一種具有結(jié)合糖能力的碳水化合物結(jié)合組件及其應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有結(jié)合糖能力的碳水化合物結(jié)合組件及其應(yīng)用。本發(fā)明公開一種蛋白，為如下(1)或(2)所示：(1)SEQIDNo.2所示的多肽；(2)將SEQIDNo.2所示的多肽的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開的CBMUmcel5D及其編碼DNA序列可應(yīng)用于糖的特異性結(jié)合方面?！緦＠f明】一種具有結(jié)合糖能力的碳水化合物結(jié)合組件及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種碳水化合物結(jié)合組件及其應(yīng)用；特別涉及一種具有結(jié)合糖能力的碳水化合物結(jié)合組件及其應(yīng)用，屬于生物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]纖維素酶是水解纖維素鏈的β_1，4糖苷鍵的酶的總稱，根據(jù)它們對(duì)纖維素水解方式的不同分為三類：內(nèi)切一β-1，4一葡聚糖酶（endo-β-1，4-glucanase,EC3·2·l·4)、外切一β-l，4一葡聚糖酶（exo-β-l，4-glucanase，又叫纖維二糖水解酶cellobiohydrolase,EC3.2.I.91)和β-葡萄糖昔酶（β-glucosidase,EC3.2.1.21)。這三種酶協(xié)同作用能將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖（LyndLR,WeimerPJ,vanZylWHjandPretoriusIS.2002.Microbialcelluloseutilization:fundamentalsandbiotechnology.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506-577.)D大部分纖維素酶由一個(gè)或幾個(gè)催化功能域和一個(gè)或更多個(gè)其它的功能域如碳水化合物結(jié)合組件（carbohydrate-bindingmodules，CBMs)組成，兩者間由連接肽連接（Shoseyov0,ShaniZ，andLevyI.2006.Carbohydratebindingmodules:biochemicalpropertiesandnovelapplications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:283-295.)〇[0003]第一個(gè)碳水化合物結(jié)合組件是1986年在瑞氏木霉（Trichodermareesei)的纖維二糖水解酶I中發(fā)現(xiàn)的，最初該結(jié)構(gòu)域被命名為纖維素結(jié)合功能域（cellulose-bindingdomain，CBD)，以它能識(shí)別和吸附纖維素而命名（VanTilbeurghH，To_eP，ClaeyssensM，BhikhabhaiR.andPetterssonG.1986.LimitedproteolysisofthecellobiohydrolaseIfromTrichodermareesei.FEBSLett.204:223-227)D后來發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域不僅能吸附纖維素，還能識(shí)別和吸附植物細(xì)胞壁其他的多糖成分，包括幾丁質(zhì)、β-1，3-葡聚糖、β-1，3-1，4-葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等，還有些碳水化合物結(jié)合組件可以結(jié)合不可溶的儲(chǔ)存多糖，例如淀粉，所以現(xiàn)在將具有這樣性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域命名為碳水化合物結(jié)合組件。碳水化合物結(jié)合組件不僅在纖維素酶中被發(fā)現(xiàn)，在其他的酶類或蛋白中也有發(fā)現(xiàn)，如糖基水解酶、酯酶、果膠酶等。[0004]碳水化合物結(jié)合組件一般位于酶的氨基端或羧基端，其大小通常大于30個(gè)氨基酸及小于250個(gè)氨基酸，所以其分子量一般大于4k道爾頓和小于40k道爾頓。根據(jù)氨基酸序列相似性，碳水化合物結(jié)合組件被劃分成不同的家族（families)。根據(jù)Cazy服務(wù)器（server)(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列碳水化合物結(jié)合組件的最新清單，目前碳水化合物結(jié)合組件被分為59個(gè)家族。隨著新的酶的發(fā)現(xiàn)，同時(shí)伴隨著新的家族的碳水化合物結(jié)合組件的被發(fā)現(xiàn)。一系列未知功能的結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被鑒定為新的碳水化合物結(jié)合組件（BolamDN，XieH，PellG，HoggD，GalbraithG，HenrissatB，andGilbertHJ.2004.X4modulesrepresentanewfamilyofcarbohydrate-bindingmodulesthatdisplaynovelproperties.J.Biol.Chem.279:22953-22963；DvortsovI.A,LuninaNA,ChekanovskayaLA,SchwarzWHjZverlovVV，andVelikodvorskayaGA.2009.Carbohydrate-bindingpropertiesofaseparatelyfoldingproteinmodulefrombeta-1,3-glucanaseLicl6AofClostridiumthermocellum.Microbiology155:2442-2449.)