本發(fā)明涉及一種以啤酒糟為原料二次混菌發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料的方法，屬于飼料加工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外普遍采用烘干的方法來(lái)保存啤酒糟，雖然有效解決了啤酒糟容易腐敗的問(wèn)題，減少環(huán)境污染，同時(shí)便于儲(chǔ)運(yùn)。但由于啤酒糟中的粗纖維含量過(guò)高，動(dòng)物適口性差，使用面不大、市場(chǎng)價(jià)格不高，加上設(shè)備投入、人工及能耗等因素，出現(xiàn)了賣(mài)鮮糟比賣(mài)干糟還賺錢(qián)的情況，有些啤酒公司出現(xiàn)烘干設(shè)備閑置。

啤酒糟直接作為飼料，一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。鄧啟華^[1]對(duì)啤酒糟生產(chǎn)豬飼料關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了研究，采用預(yù)處理技術(shù)、酶解和益生菌發(fā)酵技術(shù)降解啤酒糟的纖維含量，改善蛋白品質(zhì)，提高啤酒糟的飼喂價(jià)值。以糖糟和啤酒糟為原料，接入酵母菌^[2]，多菌株優(yōu)化組合如枯草芽孢桿菌，熱帶假絲酵母固態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料^[3-6]，且含有多種消化酶。利用響應(yīng)面分析方法，對(duì)優(yōu)化啤酒糟固態(tài)發(fā)酵制備蛋白飼料的條件進(jìn)行了進(jìn)一步的研究^[7]。孫丹鳳^[8]等對(duì)發(fā)酵啤酒糟飼料進(jìn)行豬、雞等飼喂試驗(yàn)，結(jié)果表明效果良好。

目前，未見(jiàn)有啤酒糟二次混菌發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)高蛋白啤酒糟飼料的相關(guān)報(bào)道。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄧啟華.啤酒糟生產(chǎn)豬飼料關(guān)鍵技術(shù)研究[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2010

[2]郭建華,竇少華,邱然,等.利用糖糟和啤酒糟生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].飼料工業(yè),2005,26(1):4-5

[3]蔡俊.啤酒糟發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2001,(3):30-31

[4]陶敏,王維嘉,蔡俊. 啤酒糟發(fā)酵產(chǎn)高蛋白飼料菌種的配伍[J].飼料工業(yè).2011,32(11):58-61

[5]王穎,馬海樂(lè).混菌固態(tài)發(fā)酵啤酒糟生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].飼料工業(yè),2010,31(17):26-28

[6]王成濤,朱桂華,馬玉君,等.糟渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的發(fā)酵條件的優(yōu)化及效果[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2002,14(3):72-75

[7]安曉萍,齊景偉,烏蘭,等.響應(yīng)面優(yōu)化啤酒糟固態(tài)發(fā)酵制備蛋白飼料的條件研究[J].糧食與飼料工業(yè).2013.(2):40-43

[8]孫丹鳳,王友煒,王聰,等.發(fā)酵啤酒糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定及對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響[J].飼料工業(yè),2009,30(17):26-28。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前啤酒糟發(fā)酵使作固態(tài)混菌發(fā)酵中，菌種一次添加，對(duì)產(chǎn)品發(fā)酵勢(shì)必造成微生物間的相互影響，為提高啤酒糟的使用效率，本發(fā)明通過(guò)選使用纖維素分解能力強(qiáng)的霉菌分解纖維素，為后續(xù)發(fā)酵提供糖源，再添加酵母菌和枯草芽孢桿菌，以霉菌分解纖維素產(chǎn)生的糖源進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵，達(dá)到充分利用纖維素，提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的目的的一種以啤酒糟為原料二次混菌發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料的方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種以啤酒糟為原料二次混菌發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料的方法，包括以下制備步驟：

（1）以重量計(jì)，把啤酒糟與麩皮以6-10:2的比例配置，再加入1-3倍的水，混勻后進(jìn)行滅菌；

（2）滅菌后，進(jìn)行混菌接種進(jìn)行第一次發(fā)酵，混菌接種量為18-22%，所述混菌為黑曲霉和木霉，在28-32℃下培養(yǎng)2-4天；

