果見表8。

表8 BBD實驗設計及實驗結果

4.5.3 各因素對發(fā)酵蓮藕感官評價的響應面分析

用Design-Expert對表8中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，感官評價Y對乳清粉添加量(A)、香料添加量(B)和辣椒添加量(C)三個因素的二次多項式回歸模型分析結果為：Y＝78.20+0.63A+0.50B-0.38C+1.50AB-2.25AC+0.000B C-1.98A²-2.23B²-3.97C²

對Y回歸模型分別進行方差分析和顯著性試驗，結果見表9。由表9數(shù)據(jù)可知，該模型極顯著(P＝0.0034<0.05)。失擬項(P＝0.7065>0.05)不顯著，說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結果，試驗誤差較小，能充分表明各因素之間的關系。

在所研究的各因素水平范圍內，C²表現(xiàn)極顯著，說明辣椒添加量對感官的影響最大，選擇合適的辣椒添加量對于控制最終產(chǎn)品風味具有非常重要的作用。其次是香料和乳清粉添加量。因此，對感官的影響依次為C>B>A，即辣椒添加量>香料添加量>乳清粉添加量。

從圖26～圖29中看出各因素之間的交互作用對發(fā)酵蓮藕感官的影響并不是簡單的線性關系。葡萄乳清粉添加量和辣椒交互作用的等高線圖也為楠圓，說明A與C交互作用顯著，對發(fā)酵蓮藕感官的而影響很大。其次是乳清粉添加量和香料添加量次之，香料添加量和辣椒添加量交互作用最小。C.V表示實驗本身的精確度，其值越小，表明實驗的可靠性越高，本實驗中C.V較低，為1.76％，說明實驗的操作可信度高，可用于預測發(fā)酵產(chǎn)品的感官品質，因此此模型具有一定的實踐指導意義。

表9 二次多項模型及各項的方差分析

為檢驗響應面曲線法所得結果的可靠性，進一步確定最佳條件，在模型濃度范圍內選擇為基礎，按照模型使用快速上升法進行優(yōu)化，發(fā)酵蓮藕得到最高感官評價分值的配方組合為：乳清粉添加量2.32％，香料添加量為4.44‰，辣椒添加量為1.86％，根據(jù)之前實驗確定的CaCl₂添加0.1％、生姜添加3％以及大蒜添加3％，鹽2％，溫度20℃，由此配方制成的蓮藕泡菜感官得分較好為78.38分。

4.6 驗證試驗

按優(yōu)化后的蓮藕發(fā)酵條件和輔料添加量進行3次平行試驗，發(fā)酵7d后測定各項指標。結果顯示，接種發(fā)酵蓮藕的各項指標值為硬度46.16N，色度77.65，pH為3.49，總酸1.09％，感官評分為77.5分，結果與預測值非常接近。因此說明優(yōu)化結果準確可靠，響應面法對蓮藕發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行的，具有一定的實際應用價值。

5 蓮藕自然和純種發(fā)酵理化指標的分析比較

純種發(fā)酵組采用最佳工藝條件和輔料添加比例，自然發(fā)酵組除不接種發(fā)酵劑之外其余條件均相同，以新鮮蓮藕為對照，發(fā)酵7d檢測蓮藕泡菜的主要成分，包括：pH值、總酸、色度、質構、食鹽含量、亞硝酸鹽含量、VC含量及氨基態(tài)氮含量等，結果如表10所示。

表10 自然和純種發(fā)酵過程中主要成分的差異

由表10可知，從水分來看，自然發(fā)酵的蓮藕泡菜水分顯著高于純種發(fā)酵，但是低于新鮮蓮藕(P<0.05)；從淀粉含量來看，純種發(fā)酵顯著低于自然發(fā)酵和新鮮蓮藕，可能是由于乳酸菌分解淀粉能力較強。從蛋白質含量來看，純種發(fā)酵同樣顯著低于自然發(fā)酵和新鮮蓮藕，可能是由于乳酸菌細胞內蛋白酶活力較強，能直接分解和利用蛋白質。純種發(fā)酵的總糖含量顯著低于其他兩組，可能是因為乳酸菌糖代謝較強。三種蓮藕的灰分含量幾乎相同，差異性不顯著(P>0.05)。純種發(fā)酵的總酸含量顯著高于其他兩組(P<0.05)，乳酸菌是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，產(chǎn)生大量乳酸。兩種發(fā)酵方式的蓮藕VC含量都顯著低于新鮮蓮藕(P<0.05)，這可能是由于VC不僅滲透到了泡菜液中，也可能被微生物分解利用。多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的主要酶類，能催化果蔬原料中的內源性多酚物質氧化生成黑色素，嚴重影響制品的營養(yǎng)，風味及外觀品質。過氧化物酶也能催化酚類、類黃酮的氧化和聚合，導致組織褐變。純種發(fā)酵的PPO酶和POD酶活力均小于自然發(fā)酵(P<0.05)，可能是由于乳酸菌的抗氧化活性較高。

從鹽度來看，發(fā)酵過程中，自然發(fā)酵的泡菜吸收的鹽較多，純種發(fā)酵的泡菜的含鹽量較少。低鹽泡菜符合現(xiàn)代食品工業(yè)低鹽綠色健康的趨勢。無論是自然或是純種發(fā)酵，泡菜總氨基氮含量都顯著低于新鮮蓮藕(P<0.05)，這是因為泡菜發(fā)酵過程中氨基氮會不斷溶出以及作為氮源被微生物生長繁殖所利用，發(fā)酵7d后，純種發(fā)酵泡菜總氨基氮含量高于自然發(fā)酵組，維持在0.1％左右。