〇[0005]碳水化合物結(jié)合組件的主要功能是識(shí)別和吸附多糖，它通過增加底物表面酶的濃度提高酶對(duì)可溶或不可溶底物的活性（BeguinP，andAubertJP.1994.Thebiologicaldegradationofcellulose.FEMSMicrobiol.Rev.13:25-58；Shoseyov0,ShaniZ，andLevyI.2006.Carbohydratebindingmodules:biochemicalpropertiesandnovelapplications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:283-295)。另外，CBM還有其他的一些功能，如有些CBM可以破壞底物的結(jié)構(gòu)，使晶體結(jié)構(gòu)變得松散，有利于酶更好地作用底物(LevyI，ShaniZjandShoseyov0.2002.Modificationofpolysaccharidesandplantcellwallbyendo_l，4_beta_glucanaseandcellulose-bindingdomains.Biomol.Eng.19:17-30；GiardinaT，GunningAP，JugeN，F(xiàn)auldsCB，F(xiàn)urnissCSjSvenssonB，MorrisVJ，andWilliamsonG.2001.Bothbindingsitesofthestarch-bindingdomainofAspergillusnigerglucoamylaseareessentialforinducingaconformationalchangeinamylose.J.Mol.Biol.313:1149-1159·)。有些碳水化合物結(jié)合組件可以增強(qiáng)酶對(duì)溫度和pH的穩(wěn)定性（SunnaA，GibbsMD，andBergquistPL.2000.Anovelthermostablemultidomain1，4-beta-xylanasefromCaldibacilluscellulovoransandeffectofitsxylan-bindingdomainonenzymeactivity.Microbiology146:2947-2955.)。近來還發(fā)現(xiàn)家族35和37的碳水化合物結(jié)合組件還能結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞的表面，介導(dǎo)攜帶該組件的酶結(jié)合到宿主的表面（MontanierC，vanBuerenALjDumonCjFlintJE，CorreiaMA，PratesJA，F(xiàn)irbankSJjLewisRJ，GrondinGG，GhinetMG，GlosterTMjHerveCjKnoxJP，TalbotBG，TurkenburgJPjKerovuoJjBrzezinskiR，F(xiàn)ontesCM，DaviesGJ，BorastonAB，andGilbertHJ.2009.Evidencethatfamily35carbohydratebindingmodulesdisplayconservedspecificitybutdivergentfunction.Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:3065-3070;EzerA，MatalonE，JindouSjBorovokI，AtamnaN，YuZ，MorrisonMjBayerEA，andLamedR.2008.Cellsurfaceenzymeattachmentismediatedbyfamily37carbohydrate-bindingmodules,uniquetoRuminococcusalbus.J.Bacteriol.190:8220-8222.)〇[0006]自然界大部分的微生物在實(shí)驗(yàn)室的條件下是不容易被分離和培養(yǎng)的，一般認(rèn)為可培養(yǎng)的微生物種類只占自然界中微生物種類的約1%(AmannRI，LudwigW，andSchleiferKΗ.1995.Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation.Microbiol.Rev.59:143-169；CardenasE，andTiedjeJM.2008.Newtoolsfordiscoveringandcharacterizingmicrobialdiversity.Curr.Opin.Biotech.19:544-549)，剩余的約99%的不可培養(yǎng)的微生物中蘊(yùn)藏著大量的基因資源。近年來從環(huán)境樣品未培養(yǎng)微生物中提取基因組DNA然后構(gòu)建混合基因組DNA文庫以分離基因已是成熟技術(shù)（LorenzP，andEckJ.2005.Metagenomicsandindustrialapplications.Nat.Rev.Microbiol.3:510-516.)〇宏基因組學(xué)方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到從各種環(huán)境樣品的未培養(yǎng)微生物中挖掘新的具有生物催化活性的酶的基因，現(xiàn)在已經(jīng)從未培養(yǎng)微生物中鑒定了很多新酶的基因，包括編碼一些新家族的水解酶類的基因，說明宏基因組學(xué)方法是得到新基因的好方法。