（3）第一次發(fā)酵結(jié)束后，再添加硫酸銨3%-7%，尿素1-3%，混菌接種后進(jìn)行第二次發(fā)酵，所述混菌為啤酒酵母和枯草芽孢桿菌，或飼料酵母和枯草芽孢桿菌，接種量為15%-18%，在溫度30-35℃下培養(yǎng)3-5天，即可得到高蛋白飼料。

所述的方法，優(yōu)選地，步驟（2）中，黑曲霉和木霉的比例為6:4；啤酒酵母與枯草芽孢桿菌的比例或飼料酵母與枯草芽孢桿菌的比例為5:1；步驟（1）中，滅菌條件為115℃，15min。

所述的方法，優(yōu)選地，步驟（1）中，啤酒糟與麩皮以8:2的比例配置，再加入2倍的水；步驟（2）中，混菌接種量為18-22%，在30℃下培養(yǎng)3天；步驟（3）中，添加硫酸銨3.46%，尿素2%，啤酒酵母和枯草芽孢桿菌的接種量為16.26%，或飼料酵母和枯草芽孢桿菌接種量為16.51%，在溫度35℃下培養(yǎng)4天。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明以啤酒糟為原料，利用黑曲霉和康氏木霉進(jìn)行第一次發(fā)酵，在30℃下培養(yǎng)3天時(shí)，纖維素酶活為731.603nkat。以第一次發(fā)酵的啤酒糟為原料，添啤酒酵母與枯草芽孢桿菌組合進(jìn)行第二次混菌發(fā)酵，添加硫酸銨3.46%，理論粗蛋白質(zhì)含量38.11%；添加飼料酵母與枯草芽孢桿菌組合進(jìn)行第二次混菌發(fā)酵時(shí)，理論粗蛋白質(zhì)含量43.38%。本發(fā)明方法在進(jìn)行發(fā)酵的過(guò)程中，分兩步進(jìn)行添加菌種，來(lái)分步達(dá)到所需目的，首先降低培養(yǎng)基中粗纖維的含量，再提高培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的含量，可以更好的生產(chǎn)出所需的高蛋白飼料。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅僅作示例說(shuō)明。

實(shí)施例一：

請(qǐng)參見(jiàn)圖1，菌體的初篩：確定菌種是否能利用啤酒糟的營(yíng)養(yǎng)成分生長(zhǎng)。

250mL三角瓶中裝入經(jīng)處理的啤酒糟和麩皮共30g（采取啤酒槽與麩皮的比例為8:2），作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

在250mL的燒杯中加入發(fā)酵培養(yǎng)基30g，加入0.5倍蒸餾水，在115℃滅菌15min后，接入20%的種子液（混菌為等比例分配），在32℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)3天。

當(dāng)所使用的發(fā)酵培養(yǎng)條件一致時(shí)，所接入的菌種分別為黑曲霉、康氏木霉、曲霉、青霉、康氏木霉、黑曲霉和康氏木霉、黑曲霉和青霉、康氏木霉和曲霉、康氏木霉和青霉、曲霉和青霉、黑曲霉和康氏木霉和曲霉、黑曲霉和康氏木霉和青霉、康氏木霉和曲霉和青霉、黑曲霉和曲霉和青霉，分別計(jì)算接入不同菌種，培養(yǎng)基產(chǎn)生的纖維素酶活的量。

選擇的合適的菌種，進(jìn)行進(jìn)一步配伍實(shí)驗(yàn)。

優(yōu)良啤酒糟發(fā)酵菌株配伍與優(yōu)化：以啤酒糟為主要培養(yǎng)基，以纖維素酶總活力為指標(biāo)，選擇具有良好纖維素酶高產(chǎn)霉菌菌株，并通過(guò)配伍成優(yōu)良菌群；以蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)，優(yōu)選優(yōu)良啤酒糟酵母菌株，并與芽孢桿菌優(yōu)化配伍成優(yōu)良菌群。