從亞硝酸鹽來看，發(fā)酵7d后，純種發(fā)酵泡菜亞硝酸鹽含量僅為0.68mg/kg顯著低于自然發(fā)酵泡菜的1.55(P<0.05)，這可能與體系的pH值降低和總酸度增加有關。兩種發(fā)酵方式泡菜樣品中生物胺的總量為201.74和266.02mg/kg，按FDA規(guī)定，兩種發(fā)酵方式的泡菜樣品生物胺總量均在安全范圍內，純種發(fā)酵泡菜含量較少，安全性較高。

綜上所述，從蓮藕的主要成分來看，純種發(fā)酵優(yōu)于自然發(fā)酵。

6 蓮藕泡菜殺菌條件的確定

微生物的活動會引起低鹽泡菜腐敗，導致儲藏時間短。因此，要延長泡菜的保質期必須在加工過程中控制微生物的數(shù)量。高溫殺菌可殺死絕大部分微生物，但溫度過高也會使泡菜脆度降低、組織軟化甚至風味變劣。本試驗具體的殺菌條件分別為：A：65℃，30min；B：75℃，20min；C：85℃，15min；D：95℃，10min；E：100℃，5min。每個樣品經(jīng)過殺菌后，冷卻至室溫，對樣品進行活菌計數(shù)以及感官評價，選定最佳的巴氏殺菌條件，結果如表11所示。

表11 不同殺菌條件對酸菜的影響

從表11可以看出，不同殺菌條件對蓮藕泡菜的影響比較大，C組的殺菌條件最為適合，即達到了殺菌的目的，又保持了蓮藕泡菜原有的風昧。溫度在65℃-75℃之間，仍可以從樣品中檢測到活菌，未達到殺菌的目的，這會對常溫下保存的蓮藕泡菜產(chǎn)生影響；而溫度過高時(>85℃)，雖然達到了一個很好的殺菌效果，但是會對蓮藕泡菜的品質產(chǎn)生影響，使得泡菜的質地變軟、色澤變暗。因此選擇C組作為蓮藕泡菜的殺菌條件，即殺菌溫度為85℃，殺菌時間15min。

7 蓮藕泡菜成品貯藏試驗

將巴氏滅菌的蓮藕泡菜常溫保存5d、10d、15d、20d、25d、30d，分別測定理化指標和微生物指標。結果如圖30～圖33所示。

由圖30可以看出，巴氏殺菌后的蓮藕泡菜在30d內，pH和酸度呈波動變化，pH維持在2.9-3.0之間，酸度在0.9％-1.0％之間，符合商業(yè)化生產(chǎn)的需求。

由圖31可以看出，接種發(fā)酵蓮藕泡菜鹽度在常溫儲藏15d后基本保持穩(wěn)定，鹽度較低維持在1.872％左右，低鹽泡菜綠色健康，對身體有益，符合現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展趨勢。

由圖32可以看出蓮藕泡菜在常溫下保藏15d時出現(xiàn)了亞硝峰，之后亞硝酸鹽含量下降，逐漸穩(wěn)定。在30d時僅為0.43mg/kg，遠遠小于國標要求，說明發(fā)酵蓮藕泡菜常溫下貯藏安全性較高。

由圖33可以看看出泡菜的感官變化，蓮藕泡菜在一個月內能保持較好的品質，僅滋味略有變化，質地稍微發(fā)軟，其他方面并沒有明顯的變化，仍然保持了泡菜的獨特良好風味。此外，同時對泡菜進行了微生物檢測，大腸桿菌﹤30MPN·(100g)^-1，沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等其他致病菌未檢出。因此，本試驗制備的新型蓮藕泡菜在常溫下保藏品質基本穩(wěn)定，安全性較好。

實施例1

選取成熟度高，無腐爛變質無機械損傷和蟲害斑點的蓮藕100.0kg，經(jīng)流動水洗凈附著在上面的雜質，用自動切片機去皮、切片(0.3cm-0.8cm)，再用清水沖洗干凈。

在泡菜壇內加人大蒜3kg、生姜2kg、辣椒1.86kg、以及香料0.44kg(花椒：荷葉：八角＝2:1:1)，投入預處理過的蓮藕片，加入90升溶有食鹽2kg、乳清粉2.3kg的涼開水，接種10升的植物乳桿菌grx15混合發(fā)酵劑，水封。當蓮藕泡菜pH達3.5左右，泡菜鹵和泡菜的鹽濃度一致時取出調味，包裝成約500g的小袋，真空密封。采用巴氏滅菌法，在85℃水浴中加熱15min，取出后迅速用冷水冷卻，即得到蓮藕泡菜成品。

實施例2

選取細長脆嫩、無機械損傷和蟲害斑點的藕帶100.0kg，經(jīng)流動水洗凈附著在上面的雜質，用自動切片機去皮、切段(10cm)，再用清水沖洗干凈。

在泡菜壇內加人大蒜2kg、生姜2kg、辣椒2kg、以及香料0.2kg(花椒：荷葉：八角＝2:1:1)，投入預處理過的藕帶，加入90升溶有食鹽2kg、乳清粉2kg的涼開水，接種10升的植物乳桿菌grx15混合發(fā)酵劑，水封。當藕帶泡菜pH達3.5左右，泡菜鹵和泡菜的鹽濃度一致時取出調味，包裝成約500g的小袋，真空密封。采用巴氏滅菌法，在85℃水浴中加熱15min，取出后迅速用冷水冷卻，即得到藕帶泡菜成品。