[0007]反芻動(dòng)物的瘤胃是自然界中纖維素降解最劇烈的主要場所之一，植物的纖維素類物質(zhì)是被瘤胃中共生的纖維素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物和古細(xì)菌。目前研宄認(rèn)為瘤胃中有85%的微生物是未培養(yǎng)的(KrauseD0,DenmanSE,MackieRI,MorrisonM,RaeAL,AttwoodGT,andMcSweeneyCS.2003.Opportunitiestoimprovefiberdegradationintherumen:microbiology,ecology,andgenomics.FEMSMicrobiolRev27:663-693)，可以推測這些未培養(yǎng)微生物中一定含有大量的新基因資源?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明的目的是提供一種具有結(jié)合糖能力的碳水化合物結(jié)合組件及其應(yīng)用。[0009]本發(fā)明提供一種蛋白，為如下⑴或（2)所示：[0010](I)SEQIDNo.2所示的蛋白；[0011](2)將SEQIDNo.2所示的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖結(jié)合能力的蛋白質(zhì)；[0012]所述糖具體為多糖或寡糖。[0013]上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0014]上述編碼基因中，所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N：[0015]I)SEQIDNo.1所示的DNA分子；[0016]2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；[0017]3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。[0018]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0019]上述蛋白作為碳水化合物結(jié)合組件的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；[0020]所述碳水化合物結(jié)合組件的主要功能是識(shí)別和吸附底物，它通過增加底物表面酶的濃度提高酶對(duì)底物的催化活性；[0021]所述底物具體為糖。[0022]上述應(yīng)用中，所述碳水化合物結(jié)合組件為結(jié)合糖的碳水化合物結(jié)合組件。[0023]上述蛋白或上述任一所述的編碼基因在制備具有結(jié)合糖功能的產(chǎn)品的中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；[0024]或，上述蛋白或上述任一所述的編碼基因在糖降解中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；[0025]上述蛋白作為碳水化合物結(jié)合組件識(shí)別和吸附糖，從而增加帶有該組件的酶表面的糖濃度，提高酶對(duì)糖的降解活性。[0026]上述任一所述的應(yīng)用中，所述糖為多糖或寡糖。[0027]上述任一所述的應(yīng)用中，所述多糖為非水溶性多糖或水溶性多糖；[0028]所述非水溶性多糖具體為微晶纖維素、酸膨脹的纖維素、地衣多糖、來源于樺木的非水溶性木聚糖、甘露聚糖或木薯生淀粉；[0029]所述水溶性多糖具體為羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、大麥β-葡聚糖、甲基纖維素、樺木木聚糖、豆類樹膠或來源于樺木的水溶性木聚糖；[0030]所述寡糖為纖維寡糖；[0031]所述纖維寡糖具體為纖維四糖和纖維五糖；[0032]所述木薯生淀粉具體按照如下方法制備而成：[0033]將木薯粉碎后過80目篩，密封經(jīng)Co6tl輻射滅菌得到；[0034]所述酸膨脹的纖維素為磷酸膨脹的纖維素，具體按照如下方法制備而成：[0035]①將10克微晶纖維素懸浮在質(zhì)量百分含量為85%的!13?04水溶液中，1°C攪拌1小時(shí)，得到混合物；[0036]②將混合物倒入4L溫度為2-8°C水中，放置30min;[0037]③先用溫度為2_8°C水洗滌步驟②處理后的微晶纖維素，然后用質(zhì)量百分含量為1%的NaHCO3水溶液洗滌，再用溫度為2-8°C水洗滌至酸堿平衡，得到酸膨脹的纖維素；[0038]所述來源于樺木的水溶性木聚糖和所述來源于樺木的非水溶性木聚糖具體按照如下方法制備而成：[0039]1)將樺木木聚糖按照10克：200mL的比例溶于水中，攪拌；[0040]2)離心收集上清，同時(shí)保留沉淀；[0041]3)用去離子水洗滌沉淀，離心，倒掉上清保留沉淀；[0042]4)分別將所述步驟2)所得的上清和所述步驟3)所得的沉淀低溫冷凍干燥為粉末，即為所述來源于樺木的水溶性木聚糖和所述來源于樺木的非水溶性木聚糖。[0043]上述蛋白或上述任一所述的編碼基因在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；[0044]所述蛋白質(zhì)純化的方法具體可為將上述蛋白與目的蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，形成融合蛋白；再利用帶有非水溶性糖的純化材料將所述融合蛋白進(jìn)行純化，得到目的蛋白。