對(duì)兩種不同酵母菌分別進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得出最佳發(fā)酵菌種。

一次混菌發(fā)酵條件選擇與優(yōu)化：以還原糖糖化率為考察指標(biāo)，通過(guò)纖維菌接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、加水量進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳工藝條件。

在單一菌發(fā)酵中，以發(fā)酵時(shí)間、含水量、接種量和溫度為試驗(yàn)因子，進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品粗纖維含量為考察指標(biāo)。

為考察混菌發(fā)酵效果，以發(fā)酵時(shí)間、含水量、菌種比、接種量和溫度為試驗(yàn)因子，進(jìn)行五因素四水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品粗纖維含量為考察指標(biāo)。

通過(guò)SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 22）對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出最佳工藝條件。

二次混菌發(fā)酵條件選擇與優(yōu)化：根據(jù)啤酒糟的營(yíng)養(yǎng)成分的確定影響因子，進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)重要因子進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，并進(jìn)行培養(yǎng)條件的驗(yàn)證。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)：通過(guò)前期試驗(yàn)，選取影響發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的可能因素，包括硫酸銨、尿素、接種量、菌種比、溫度、時(shí)間。為了對(duì)這6個(gè)因素進(jìn)行全面考察，選用了Plackett-Burman設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取2個(gè)水平，粗蛋白質(zhì)含量作為響應(yīng)值Y?？疾旄饕蛩氐闹餍?yīng)和交互作用，確定重要影響因素。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到，影響粗蛋白質(zhì)含量的主要因子，再以這3個(gè)因素進(jìn)入下一步的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面分析：根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選的3個(gè)主要影響因素，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以粗蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。最后通過(guò) Minitab軟件處理，得到最佳工藝。

以啤酒糟（燕京啤酒（衡陽(yáng)）有限公司提供）和麩皮按重量比8:2混合后為原料（培養(yǎng)基），利用黑曲霉（Aspergillus niger）（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供）和康氏木霉（T.koningi AS3.2774）（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供）進(jìn)行一次發(fā)酵，按重量計(jì)，發(fā)酵時(shí)加水量為啤酒糟和麩皮的總重量的2倍，黑曲霉：木霉為6:4的混菌接種量為20%（接種量為培養(yǎng)基體積的20%），在30℃下培養(yǎng)3天時(shí)，纖維素酶活為731.603nkat。以第一次發(fā)酵的啤酒糟為原料，并添加硫酸銨3.46%（添加量為培養(yǎng)基體積的3.46%），尿素2%（添加量為培養(yǎng)基體積的2%），啤酒酵母（Sac-charomyces cerevisiae）（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供）組合進(jìn)行第二次混菌發(fā)酵，最佳條件為溫度35℃，培養(yǎng)4天，接種量16.26%（接種量為培養(yǎng)基體積的16.26%），啤酒酵母比枯草芽孢桿菌的比例為5:1，理論粗蛋白質(zhì)含量38.11%（凱氏定氮法）。

實(shí)施例二：

以啤酒糟（燕京啤酒（衡陽(yáng)）有限公司提供）和麩皮按重量比8:2混合后為原料（培養(yǎng)基），利用黑曲霉（Aspergillus niger）和康氏木霉（T.koningi）進(jìn)行一次發(fā)酵，按重量計(jì)，發(fā)酵時(shí)加水量為啤酒糟的2倍，黑曲霉：木霉為6:4的混菌接種20%（接種量為培養(yǎng)基體積的20%），在30℃下培養(yǎng)3天時(shí)，纖維素酶活為731.603nkat。以第一次發(fā)酵的啤酒糟為原料，添加硫酸銨5.00%，尿素2%，飼料酵母（AS2.1180）（湖南湖南輕工研究院提供）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）組合進(jìn)行第二次混菌發(fā)酵時(shí)，最佳條件為溫度33.73℃，培養(yǎng)4天，接種量16.51%，飼料酵母比枯草芽孢桿菌的比例為5:1，理論粗蛋白質(zhì)含量43.38%（凱氏定氮法）。