[0045]本發(fā)明在大腸桿菌RosettaTM(DE3)中表達(dá)CBMumeel511DNA序列、純化表達(dá)產(chǎn)物CBMUmral5D多肽并檢測該多肽對(duì)糖的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)該多肽可以結(jié)合廣泛的糖底物，包括多糖和寡糖。本發(fā)明提供的〇81^_151)與已知的碳水化合物結(jié)合組件都沒有同源性，該多肽是一個(gè)新的碳水化合物結(jié)合組件?！緦＠綀D】【附圖說明】[0046]圖1為PET-CBMumeel511的酶切電泳圖譜。[0047]圖2為CBMunicel511蛋白液的電泳圖。[0048]圖3為CBMumral511的圓二色譜圖。[0049]圖4為CBMuniral5Jt水溶性多糖的結(jié)合能力的電泳檢測結(jié)果。[0050]圖5為CBMuniral5D對(duì)非水溶性多糖的結(jié)合能力的電泳檢測結(jié)果。[0051]圖6為CBMumeel511對(duì)纖維寡糖的ITC滴定結(jié)果。[0052]圖7為CBMumeel5Jt水溶性多糖的ITC滴定結(jié)果。[0053]圖8為鈣離子影響CBMumeel5Jt水溶性多糖結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)的ITC滴定結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】[0054]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0055]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0056]下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。[0057]下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。[0058]羧甲基纖維素（Carboxymethylcellulose，CMC)、微晶纖維素（Avicel)、地衣多糖(Lichenan)、大麥β-葡聚糖（barley-glucan)、甲基纖維素（methylcellulose)、輕乙基纖維素（hydroxyethylcellulose)、樺木木聚糖（birchwoodxylan)為SIGMA公司產(chǎn)品。[0059]木薯生淀粉按照如下方法制備而成：[0060]將木薯粉碎后過80目篩，分裝至藥品瓶中，密封后經(jīng)Co6tl輻射滅菌，保存?zhèn)溆?。[0061]纖維二糖（Cellotriose)、纖維三糖（Cellotriose)、纖維四糖（Cellotetraose)和纖維五糖（Cellopentaose)為Megazyme公司產(chǎn)品。[0062]甘露聚糖（Manna)和豆類樹膠（beangum)為Megazyme公司產(chǎn)品。[0063]瓊脂糖為Amresco公司產(chǎn)品。[0064]酸膨脹的纖維素（Acid-swollencellulose)按照如下方法制備而成：[0065]①10克微晶纖維素（Avicel)懸浮在85%的H3PO4水溶液中，1°C攪拌1小時(shí)，得到混合物。[0066]②將混合物倒入4L冰冷（溫度范圍2-8°C)的水中，放置30min。[0067]③先用預(yù)冷的水（溫度范圍2_8°C)洗滌步驟②處理后的Avicel幾次，然后用1%的NaHCO3水溶液洗滌，再用預(yù)冷的水（溫度范圍2-8°C)洗滌至酸堿平衡，得到酸膨脹的纖維素。[0068]④將酸膨脹的纖維素儲(chǔ)存在5mMNaN3水溶液中，1°C保存。[0069]來源于樺木的水溶性木聚糖和非水溶性木聚糖按照如下方法制備而成：[0070]①稱取10克樺木木聚糖溶于200mL去離子水中，用磁力攪拌器攪拌2h。[0071]②4°C，8000rpm離心10min，收集上清，同時(shí)保留沉淀。[0072]③用去離子水洗滌沉淀三次，每次于4°C，SOOOrpm離心10min，倒掉上清保留沉淀。[0073]分別將步驟②所得的上清和步驟③所得的沉淀低溫冷凍干燥為粉末，即為水溶性樺木木聚糖（Solublebirchwoodxylan)和非水溶性樺木木聚糖（insolublebirchwoodxylan)〇[0074]實(shí)施例1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建和各個(gè)重組蛋白的表達(dá)[0075]-、CBMunicel511DNA片段的制備[0076]人工合成SEQIDNo.1所示的DNA分子，將其命名為CBMumeel511。CBMumeel511編碼SEQIDNo.2所示的多肽，將該多肽命名為CBMUmeel5D。CBMumeel51^預(yù)計(jì)分子量為16.30KDa，等電點(diǎn)pi為4.75。[0077]二、PET-CBMumcel51^組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定[0078]I、pET-CBMUnicel5D的構(gòu)建[0079]①以SEQIDNo.1所示的DNA分子為模板，用引物1和引物2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在CBMumeel511的上游和下游分別引入NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，得到PCR產(chǎn)物丙。[0080]引物1:5'-GACCATATGGACGACTTTCAAATAACATATACCGTGAA-3'；(SEQIDNo.3)[0081](下劃線所示的序列為NdeI酶切識(shí)別位點(diǎn)）[0082]引物2:5'-CGACTCGAGGGAACGGATACCAGAAGGCGCT-3'。（SEQIDNo.4)[0083](下劃線所示的序列為XhoI酶切識(shí)別位點(diǎn)）[0084]②用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切PCR產(chǎn)物丙，回收酶切產(chǎn)物。[0085]③用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pET_30a(+)(Novagen公司產(chǎn)品），回收載體骨架。[0086]④將步驟②的酶切產(chǎn)物和步驟③的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pET-CBMUmc;el5D，將pET-CBMUmc;el5D進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果正確。pET-CBMUmc;el5D的骨架為pET-30a(+)，在NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了CBMumeel511序列。[0087]2、重組質(zhì)粒的鑒定[0088]pET-CBMUmcel5D的酶切電泳圖譜如圖1所示。[0089]圖1中，泳道1為Ikbladder(片段大小從大到小依次為：10.Okb，8.Okb，6.Okb，5.Okb，4.Okb，3.5kb，3.Okb,2.5kb,2.Okb,I.5kb，lkb，0·75kb，0·5kb);泳道2為pET-CBMUm。el5D用NdeI和XhoI雙酶切后的酶切產(chǎn)物，其中標(biāo)號(hào)為I的條帶為大小為5.3kb的條帶，該條帶是載體骨架，標(biāo)號(hào)為2的條帶為大小為500bp的條帶，該條帶是插入的目的片段CBMUmcel5D。[0090]PET-CBMUmeel5D中，起始密碼子和終止密碼子由pET-30a(+)提供。表達(dá)產(chǎn)物的C端有一個(gè)由表達(dá)載體pET-30a(+)提供的His標(biāo)簽（6XHisTag)。[0091]三、重組蛋白的表達(dá)和純化[0092]1、制備重組菌[0093]用PET-CBMunicel511轉(zhuǎn)化E.coliRosetta?(DE3)，得到重組菌Rosetta?(DE3)/pET-CBMUmcel5D〇[0094]2、重組蛋白的表達(dá)[0095]培養(yǎng)重組菌Rosetta?(DE3)/pET_CBMUmeel5D并誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，得到具有表達(dá)產(chǎn)物CBMudim15d的菌液，并制備粗蛋白液。[0096]具體步驟如下：[0097]①重組菌的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)[0098]將重組菌Rosetta?(DE3)/pET-CBMUmeel5D接種到IOml含有34μg/ml氯霉素與25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜；取2ml過夜培養(yǎng)物到200ml含有34μg/ml氯霉素與25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)至006(|(|為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為ImM，28°C繼續(xù)培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)，6000g離心收集菌體。[0099]②制備粗蛋白液[0100]將步驟①收集的菌體加入咪唑濃度為IOmM的裂解緩沖液（50mMNaH2PO4,300mM似〇1，10禮咪唑，？!18.0，余量為水）中，重懸菌體，置冰上30分鐘。用超聲波破碎細(xì)胞，30(^作用lh，每次作用時(shí)間5s，每次作用間隔5s。12000g離心15分鐘，收集上清即為CBMunrcel511粗蛋白液。[0101]3、重組蛋白的純化[0102]將CBMUmcel5D粗蛋白液用Clontech公司的TALONMetalAffinityResins試劑盒(方法參照試劑盒說明書）進(jìn)行純化，得到CBMui^15d蛋白液。純化步驟如下：[0103]①將試劑盒中TALON樹脂完全懸浮，快速吸取2ml的樹脂到一個(gè)約IOml的吸附柱中，讓吸附柱中的液體自然流盡。[0104]②在吸附柱中加一個(gè)柱體積的去離子水，讓吸附柱中的液體自然流盡。[0105]③重復(fù)步驟②。[0106]④在吸附柱中加一個(gè)柱體積的咪唑濃度為IOmM的洗滌緩沖液，讓吸附柱中的液體自然流盡。[0107]⑤取一個(gè)滅好菌50ml的離心管，將CBMumeel51^i蛋白液和步驟④中處理好的樹脂混合與離心管中，在室溫置于脫色搖床上SOrpm搖動(dòng)40分鐘，使帶有多組氨酸標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白CBMumrel51^P樹脂充分結(jié)合，將混合液倒回吸附柱中，讓吸附柱中的液體自然流盡。[0108]⑥加入1個(gè)柱體積咪唑濃度為20mM的洗滌緩沖液（50mMNaH2PO4,300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0,余量為水）到吸附柱中，讓液體自然流盡。[0109]⑦重復(fù)步驟⑥[0110]⑧依次向吸附柱中加入咪唑濃度為40mM、60mM、80mM、IOOmM(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，咪唑濃度分別為40禮、601111、801111、1001111，？!18.0，余量為水）的洗滌緩沖液各21^，每次加入lmL，讓液體自然流下，分別收集各洗脫液。[0111]⑨向吸附柱中加6ml咪唑濃度為250mM的洗脫液（50mMNaH2PO4,300mMNaCl，250mM咪唑，ρΗ8·0,余量為水）到柱子中，分管（lml/管）收集洗脫液。[0112]注：步驟⑧和⑨收集的洗脫液中均含有目的蛋白CBMui^15d，可選取較純的洗脫液(步驟⑧或⑨收集的洗脫液）作為〇81^_151)蛋白液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。[0113]CBMunicel511蛋白液的電泳圖如圖2所示。[0114]圖2中，1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（marker);2為TALON樹脂純化的CBMUmeel5D。[0115]圖2表明，經(jīng)TALON樹脂純化后CBMumeel511蛋白已達(dá)到SDS-PAGE單條帶純（如箭頭所示）。[0116]實(shí)施例2、CBMumeel51^白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析[0117]用實(shí)施例1制備的CBMumeel51^白液進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。[0118]圓二色譜測定CBMumeel511的二級(jí)結(jié)構(gòu)[0119]一、樣品準(zhǔn)備[0120]將CBMumeel51^白液用截流為3kDa的MILLIP0RE超濾管置換緩沖液，置換的緩沖液為pH5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液，置換緩沖液后濃縮蛋白溶液，使其濃度為500μg/mL，將其記作待測液。[0121]二、圓二色譜測定[0122]將待測液加入Imm規(guī)格的比色皿（圓二色譜儀器配置的）中，待測液加入量應(yīng)超過比色皿容積的2/3,并輕輕震蕩排除比色皿中的氣泡。測量時(shí)參數(shù)設(shè)置為，掃描波長：188?250nm，掃描速度：60nm/min,米集時(shí)間（Acquisitionduration:1s，掃描步長（Scanstep)：lnm〇[0123]三、數(shù)據(jù)分析[0124]掃描所得的峰圖使用⑶ROMBiokine4優(yōu)化數(shù)據(jù)，將峰圖按照每三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行平滑處理；使用origin8.0作圖；使用Dicroprot根據(jù)軟件提供的K2D模式計(jì)算三種主要二級(jí)結(jié)構(gòu)（包括α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲）的含量，結(jié)果如圖3和表1所示。[0125]表ICBMumeel51^白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[0126]【權(quán)利要求】1.一種蛋白，為如下（1)或（2)所示：(1)5￡〇10此.2所示的蛋白；(2)將SEQIDNo.2所示的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N：1.SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5.權(quán)利要求1所述蛋白作為碳水化合物結(jié)合組件的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述碳水化合物結(jié)合組件為結(jié)合糖的碳水化合物結(jié)合組件。7.權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述的編碼基因在制備具有結(jié)合糖功能的產(chǎn)品的中的應(yīng)用；或，權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述編碼基因在糖降解中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求6-7任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述糖為多糖或寡糖。9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述多糖為非水溶性多糖或水溶性多糖；所述非水溶性多糖具體為微晶纖維素、酸膨脹的纖維素、地衣多糖、來源于樺木的非水溶性木聚糖、甘露聚糖和木薯生淀粉；所述水溶性多糖具體為羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、大麥0_葡聚糖、甲基纖維素、樺木木聚糖、豆類樹膠或來源于樺木的水溶性木聚糖；所述寡糖為纖維寡糖；所述纖維寡糖具體為纖維四糖和纖維五糖。10.權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述編碼基因在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用?！疚臋n編號(hào)】C12N15/56GK104498459SQ201410836588【公開日】2015年4月8日申請日期:2014年12月29日優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日【發(fā)明者】馮家勛,段承杰,馮玉亮,曹啟龍申請人:廣西大學(xué)